Cancers

Les souris dont la tumeur dépasse 1 500 mm3, qui perdent plus de 20 % de leur poids ou dont le point d'injection s'ulcère sont mises à mort avant paralysie complète. 792 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de myélome, une injection du composé radioactif, des séances d'imagerie sous anesthésie pouvant durer deux heures, puis une ponction cardiaque terminale suivie d'une dislocation cervicale. Le projet reprend une molécule abandonnée en essai clinique de phase II sur le cancer du pancréas, reformulée avec du cuivre radioactif pour cumuler chimiothérapie et radiothérapie interne.

Objectifs

Malgré des avancées importantes dans les stratégies thérapeutiques ces dernières décennies, le myélome multiple (MM) reste incurable. La surveillance de la progression maligne et de la récidive après traitement sont des défis centraux pour améliorer le taux de survie des patients atteints de MM. Le mécanisme de cuproptose induisant la mort cellulaire dépendante du cuivre a été exploré à travers l'utilisation de l'elesclomol en chimiothérapie. En raison d'un effet thérapeutique suboptimal dans le cancer du pancréas ainsi que de problèmes de solubilité, celui-ci a été abandonnée lors des essais de phase II . Actuellement, il a été mis au point une version hydrosoluble de l'elesclomol offrant ainsi la possibilité d'améliorer l'efficacité thérapeutique de cette molécule et suscitant un nouvel intérêt clinique. À travers ce projet, l'objectif est d'exploiter le double effet de l'elesclomol en le fonctionnalisant avec le cuivre (Cu64 ou Cu67), permettant ainsi la réalisation de la cuproptose tout en associant l'efficacité potentielle de la radiothérapie interne du cuivre radioactif. Le cuivre est l'un des radioéléments les plus prometteurs pour l'approche théranostique en raison de sa disponibilité en cyclotron et de ses propriétés physiques. Les objectifs du projet sont de développer de nouvelles molécules à base d’elesclomol dans le cadre de traitement du myélome multiple mais également le dépistage et le suivi du développement tumoral chez l’homme. Après la confirmation par les études in vitro, les molécules présentant les meilleurs résultats sur les lignées cellulaires de MM seront étudiées in vivo sur modèles murins. Le projet in vivo consistera aux études de pharmacocinétiques, de biodistribution et d’efficacité thérapeutique sur souris après greffe tumorale. L’étude de biodistribution des molécules radiomarquées sera réalisée par tomographie d’émission de positons (TEP) couplée à l’imagerie par tomodensitométrie X (TDMX). Cette démonstration de concept pourrait conduire au développement d'une nouvelle approche thérapeutique de radiothérapie interne vectorisée en utilisant la chimiothérapie comme double vecteur thérapeutique, ouvrant ainsi la voie à une nouvelle approche thérapeutique.

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre d’ajouter ces molécules comme nouvel outil de traitement et de diagnostic du myélome multiple. Elle permettra également de mieux comprendre la conjugaison des effets liés à l’elesclomol combiné à l’approche par radiothérapie interne vectorisée. Cette étude devrait également démontrer l’intérêt de cette approche pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer chez l’Homme grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

L’administration des molécules se feront par voie intraveineuse sur animal vigil d’une durée

Impact sur les animaux

L’elesclomol a été testé chez l’Homme dans des essais cliniques précoces dont aucune nuisance n’a été observée. L’ensemble des informations liées à la toxicité cellulaire de la molécule et de sa formulation ont été établies in vitro sur plusieurs lignées cellulaires cancéreuses. Nous n’attendons pas de nuisances liées à la molécule sur les souris immunodéficientes car celle-ci sera réalisée à 70% de la MTD identifié en PE1 au maximum. Les nuisances et les points limites identifiées sur souris avec tumeur attendues sont une perte de poids (max >20%), une augmentation du volume tumoral excessif (jusqu’à induire des difficultés locomotrices, à induire une souffrance/une douleur ou >1500mm3), l’apparition de nécrose/ulcération/infection possible au lieu d’injection. Un score de 3 sur la grille de score impliquera la mise à mort de l’animal avant paralysie complète

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement et analyses post-mortem.

Remplacement

Des études in vitro déterminant la cytotoxicité de la molécule ont été préalablement réalisés afin de remplacer une partie des expérimentations in vivo. Cependant à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. La pharmacocinétique et la toxicité systémique (toxicité qui affecte tout l’organisme) ne peuvent être déterminées que in vivo. Cette étude préclinique, visera à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation de ces molécules radiomarquées pour étudier la biodistribution par imagerie TEP ainsi que le traitement du myélome multiple et du glioblastome, et d’y intégrer les paramètres environnementaux inhérents à un organisme entier.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Une approche statistique a déterminé que le nombre d'animaux par groupes nécessaire pour déterminer un effet significatif lors de l'analyse des données est de 6 individus. Cette taille fournira la puissance nécessaire pour détecter une réduction du volume tumoral de ≥30% par rapport au contrôle, avec un écart-type de 25% au maximum dans le groupe de contrôle. Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochable. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible. L’étude de toxicité sur souris saine ainsi que de biodistribution servent d’études pilotes avec un nombre restreint de groupes qui conditionnera la suite du projet, le nombre annoncé est donc un nombre maximum d’animaux pour l’étude de 3 fonctionnalisations de elesclomol.

