Cancers

Greffées avec des cellules de cancer colorectal, puis soumises à trois séances de protonthérapie de vingt minutes sous anesthésie générale et à des injections d'immunothérapie deux fois par semaine pendant trois semaines, 374 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles font l'aller-retour entre deux établissements, l'irradiation par protons n'ayant lieu que sur l'un des deux, et leur tumeur est suivie six mois. Le porteur décrit des douleurs, des infections, une perte de poids et des zones de tissu mort à la surface des tumeurs, tout en écrivant qu'aucun effet secondaire n'est attendu de la protonthérapie ni des immunothérapies. Toutes sont tuées, même guéries, au motif qu'elles pourraient récidiver.

Objectifs

Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2). L'objectif de cette étude est de comparer l'efficacité de deux approches thérapeutiques pour traiter le cancer du côlon en utilisant la protonthérapie et l'immunothérapie. La protonthérapie est une technique de radiothérapie qui utilise des protons (particules chargées) pour cibler de manière précise les cellules cancéreuses, réduisant ainsi les dommages aux tissus sains voisins de la tumeur. L'immunothérapie, utilisant des anticorps vise à stimuler le système immunitaire pour qu'il reconnaisse et détruise les cellules cancéreuses. Les deux traitements seront administrés de deux manières : simultanément (protonthérapie et immunothérapie en même temps) ou de manière séquentielle (d'abord la protonthérapie, puis l'immunothérapie). Notre étude s'intéresse à l'impact de cette combinaison sur l'environnement immunitaire autour de la tumeur. L’étude utilisera des souris, qui recevront des greffes de cellules de côlon cancéreuses. Après les traitements, la croissance du cancer sera suivie pendant six mois pour déterminer quelle association de traitements est la plus efficace. Le but est d’optimiser cette association de protonthérapie et d’immunothérapies pour améliorer le traitement du cancer du côlon.

Bénéfices attendus

Nous voulons identifier la meilleure façon de donner ces traitements : soit en les administrant ensemble, soit en les donnant l'un après l'autre. Le but final est de trouver un traitement antitumoral beaucoup plus efficace. Les résultats de cette recherche pourraient ensuite servir à développer un essai clinique sur la meilleure des deux approches, ce qui pourrait grandement aider à créer de nouvelles stratégies de traitement contre le cancer.

Procédures

EU1 : Un groupe d'animaux subira une injection de 1 min sous anesthésie générale, puis un prélèvement sanguin de 1 min toutes les deux semaines sur animal vigil. EU1 : Un groupe d'animaux subira une injection de 1 min sous anesthésie générale, puis un prélèvement sanguin de 1 min toutes les deux semaines sur animal vigil, puis 1 injection d'une minute 2 fois par semaine sur animal vigil pendant 3 semaines. EU2 : Un groupe d'animaux subira un prélèvement sanguin de 1 min, puis 3 séances d’irradiation sous anesthésie générale d'une durée de 20 minutes chacune. EU2 : Un groupe d'animaux subira un prélèvement sanguin de 1 min, puis 1 injection d'une minute sur animal vigil, suivie par 3 séances d’irradiation sous anesthésie générale d'une durée de 20 minutes chacune.

Impact sur les animaux

Lorsque des cellules cancéreuses sont implantées chez la souris, cela peut causer des douleurs, des infections, une perte de poids temporaire et parfois de la déshydratation. Les tumeurs issues de ces cellules peuvent parfois développer des zones de tissu mort en surface, ce qui a été observé dans d'autres études. Les immunothérapies que nous utiliserons ont déjà été testées et n'ont pas causé d'effets secondaires. Cependant, les injections répétées peuvent engendrer un peu de stress pour les animaux et une inflammation ou une infection au point d’injection. Le transport des souris entre les deux établissements peut induire du stress, mais il est indispensable pour les amener sur le site où elles seront irradiées avec des protons. Quant à la protonthérapie, aucun effet secondaire n'est attendu, hormis le stress des anesthésies répétées.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort si les points limites sont atteints ou à la fin du projet, car aucune d’entre elles ne peut être maintenue en vie. En effet, ayant toutes reçu des injections de cellules cancéreuses, elles présentent un risque et pourraient récidiver, même si elles sont guéries.

Remplacement

Pour étudier l'efficacité des traitements combinés avec la protonthérapie, il est important d'utiliser des animaux car ils ont des fonctions physiologiques complètes, comme dans un corps humain. De plus, pour tester l'association avec des immunothérapies, il est nécessaire d'utiliser des animaux dont le système immunitaire fonctionne bien. La recherche montre que l'effet de la protonthérapie dépend du niveau d'oxygène dans les tissus, qui peut varier, ainsi que de l'environnement autour de la tumeur. Nos premières études sur ce modèle nous ont aidés à choisir les bonnes immunothérapies à associer à la protonthérapie. À ce stade, seule une étude sur des animaux peut évaluer l'impact de la combinaison de ces traitements sur la réponse du système immunitaire. Les études sur des cultures cellulaires, qui utilisent des cellules en dehors d'un organisme, ne peuvent pas reproduire la complexité d’un corps entier, surtout lorsqu’il s’agit d’étudier comment fonctionne le système immunitaire.

Réduction

Les études préliminaires ont contribué à sélectionner les immunothérapies les plus adaptées, ce qui a permis de réduire le nombre de groupes. Le nombre d'animaux requis a été défini de manière à garantir un échantillon suffisant pour effectuer une analyse statistique fiable.

Raffinement

Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés à 5-8 souris par cage, avec de la litière, des frisures de papier kraft, des tubes de coton (nidification), des bâtons et des tunnels. Les procédures expérimentales seront réalisées par des manipulateurs qualifiés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement deux semaines avant de démarrer les procédures. Des anesthésies et des analgésies sont appliquées dès que possible pour éviter tout risque de stress et de souffrance. Pendant les phases où les souris seront anesthésiées, elles seront maintenues au chaud et leurs yeux seront protégés. Au réveil, si nécessaire, une réhydratation sera administrée. Les souris seront pesées régulièrement, leur état de santé général sera soigneusement suivi et la taille des tumeurs sera mesurée trois fois par semaine. Si des signes de détérioration sont détectés, une surveillance renforcée pourra être mise en place (jusqu’à deux fois par jour). Si nécessaire, le responsable du projet ou un vétérinaire interviendra pour ajuster les soins ou, en dernier recours, décider de mettre fin à la souffrance de l’animal. Les injections seront effectuées par du personnel qualifié en utilisant des aiguilles adaptées. Les prélèvements sanguins seront réalisés avec soin pour minimiser les risques d’hématome permettant ainsi une bonne cicatrisation. Lors des transports en voiture, les souris seront placées dans des boîtes de transport équipées de filtres pour éviter toute contamination. Ces boîtes contiendront de la litière, de la nourriture, de l’eau en gel et des éléments pour leur confort afin de réduire leur stress. Si la température extérieure est trop froide, des chaufferettes seront placées sous les boîtes pour maintenir une température agréable.

Choix des espèces

Les souris sont couramment utilisées en laboratoire en raison de leur petite taille, de leur reproduction rapide et de leur faible coût d’élevage comparé à d'autres animaux. Ce choix repose principalement sur leur similitude avec l’homme au niveau de l'anatomie, de la physiologie et de la génétique. L’utilisation de souris adultes est justifiée par le fait qu’à ce stade de leur développement, leurs systèmes biologiques, notamment leur système immunitaire, sont pleinement développés et fonctionnels, permettant ainsi d’étudier de manière réaliste la progression du cancer et la réponse immunitaire aux traitements. Contrairement aux cultures cellulaires, qui offrent une vision restreinte des interactions biologiques, les souris adultes permettent d’observer les mécanismes immunitaires et tumoraux dans un organisme vivant et complexe. Cette approche est essentielle pour mieux comprendre comment le système immunitaire combat les tumeurs et pour tester l'efficacité de thérapies innovantes, telles que les traitements immunitaires, dans un contexte proche de la réalité humaine. De plus, le système immunitaire de la souris est bien documenté et les outils d’analyse disponibles sont parfaitement adaptés à ce modèle animal.

