Cancers

Six heures de perfusion de glucose radiomarqué par pompe osmotique implantée sous la peau, trois prélèvements de sang, puis deux séances d'IRM séparées par un trajet en voiture d'un site à l'autre : 2 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce sont des souris Nude, immunodéficientes, dont le porteur reconnaît le "phénotype dommageable", choisies pour qu'elles ne rejettent pas les greffes de cellules tumorales de surrénale posées dans leur flanc ou dans le coussin graisseux du cou. Ces greffes peuvent gagner en profondeur, fusionner avec les muscles dorsaux et comprimer la colonne vertébrale, jusqu'à une paraplégie. Toutes seront tuées pour récupérer la tumeur, le porteur estimant qu'il ne serait "pas possible de maintenir les animaux en vie tout en respectant leur bien être après avoir retiré la tumeur".

Objectifs

Les cancers de la glande surrénale sont des cancers rares qui ont la particularité d’être fréquemment héréditaires. Les patients sont porteurs d’anomalies génétiques qui leur procurent un risque très important de développer une ou plusieurs de ces tumeurs au cours de leur vie. Dans certains cas, ces anomalies génétiques sont par ailleurs la cause de forme plus agressives de la maladie avec le développement de métastases dans les os ou le foie notamment. A l’heure actuelle, les traitements sont peu efficaces pour traiter ces patients et le diagnostic précoce de la présence d’une tumeur, permettant de la retirer par chirurgie reste le traitement le plus efficace. Dans le cas des formes héréditaires, l’identification d’une anomalie génétique permet de proposer un test génétique au membre de la famille pour identifier les individus porteurs de l’anomalie et leur proposer un suivi préventif. Des travaux antérieurs ont montré que l’une des conséquences de ces anomalies génétiques étaient une modification de la façon dont les cellules cancéreuses transforment les sucres, en particulier le glucose. Ces modifications du métabolisme peuvent être utilisées à la fois comme outils diagnostiques (les modifications étant différentes en fonctions du type d’anomalie génétique) et thérapeutique (le ciblage de ces modifications pourrait empêcher les cellules cancéreuses de se nourrir et donc de proliférer). L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles souris chez qui nous grefferons sous la peau des cellules tumorales ayant différentes anomalies génétiques retrouvées chez les patients. Dans ces modèles, nous étudierons comment les cellules cancéreuses utilisent le glucose pour proliférer. Nous développerons également des techniques d’imagerie par IRM qui permettront d’identifier les anomalies du métabolisme du glucose, en lien avec chaque type d’anomalie génétique. Ces travaux devraient permettre à fois d’identifier des voies qui pourraient être la cible de thérapie anti-cancéreuses spécifiques des anomalies génétiques (et donc potentiellement responsables de moins d’effets secondaires des traitements), et de développer des outils facilement utilisables en radiologie pour détecter les patients porteurs de ces anomalies génétiques. Ce projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs ou "EU. La mise en place des modèles de souris est réalisée dans l'EU1 et l'imagerie sera effectuée sur deux appareils d’IRM différents situés sur 2 sites distincts (EU2 et EU3).

Bénéfices attendus

En aidant à la compréhension des différents mécanismes de malignité des tumeurs en fonction de leurs mutations ainsi qu’à la compréhension de leur métabolisme complexe dans un contexte in vivo, le laboratoire pourra proposer de nouvelles cibles thérapeutiques ciblant des métabolites uniquement dans les cellules tumorales de la surrénale. Cette étude pourrait également permettre de développer une méthode innovante de diagnostic précoce ou de réponse thérapeutique pour les tumeurs pouvant, in fine, être transférée chez les patients.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie pour avoir une greffe de cellules tumorales dans le flanc ou dans le coussin graisseux sous anesthésie et analgésie (moins de 10 minutes). Une partie des animaux subira une perfusion intraveineuse de glucose radiomarqué durant 3h, avec 3 prélèvements de sang de 50 µL (30 secondes par prélèvement), sous anesthésie gazeuse et analgésie. Une autre partie des animaux subira une perfusion de glucose radiomarqué durant 6h par pompe osmotique, avec 3 prélèvements de sang de 50 µL (30 secondes par prélèvement), sous anesthésie gazeuse et analgésie. Une troisième partie des animaux sera transportée en voiture du site 1 vers le site 2 pour une première séance d’imagerie IRM de 30 minutes sous anesthésie gazeuse. Après transport en voiture de 30 minutes vers le site 3, ces animaux auront une acclimatation de 3 à 7 jours puis une seconde séance d’imagerie IRM de 30 minutes sur le site 3.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un léger stress lors de la contention, de l’anesthésie et lors du transport vers les différents sites d'expérimentation. L’injection de cellules tumorales peut provoquer de l’inflammation au niveau de la zone d’injection pouvant induire une irritation. L'implantation d’une pompe osmotique sous cutanée ainsi que le développement d’une tumeur dans le coussinet graisseux peuvent causer une légère douleur et potentiellement une réduction temporaire de la mobilité de la souris. Les tumeurs greffées sous le coussinet graisseux des souris peuvent potentiellement se développer en profondeur et adopter un comportement métastatique en fusionnant avec les muscles dorsaux résultant en une compression de la colonne vertébrale. Les animaux peuvent rarement montrer rapidement des signes de difficultés motrices dans les postérieurs, se développant en paraplégie.