Raffinement

Toutes les manipulations susceptibles de générer de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Les souris seront observées et la croissance des tumeurs sera mesurée régulièrement. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance animale par interruption de la procédure. Une période d’acclimatation de 2 semaines sera observée avant le début d’une procédure. Les animaux seront habitués 2-3x par semaine pendant au moins 1 semaine avant le début d’une procédure, afin de réduire le stress dû aux manipulations lors de l’étude. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement permettant à l’animal d’exprimer des comportements naturels. L’imagerie se fait sous anesthésie gazeuse dans une enceinte chauffée avec monitora de la température et de la fréquence respiratoire.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. La disponibilité d’animalerie agrée pour la souris ainsi que l’expertise présente à proximité facilite le suivi et la qualité des expérimentations. Le modèle murin est d’autant plus indiqué car il permet de combiner une étude de toxicité et d’efficacité thérapeutique sur des souches immunodéprimées particulièrement adaptées à l’études de la biologie des cancers. Les souris mâles et femelles auront un poids compris entre 20 et 45g lors de leur utilisation et seront âgés de 8-12 semaines, soit l’âge de leur maturité sexuelle. Cet âge permet de s’affranchir des problèmes à la fois prés pubères et de vieillissement et donc évite d’inclure des paramètres supplémentaires dans la compréhension des mécanismes mis en jeu.

Le système immunitaire des souris utilisées est rendu déficient pour favoriser la prise de tumeurs mammaires humaines. 114 souris de cinq à six semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les poumons et les ganglions. Après injection des cellules tumorales, elles subissent une chirurgie de résection et l'implantation d'une puce sous la peau, puis six semaines de mesures au pied à coulisse et de pesées trois fois par semaine, la peau au niveau de la tumeur pouvant s'ulcérer ou se nécroser. Le porteur reconnaît n'avoir pas pu justifier statistiquement l'effectif de la première procédure, 24 souris, et s'appuie sur la littérature et son expérience.

Objectifs

Le cancer du sein triple négatif est un sous-type particulièrement agressif du cancer du sein. Représentant environ 10 à 15 % de l’ensemble des cancers du sein, le cancer du sein triple négatif touche plus fréquemment des patientes jeunes et présente une forte propension à métastaser précocement, en particulier vers les poumons, le cerveau et les os. Malgré les avancées réalisées en oncologie, ce cancer demeure l’un des sous-types les plus difficiles à traiter en raison de sa grande hétérogénéité, du nombre limité d’options thérapeutiques ciblées et de l’apparition fréquente de résistances aux chimiothérapies conventionnelles. Au cours de la dernière décennie, de nombreux efforts ont été consacrés au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, afin d’améliorer le pronostic des patientes. Parallèlement, les progrès réalisés dans les modèles précliniques, notamment grâce a de nouveaux modèles et à l’imagerie en temps réel, ont permis d’évaluer l’efficacité de traitements expérimentaux dans des contextes biologiquement pertinents. Dans ce contexte, le présent projet vise à explorer une nouvelle approche thérapeutique ciblant ce type de cancer. L’objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité thérapeutique d’un nouveau dispositif médical implantable sous-cutané (puce microfluidique) dans un modèle xénogreffe de cancer du sein métastatique triple négatif. Le modèle sera suivi à l’aide d’un système d’imagerie afin d’évaluer la réponse globale au dispositif.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. Ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’efficacité d’un potentiel nouveau traitement anticancéreux plus efficace chez des patientes atteintes de cancer du sein triple négatif, étant peu ou non réceptives aux traitements de référence.

Procédures

Implantation de cellules tumorales par injection (1min). Chirurgie de résection et implantation de la puce microfluidique (10min) Mesures tumorales au pied à coulisse 3x/sem et pesées 3x/semaine (quelques secondes) jusqu’à 6 semaines après implantation. Imagerie par fluorescence (10min, 1x/semaine) Administration d’analgésique pendant quelques secondes pouvant être réalisée jusqu’à 4 fois. Prélèvements sanguins une fois toutes les deux semaines (3min).

Impact sur les animaux

Une perte de poids, une détresse respiratoire et une altération de la mobilité peuvent être envisagés suite au développement des métastases, mais les animaux seront surveillés de manière adéquate. Les animaux vont subir une intervention chirurgicale sous anesthésie afin de réséquer la tumeur et d’implanter la puce microfluidique en sous-cutané qui peut entrainer un stress. La tumeur peut à un certain volume gêner à la locomotion, et la peau au niveau de la tumeur peut potentiellement ulcérer voire nécroser. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress pendant plusieurs semaines lors de la contention et éventuellement une gêne, sensibilité au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever en post-mortem les poumons et les ganglions lymphatiques pour les analyser.

Remplacement

Plusieurs études préliminaires ont été menées in vitro pour s’assurer de l’efficacité prometteuse du traitement sur des lignées cancéreuses en culture ainsi que plusieurs étapes de vérification de caractéristiques valides pour un candidat médicament, cependant les interactions entre le métabolisme, les cellules du système immunitaire et le microenvironnement tumoral sont complexes et impactées par différents organes, ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Même si nous cherchons à développer nos modèles en impression 3D, tout ceci n’étant encore qu’à un stade très précoce et ne représentant pas totalement le microenvironnement tumoral et sa complexité, l’étude de l’efficacité de potentielles molécules anticancéreuses sur cette tumeur métastatique ne peut, pour le moment, se faire que sur organisme entier.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de mener le but de la procédure à bien. Pour la première procédure, il n’a pas été possible de justifier statistiquement les effectifs au vu de la portée exploratoire de ce développement, cependant nous nous sommes appuyés sur une revue extensive de la littérature et notre expérience pour déterminer que nous aurions besoin de 24 souris. Dans la 2e procédure, pour la comparaison des volumes tumoraux, nous utiliserons un test statistique approprié et nous avons donc besoin de 90 animaux, ce qui fait un total de 114 animaux pour les deux procédures.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet qui les pèseront plusieurs fois afin de limiter leur stress. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de l’animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des souris sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont formés et expérimentés, ils sont donc à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures.