Gavées chaque jour pendant trois semaines, irradiées, greffées par injection dans le sinus de l'œil ou dans la veine de la queue, 1 048 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Un amendement ajoute à 400 d'entre elles une greffe sous-cutanée de cellules tumorales, suivie de deux séances d'imagerie par semaine pendant vingt et un jours et de mesures de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine. Le projet vise à accélérer la reconstitution du système immunitaire après greffe de cellules souches chez des malades du sang, en la ramenant de deux ans à trois mois. Pour ces souris porteuses de tumeurs, le porteur annonce des points limites entraînant une mise à mort anticipée, sans préciser lesquels.

Objectifs

La greffe de cellules souches offre des perspectives de guérison aux patients atteints d’hémopathies malignes (cancer du sang) et à d'autres troubles hématologiques comme les déficits immunitaires. La transplantation avec des cellules souches peut être autologue (provenant des propres cellules du patient) ou allogénique (provenant d’un donneur sain et compatible avec le receveur). La greffe allogénique est limitée par le manque de donneurs compatibles. Lorsqu’un patient est atteint d’un cancer du sang, celui-ci subira des chimiothérapies et/ou irradiation réduisant à néant son système immunitaire avant d’être injecté par des cellules souche. Mais la durée de restauration d’un système immunitaire efficace et fonctionnel après la greffe peut aller jusqu’à deux ans. Durant cette période, le patient n’a pas d’immunité pleinement fonctionnelle et peut contracter de multiples infections représentant une des principales causes de mortalité. Nous proposons de réduire cette période de risque chez les patients en proposant une approche thérapeutique innovante pour accélérer la reconstitution d’un système immunitaire fonctionnel. De cette façon, le délai de reconstitution est réduit à 3 mois (au lieu de deux ans) permettant de réduire les durées d’hospitalisation et les risques d’infections opportunistes. Dans cette perspective, les résultats précliniques doivent être consolidés par des données pharmacologiques dans un modèle murin adulte mimant la condition clinique des patients. La souris représente un modèle pertinent pour l’étude. Ces souris nécessitent un conditionnement par chimiothérapie et/ou irradiation comparable à ceux utilisés chez les patients avant d’être greffés. Ces souris représentent un modèle indispensable afin de tester in vivo les stratégies thérapeutiques proposées dans des conditions similaires à celles utilisées chez les patients. Il s’agit d’une étape indispensable à l’application de nouvelles stratégies innovantes dans les protocoles cliniques. Le projet se déroulera sur deux EU différentes.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et de justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant l’injection de cellules immunitaires pour lutter contre les cancers du sang. L’acquisition de ces données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. De plus, les études de régénération d’un thymus chez les souris âgées peuvent ouvrir la voie à une nouvelle perspective thérapeutique chez les patients souffrant de complications liées au processus de vieillissement, au SIDA, ou aux radiations dues à une catastrophe nucléaire. En effet, dans tous les cas cités, les personnes sont susceptibles de perdre leurs systèmes immunitaires et l’approche thérapeutique proposée permettrait de régénérer de façon rapide et efficace une défense immunitaire fonctionnelle. AMENDEMENT : Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des progéniteurs lymphoïdes qui pourront avoir un éventuel effet antitumoral.

Procédures

Les interventions se limiteront à : 1. Irradiation : L’irradiation durera moins de 5 minutes sur les animaux vigiles. 48 souris seront irradiées 1 fois (EU1). 2. Une seule injection intraveineuse dans le sinus orbitale gauche et/ou droit sous anesthésie générale. L’injection durera 1 minute / animal sur 128 souris (EU1) 3. Une injection intraveineuse dans la veine caudale de la queue des souris vigiles maintenues dans un tube de contention. L’injection durera

Impact sur les animaux

De façon général, les médicaments de chimiothérapies et/ou irradiation peuvent occasionner chez l'animal des symptômes cliniques de type amaigrissement et anémie. Les injections peuvent provoquer une légère douleur localisée et un stress nécessitant une anesthésie générale au préalable. Le gavage peut provoquer un stress et une douleur au niveau de l’œsophage chez l’animal. AMENDEMENT : L’injection sous-cutanée de tumeurs peut entrainer un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. La manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress chez les animaux. Le transport entre les deux animaleries peut également engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérience pour le prélèvement et l’analyse des organes nous permettant de conclure sur l'efficacité du traitement.

Remplacement

Des études de différenciation in vitro ont été réalisées afin d’optimiser les conditions de préparation des cellules à injecter et de s’assurer de leur potentiel à donner des cellules fonctionelles. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus expérimental de mises au point. Les études précliniques de pharmacologie (mode d’administration, effet dose-réponse, efficacité de colonisation du thymus âgés) sont demandées par les autorités règlementaires avant les essais cliniques et ne peuvent pas être substituées ou mimés in vitro.

Réduction

La méthode de chimiothérapie et/ou irradiation la plus adaptée sera préalablement choisie avant les études de dose réponse. Ces études permettront de choisir une condition de greffe optimale et ainsi de diminuer les échecs de greffe. Le modèle animal choisi et le plan expérimental sont inspirés de plusieurs études similaires très bien documentées dans la littérature. Cela confirme la pertinence du modèle expérimental et renforce la validité de nos hypothèses évitant des étapes intermédiaires de mise au point chez l’animal. Le nombre d’animaux par groupe dans les différentes procédures a été calculé selon une méthode fiable et très utilisée dans la littérature permettant de fournir des données statistiquement exploitables. Les expérimentations seront regroupées au maximum et dans la mesure de la faisabilité technique, afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Une partie des animaux pourra ne pas être utilisée en fonction des résultats obtenus pour permettre l’ajustement de la dose des traitements (168 souris potentielles). AMENDEMENT : L’utilisation de l’imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale en évitant la mise à mort sequentielle d’animaux.

Raffinement

Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton de nidification et de rouleaux en carton pour favoriser les cachettes et le jeu. Le nombre de souris sera limiter à 5 animaux par cage. Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de l'étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés. La mise à mort sera précédée par une anesthésie générale pour éviter le stress et la souffrance. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable ou souffrance à l’issue de la greffe des cellules immunitaires au sinus retro-orbital chez les animaux greffés. Toute chimiothérapie et/ou irradiation sera suivie rapidement par une greffe de cellules et toute manifestation de signes de douleur sera scrutée selon les critères de définition des points limites de la présente étude. En cas de signe de souffrance et selon les résultats de la grille préétablie, le personnel qualifié et le responsable scientifique de l’étude pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de la mise à mort de l'animal. AMENDEMENT : Des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Lors du transfert, les souris seront transférées dans des boites de transport avec de l’enrichissement et de la nourriture, les 2 établissements étant sur le même palier. Des mesures analgésiques adaptées seront mises en œuvre avec le vétérinaire pour limiter la douleur.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement du systéme immunitaire. En effet, le système immuno-hématologique murin est très similaire au système humain dans sa fonctionnalité et son développement permettant une extrapolation des résultats obtenus. Cette espèce est facile à élever en animalerie et présente une grande homogénéité génotypique. Souris adultes de 6 à 12 semaines (et souris adultes âgées de plus de 9 mois) car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier son développement.

Avant qu'un implant vasculaire ou un implant libérant un médicament ne soit mis sur le marché, la réglementation impose d'en tester la tolérance sur des animaux non-humains. 90 lapins vont être utilisés pour cela, tous tués à l'issue du suivi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit sous anesthésie générale, en une intervention d'une trentaine de minutes, plusieurs injections de biomatériau dans la peau et dans les muscles, en différents sites, puis jusqu'à huit prélèvements sanguins de 2 mL en vingt-quatre heures sur animal vigile. Le porteur reconnaît des démangeaisons et des douleurs au site d'implantation dues à une inflammation ou à une nécrose locale, et présente le cumul des implants sur un même lapin comme une mesure de réduction.