Devenir

Les animaux seront élevés pour être utilisés lors d’expérience où ils développeront des tumeurs, suite à une injection de cellules ou une greffe d’un fragment de tumeur dans le flanc ou dans la graisse du cou. À la fin de ces expériences les animaux seront euthanasiés pour récupérer la tumeur car il ne serait pas possible de maintenir les animaux en vie tout en respectant leur bien être après avoir retiré la tumeur.

Remplacement

Les analyses in vitro ne sont pas suffisantes pour l’étude des mécanismes de cancérogenèse, notamment la caractérisation des évènements menant au processus métastatique, qui intègre le microenvironnement tumoral, la néovascularisation, et les régulations endocrines. Il est donc très difficile voire impossible de reproduire fidèlement l'ensemble de ces interactions in vitro, dans des modèles de cellules isolées. De plus, les cellules humaines de ce cancer ne poussent pas en culture in vitro. Il est donc encore nécessaire d’utiliser un modèle murin afin de s’approcher au plus des tumeurs humaines.

Réduction

Les paramètres expérimentaux ont été définis selon des études déjà publiées (temps de traitement, doses et voies d’administration). Nous avons déterminé un nombre restreint d’animaux au maximum de sorte à pallier le problème de variation observable in vivo mais également dû à la différence de taille des tumeurs qui peut considérablement altérer le métabolisme intra tumoral, soit 2240 animaux au total sur 5 ans. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques. Afin de réduire le nombre total d'animaux nécessaires pour atteindre une significativité statistique, nous avons utilisé un logiciel pour calculer le nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats significatifs d’un point de vue statistique. Des analyses statistiques seront effectuées sur chacune des expériences.

Raffinement

Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des maisonnettes et morceaux de bois si nécessaire. Les animaux sont hébergés à un maximum de 5 par cage et s'il y a nécessité d'un hébergement individuel dû à une blessure ou une bagarre, il sera placé en cage double séparé d’un congénère par une cloison transparente trouée. Les animaux Nude présentent un phénotype considéré comme dommageable à cause de leur statut immuno-déficient. Ils seront hébergés en zone d’expérimentation dédiée aux animaux immunodéprimés, sur portoirs ventilés et toute manipulation sera faite sous une hotte de change préalablement désinfectée afin de réduire l'impact de leur phénotype et qu'il ne s’exprime en développant une quelconque maladie. La procédure chirurgicale pour les greffes est pratiquée après administration en sous-cutané d’un analgésique 30 minutes avant la chirurgie. Les animaux sont ensuite endormis et maintenu par anesthésie gazeuse sur un tapis chauffant puis surveillés jusqu’à leur réveil. L’état des animaux est observé, au minimum, deux fois par semaine afin de monitorer leur bien-être et d’observer l’apparition des tumeurs. Les souris sont pesées toutes les semaines pour détecter toute variation de poids anormal, ou stagnation malgré l’augmentation du volume tumoral. Dès l’apparition de tumeurs, celles-ci seront mesurées avec un pied à coulisse deux fois par semaine. Les animaux ayant reçu une greffe de pompe osmotique seront monitorés toutes les heures jusqu’à la fin de l’expérimentation. Le transport des animaux entre les sites d'expérimentation se fera en voiture dans des cages de transport adaptée avec litière, cotons compactés et gelée alimentaire adaptée au besoin des animaux. Des points limites adaptés ont été défini au préalable afin de réduire au maximum la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le choix des souris permet d’augmenter les chances de prise tumorale à partir des greffes de cellules, nos lignées cellulaires étant également d’origine murine. Par ailleurs le modèle murin nous permet d’avoir accès à des animaux immunodéficients qui constituent un modèle préclinique particulièrement adapté à la réalisation de greffes de cellules et/ou tumeurs humaines ou murines. Nos lignées cellulaires sont issues de différentes souris, rendant préférable l’utilisation d’une souris receveuse immunodéficiente afin de minimiser le risque de rejet de greffes. Les animaux seront âgés de 7 à 8 semaines (jeunes adultes ayant atteint la maturité ; cet âge correspond à l’âge médian de développement de la maladie chez l’Homme). C'est cet âge qui est le plus souvent rapporté dans la littérature pour ce type d'étude, ce qui nous permettra de confronter nos résultats avec ceux d'autres équipes.