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler avec la souris car c’est une espèce sur laquelle de nombreux modèles de cancer ont été développés, et qui permet de manipuler facilement le système immunitaire en induisant une déficience pour une meilleure prise de nos tumeurs humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

Pour classer six peptides selon qu'ils freinent ou stimulent le système immunitaire, 160 souris subissent une réaction allergique provoquée sur l'oreille, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole tient en huit jours : rasage de l'abdomen sous anesthésie, dépôt d'un produit allergisant sur la peau, deux injections des peptides à tester, puis application du même produit sur l'oreille droite pour déclencher un gonflement, mesuré à l'épaisseur. Toutes sont tuées le lendemain de la dernière mesure pour prélever leurs oreilles. Le porteur affirme que l'étude chez l'animal est "indispensable" pour valider ces molécules, après un tri de plus de cinquante peptides sur cellules en culture, et indique qu'aucune des plus de 200 souris déjà utilisées dans ce modèle n'a nécessité de mise à mort anticipée.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l'efficacité de nouvelles molécules (appelées peptides) capables de réguler le système immunitaire, c'est-à-dire notre système de défense contre les infections et les maladies. Notre système immunitaire possède des mécanismes de contrôle comparables aux freins et accélérateurs d'une voiture. Parfois, ces mécanismes sont déréglés : le système immunitaire peut être trop actif (causant des maladies auto-immunes comme la polyarthrite ou des allergies) ou pas assez actif (permettant aux cancers de se développer). Nous testerons six molécules différentes : - Quatre molécules « freins » qui pourraient calmer un système immunitaire trop actif - Deux molécules « accélérateurs » qui pourraient stimuler un système immunitaire insuffisant Pour évaluer ces molécules, nous utiliserons un modèle de réaction allergique cutanée chez la souris. Ce modèle reproduit ce qui se passe lors d'un eczéma de contact chez l'homme : la peau devient rouge et gonflée au contact d'une substance à laquelle l'organisme a été préalablement sensibilisé. En mesurant l'intensité de cette réaction inflammatoire, nous pourrons déterminer si nos molécules sont capables de la diminuer (pour les « freins ») ou de l'augmenter (pour les « accélérateurs »), et ainsi identifier les candidats les plus prometteurs pour le développement de futurs traitements.

Bénéfices attendus

Bénéfices scientifiques : Cette étude permettra de mieux comprendre comment réguler le système immunitaire avec de nouvelles molécules, ouvrant des pistes pour traiter des maladies actuellement difficiles à soigner. Bénéfices médicaux potentiels : Pour les molécules « freins » : elles pourraient aider à traiter des maladies où le système immunitaire attaque l'organisme par erreur (maladies auto-immunes comme la polyarthrite rhumatoïde, le lupus, la sclérose en plaques) ou pour prévenir le rejet après une greffe d'organe. Pour les molécules « accélérateurs » : elles pourraient renforcer les traitements contre le cancer (immunothérapie) ou améliorer la réponse aux vaccins chez les personnes dont le système immunitaire est affaibli. Avantages de ces nouvelles molécules par rapport aux traitements existants : - Coût de fabrication plus faible - Administration plus simple (injection sous la peau plutôt que perfusion à l'hôpital) - Meilleure diffusion dans les tissus.

Procédures

Le protocole s'étend sur 8 jours. Par convention, le jour du challenge (application sur l'oreille) est désigné Jour 0. Les étapes préalables de sensibilisation sont numérotées en jours négatifs (J-7, J-6, J-2, J-1), indiquant le nombre de jours avant le challenge. Les souris subiront les interventions suivantes sur une durée totale de 8 jours : 1. Rasage de l'abdomen (Jour -7, durée : 5 min) : réalisé sous anesthésie gazeuse brève (2-3 min) pour éviter le stress de contention. Récupération complète en moins de 5 minutes. 2. Sensibilisation cutanée (Jour -6, durée : 30 sec) : application d'une goutte de produit allergisant sur l'abdomen rasé. Ce geste est réalisé sur animal éveillé avec contention manuelle douce. Cette étape prépare le système immunitaire à réagir au produit. 3. Injections sous la peau (Jours -2 et -1, durée : 20 sec par injection) : deux injections des molécules à tester dans le haut du dos. Ces gestes sont réalisés sur animal éveillé avec contention manuelle douce. 4. Application sur l'oreille (Jour 0, durée : 30 sec) : application du même produit allergisant sur l'oreille droite pour déclencher la réaction allergique localisée. Ce geste est réalisé sur animal éveillé. 5. Mesures (Jours 0 et +1, durée : 2 min par souris) : mesure de l'épaisseur de l'oreille avec un instrument de précision pour quantifier l'inflammation. Ces mesures sont réalisées sur animal éveillé. À l'issue des mesures (Jour +1), les animaux sont euthanasiés et les oreilles sont prélevées pour des analyses au microscope.