Objectifs

Les biomatériaux sont des matériaux conçus pour interagir avec les systèmes biologiques, qui participent à la constitution d'un dispositif à visée diagnostique, d’assistance fonctionnelle ou thérapeutique. Ils peuvent être de différente nature (métaux, céramiques, polymères) et remplir des fonctions très variées : valves cardiaques, stents, implants dentaires, lentilles, prothèses, sutures, organes artificiels, etc. Tous doivent répondre à des exigences de biocompatibilité et de performances en lien avec leur utilisation. Dans le cadre de ce projet, on s’intéresse plus particulièrement à de nouveaux biomatériaux polymériques synthétiques ou naturels. Ces matériaux se présentent sous la forme de particules solides ayant une taille de quelques dizaines de microns à quelques millimètres, ou sous forme de gel liquide. Deux utilisations sont à l’étude : agent d’occlusion vasculaire, pour dévasculariser des tumeurs ou des saignements par voie endovasculaire, et vecteur de principe actif pour libérer une substance active sur une période contrôlée (anticancéreux, anti-inflammatoire, analgésique). L’implantation de ces biomatériaux chez l’homme et chez l’animal est réglementairement précédée d’une phase au cours de laquelle ces biomatériaux sont évalués en termes de sécurité pour la personne ou l’animal qui les recevra. Le projet a pour objet l’évaluation de la biocompatibilité et de la libération de principes actifs de ces biomatériaux

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont d’ordre scientifique et technologique. Les études menées doivent permettre de vérifier la bonne tolérance de futurs produits de santé destinés à une utilisation chez l’homme ou chez les animaux, tels que des implants vasculaires ou des implants libérant de façon prolongée des molécules actives telles que des anti-douleurs. Elles correspondent à une obligation réglementaire pour le développement et la mise sur le marché de dispositifs implantables et produits combinant un agent pharmacologique.

Procédures

Les animaux subissent une intervention chirurgicale unique correspondant à l’injection du matériau sous forme de suspension en différents sites (ex. intradermique, intramusculaire). La procédure est réalisée sous anesthésie générale et dure environ 30 min. Des prélèvements sanguins peuvent ensuite être effectués pour doser une molécule libérée par le matériau ou doser un marqueur de l’état de l’animal (maximum 8 prélèvements de 2 mL sur 24h, puis repos sur une semaine). Ces prélèvements sanguins sont réalisés sur l’animal vigile et durent moins de 5 min.

Impact sur les animaux

Outre le stress engendré par la contention et la manipulation des animaux, il est possible que l’implantation des biomatériaux, la réaction de l’organisme à ces matériaux ou les doses de médicament libérées par le matériau engendre des effets indésirables sur les animaux, tels que des démangeaisons et des douleurs au site d’implantation dues à une inflammation ou une nécrose locale (événement très rare). D’une façon générale et moins sévère, l’appétit des animaux peut être diminué pendant les premières 24 à 48 h suivant la procédure d’implantation.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de la période de suivi et des échantillons sont collectés pour analyse microscopique de l’implant et des tissus environnants;

Remplacement

Des études de cytotoxicité sur cultures cellulaires in vitro sont réalisées au préalable dans les étapes précoces du développement du biomatériau. Des essais de libération de principes actifs dans différentes conditions sont également effectués pour les implants chargés. Cependant, les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse d’un organisme entier face à l’administration d’un implant ou d’une molécule thérapeutique. La réaction immunitaire, la pharmacocinétique d’un médicament ne peuvent être reproduites dans des modèles in silico ni dans des modèles in vitro. Ces modèles sont aussi insuffisants pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Le recours à des essais sur animaux vivants apporte des données à la fois supplémentaires et indispensables sur le comportement des biomatériaux dans les tissus vivants;

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est déterminé d’après les recommandations des normes applicables (ex ISO10993-6 préconisant 3 animaux et 10 échantillons d’essais pour une implantation sous-cutanée) afin de pouvoir effectuer des analyses statistiques comparatives. On inclut parmi les implants des biomatériaux contrôle (matériaux référence ou produits commerciaux) dont les effets locaux sont connus. Le nombre total d’animaux est réduit d’une part en posant sur le même animal plusieurs types d’implants, en implantant le même biomatériau au même animal plusieurs fois en différents sites, et en effectuant plusieurs prélèvements sur le même implant au moment de l’analyse histologique.

Raffinement

L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale. Un protocole de suivi des animaux et de prise en charge de la douleur et des traitements analgésiques systématiques et symptomatiques sont mis en place. Des points-limites avec évaluation des paramètres de suivi sont utilisés afin de réduire au maximum la douleur animale. Une visite de minimum une fois par jour est effectuée pour évaluer ces paramètres. Les animaux sont hébergés et suivis dans des conditions qui respectent leur bien-être : température et hygrométrie de l’environnement contrôlés, espace suffisant, présence systématique d’enrichissement du milieu (bâtons de bois à ronger, jouets, plateformes) et alimentaire (foin, persil, carottes), nourriture et eau à volonté

Choix des espèces

• La taille et l’anatomie du lapin permettent d’utiliser le même matériel que dans les plupart des procédures cliniques sur espèces cibles. • La procédure d’implantation est simple et rapide. • Plusieurs biomatériaux et plusieurs sites d’implantation peuvent être étudiés sur le même animal • Les prélèvements sanguins peuvent être répétés sans sacrifice de l’animal, ce qui permet d’obtenir une cinétique plasmatique sur un animal et de réduire le nombre total d’animaux utilisés par rapport à des espèces plus petites. • L’espèce est couramment utilisée et référencée pour ce type de tests, qu’il s’agisse de médicaments ou dispositifs médicaux. Animaux jeunes adultes, âgé de 4 à 12 mois, de 3.5 kg ou plus. Les animaux devront avoir plus de 4 mois pour avoir atteint un poids qui permet d’injecter une plus grande quantité de matériaux que chez des animaux plus jeunes et ainsi diminuer le nombre total d’animaux utilisés. On évite également les animaux plus jeunes car les tissus sont encore en croissance. On limite l’âge maximum à 12 mois car les animaux plus âgés ne sont généralement pas disponibles chez les fournisseurs, ou bien ponctuellement avec des écarts d’âge importants ou des historiques différents, introduisant une hétérogénéité au sein du lot et un risque de biais des résultats. Tous les animaux inclus dans un protocole donné devront être du même âge à +/- 1 mois et du même poids à +/- 500g pour avoir un groupe homogène.

Les souris sont tuées quand le volume de leur tumeur atteint le maximum toléré, ou plus tôt en cas de nécrose ou d'ulcération de la tumeur, de poil hérissé, de dos voûté ou de déshydratation. 1 466 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur système immunitaire est d'abord affaibli par une irradiation à 2 grays ou neuf jours de gavage à la ciclosporine, avant la greffe de cellules tumorales humaines et des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie. Le porteur affirme que la croissance tumorale ne semble pas induire de douleur jusqu'à cette limite, tout en citant la nécrose et l'ulcération parmi les motifs d'arrêt.

Objectifs

Les lymphomes cutanés à cellules T (CTCL) touchent environ 1/100 000 adultes chaque année. On estime que l’incidence a triplé en 30 ans. Des données préliminaires ont démontré que deux traitements (anti-CCR8 et anti-PAR2) sont capables de recruter des cellules immunitaires ce qui permet d’induire la mort des cellules tumorales. Pour aller en phase I d’essai chez l’Homme, nous devons tester l’efficacité de ces traitements sur des souris. Pour cela nous devons avoir une souris qui possède un système immunitaire (nos deux traitements reposent sur une coopération avec le système immunitaire) et qui permet une prise des cellules tumorales dans l’organisme. Nous allons tester 3 modèles de souris différents pour réussir à avoir des souris xénogreffées avec un système immunitaire. Nous testerons les 3 possibilités et nous garderons in fine qu’une seule de ces 3 méthodes en fonction des résultats (prise de la greffe, nombre de cellules immunitaires). Nous testerons ensuite les deux traitements, ciblant CCR8 ou PAR2, sur le modèle le plus efficace. Le but de ce projet étant de prouver, in vivo, l’efficacité de ces nouveaux traitements contre les lymphomes cutanés à cellules T.

Bénéfices attendus

Le projet vise à proposer des immunothérapies innovantes pour les lymphomes cutanés à cellules T). Les lymphomes sont des maladies rares avec un manque de traitements. Ce projet nous permettra de démontrer l’efficacité de ces deux traitements grâce aux cellules immunitaires présentes dans ces souris qui permettent de détruire les cellules tumorales liées aux anticorps que nous testons. Si les résultats sont concluants, et en association avec les résultats de toxicologie, ce projet pourra conduire à un essai de phase I d’essai chez l’Homme.