12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir huit prélèvements sanguins à la queue, trente semaines de gavage quotidien et trente semaines d'injections intrapéritonéales bihebdomadaires. S'y ajoutent une chirurgie d'implant d'œstrogène, une injection de cellules tumorales humaines, une ligature vasculaire, une biopsie de la queue à six jours de vie et des transports entre cinq sites pour les séances d'imagerie. Les souris des procédures expérimentales sont tuées pour exploration anatomique et histologique, celles de l'élevage restant en vie pour la reproduction, à l'exception des mâles immunodéficients. Le porteur justifie l'effectif par un calcul de puissance mené "en utilisant un logiciel de statistique", sans autre indication sur la façon dont on parvient à 12 812 individus.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.

Fournir des anticorps à des équipes de recherche publiques ou privées, à raison d'environ 2 milligrammes par animal : 200 lapins New Zealand White sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit quatre injections d'une information génétique codant l'antigène visé, par voie intradermique, intramusculaire ou sous-cutanée, puis subit trois prélèvements sanguins de 25 à 40 minutes après administration orale d'un tranquillisant. Le porteur signale de la fièvre, un inconfort modéré et l'apparition de petites boules au point d'injection, et compte deux lapins par protocole. Tous sont tués en fin de protocole parce que chaque immunisation est spécifique d'un antigène, ce qui interdit de les réutiliser ailleurs.

Objectifs

L’objectif du projet est de générer par une approche d’immunisation génique des anticorps de lapin contre des antigènes d’intérêt pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L’immunisation correspond à un processus d’éducation et d’activation du système immunitaire contre un antigène spécifique. Parmi les différentes approches d’immunisation existantes, l’immunisation génique sera utilisée. Cette approche émergente vise à faire produire transitoirement un antigène en administrant une information génétique codant in situ pour un antigène spécifique, initiant ainsi une réponse immunitaire. Les anticorps obtenus seront utilisés dans des approches allant de la recherche au diagnostic. Le nombre de lapins prévus par protocole permettra d’obtenir une quantité suffisante d’anticorps (environ 2 milligrammes par lapin) pour une utilisation sur plusieurs années.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voire thérapeutiques. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

4 injections en intradermique, en intramusculaire ou en sous-cutanée de l’information génétique codant pour l’antigène d’intérêt (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les prélèvements de sang n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor. Les prélèvements seront réalisés après administration par voie orale d’un tranquillisant à effet vasodilatateur, permettant de prélever le lapin dans de bonnes conditions pour le lapin et l'expérimentateur. L'injection couplée à un agent de transfection peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-agent de transfection). Les manipulations des lapins étant source de stress, une habituation sera mise en œuvre, afin de mettre en place une relation de confiance entre le lapin et les expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant notamment dans la caractérisation de molécules thérapeutiques, a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en œuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d’une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

Immunodéficientes par construction, donc incapables de rejeter les cellules leucémiques humaines qu'on leur transplante, 288 souris vont être utilisées dans ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules prélevées chez des patients atteints de leucémie aiguë lymphoblastique, développent le cancer dans leur moelle osseuse, leur sang et leur rate, puis subissent quatre injections de molécules inhibitrices et un prélèvement de sang à 35 jours, le tout à l'état vigile. Elles sont toutes tuées, en fin de procédure ou à l'atteinte des points limites, pour prélever la moelle et la rate et y doser les cellules leucémiques. Le porteur écrit que le remplacement par des méthodes sans animaux "n'est plus possible à ce stade" du projet, les molécules ayant déjà été testées sur des cellules de patients.