Impact sur les animaux

Effets attendus : Rasage (Jour -7) : stress bref lié à l'anesthésie (quelques minutes), récupération rapide. Sensibilisation cutanée (Jour -6) : possibilité d'une légère rougeur temporaire sur l'abdomen, sans gêne notable pour l'animal. Injections (Jours -2 et -1) : stress bref lié à la contention (moins de 20 secondes). Possibilité d'une petite bosse sous la peau au point d'injection, disparaissant en 1-2 jours. Réaction allergique sur l'oreille (Jour 0 à Jour +1) : c'est la phase où les effets sont les plus visibles : - Gonflement de l'oreille traitée (augmentation d'épaisseur de 0,1 à 0,3 mm) - Rougeur et légère chaleur de l'oreille - Ces effets restent strictement localisés à l'oreille traitée État général : les souris conservent un comportement normal (alimentation, déplacements, interactions avec leurs congénères). Pas de perte de poids significative attendue. Signes pouvant nécessiter une euthanasie anticipée (observés chez moins de 2% des animaux selon notre expérience) : - Perte de poids importante - Extension des lésions cutanées au-delà de la zone traitée - Grattage excessif ou automutilation - Prostration ou isolement du groupe - Signes de douleur non contrôlée. Sur plus de 200 souris utilisées dans ce modèle dans notre laboratoire, aucun animal n'a nécessité d'euthanasie anticipée.

Devenir

Aucun animal ne sera maintenu en vie à l'issue de la procédure. Tous les animaux (160 souris) seront euthanasiés à la fin de l'étude, le protocole nécessitant le prélèvement des oreilles pour analyses microscopiques.

Remplacement

Avant de recourir à l'expérimentation animale, des tests sur cellules en culture ont été réalisés pour sélectionner les candidats les plus prometteurs parmi plus de 50 peptides. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de reproduire le fonctionnement complet du système immunitaire : elles ne peuvent pas évaluer le devenir des peptides dans l'organisme, les interactions entre les différents types de cellules immunitaires, ni le recrutement de ces cellules vers le site d'inflammation. L'étude chez l'animal est donc indispensable pour valider l'efficacité de ces molécules avant tout développement thérapeutique.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé mathématiquement au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Sur plus de 50 molécules conçues initialement, seules les 6 plus prometteuses — présélectionnées par des tests en laboratoire — sont testées chez l'animal. Chaque souris fournit plusieurs mesures (épaisseur de l'oreille, poids de la biopsie, analyses microscopiques), ce qui maximise les informations obtenues par animal. Les résultats seront publiés et rendus accessibles à la communauté scientifique afin d'éviter toute duplication inutile de ces expériences.

Raffinement

De nombreuses mesures sont prises pour assurer le bien-être des animaux et minimiser leur inconfort : Hébergement adapté : - Souris hébergées en groupe (4-5 par cage) pour préserver les contacts sociaux - Cages enrichies avec matériel de nidification (papier, coton), abris et litière abondante - Conditions de température, humidité et lumière contrôlées - Période d'acclimatation de 7 jours avant le début des manipulations Réduction du stress lors des manipulations : - Rasage réalisé sous anesthésie gazeuse brève - Manipulations douces et rapides - Surveillance et prise en charge de la douleur : - Observation quotidienne de tous les animaux, renforcée (2 fois par jour) pendant la phase de réaction allergique - Utilisation d'une grille d'évaluation standardisée avec des critères objectifs (poids, aspect du pelage, comportement, aspect des lésions) - Points limites définis : si un animal montre des signes de souffrance importante, il est immédiatement euthanasié - La surveillance est renforcée lors de la phase de réaction, et que l'euthanasie est immédiate en cas de signes de souffrance (score 3) Durée limitée : - Protocole de 8 jours seulement - Euthanasie réalisée à la fin de l'étude, avant que l'inflammation ne devienne inconfortable, sous anesthésie profonde (méthode rapide et sans douleur)

Choix des espèces

Choix de l'espèce : La souris a été choisie pour les raisons suivantes : 1. Modèle validé : le modèle d'allergie cutanée utilisé est un standard international pour évaluer des molécules modulant le système immunitaire. Il existe de nombreuses données publiées permettant de comparer nos résultats. 2. Sensibilité adaptée : la souche de souris choisie présente une bonne sensibilité aux réactions allergiques cutanées, ce qui permet de détecter efficacement l'effet de nos molécules. 3. Pertinence pour l'homme : les mécanismes immunitaires ciblés par nos molécules sont très similaires chez la souris et chez l'homme (plus de 70% de ressemblance), ce qui permet d'envisager une application future chez l'homme. 4. Disponibilité : ces souris sont facilement disponibles auprès de fournisseurs agréés, avec des caractéristiques génétiques standardisées garantissant la reproductibilité des expériences. Stade de développement : Les souris utilisées seront des adultes jeunes (7-9 semaines), car : 1. À cet âge, le système immunitaire est pleinement mature, garantissant des réponses représentatives. 2. C'est l'âge standard utilisé dans la littérature scientifique, facilitant la comparaison des résultats. 3. Les souris sont suffisamment développées pour bien tolérer les manipulations.