Procédures

Pour réussir à greffer des cellules tumorales dans des souris, nous allons devoir diminuer le système manière de façon transitoire, pour cela nous irradierons les souris. Pour visualiser l’effet des traitements sur les cellules tumorales, nous allons prélever de façon hebdomadaire 75uL de sang. Pour cela, les souris seront préalablement anesthésiées pour réduire leur douleur.

Impact sur les animaux

Dans notre protocole, soit nous irradions des souris, soit nous injectons de la cyclosporine par gavage pendant 9 jours avant la greffe de cellules tumorales humaines. Les souris seront irradiées une fois 24h ou 48h avant la greffe à 2 grays. Cette faible dose de radiation induit une perte de poids à 7-10 jours avant que les souris reprennent leurs poids initiaux. Selon la littérature, cette dose n’affecterait pas la durée de vie de la souris. Si le protocole d’irradiation ne fonctionne pas, nous allons traiter les souris oralement avec de la cyclosporine. Le gavage se fera sur souris anesthésiées par isoflurane. Il est attendu une perte de poids au jour 5 avant un retour aux poids initiaux à jour 12. Ensuite, nous injecterons des cellules tumorales humaines aux souris en intrapéritonéales. Au bout de 2 semaines nous prévoyons la formation de tumeur. Nous injecterons en intrapéritonéale des cellules immunitaires ce qui provoquera une douleur modérée. Dans toutes les contritions, nous injecterons les deux traitements en intrapéritonéale ce qui provoquera une douleur modérée. Nous arrêterons le protocole quand le volume de leur tumeur sera trop important ou que l’animal présente des signes de mal-être (poil hérissé, dos vouté, déshydratation) ou en cas de nécrose ou d’ulcérisation des tumeurs. Nous prélèverons du sang toutes les semaines pour doser les cellules tumorales circulantes dans le sang. Les souris seront alors anesthésiées et 75uL de sang sera prélevé de façon hebdomadaire.

Devenir

Pour l'ensemble de ces procédures, les souris seront mises à mort quand le volume tumoral attendra le maximum tolérable. À noter, ces modèles de lymphome sont largement documentés et la croissance tumorale ne semble pas induire de douleur pour l'animal jusqu'à cette limite. En cas de non-développement ou de régression de la tumeur, les souris seront conservées pour une durée de 6 semaines après traitement (durée la plus couramment publiée) puis mis à mort pour analyse.

Remplacement

Nous utilisons différentes lignées humaines de lymphomes ainsi que des cellules de patients. Ces cellules nous ont permis d’obtenir nos données préliminaires, et de confirmer l’activité anti-tumorale des anticorps en question. Nous devons donc maintenant tester les deux traitements dans des modèles in vivo. Pour cela nous souhaitons utiliser deux modèles de souris immunodéficientes pour confirmer l’intérêt thérapeutiques des anticorps et leur capacité à induire une forte régression tumorale. Nous pourrons également obtenir par ces modèles, des données pharmacocinétiques (demi-vie de l’anticorps, concentration dans le sang) et des données d’histopathologie. Cela nous permettra ainsi d’aller en essai de phase I chez l’Homme.

Réduction

Pour limiter le nombre de souris utilisées, des tests préliminaires in vitro ont été fait pour démontrer l’effet des deux traitements sur des lignées cellulaires. Ces tests nous ont permis d'évaluer l'efficacité et la toxicité des traitements et de sélectionner les combinaisons les plus prometteuses, réduisant ainsi le nombre de tests nécessaires sur les souris. Pour déterminer le nombre de souris nécessaires, nous avons utilisé des calculs statistiques ce qui nous a permis de déterminer le nombre de souris par groupe par traitement. Ainsi, nous avons besoin d'au moins 11 souris par groupe pour garantir la validité des tests.

Raffinement

Afin de limiter la douleur des animaux, des points limites précis ont été définis (volume maximum de la tumeur, perte de poids...). Aussi, lors des phases d'implantation de cellules tumorales dans des souris, les souris seront anesthésiées sous isoflurane. Nous mettons en place des conditions d'hébergement optimales et des stratégies de raffinement rigoureuses pour améliorer le bien-être des souris. Les cages sont spacieuses et équipées de litières absorbantes et non toxiques, renouvelées régulièrement pour assurer un environnement propre. Nous fournissons également des enrichissements environnementaux, tels que des tunnels, des roues d'exercice, et des matériaux de nidification, pour favoriser les comportements naturels et réduire le stress. Les souris sont maintenues à une température et une humidité contrôlée, avec un cycle lumière/obscurité approprié pour respecter leur rythme circadien. De plus, nous effectuons des évaluations régulières de la santé et du comportement des animaux, et ajustons les conditions d'hébergement en fonction des besoins spécifiques identifiés. Ces pratiques de raffinement sont essentielles pour garantir le bien-être des souris tout en obtenant des résultats expérimentaux fiables et reproductibles.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris pour vérifier l’efficacité des traitements et obtenir des données pharmacocinétiques. Cela permet de voir si les traitements vont diminuer la taille des cellules tumorales. Toutes les études préliminaires ont été mises en place sur des cellules de patients ou des lignées cellulaires. Les souris sont génétiquement modifiées pour être partiellement ou totalement immunodéficientes ce qui permet de greffer de tumeurs humaines, y compris les lymphomes T humains et d'éviter les réactions de rejet de greffes. Nous allons sélectionner des jeunes adultes de 6 à 10 semaines. Ces souris ont fini leur croissance et refléteront au mieux la physiopathologie du lymphome cutané à cellules T dont les tumeurs surviennent principalement chez l'adulte. La standardisation de l'âge permettra une meilleure reproductibilité expérimentale.

Toutes tuées pour prélèvement d'organes et de tissus, 1 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales par injection, jusqu'à soixante injections de traitement, une par jour tant que la tumeur ne régresse pas, et deux séances d'irradiation sous anesthésie générale. Le porteur attend une baisse d'appétit, une réduction de l'activité, des signes de fatigue et des altérations du comportement social liés à la progression des tumeurs et aux effets secondaires. Les bénéfices annoncés, surmonter les limites des thérapies conventionnelles et réduire les effets secondaires chez les patients, restent au conditionnel, et le porteur affirme que suivre les cellules immunitaires dans la tumeur exige un "modèle animal vivant entier".

Objectifs

Nous allons étudier une nouvelle stratégie thérapeutique qui combine une radiothérapie à faible dose (LDRT), un traitement immunologique (inhibiteur de PD-L1) et des traitements qui favorisent ou bloquent un type spécifique de mort cellulaire appelé ferroptose. Le but principal de ce projet est de comprendre si cette combinaison peut être plus efficace pour traiter les tumeurs et déclencher des effets à distance, appelés effets abscopaux, provoqués par la radiothérapie. La LDRT, qui utilise de très faibles doses de rayons (entre 0,5 et 2 Gy par séance), aide à stimuler les défenses immunitaires du corps et à réduire l’inflammation, tout en limitant les effets secondaires sur les tissus sains. Des études récentes montrent que la ferroptose, une forme de mort cellulaire contrôlée qui dépend du fer, peut rendre les cellules tumorales plus sensibles à la radiothérapie et renforcer la réponse immunitaire du corps contre les tumeurs. En combinant cette approche avec un traitement immunologique, nous espérons améliorer les effets bénéfiques, augmenter la survie des souris et comprendre les mécanismes derrière ces résultats.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer les avantages et les effets synergiques possibles de la combinaison de la radiothérapie, de l’immunothérapie et des agents modulant la mort cellulaire programmée (comme des inhibiteurs ou des inducteurs). Cette approche intégrative, appliquée dans un cadre préclinique de traitement multimodal, permettrait de surmonter les limites des thérapies conventionnelles et d’améliorer l’efficacité thérapeutique globale. En modulant les réponses immunitaires dans le microenvironnement tumoral et les mécanismes de mort cellulaire des tumeurs, cette stratégie pourrait augmenter significativement la réponse tumorale globale et offrir des bénéfices supplémentaires, notamment par l’optimisation des effets abscopaux. En outre, cette méthode à multiples facettes promet de générer des approches plus efficaces pour le traitement antitumoral, tout en réduisant les effets secondaires souvent associés aux thérapies actuelles.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de cellules tumorales (n=1, 25 secondes) et à des injections de traitements (tous les jours jusqu’á régression de la tumeur ou fin de la procédure , durée 25 secondes), sous anesthésie locale, au maximum 60 injections. Les animaux vont recevoir une anesthésie générale afin de les placer dans les dispositifs qui permettent la réalisation des irradiations localisées au niveau des tumeurs (n=2, durée 12 minutes en tout).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir un stress léger dû à leur manipulation fréquente par l’expérimentateur, notamment lors des interventions telles que les injections ou l’administration de traitements. Ils peuvent également ressentir de la douleur et un inconfort légers à modérés, provoqués par des injections pour l’implantation des tumeurs, des traitements de radiothérapie ou l’administration de médicaments par injection. Par ailleurs, en raison de la progression des tumeurs ou des effets secondaires des traitements, les animaux peuvent présenter des changements comportementaux légers ou modérés comme une diminution de l’appétit, une réduction de l’activité physique, des signes de fatigue ou des altérations du comportement social.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer l'effet thérapeutique du ciblage de la ferroptose combinés à la radiothérapie et à des immunomofulateurs sur la réponse tumorale. Ceci exige donc un système immunitaire dynamique complet (composé de toutes les cellules immunitaires) en interaction direct avec le stroma tumoral. L’étude du recrutement et de la réponse des cellules immunitaires dans la tumeur ainsi que leurs interactions complexes nécessite le recours à un modèle animal vivant entier et ne peut pas être réalisé in vitro ni in silico.