Objectifs

La Leucémie Aiguë Lymphoblastique (LAL) est un cancer du sang. Elle représente environ 1,5 nouveau cas pour 100000 habitants par an, soit environ 1000 nouveaux cas par an en France. Elle se déclare en majorité chez l’enfant de 2 à 5 ans, 75% des malades ont moins de 18 ans, et représente 30% des cancers de l’enfant. Malgré les améliorations du traitement des LAL, les taux de rechute restent élevés (de l’ordre de 25%). Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Dans ce projet, nous transplantations des cellules leucémiques issues de patients dans des souris immunodéficients qui vont développer le cancer afin d’étudier l’effet thérapeutique de nouvelles molécules inhibitrices du cancer.

Bénéfices attendus

En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de leucémies, nous avons identifié de nouveaux composés qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs efficacités, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Le bénéfice attendu du projet concerne donc la découverte de nouvelles molécules inhibitrices et donc de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des Leucémies Aiguës Lymphoblastiques.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à des transplantations de cellules leucémiques. Une seule injection est prévue par souris, durée de 5 minutes par injection. Après la transplantation, des injections des molécules inhibitrices se feront sur animaux vigiles. Quatre injections par souris sont prévues, durée par injection de 5 minutes. Trente-cinq jours après la transplantation, un prélèvement de sang sur animaux vigiles est prévu. Un seul prélèvement par souris, durée du prélèvement de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des cancers (leucémies), avec une multiplication proliférative des cellules leucémiques lymphoblastiques dans la moelle osseuse, le sang et la rate des animaux. Les injections et prélèvements sur animaux vigiles engendreront du stress et de la douleur au point de piqure.

Devenir

La mise à mort sera effectuée sur les animaux soit en fin de procédure, soit lorsque des points limites auront été atteints. Les animaux seront tous mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever des tissus (les moelles osseuses et les rates) afin de doser la présence des cellules leucémiques.

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Les anticorps et les immunoliposomes que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testé in vitro sur des méthodes alternatives ; sur des cellules primaires isolées de patients, ainsi que sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet d’être sûr que ces molécules qui vont être étudiées in vivo sont fonctionnelles sur les cellules cancéreuses. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche par : la limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour les courbes de survie, nous utiliserons des groupes de 7 souris, pour les tests sur la viabilité cellulaire, nous utiliserons des groupes de 5 souris.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. Comme il s’agit d’animaux immunodéficients, un couvercle filtrant sera placé sur toutes les cages. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent quotidiennement à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Après le prélèvement de sang et les injections, nous donnons des soins adéquats, la queue de la souris en légèrement pincée pendant 30 secondes pour éviter tout saignement. Les souris pour lesquelles nous avons prélevé le sang ou injecté sont placées dans une nouvelle cage et dans une litière propre. Une surveillance des animaux sera également réalisée par les expérimentateurs tout le long de la procédure (au minimum 2 fois par semaine puis tous les jours après 35 jours). Nous avons établi les points limites de nos procédures expérimentales. Les procédures d’euthanasie appropriées seront appliquées des lors où un des points limites est observé.

Choix des espèces

Pour qu’un nouveau traitement puisse être étudié en thérapie clinique, il est nécessaire de mener des études précliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules leucémiques provenant de patients que l’on peut transplanter à des souris immunodéficientes. Quelques semaines après l’injection, les cellules leucémiques humaines sont présentes dans la moelle osseuse et la rate des souris qui constituent un modèle d’étude reproduisant la physiopathologie de cette maladie. Ces études ne peuvent se réaliser que dans le modèle murin. L’hématopoïèse et la leucémogenèse des souris (mus musculus) est celle qui se rapproche le plus de l’homme. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules leucémiques.