480 souris reçoivent sous la peau une greffe de cellules cancéreuses du pancréas, puis pour certaines des injections d'anticorps trois fois par semaine pendant quinze semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur chronomètre chaque geste, une minute pour la greffe, moins d'une minute par injection, et mentionne plus brièvement l'ulcération cutanée que peut provoquer la tumeur au point d'implantation et les indurations dues aux injections répétées. L'anticorps testé ralentit déjà la croissance de cellules tumorales dans le cancer du foie, et le porteur affirme qu'une validation dans un "animal entier" reste requise avant tout passage clinique. Toutes sont tuées pour prélever tumeurs, foie et plasma.

Objectifs

Le cancer du pancréas est aujourd’hui l’un des cancers les plus meurtriers, avec très peu d’options thérapeutiques efficaces. Pour les formes avancées, les traitements actuels permettent rarement de dépasser une année de survie. Bien que l’immunothérapie ait révolutionné la prise en charge de plusieurs cancers, elle reste pour le moment peu efficace dans le cancer du pancréas. Cependant, de nouvelles pistes suggèrent que des traitements combinés pourraient améliorer la réponse des patients. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine très fortement augmentée dans les tumeurs du pancréas, qui semble favorisée par les cellules cancéreuses et associée à un plus mauvais pronostic. Nous avons développé un anticorps dirigé contre cette protéine, qui ralentit déjà la croissance de cellules tumorales dans le cancer du foie. Nous pensons qu’elle pourrait également jouer un rôle important dans le cancer du pancréas et influencer la réponse immunitaire. Notre objectif est donc double : - Comprendre comment cette molécule contribue au développement du cancer du pancréas et à la manière dont la tumeur interagit avec son environnement. - Tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, en évaluant si l’anticorps que nous avons développé, seul ou associé à l’immunothérapie, peut ralentir la croissance tumorale et améliorer l’efficacité des traitements. À terme, ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour un cancer qui manque cruellement d’options efficaces.

Bénéfices attendus

Les cancers du pancréas sont un grave problème de santé public. Bien que rare, il est pratiquement incurable en l’état actuel et les patients atteints ont une durée de vie très faible. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements plus efficaces. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies ciblant le système immunitaire et ainsi la survie de très nombreux malades dans le futur.

Procédures

La majorité des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Dans certains cas la croissance de la tumeur sous cutanée peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée au niveau du site d’implantation des cellules. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 3 fois par semaine pendant une durée pouvant aller jusqu’à 15 semaines. Les injections seront réalisées sur animaux vigiles, ce qui prend moins d’une minute à être réalisée. Les injections répétées peuvent parfois engendrer une induration ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Un stress physique lors de la manipulation et de la contention nécessaires à l’injection des traitements sont attendus, mais de courte durée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les injections répétées peuvent parfois engendrer une induration ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Dans certains cas la croissance de la tumeur sous cutanée peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée au niveau du site d’implantation des cellules. Un stress physique lors de la manipulation et de la contention nécessaires à l’injection des traitements sont attendus, mais de courte durée.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs ; foie ; plasma) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite en parallèle une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront hébergés en portoirs ventilés, ce qui les protégera des infections. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement

2 588 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à trente administrations de composés thérapeutiques, jusqu'à trente injections d'un produit qui rend les tumeurs visibles et quatre prélèvements de sang, et développent une gêne respiratoire au stade avancé du cancer du poumon. Une partie a 78 semaines, âge que le porteur rapporte à 56 ans chez l'humain, pour comparer le développement tumoral entre individus jeunes et âgés. Le bénéfice tient en une phrase, proposer à terme de nouvelles options aux malades, et le porteur conclut que l'étude du cancer chez la souris reste "indispensable".

Objectifs

Les cellules produisent l’énergie dont elles ont besoin grâce aux mitochondries, de véritables « centrales énergétiques ». Lorsqu’elles sont endommagées, ces structures peuvent provoquer la mort des cellules. Les cellules cancéreuses, en revanche, ont développé un système de tri et de recyclage appelé mitophagie, qui leur permet d’éliminer les mitochondries défectueuses et ainsi de survivre, même face aux traitements. Nos travaux ont montré que ce mécanisme est activé tout au long du développement du cancer du poumon et qu’une protéine clé joue un rôle central dans ce processus. La bloquer rend les tumeurs plus sensibles aux traitements. Ce projet vise à mieux comprendre ce mécanisme afin d’améliorer l’efficacité des thérapies actuelles, notamment la chimiothérapie, les thérapies ciblées et l’immunothérapie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à terme de proposer de nouvelles options thérapeutiques pour les patients souffrants de cancer du poumon.

Procédures

Dans ce projet les souris seront soumises à différentes types d’interventions comme : -des contentions : pour les anesthésier (30 secondes, 1 fois), pour les traiter (30 secondes, de 1 fois à 30 fois), pour leur administrer des composés pour la visualisation des tumeurs (30 secondes, nombre voir ci-après), -des administrations de composés thérapeutiques (10 secondes, 30 fois au maximum), d’un produit pour visualiser les tumeurs (10 secondes, 30 fois au maximum) -de prélèvements sanguins (30 secondes, maximum 4).

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux seront du stress lors des contentions et des administrations, une gêne respiratoire uniquement pour le groupe de souris représentant le cas de stade avancé de tumeurs pulmonaires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour réaliser les analyses in vitro nécessaires à notre étude.