Réduction

Afin de pouvoir observer des différences qui soient statistiquement interprétables entre les différents groupes de traitements, nous avons besoin d’utiliser des tests statistiques solides et adéquats. Ces tests exigent l’utilisation d’un nombre minimum d’animaux par groupe. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique a priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. De plus, notre expertise dans le domaine de la radiobiologie ainsi que les données de la littérature nous permettent de réduire les conditions expérimentales et donc réduire le nombre d’animaux. Le critère de jugement principal pour le calcul de puissance est la taille tumorale. La randomisation est réalisée de façon à avoir la même moyenne taille tumorale dans chaque groupe de traitement. Nos calculs de puissance statistique nous ont permis de minimiser le nombre d’animaux tout en obtenant des différences significatives.Ces calculs visent à optimiser le nombre d’animaux requis tout en garantissant la pertinence des résultats expérimentaux.

Raffinement

Toutes les manipulations expérimentales seront menées en veillant à adhérer aux normes les plus élevées pour minimiser la douleur et le stress chez les animaux. Une anesthésie générale ou locale adéquate sera utilisée pendant les expériences pour soulager ou éliminer la douleur en particulier lors des injections . Les conditions d'hébérgement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaires. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement. Les points limite précoces seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et des réponses immunitaires pendant le développement tumoral. De plus, pour des raisons de taille, de prix et de temps nous avons choisi cette espèce. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures.

Jusqu'à 15 % d'animaux en plus sont inclus dans chaque étude pour former des groupes homogènes après la chirurgie. 2 800 souris et 350 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée directement dans la prostate sous anesthésie générale, une partie des animaux étant castrée lors d'une seconde intervention, avant des IRM d'une heure sous anesthésie et des traitements répétés par injection ou par voie orale. La société qui porte le projet se présente comme prestataire de services en recherche préclinique et affirme que les méthodes sans animaux ne permettent pas de prévoir l'efficacité d'un candidat médicament, les reconstructions de tumeurs en 3D restant selon elle "marginales".

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer de la prostate est le deuxième plus mortel (environ 398 000 décès en 2022 pour environ 1,5 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer de prostate greffés directement au niveau de la prostate, les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

La greffe de la tumeur est faite sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieure à 30 min). La castration des animaux sera réalisée sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieure à 30 min) L’IRM est réalisée sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1 heure. Les animaux sont traités par injection (intraveineuse ou intrapéritonéale) ou par voie orale. Les traitements seront réalisés de préférence sous anesthésie générale (isoflurane), mais les animaux pourront être immobilisés ponctuellement par une contention douce ou à l’aide d’un tube à contention si l’anesthésie est contre-indiquée. Les animaux seront immobilisés par une contention douce pour mesurer la taille des tumeurs (inférieur à 30 secondes) Les prélèvements de sang (1 minute) seront réalisés de préférence sous anesthésie générale (isoflurane) mais les animaux pourront également être immobilisés ponctuellement par une contention douce ou à l’aide d’un tube à contention si le geste est rapide (inférieur à 30 secondes) et génère moins de stress à l’animal que l’anesthésie générale elle-même.

Impact sur les animaux

- La castration pourra entrainer une douleur et une gêne modérée pendant 1 ou 2 jours - L’évolution de la tumeur pourra entraîner une douleur lié une gêne, un envahissement de la cavité abdominale ou pelvienne, de l’ascite. Il est possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs, du poids et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. -A la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger de 1 à 2 jours. -Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de composés dans différents schémas d’administration qui pourront induire un stress léger. L’injection intraveineuse, intrapéritonéale ou per os pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les produits administrés pour la thérapie peuvent provoquer une perte de poids transitoire.

Devenir

Sachant que les animaux sont porteurs de tumeurs, les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (poids ou imagerie). Le nombre de groupes sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera deux groupes avec tumeur, un groupe contrôle (non traité ou traité avec le véhicule) et un groupe traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés sera testé au cours de la même étude afin de ne pas multiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu de la chirurgie et afin de pouvoir former des groupes homogènes il sera en général nécessaire d’inclure jusqu’à 15% d’animaux surnuméraire. Le nombre d’animaux par groupe se situera entre 5 à 15 animaux. Il s’agit d’un nombre minimum d’animaux permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et nombre/volume de métastases déterminés par imagerie).

Raffinement

Les animaux sont pesés et le volume tumorale est estimé 2 fois/semaine minimum. Ces fréquences seront adaptées en fonction de l’état général des animaux. Un gel nutritif sera placé au fond des cages après les chirurgies et dès l’observation d’une perte de poids >10%. Une réhydration sera mis en place par perfusion sous cutanées et/ou alimentation humide pour les souris si necessaire. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages. Les chirurgies sont réalisées sur matelas chauffants jusqu’au réveil de l’animal. La greffe est réalisée en condition aseptique sous anesthésie générale avec administration préalable d’un analgésique opiacé 30 min avant et un anesthétique local. Les animaux reçoivent une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien en pré-opératoire et post-opératire et des soins adaptés.. Les administrations/prélèvements sont réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible. Certaines administrations sont réalisées avec analgésie préalable (opiacés). Ces administrations/prélèvements sont effectués en suivant les recommandations de la SBEA. Dans le cas de chirurgie sans réveil une anesthésie profonde est réalisée avec administration d’un analgésique local (lidocaïne et bupivacaïne), d’un alpha2 agoniste et d’un opiacé débutée 30min avant la chirurgie. Les principaux points limites sont listés en détail dans les procédures. Si des signes cliniques sont observés, l’animal est mis en observation et un traitement est mis en place si possible. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines minimum lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’induction tumorale. Les animaux adultes pourront mieux supporter le développement tumoral ainsi que les éventuels effets secondaires des composés testés.

Irradiées puis greffées avec des cellules sanguines humaines, 960 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 480 d'entre elles portant deux mini-os humains implantés sous la peau. Pour 240 souris, le protocole prévoit vingt injections, quarante administrations par voie orale et quinze séances d'imagerie sous anesthésie, et 480 subissent un prélèvement de moelle osseuse au fémur. Le porteur écrit qu'il est facile de mesurer la souffrance de la souris et d'y remédier rapidement, et indique dans la même demande que le développement de la leucémie entraîne une paralysie du train arrière. Toutes seront tuées pour prélever moelle osseuse, rate, colonne vertébrale et ossicules.