100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Leur microbiote intestinal est d'abord éliminé par quatre gavages d'une solution purgative à vingt minutes d'intervalle, ce qui provoque des diarrhées, puis remplacé par un microbiote humain administré en trois gavages espacés de trois jours, avant des injections d'anticancéreux et d'antibiotique dans l'abdomen. Elles passent huit jours isolées, cage par cage, pour éviter que les bactéries ne circulent entre elles. Le porteur écrit qu'un placement auprès d'une association de protection animale ne semble pas approprié vu l'état de santé de l'animal, et que le recours aux souris est "indispensable" faute de méthode reproduisant un microbiote humain in vitro.

Objectifs

Le traitement des cancers solides consiste fréquemment en l’utilisation de médicaments cytotoxiques (chimiothérapies) lesquels ciblent l’ADN des cellules cancéreuses, dont la prolifération est rapide. Les très nombreuses bactéries du microbiote digestif du patient sont des cellules à prolifération rapide et il a récemment été montré qu’elles sont aussi la cible des médicaments cytotoxiques. L’altération de l’ADN bactérien par les molécules antimitotiques strese les bactéries et favorise l’émergence de mutants in vitro. Dans le tube digestif des patients traités par anticancéreux, ces mutants résistants pourraient être ensuite sélectionnés par un traitement antibiotique (très fréquemment prescrite en traitement des complications infectieuses en cours de chimiothérapie), et ainsi augmenter le risque d'infections nosocomiales à bactéries résistantes aux antibiotiques, plus difficiles à traiter. Les résultats obtenus jusqu’à présent résultaient d’expérimentations in vitro, qui confrontaient une molécule anticancéreuse à une seule espèce bactérienne, ne tenant compte ni de la composition en nutriments du système digestif, ni de la complexité du microbiote digestif. Il est en effet établi que la communauté bactérienne digestive (composée d’environ 500 espèces) protège de la colonisation par les bactéries résistantes en raison de compétition pour les nutriments chez des individus sains. Dans ce projet, nous souhaitons de manière inédite mesurer l’influence d’un traitement par des molécules anticancéreuses connues pour stresser les bactéries sur l’émergence de bactéries commensales résistantes aux antibiotiques dans le microbiote digestif d’un modèle murin de microbiote humanisé par greffe fécale. Nous souhaitons ainsi démontrer que les traitements anticancéreux favorisent l'apparition de bactéries commensales résistantes aux antibiotiques (objectif principal). Nous explorerons aussi les mécanismes sous-jacents à cette émergence, en mesurant les modifications de la composition et des fonctions biologiques des microbiotes soumis à des doses thérapeutiques d’anticancéreux (objectif secondaire).

Bénéfices attendus

Les données obtenues dans le modèle murin et combinées à celles d’une étude clinique qui sera réalisée en parallèle, permettront de générer de nouvelles hypothèses d’optimisation des stratégies thérapeutiques des cancers chez l’Homme.

Procédures

Tous les animaux auront les interventions suivantes : gavage (4 fois avec une solution purgative à 20 min d’intervalle, 3 gavages de greffon, à 3 jours d’intervalle, durée de gavage < 1 min) ; injections intra-péritonéales (1 fois l’anticancéreux/sérum physiologique, 3 fois l’antibiotique, durée d’injection < 10 s).

Impact sur les animaux

Des nuisances d'intensités légères dues aux injections intra-péritonéales des chimiothérapies/sérum physiologique et de l’antibiotique ainsi que des douleurs au niveau des points d’injection peuvent être attendues. Par ailleurs, même si l’expérience montre que l’injection de molécules anticancéreuses est bien tolérée par les souris, des effets indésirables liés à l’administration d’agents cytotoxiques ne peuvent pas être exclus (nuisances modérées). Le mode d’élimination du microbiote naturel de la souris par une solution purgative (préalable à l’installation du microbiote humain) risque de causer des diarrhées ainsi qu’un inconfort de courte durée (< 30 min) et le gavage oro-gastrique peut induire du stress responsable d’une augmentation de la morbidité et mortalité des souris (évèvements rares, nuisances modérées). Les implantations de microbiote humain ne présentent a priori aucune implication pathologique pour les animaux. En effet, l'introduction d'un microbiote particulier n'induira pas le développement de maladies. Cependant les souris seront étroitement surveillées par un vétérinaire en cas de survenue de diarrhées (nuisance modérée).