Remplacement

Le développement d’un cancer ne dépend pas seulement de la transformation d’une cellule normale en cellule cancéreuse. Il repose aussi sur l’environnement qui entoure la tumeur, composé d’autres cellules, de signaux liés au métabolisme et de phénomènes inflammatoires. Tous ces éléments interagissent et collaborent pour permettre à la tumeur de se développer. La croissance d’une tumeur résulte donc d’un dialogue constant entre les cellules cancéreuses et leur environnement, en particulier avec le système immunitaire. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode globale capable de reproduire toutes ces interactions complexes en laboratoire. C’est pourquoi l’utilisation de modèles animaux, comme la souris, reste indispensable pour étudier le développement du cancer dans un organisme vivant.

Réduction

Dans un but de réduction, nous utiliserons indifféremment les mâles et les femelles, ce qui nous permettra d’utiliser la grande majorité des animaux générés dans les élevages. Des études préalables in vitro permettent de sélectionner des gènes d’intérêt afin de réduire le nombre tester in vivo, et l’ordre de réalisation des procédures servira à comparer différentes conditions afin de sélectionner la plus efficace pour réduire le nombre d’animaux utilisé dans certaines expériences.

Raffinement

Afin de garantir le bien-être des animaux, ceux-ci seront observés chaque semaine à l’aide d’une grille d’évaluation adaptée. Cela permettra de détecter rapidement tout signe de douleur, de stress ou de problème de santé. L’utilisation de modèles génétiques contrôlables permet de maîtriser le développement de la maladie et d’assurer un suivi attentif et régulier des animaux. L’évolution des tumeurs pulmonaires sera suivie au cours du temps grâce à une technique d’imagerie réalisée sous anesthésie, ce qui permet une évaluation précise tout en limitant l’inconfort. Cette approche aide à définir au plus juste le moment d’arrêter l’expérimentation, dans le but de préserver au maximum le bien-être des animaux. Toutes les procédures potentiellement stressantes ou douloureuses, comme certaines injections et les examens d’imagerie, seront réalisées sous anesthésie. Enfin, un gel protecteur sera systématiquement appliqué sur les yeux afin d’éviter leur dessèchement et toute atteinte visuelle.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche phylogénétiquement de l’homme, ce qui pourra permettre d’extrapoler rapidement les résultats obtenus chez la souris vers le développement de traitements chez les patients atteints de cancer du poumon. Le cancer ne se développe pas seulement lorsqu’une cellule normale devient cancéreuse. Il a aussi besoin d’un environnement particulier autour de la tumeur, composé d’autres cellules, de signaux métaboliques et de réactions inflammatoires, qui favorisent sa croissance. Le développement d’une tumeur dépend donc d’une interaction étroite entre les cellules cancéreuses et leur environnement, notamment avec le système immunitaire. Aujourd’hui, il n’existe pas de méthode alternative capable de reproduire toutes ces interactions, c’est pourquoi l’étude du cancer dans des souris reste indispensable. Les souris seront utilisées à l’âge de 8-12 semaines (équivalent âge humain = 16 ans) ou à 78 semaines (équivalent âge humain = 56 ans) afin d’étudier le développement du cancer du poumon chez des individus jeunes et âgés.

Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, respirent vite ou portent une plaie non guérie après deux jours sont mises à mort. 468 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs poumons. Elles inhalent sous anesthésie des molécules qui déclenchent un cancer du poumon, puis reçoivent jusqu'à vingt injections réparties sur six semaines, avec perte de poids et gêne respiratoire liées aux tumeurs. Le porteur écrit qu'aucune médication n'est prévue pour ne pas interférer avec les expériences, alors que les molécules testées seront selon lui "bientôt proposées en routine aux patients".

Objectifs

Les cancers du poumon sont la première cause de mortalité par cancer en France et dans le monde. Malgré les avancées thérapeutiques récentes, principalement basées sur les thérapies ciblées et les immunothérapies, de nombreuses tumeurs restent résistantes aux traitements et le taux de survie global à cinq ans ne dépasse pas 26 %. Il y a maintenant des nouvelles molécules qui bloquent un gène très important dans la survenue des tumeurs du poumon. Dans ce projet nous souhaitons caractériser l’apport de ces nouvelles molécules sur les thérapies classiques (chimiothérapie combinée à l’immunothérapie), identifier les potentiels mécanismes qui bloqueraient l'efficacité de ces traitements combinés et définir des stratégies pour contourner ces blocages.

Bénéfices attendus

Ces expériences pré-cliniques nous permettront de mieux appréhender l’efficacité des nouveaux traitements pour bloquer la progression des cancers du poumon. Ces traitements, qui incluent de nouvelles molécules qui suppriment l'activité d’un gène impliqué dans la progression des cancers, seront bientôt proposés en routine aux patients .

Procédures

- Les souris seront soumises à l'inhalation de molécules stimulant l’initiation du cancer. Cet acte dure moins de 30 secondes. Il est réalisé sous anesthésie pour diminuer le stress de l'animal. - Injections: 20 secondes x nombre d’injection, au maximum 20 injections par animal réparties sur 6 semaines. - Manipulation pour prise de poids : 15 secondes par animal, ce qui est le temps nécessaire pour prendre la souris, la poser sur la balance, reporter son poids et la reposer dans sa cage.