Objectifs

L’hématopoïèse est un processus finement régulé qui aboutit à la production de toutes les cellules sanguines, à partir de cellules souches et de progéniteurs (CSPH) localisés, chez l’adulte, dans la moelle osseuse. Nous souhaitons tester l’hypothèse selon laquelle certaines anomalies génétiques décrites dans des leucémies de l’enfant peuvent transformer des CSPH humaines normales. Il est établi que les caractéristiques fonctionnelles et d'expression des CSPH changent durant le processus de formation du système sanguin, débutant dans l'embryon et se concluant à l'âge adulte. Nous avons également montré que des facteurs solubles produits notamment par la moelle osseuse participent grandement au développement leucémique. La poursuite de notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes du développement leucémique à partir de cellules humaines sensibles à la transformation, ainsi que d’évaluer plus précisément la contribution de la moelle osseuse, dans ce processus et dans la réponse aux traitements. Pour cela, nous utiliserons des CSPH humaines dans lesquelles sera exprimée génétiquement une fusion entre deux gènes, découverte dans des leucémies de l’enfant et distinctes de celles de l’adulte, nous les transplanterons dans des modèles de souris receveuses permissives aux greffes de cellules d’origine étrangère dans lesquelles nous aurons implanté ou pas des petits fragments de moelle osseuse humaine normale (appelés ossicules). Les objectifs du projet sont les suivants : Objectif 1 : Définir la cellule à l’origine de la transformation leucémique chez l’enfant Nous voulons définir la ou les CSPH humaines sensibles au développement leucémique sous l’influence de la fusion génique d’intérêt, afin de mieux comprendre dans quel type cellulaire la pathologie est initiée. Objectif 2 : Etudier le rôle la moelle osseuse humaine sur le développement leucémique Nous voulons étudier l’influence de moelle osseuse humaine, avec des modèles appelés ossicules, sur le développement de la leucémie induite par l’anomalie génique étudiée. Objectif 3 : Etudier le rôle de la moelle osseuse humaine sur la réponse à des traitements Nous étudierons l’influence des modèles, appelés ossicules, sur la réponse des cellules leucémiques à une thérapie ciblée identifiée récemment.

Bénéfices attendus

Les leucémies pédiatriques liées à une anomalie génétique spécifique touchent surtout les très jeunes patients, et malheureusement, il n'existe pas encore de traitement ciblé pour ces cas. Dans nos recherches précédentes, nous avons découvert que les cellules sanguines fœtales sont plus sensibles au développement de la leucémie que des cellules sanguines post-natales, et que l'environnement autour de ces cellules joue un rôle important dans ce processus. Cependant, de nombreuses questions sur la manière dont cette transformation se produit restent encore sans réponse. Le projet que nous souhaitons développer vise à mieux comprendre cette maladie. Les modèles que nous proposons sont essentiels pour découvrir comment la leucémie se développe à partir de cellules humaines et permettront de mieux refléter la complexité de cette maladie dans un organisme vivant, comme la souris. Dans le cas de la leucémie associée à l’anomalie génétique étudiée, notre projet pourrait également aider à mettre au point et tester de nouveaux traitements spécifiques qui doivent d'abord être validés sur des modèles précliniques avant de pouvoir être proposés aux patients. À plus long terme, ces modèles pourraient également être adaptés pour étudier d'autres maladies infantiles, notamment des leucémies liées à d'autres anomalies génétiques. Cela permettrait de proposer de nouveaux protocoles de traitement, essentiels pour ces différentes maladies infantiles.

Procédures

1 Irradiation en vigile : 2min, 960 animaux 1 Injection de cellules humaines sous anesthésie : 2min, 960 animaux 1 Prélèvement de moelle osseuse sous anesthésie : 5min, 480 animaux 1 Prélèvement de sang sous anesthésie : 3 min, 720 animaux 1 Injection de cellules humaines qui constitueront les mini-os humanisés sous anesthésie : 5min, 480 animaux 20 Injections de molécules sur animal vigil : 1min, 240 animaux 2x20 Traitements par la voie orale sur animal vigil : 2min, 240 animaux 15 Suivis du traitement sous anesthésie par bioluminescence : 10min, 240 animaux

Impact sur les animaux

-L'irradiation avant la transplantation provoque une anémie qui dure environ dix jours. - Les prélèvements de sang et de moelle osseuse à l’os du fémur peuvent causer des douleurs localisées, précocement après que le geste ait été fait. -Les mini-os humanisés implantés sous la peau des souris peuvent causer une gêne localisée. -le suivi de la progression de la maladie par bioluminescence peut entrainer un stress -les traitements par gavage ou injection sous-cutanée peuvent entrainer stress et inconfort/douleur localisé (point d’injection) -le développement de la leucémie entraine une paralysie du train-arrière.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées en fin de procédures. Les tissus/organes hématopoïétiques (moelle osseuse, rate, colonne vertébrale, ossicules) seront prélevés et les cellules qui y sont contenues seront soumises à une caractérisation qui nous permettra d’identifier la quantité et la qualité des cellules leucémiques présentes dans les organes en question. Cela permettra de comparer les différents groupes de souris afin de pouvoir tirer les conclusions suite à nos observations.

Remplacement

Dans le cadre de l’étude des leucémies, l’expérimentation sur des animaux, comme les rongeurs, est essentielle pour comprendre comment la maladie se développe dans un patient. Les méthodes de culture cellulaires (in vitro) ne permettent pas de reproduire fidèlement tous les mécanismes qui se ont lieu dans un corps vivant. Les modèles animaux, et notamment les souris, sont les seuls à pouvoir imiter fidèlement les processus complexes comme la migration et le développement des cellules sanguines, qu’elles soient saines ou malades. Bien que nous utilisions des systèmes de culture en laboratoire aussi souvent que possible, ils ne reproduisent pas toutes les étapes du développement de la leucémie, que ce soit dans la moelle osseuse ou dans d'autres organes. En plus, ces modèles de culture ne démontrent pas le processus complet de transformation en leucémie, contrairement aux modèles vivants (in vivo). C'est pourquoi les expériences sur les rongeurs sont indispensables et complètent les stratégies de culture en laboratoire. En plus de cela, ce projet vise à proposer un traitement qui devra être testé sur ces modèles animaux avant de pouvoir être utilisé chez les patients.

Réduction

Nous avons à cœur de réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Les groupes d’étude comprendront entre 8 et 10 souris par groupe. Chaque expérience sera réalisée 2 ou 3 fois de manière indépendante afin d’obtenir des résultats fiables d’un point de vue statistique. Si les résultats de deux expériences sont statistiquement significatifs, nous pourrons décider de ne pas réaliser une troisième expérience. Lorsque nous devons tester plusieurs traitements en suivant la même procédure, nous réaliserons les expériences en même temps pour comparer tous les groupes avec un seul groupe témoin. Cela permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’utilisation du modèle d’ossicules (mini-os humanisés) permet aussi de limiter le nombre d’animaux. Chaque souris portera 2 ossicules (un sur chaque flanc), ce qui nous permettra d’augmenter le nombre d’ossicules testés sans avoir besoin d’utiliser plus de souris.

Raffinement

Les animaux utilisés pour atteindre les objectifs du projet seront régulièrement surveillés par l’équipe et le personnel animalier afin de repérer tout changement de comportement et éviter autant que possible toute douleur, souffrance ou stress inutile. Afin d’améliorer le bien-être des souris vis-à-vis des potentiels souffrances et angoisses liées aux manipulations expérimentales, les souris affaiblies seront supplémentées avec de l’hydrogel et de la nourriture humidifiée déposée directement dans la cage en plus de leurs nids en coton et des tubes en cartons pour plus de confort. Un analgésique sera donné lors du prélèvement de sang et de moelle osseuse réalisé pour apprécier le développement leucémique. Les injections de cellules et les prélèvements sanguins et médullaires seront réalisés sous anesthésie générale. Des critères, appelés points limites, seront définis pour assurer le bien-être des animaux et limiter leurs souffrances en cas de progression irréversible de la maladie.