Devenir

Les animaux seront mis à mort car il ne sera pas possible de réutiliser ces animaux pour une autre expérimentation en raison de l’administration d’anticancéreux notamment. Un placement de l’animal auprès d’une association de protection animale ne semble pas non plus appropriée en raison de l’état de santé de l’animal qui ne peut être garanti à l’issue de l’expérimentation.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable un microbiote intestinal humain in vitro d’autant plus qu’une partie du microbiote est constitué de bactéries viables mais non cultivables. Les modèles les plus fiables requièrent l’humanisation, partielle et temporaire, du microbiote d’animaux. Actuellement, il est impossible de ne pas recourir à des modèles animaux. Le recours aux souris est donc indispensable pour ce projet qui utilisera le minimum de souris nécessaire en respectant le plus possible le bien-être animal.

Réduction

Cette étude comportera des petits groupes animaux (n=10) pour pouvoir faire des tests statistiques validant les résultats. Un support en biostatistique est apporté par un expert de la spécialité, afin d’optimiser les méthodes expérimentales. L’utilisation de 10 souris par lot permet de lisser les variations interindividuelles. Les souris utilisées pour l’étude pilote des points limites pourront entrer dans les statistiques finales, réduisant ainsi le nombre de souris par lot dans l’étude principale.

Raffinement

L'hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignées de souris. La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (dômes, coton, netlets), et maintien des animaux en groupes de 5 afin d’éviter le stress de l’isolement jusqu’à l’administration des antibiotiques (J8). Ensuite les souris devront impérativement être hébergées individuellement pour éviter les contaminations croisées par les bactéries du microbiote digestif (objet de l’étude). Nous limiterons l’hébergement individuel à 8 jours (entre J6 et J14) pour réduire l’inconfort des souris. Pendant cette période, les animaux garderont un contact visuel et olfatif avec leurs congénères et l’enrichissement dans leur cage sera augmenté et varié. Les conditions d’hébergement seront optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (dômes, coton, netlets), En rapprochant les cages au maximum, nous nous assurerons que les animaux puissent communiquer. Les Souris pourront voir leurs congénères (cages transparentes) et les sentir (pas de couvercle filtrants). L’enrichissement sera renforcé (tubes en Plexiglas, billes de bois à ronger). La durée maximale de leur vie solitaire sera de 8 jours (J6 à J14). Une surveillance attentive est assurée quotidiennement, y compris les week-ends et les jours fériés. Une intervention immédiate et appropriée sera entreprise dès l'apparition de tout signe de détresse selon les scores des points limites fixes dans la procedure.

Choix des espèces

En plus des avantages pratiques liés à l’élevage ainsi qu’à l’expérimentation sur ce modèle animal parmi toutes les possibilités qu’offre l’expérimentation animale, la Souris est celui le plus utilisé dans les études sur le microbiote intestinal en général et plus particulièrement sur la greffe de microbiote fécal. En utilisant des souris, nous pouvons bénéficier des retours d’expérience d’autres équipes et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés pour la mise au point des protocoles. De plus, les résultats obtenus pourront être comparés aux études précédentes et permettre une analyse plus fine. Le protocole que nous allons suivre utilise des souris adultes de 8 semaines. Nous n’avons pas de raison de modifier ce paramètre dans notre étude.

870 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de tumeur par injection sous-cutanée, puis un gavage quotidien pendant deux semaines et des injections intrapéritonéales, quotidiennes ou réparties sur la semaine selon le traitement testé, avant un prélèvement de sang sous anesthésie le jour de sa mise à mort. Le porteur reconnaît que sur les trois semaines de l'expérience, les souris porteuses de tumeurs peuvent perdre du poids et montrer des signes de souffrance, immobilité, isolement, dos voûté, poil terni. L'objet est de comparer plusieurs traitements anti-angiogéniques associés à des immunothérapies afin de "mieux les prescrire", et l'atteinte d'un point limite qui ne peut pas être soulagé conduit à tuer l'animal avant la fin du protocole.