Impact sur les animaux

- Stress à la préhension. – Stress lié à l’injection.- Perte de poids liée à la présence de tumeurs. – gene respiratoire liée la présence de tumeurs.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tissus pulmonaires et l’analyse post mortem des échantillons. Les poumons seront prélevées pour des analyses histologiques et biochimiques afin de répondre aux objectifs scientifiques du projet. Les critères d’analyse incluront : 1. La taille et le nombre des lésions cancéreuses pour évaluer la progression tumorale. 2. La présence de cellules immunitaires dans les lésions tumorales, afin de confirmer leur implication dans le développement des cancers. Ces analyses permettront de valider ou d’infirmer les hypothèses du projet, notamment en ce qui concerne l’efficacité des nouveaux inhibiteurs pour ralentir ou stopper la progression des tumeurs. En résumé, la mise à mort des animaux est essentielle pour atteindre les objectifs expérimentaux, tout en garantissant que les animaux ne subissent aucune souffrance inutile à l’issue de la procédure.

Remplacement

Nous avons utilisé des approches de culture cellulaire et analyses informatiques dans les étapes préliminaires qui ont permis le financement de ce projet. Les concentrations actives des molécules que nous testerons ont été validées sur des cultures cellulaires et/ou grâce à une étude exhaustive de la littérature. A ce jour il n'existe pas de méthode de remplacement (co culture de cellules associée à une modélisation informatique ou modèles invertébrés) qui permettent de caractériser chez les mammifères la dynamique des interactions cellulaires et moléculaires mises en jeu dans les pathologies telle le cancer du tissu pulmonaire résistants aux traitements. De ce fait, le recours à l’animal vivant est requis.

Réduction

Une étude exhaustive de la littérature a été menée avant d'initier ce projet pour s'assurer de la non-reproduction de résultats déjà publiés. De plus, nous avons réalisé une étude statistique prévisionnelle qui nous permet de prédire le nombre minimal d’animaux qu’il faut inclure par groupe expérimental afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les expériences seront arrêtées dès que nous aurons obtenu les résultats permettant de valider nos hypothèses de travail.

Raffinement

Nous avons montré l’absence de toxicité de nos composés et de leur véhicule sur des cellules en culture et sur des animaux vigiles. Nous avons choisi une technique basée sur l’instillation. L’instillation est réalisée sous anesthésie gazeuse sous une lampe chauffante pour limiter la perte de température. Le temps d’anesthésie a été adaptée pour limiter le risque de fausse route. Les animaux seront mis à mort avant l'apparition de signes cliniques extérieur. Pour limiter au maximum la souffrance des souris nous avons établi une fiche d’observation qui liste les mesures que nous prenons pour assurer le bien-être et nous avons défini des points limites (non guérison de plaie après traitement, manque de soin associé à un isolement pendant plus de 2j, suintement au site d’injection, respiration rapide, blessure étendue ou surinfectée, perte de poids >20%) à partir desquels l’expérience sera arrêtée. Aucune médication n’est prévue pour ne pas interférer avec nos expériences. Dans le cas de blessures légères, nous appliquerons un antiseptique pour nettoyer la plaie et réaliserons un suivi spécifique des animaux et si la blessure n’est pas en cours de guérison pas après 2j, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, il existe beaucoup d’outils (Anticorps, imagerie) qui permettent de travailler avec les souris. Le modèle génétiquement modifié que nous utilisons est bien caractérisé dans la littérature comme dans notre centre de recherche. Il est particulièrement adapté à notre projet avec un développement de cancer du poumon après l’expression de la forme active d'un gène promoteur de tumeur. Les souris femelles et mâles seront mises en expérimentation à un âge minimum de 8 semaines, soit à l’âge adulte. A cet âge, le système immunitaire des souris est mature. Les souris seront mises à mort au maximum 4 mois après le début de l’expérience pour permettre le prélèvement des tissus et leur analyse.

Les souris utilisées sont sévèrement immunodéficientes, condition sans laquelle les cellules tumorales et immunitaires humaines qu'on leur injecte seraient rejetées. 40 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules cancéreuses humaines dans l'abdomen, y développe une tumeur suivie deux fois par semaine par imagerie sous anesthésie, avec jusqu'à 17 administrations d'un réactif de détection, quatre injections intraveineuses dans la queue et 24 injections sous-cutanées. Toutes sont tuées à la fin pour le prélèvement d'organes, le porteur n'excluant pas une dissémination tumorale et une gêne respiratoire en cas de métastases pulmonaires.

Objectifs

L’immunothérapie dans le domaine du cancer est une approche thérapeutique qui vise à stimuler le système immunitaire du patient pour qu’il puisse éliminer les cellules cancéreuses. Parmi les approches disponibles, il est possible de récupérer certaines cellules immunitaires du patient, de les modifier afin qu’elles reconnaissent spécifiquement les cellules cancéreuses avant de les réinjecter au patient. Cette approche, appelée thérapie cellulaire, a démontré son efficacité dans de nombreux essais cliniques pour le traitement de différents cancers. Nous avons réussi à générer des cellules immunitaires modifiées capables de reconnaître différents types de cancers, tels que le cancer de l’ovaire et un sous-type de cancer du sein très agressif. De plus, nous avons démontré que ces cellules immunitaires modifiées sont capables d’éliminer des cellules cancéreuses in vitro. Cependant, il est nécessaire de vérifier leur potentiel thérapeutique in vivo. Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunodéficientes permettant l’étude de la croissance tumorale en présence de cellules immunitaires humaines spécifiques. L’objectif principal est de valider la capacité de ces cellules immunitaires modifiées à éliminer les cellules cancéreuses in vivo, et de déterminer si la version optimisée du produit présente une efficacité supérieure à celle du traitement de référence.