Choix des espèces

La souris est un petit mammifère facile à élever et à reproduire en captivité. Comme sa génétique et son comportement sont bien connus, il est facile de mesurer son bien-être, sa souffrance et son stress et d’y remédier rapidement. Cela en fait un excellent modèle pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. De plus, la souris partage 99% de ses gènes avec l’être humain, ce qui permet de transposer plus facilement les résultats obtenus chez la souris aux pathologies humaines, aidant ainsi à améliorer leur compréhension et leur traitement. Enfin, les souris reproduisent les étapes principales du développement des leucémies, ce qui en font de bons modèles d’étude, en particulier de traitements. Les souris que nous utiliserons dans ce projet sont des souris immunodéficientes (qui n’ont pas de système immunitaire fonctionnel), qui peuvent recevoir des greffes de cellules sanguines humaines, qu’elles soient normales ou leucémiques. Ces souris, élevées dans des conditions spécifiques, ne présentent pas les défauts associés à leur immunodéficience. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, qui, selon les recherches de notre laboratoire, montrent une excellente capacité à accepter des greffes après injection, que ce soit pour des cellules normales ou malades.

Greffés d'une tumeur sous la peau, dans la peau ou dans le coussinet graisseux mammaire, gavés jusqu'à cinq fois par jour et saignés jusqu'à quatre fois par jour à la veine saphène, 88 000 souris et 500 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme réduire le nombre de manipulations au strict nécessaire, dans un projet dimensionné pour environ 170 études par an pendant cinq ans, à la demande de clients. Les animaux dont la tumeur ne pousse pas sont utilisés pour entraîner le personnel au gavage et aux prélèvements sanguins, ou tués pour fournir des organes témoins. Ceux qui passent d'une procédure à la suivante sont tués à la fin de la seconde, les autres à la fin de la leur.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer de nouveaux traitements dans des modèles ectopiques (i.e. injection de cellules cancéreuses à un site ne correspondant pas à celui de la tumeur d’origine) chez la souris ou le rat pour les cancers dont les besoins sont non satisfaits. Ce projet comprend quatre procédures : -Développement de modèles ectopiques - Evaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie (PK/PD) d’une molécule d’intérêt chez le rongeur porteur de tumeur - Evaluation de la tolérabilité d’une molécule d’intérêt après administration unique ou répétée chez le rongeur porteur de tumeur - Evaluation de l’efficacité d’une molécule d’intérêt sur des modèles ectopiques chez le rongeur. La première étape qui permettra par la suite d’évaluer une nouvelle molécule d’intérêt thérapeutique est le développement de modèles ectopiques. La greffe sera réalisée sur des animaux immunodéprimés pour des cellules tumorales d’origine humaine (xénogreffe) ou sur des animaux immunocompétents de même espèce que la lignée tumorale (modèles syngéniques). En fonction des cellules injectées, les greffes seront réalisées par voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire. Trois types d’études pourront ensuite être réalisées sur ces souris/rats porteurs de tumeurs décrites ci-dessous. L’évaluation de la PK/PD est réalisée en analysant les concentrations sanguines et/ou tissulaires d’un composé ainsi que les niveaux d’expression/activation de biomarqueurs associés après administration unique ou répétée du composé. Le modèle PK/PD établi est indispensable pour la détermination des doses et fréquence à utiliser dans les études d’efficacité, de toxicologie réglementaire et il permet également de prédire les doses à administrer lors des phases de preuve de concept en développement clinique chez l’Homme. L’évaluation de la tolérabilité d’un composé est réalisée à des doses thérapeutiques déterminées par des études de pharmacocinétique sur souris naïves et des études PK/PD effectuées en amont. Elle consiste en l’administration unique ou répétée d’un composé et à l’observation de signes cliniques des animaux pour déterminer la/les doses et/ou la fréquence d’administration qui pourront être utilisées dans les études consécutives.

Bénéfices attendus

A l’origine de plus de 10 millions de décès par an, le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde. Les principaux traitements aujourd’hui consistent en la chirurgie et la chimiothérapie, souvent associées à une radiothérapie. Malgré ces options thérapeutiques, le nombre important de décès par an souligne l’inefficacité de ces traitements et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans le domaine de l’oncologie. A long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Greffe des cellules tumorales à l’aide d’une aiguille réalisées par voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire sous anesthésie gazeuse : durée 30 secondes 1 seule fois pendant l’étude. Dans le cas de l’utilisation d’un trocart, sous anesthésie gazeuse : durée 30 sec 1 seule fois pendant l’étude. • Mesure des tumeurs : o Avec le pied à coulisse : durée 30 secondes 2 à 3 fois par semaine sur animaux vigiles. o Avec l’appareil de bioluminescence : durée 10 minutes sous anesthésie gazeuse maximum 3 fois par semaine. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique o par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique, (max5xjour), intrapéritonéale (max4xjour), sous-cutanée (max4xjour), intramusculaire (max2xjour), intratumorale (1 injection/jour), ou intradermique (1 injection/jour) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, d’un seul traitement à plusieurs semaines de traitement selon la procédure réalisée. o par voie intraveineuse à la veine caudale : durée 2 minutes sur animaux vigiles, maximum 2 fois par jour pendant 3-4 jours (dépendant des veines de l’animal). L’installation d’un cathéter sera nécessaire pour des administrations plus longues. • Traitement par irraidation pendant maximum 5 min une seule fois pendant l'étude • Administration de luciférine pour imagerie de bioluminescence o par voie intrapéritonéale (max3xsemaine) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, maximum 3 fois par semaine pendant une à plusieurs semaines selon la procédure réalisée. Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang sur animal vigile o via la veine caudale : durée 30 secondes (max 2xjour) o via la veine saphène : durée 30 secondes (max 4xjour) o via la veine mandibulaire : durée 30 secondes (max 2xjour) o via amputation unique de la queue (coupe 1 à 2 mm sur l’extrémité non innervée de la queue) durée 1 min (max 10xjour). • Prélèvements de sang sur animal anesthésié à l’isoflurane o via la veine sublinguale (max 1x/jour).

Impact sur les animaux

Nuisances des animaux : pour chacune des procédures, les animaux seront injectés avec des cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (sévérité légère) et tatoués (sévérité légère). Certains modèles tumoraux peuvent nécroser, d’où l’intérêt de choisir un site d’injection de cellules tumorales adapté (voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire) grâce à la procédure de développement de modèles pour éviter ces nuisances aux animaux. Pour les procédures de PK/PD, de tolérabilité et d'efficacité, les animaux sont traités avec des molécules pendant quelques jours à plusieurs semaines qui peuvent parfois être mal tolérées notamment durant les études de tolérabilité (dose du composé importante) et d’efficacité (traitement à long terme). Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure de la croissance tumorale. Effets indésirables : ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations. Les animaux sont observés quotidiennement à minima et jusqu’à 2 fois par jour lors des traitements pour réagir au plus vite à l’inconfort des animaux et y apporter des solutions (arrêt des traitements, réhydratation, raffinement).

Devenir

Les animaux utilisés pour la procédure de développement de modèles peuvent être réutilisés pour effectuer une étude de PK/PD ou de tolérabilité puis seront mis à mort à la fin de cette 2ème procédure. Les animaux utilisés pour une étude de tolérabilité peuvent être réutilisés pour effectuer une étude de PK/PD ou d'efficacité et seront mis à mort à la fin de cette 2ème procédure. Pour les procédures de PK/PD et d'efficacité, ainsi que pour les animaux des procédures développement de modèles et de tolérabilité non-réutilisés, les animaux seront mis à mort à l’issue de leur procédure respective. Quelque soit la procédure, des prélèvements de sang et de tissus pourront être réalisés et feront l’objet d’analyses ultérieures (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques …).

Remplacement

Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basé sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive avec une multitude de tests in silico et in vitro. Ces modèles in vitro sont utilisés autant que possible en amont pour limiter le recours à l’animal. Cependant, ils ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorales. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive avec une multitude de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme) sans recours à l’animal. En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d'observer une activité sur les modèles qui font l’objet des procédures de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’études prévues pour ce projet se base sur l’analyse rétrospective des trois dernières années, nous estimons que pour les 5 ans de ce projet, 170 études environ seront conduites par an. Les données de mise en place des modèles obtenus dans la procédure développement de modèle" permettront de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de PK/PD, de tolérabilité ou d'efficacité. Une analyse de puissance statistique sera appliquée pour la détermination de la taille des groupes expérimentaux. Des analyses rétrospectives seront conduites pour s'assurer de la bonne adéquation du nombre d'animaux par groupe et de la puissance statistique recherchée. Les animaux qui sont exclus des études pour des raisons de taille tumorale trop petite ou trop grande sont toujours utilisés pour permettre d’avoir soit des tissus témoins pour la détermination du pourcentage de liaison aspécifique ou de la concentration des molécules d’intérêt dans les tumeurs. Si des tumeurs n’ont pas du tout poussé, les animaux pourront être utilisés pour des entraînements à différents gestes techniques tels que le gavage ou les prélèvements sanguins ou pour récupérer des matrices blanches (organes, sang, plasma). De plus les procédures sont interconnectées et les animaux peuvent être utilisés pour plusieurs procédures limitant de ce fait l’utilisation d’animaux. Les animaux de la procédure "développement de modèle" peuvent être inclus dans une procédure de PK/PD ou de tolérabilité. Les animaux inclus dans une procédure de tolérabilité pourront également être inclus dans une étude de PK/PD ou d’efficacité.