Objectifs

La formation de nouveaux vaisseaux sanguins, est nécessaire au développement tumoral. Les cellules tumorales, ainsi que les cellules du microenvironnement tumoral produisent des facteurs favorisant la formation de nouveaux vaisseaux sanguins au sein de la tumeur. Mais il a été observé que ces facteurs agissaient également sur le système immunitaire de souris porteuses de tumeurs et de patients atteints de cancer, et aboutissaient au blocage de la réponse immunitaire. Or, la réponse immunitaire contre la tumeur est nécessaire à l’élimination de celle-ci. Des traitements ciblant ces facteurs sont utilisés pour traiter certains cancers. Ils réduisent non seulement les vaisseaux sanguins au niveau de la tumeur mais aident également à améliorer la réponse immunitaire contre la tumeur. Ces traitements sont associés à des immunothérapies en particulier dans le cancer du rein résultant en une augmentation des effets anti-tumoraux observés. Plusieurs traitements ciblant la formation des vaisseaux sanguins sont actuellement associés à des immunothérapies sans avoir vraiment d’argument pour privilégier l’un de ces traitements. Il est important de comprendre l’impact de ces traitements sur la réponse immunitaire pour permettre de mieux les prescrire et de proposer de nouveaux traitements aux patients atteints de cancer.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra donc à la fois de faire progresser les connaissances concernant l’interaction entre l’angiogenèse (formation des vaisseaux sanguins) et la réponse immunitaire anti-tumorale et pour les patients atteints de cancer de mieux prescrire les traitements anti-angiogéniques en association avec des immunothérapies. Cette étude pourrait également permettre de proposer de nouvelles combinaisons d’anti-angiogéniques et d’immunothérapies.

Procédures

Injection sous-cutanée 1 fois au début de la procédure sur animaux vigiles ; durée totale du geste : 1-2 min Gavage 1 fois par jour tous les jours sur 2 semaines sur animaux vigiles ; durée totale du geste : 1-2 min Injection intrapéritonéale 1 fois par jour tous les jours sur 2 semaines ou 2 ou 3 fois par semaine selon le traitement administré sur animaux vigiles ; durée totale du geste : 1-2 min Prélèvement de sang sous anesthésie générale le jour de la mise à mort (durée totale environ 10 min puis mise à mort)

Impact sur les animaux

L’injection des cellules tumorales se fait par voie sous-cutanée. L’injection par voie sous-cutanée cause un stress et une douleur légère de courte durée. Le gavage cause un stress et une douleur légère de courte durée. L’injection par voie intra-péritonéale cause un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements de sang peuvent induire des douleurs légères et transitoires. Sur la durée entière de l’expérience (3 semaines environ), les souris avec des tumeurs peuvent perdre du poids ou présenter des signes évocateurs de souffrances tels que des troubles du comportement (immobilité, isolement...) et de l’aspect physique (dos vouté, apparence du poil...).

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes pour l'étude de la réponse immunitaire.

Remplacement

Le microenvironnement tumoral est complexe, les modèles in vitro ne permettent pas de le mimer fidèlement. Les modèles organoïdes ne reproduisent pour l’instant pas la complexité du microenvironnement tumoral. Il est en effet possible de faire se développer de petites sphères de cellules tumorales in vitro, mais il est très difficile de faire se développer des vaisseaux sanguins et d’y ajouter les différentes populations immunitaires. Les cellules immunitaires survivent très mal dans ces conditions. La présence de la tumeur et le développement des vaisseaux sanguins vont modifier le microenvironnement tumoral en induisant en particulier le développement de cellules immunosuppressives. C’est ce développement et l’impact des traitements anti-angiogéniques sur ces processus que nous étudierons dans ce projet, ce qui ne peut donc se faire qu’in vivo. C’est pourquoi l’expérimentation utilisant un modèle animal mimant le plus fidèlement le microenvironnement tumoral est indispensable. En parallèle à ce projet d’expérimentation animale, des expérimentations seront réalisées à partir de prélèvements humains (sanguins ou tumoraux).

Réduction

L'implantation des cellules tumorales est mise au point. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Une grille de score et de points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L'atteinte d'un point limite qui ne pourra être soulagé entrainera une mise à mort anticipée de l'animal avant la fin du protocole.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour le suivi de la croissance tumorale. De nombreux outils sont disponibles pour analyser la réponse immunitaire chez la souris (en particulier des anticorps). D’autre part, les anti-angiogéniques utilisés dans ce protocole ont déjà été utilisés chez la souris et ont montré un impact sur la croissance tumorale. Des souris adultes à partir de 6-8 semaines seront utilisées car c’est à cet âge que le système immunitaire est complètement développé.