Bénéfices attendus

En cas de résultats positifs, cette étude permettra de valider une nouvelle approche thérapeutique innovante pour les patients atteints de cancer, notamment de cancers de l’ovaire et du sein qui ne répondent pas aux traitements standards. Ceci accélèrera la validation préclinique de cet outil thérapeutique afin d’entamer le transfert vers la clinique.

Procédures

Pour réaliser l’injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses humaines, chaque souris est brièvement maintenue pendant environ 15 secondes. Une seule injection sera effectuée par animal. À la suite de cette injection, les souris développeront une tumeur au niveau de la cavité abdominale. La croissance tumorale sera suivie par imagerie deux fois par semaine durant toute la durée de la procédure. La veille de la première mesure, les animaux seront rasés. Cette intervention, d’une durée d’environ 2 minutes, pourra être répétée une fois au cours de la procédure si nécessaire. Le jour de chaque acquisition, les animaux seront anesthésiés et maintenus brièvement afin de recevoir un réactif permettant la détection du signal tumoral, puis resteront sous anesthésie durant toute la séance d’imagerie (environ 10 minutes). Chaque souris pourra recevoir au maximum 17 administrations de ce réactif. Le traitement expérimental sera administré par voie intraveineuse au niveau de la queue, nécessitant une immobilisation d’environ une minute ; quatre injections intraveineuses seront effectuées par animal. Des injections sous-cutanées de molécules de soutien aux cellules lymphocytaires seront réalisées trois fois par semaine durant toute la procédure, soit un total de 24 injections sous-cutanées, avec une contention d’environ 15 secondes par geste. Les animaux seront également pesés deux fois par semaine durant la procédure, une contention de 15 secondes étant nécessaire pour cette opération.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales dans la cavité abdominale de la souris est susceptible d’entraîner une douleur modérée et temporaire au moment de l’administration. À la suite de cette injection, les animaux développeront des tumeurs localisées principalement dans la cavité péritonéale. Toutefois, une dissémination tumorale ne peut être totalement exclue. En cas de formation de métastases, notamment au niveau des poumons, une gêne respiratoire pourrait survenir. L’injection intraveineuse du traitement dans la queue peut provoquer une gêne modérée et passagère au moment de l’injection. Des inflammations locales légères peuvent également apparaître à la suite de multiples injections. À ce jour, aucun effet indésirable majeur lié au transfert de cellules immunitaires modifiées chez la souris n’a été rapporté dans la littérature. Nous n’envisageons donc pas d’effets secondaires spécifiques liés à ce traitement. L’administration sous-cutanée de protéines solubles pourrait entraîner une douleur légère ou temporaire au site d’injection. De même, les injections intrapéritonéales répétées nécessaires au suivi de la croissance tumorale par imagerie peuvent induire une inflammation locale ou une gêne transitoire, sans conséquence durable sur le bien-être des animaux. Enfin, les manipulations répétées (injections, pesées, surveillances) peuvent occasionner un stress transitoire.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever certains organes dans le but d’analyser leur composition immunitaire.

Remplacement

Des expériences in vitro ont déjà été réalisées afin de confirmer l’efficacité des cellules immunitaires modifiées générées et leur capacité à éliminer des cellules tumorales. Les animaux sévèrement immunodéficientes correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires utilisant des cellules immunitaires modifiées puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires murines. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires modifiées in vivo, ce qui est l’objectif de cette étude.

Réduction

Le projet comporte une seule procédure expérimentale, ayant pour objectif principal de démontrer l’effet antitumoral du traitement standard et d’évaluer si la version optimisée de ce traitement présente une efficacité supérieure au produit non optimisé. Dans l’hypothèse où les résultats in vitro montreraient que le traitement optimisé est moins efficace que le prototype initial, aucun test in vivo ne serait réalisé avec ce traitement optimisé. Un outil statistique approprié a été utilisé pour déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaire et suffisant afin de garantir la validité scientifique de l’étude tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. De plus, un ensemble optimal de données et d’échantillons sera collecté pour chaque animal, de manière à maximiser les informations obtenues tout en limitant le recours aux animaux au strict minimum requis pour répondre à l’ensemble des objectifs expérimentaux.

Raffinement

L’effet des composés (cellules cancéreuses et réactifs injectés) sur l’état physiologique des souris est suivi par observation clinique, pesée des animaux et mesure des tumeurs par imagerie. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour le projet, incluant des critères d’arrêt de l’expérience en cas de souffrance des animaux. Aucun effet indésirable lié à des molécules de soutien dans le modèle de souris utilisé n’est attendu. Les souris seront anesthésiées pour le suivi longitudinal réalisé par imagerie. Leur réveil est facilité en plaçant la cage sur un tapis chauffant.

Choix des espèces

Les souris utilisées correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires utilisant des cellules immunitaires modifiées puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires de souris. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires transférées in vivo, ce qui est l’objectif de cette étude. Les animaux utilisés seront à l’âge de 6-8 semaines afin de pouvoir réaliser les greffes dans l’abdomen et l’injection en intraveineuse des cellules immunitaires dans des conditions optimales.