Raffinement

Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée des procédures. En cas d’apparition de signe de douleur, une injection unique en sous-cutanée d'analgésique sera réalisée. Une fiche de suivi des signes cliniques sera mise en place. Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées et d’appliquer des points d’arrêt anticipés les plus précoces possibles. Ainsi, à partir d’un total de 4, un suivi vétérinaire sera mis en place avec une surveillance renforcée des animaux et des mesures complémentaires seront prises telles qu’aliment humide au sol ou ajout d’enrichissement, et à partir d’un total de 6, l’animal sera euthanasié. De plus, si un animal atteint un des points limite établis, il sera immédiatement euthanasié. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles ectopiques de cancer chez la souris et le rat existent dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références, etc…) Les données de la littérature indiquent clairement que les rats et les souris adultes représentent des modèles fiables pour l'évaluation de l'efficacité de composés dans le domaine du cancer, nous utiliserons donc des animaux adultes.

Pour créer des modèles vivants de gliomes pédiatriques de la ligne médiane, des tumeurs que le porteur décrit comme universellement incurables, 3 450 souris immunodéprimées de cinq à huit semaines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans le cerveau, sous anesthésie générale, une greffe stéréotaxique issue d'une biopsie tumorale d'enfant, puis jusqu'à 52 séances d'imagerie hebdomadaires, soit un an de suivi. Les tumeurs mettent quatre à douze mois à se développer et peuvent provoquer ataxie, perte d'appétit, prostration et perte d'équilibre, exceptionnellement une exorbitation des yeux. La procédure s'arrête quand la tumeur émet un seuil de lumière prédéfini, et toutes les souris sont tuées pour analyse de leur cerveau.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de mettre au point des modèles in vivo de tumeurs universellement incurables à ce jour ainsi que de tumeurs chimiorésistantes et responsables de nombreuses rechutes chez le patient. Ces tumeurs sont très différentes des gliomes de l’adulte et des tumeurs corticales de l’enfant et il est nécessaire de pouvoir les étudier plus spécifiquement. Compte tenu de la rareté du matériel primaire disponible et de l’absence de modèles pertinents de ces deux maladies, nous prévoyons de développer des modèles in vivo en réalisant des greffes intracérébrales à partir de biopsies tumorales de patients au diagnostic et/ou à la rechute. Récemment, notre groupe a pu développer les premiers modèles in vivo au monde de gliomes diffus de la ligne médiane à partir de biopsie de patient au diagnostic. Cependant, il reste crucial de renforcer la diversité génétique des modèles ainsi que d’élargir à d’autres types cancéreux afin de généraliser nos hypothèses et de consolider les statistiques sur une plus large cohorte. Afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux, nous développons en parallèle des cultures cellulaires primaires permettant dans un premier temps d’étudier à la fois la biologie de la tumeur mais également sa réponse à de nouvelles thérapies anticancéreuses. Néanmoins, ces modèles alternatifs ne nous permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement (tumeurs cérébrales infiltrantes et métastatiques) ou encore la réponse aux traitements qui implique souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, immunitaire…).

Bénéfices attendus

Obtenir un modèle murin génétiquement modifié de gliomes diffus de la ligne médiane permettra de mieux comprendre les étapes précoces du développement de ces tumeurs, pour le moment encore inconnu. Cette compréhension permettra d’identifier les modifications précoces menant à l’apparition de cellules tumorales permettant l’exploration de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Greffe stéréotaxique sous anesthésie générale et analgésie adatée: 1 par animal, durée entre 1 et 5 minutes. Séance d'imagerie sous anesthésie générale : une fois par semaine, durée 1-5 minutes, nombre maximal : 52 (correspondant à un an de suivi au maximum).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liées à la greffe d'une tumeur dans le cerveau. La greffe, sous anesthésie générale occasionnera une petite plaie sur le dessus du crâne, qui entraînera une gêne légère et temporaire. Par la suite, on pourra éventuellement observer des symptômes neurologiques qui sont fréquemment observés en présence d’un volume tumoral conséquent (ataxie), perte d'appétit et donc perte de poids, prostration des animaux, perte d’équilibre. L’augmentation de la pression intracrânienne peut exceptionnellement entraîner des symptômes tels que l'exorbitation des yeux, l'atteinte de l’oreille interne qui entraineraient l'arrêt immédiat de la procédure.

Devenir

Les animaux ayant tous les greffes de tumeurs dans le cerveau, ils devront être euthansiés à la fin de la procédure pour examens et analyses sur leur cerveau.

Remplacement

Une singularité des gliomes de la ligne médiane (composée du thalamus, du pont et de la moelle épinière), résulte dans leur phénotype systématique d’infiltration des structures de la ligne médiane dans un premier temps, puis plus largement de tout le cerveau au décours de la maladie. Ces particularités résultent des interactions des cellules tumorales avec leur environnement qui ne peuvent être appréhendées que dans des modèles vivo, où la variété et complexité du microenvironnement tumoral peut être reproduite. De plus, la barrière hématoencéphalique, qui isole le cerveau du reste de l’organisme, est une limitation très importante dans le traitement de cette maladie (barrière non rompue) et il est nécessaire de développer des modèles de greffes afin d’évaluer une nouvelle médication avant les phases cliniques. Les molécules médicamenteuses potentiellement identifiées par la suite seront testées sur des modèles de cultures cellulaires afin de limiter leur toxicité lors du traitement des animaux, en déterminant des concentrations et une posologie adéquate. Une des perspectives de ce projet, est également d’étudier le système immunitaire dans toute sa complexité, ce qui n'est possible que dans un animal vivant.

Réduction

Pour la primogreffe (P0), nous voulons uniquement savoir si la biopsie est tumorigène ou non. Pour cela, nous nous contenterons donc de ne greffer que 3 animaux par tumeur afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé (réponse : oui/non). Si après la primogreffe, les souris présentent des tumeurs, alors nous réaliserons 4 passages successifs afin d’avoir suffisamment de matériel pour stabiliser le modèle, stocker la tumeur et réaliser des tests histologiques et moléculaires sur ces modèles à chaque passage : 1 souris servira au passage, 1 souris pour l’analyse histologique, 1 souris pour l’analyse moléculaire et 2 souris pour la cryoconservation du modèle.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale et recevront des anti-douleurs par voie sous cutanée dès l’arrivée des premiers symptômes neurologiques ou de la douleur.. Les animaux seront examinés quotidiennement. Ils seront stabulés en groupes sociaux avec un enrichissement environnemental. Les animaux auront des examens en imagerie chaque semaine, et la détection éventuelle de tumeurs emettant un seuil de lumière prédéfini conduira à l'arrêt de la procédure pour ces aimaux. Des points limites précoces et précis ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

L'utilisation de modèles de souris immunodéprimées permet de favoriser la prise de greffe de tumeurs et de lignées cellulaires cancéreuses humaines. Les animaux utilisés auront entre 5 et 8 semaines correspondant à l’âge du jeune adulte. Nos études préalables nous ont montrées qu'il n'y avait pas différences de prise de greffe chez des animaux juste sevrés (3 semaines) et des animaux adultes (plus de 6 semaines). Cependant, le développement de la tumeur étant lent (entre 4 et 12 mois selon les modèles), nous utiliserons des animaux jeunes afin de ne pas avoir un état général dégradé qui pourrait être dû à la dégénérescence du modèle en fin de protocole.