Cancers

Greffées de cellules d'adénocarcinome colorectal humain sous anesthésie, 80 souris mâles portent une tumeur pendant deux à trois semaines, traitées tous les trois jours et passées deux à trois fois en microtomographie à rayons X. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tumeurs. Le porteur écrit qu'aucune nuisance ni douleur n'est prévisible puisque les animaux sont anesthésiés pendant les manipulations puis tués en fin de protocole, tout en listant la perte de poids, le stress et la perte de mobilité parmi les effets à surveiller. Le projet transpose au cancer colorectal des peptides déjà testés sur un modèle de mélanome, jugé moins utile parce que ce cancer est plus rare et de meilleur pronostic.

Objectifs

Avec plus de 43000 personnes touchées par an en France, le cancer colorectal se situe au troisième rang des cancers les plus fréquents chez l’homme et au deuxième rang chez la femme. Il constitue la deuxième cause de décès par cancer et représente près de 12 % de l’ensemble des décès par cancer, en particulier chez les 65 ans et plus. Le choix du traitement du cancer colorectal dépend du stade, de sa localisation et de l'état général du patient. Bien que la  chirurgie  soit utilisée en première ligne, la chimiothérapie peut être prescrite à tous les stades de la maladie, et plus récemment, des thérapies ciblées sont utilisées en association avec la chimiothérapie . Malheureusement tous les patients ne répondent pas à ces thérapies et des phénomènes de résistance se développent très souvent. La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du cancer colorectal demeure donc un défi majeur.

Bénéfices attendus

Historiquement, nos premiers résultats sur les effets anti-cancéreux de nos peptides ont été obtenus sur un modèle de mélanome, en association avec un laboratoire de dermatologie. Toutefois, en France, le mélanome cutané se situe au 9ème rang des cancers tous sexes confondus et ne représente que 2 à 3 % de l’ensemble des cancers. C’est également un cancer de bon pronostic avec une survie à 5 ans supérieure à 80% dans le cas du mélanome de stade I, représentant lui-même 84% des cancers diagnostiqués. A l’heure actuelle, les traitements sont souvent efficaces depuis les progrès de l’immunothérapie. Le cancer colorectal est, quant à lui, le troisième cancer le plus fréquent, tous sexes confondus, en France où il représente la deuxième cause de décès par cancer. Les traitements peuvent être très lourds avec de nombreux effets secondaires. Il apparaît donc important de cibler de nouvelles approches thérapeutiques, c’est pourquoi nous souhaitons vérifier que l’activité anti-tumorale de notre molécule et de ses analogues, observée in vivo dans un modèle de mélanome murin, est transposable au cancer colorectal. En effet, les résultats préliminaires obtenus dans un modèle in vitro de tumeur 3D sont très prometteurs.

Procédures

Pour nos expériences, les animaux seront sous anesthésie générale (quelques minutes) pour l'injection des cellules de cancer colorectal. 7 jours après, les animaux seront traités tous les 3 jours (quelques secondes par animal) pendant 2 à 3 semaines. Le suivi longitudinal (imagerie 3D par microtomographie rayons X) des animaux se fera sous anesthésie (10 à 15 minutes) à raison de 2 à 3 fois au cours des 2 dernières semaines du projet.

Impact sur les animaux

Pas de nuisances ou critère prévisible de douleur dans la mesure ou les animaux seront sous anesthésie générale durant les manipulations puis euthanasiés en fin de protocole. Douleur potentielle modérée et passagère (piqure) à l'injection des molécules. Une surveillance quotidienne du développement des tumeurs permettra de s'assurer du bien-être des animaux (absence de gêne à la locomotion ou de signes visibles de souffrance). Les effets indésirables surveillés pourraient être : perte de poids, stress, perte mobilité.

Devenir

Pour chaque procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des expérimentations, afin de prélever et d'analyser les tumeurs.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans la continuité d’études réalisées in silico, in vitro et ex vivo. Les peptides testés ont fait l’objet d’une étude in silico afin de sélectionner les meilleurs candidats potentiels. Ces candidats ont ensuite été validés par des études in vitro (migration et invasion cellulaire, modèles 3D multicellulaires) et ex vivo (anneaux aortiques) et nous testerons dans ce projet les peptides ayant donnés les meilleures réponses. Ce projet vise donc à valider in vivo les effets observés. Aucune méthode de substitution n’existe actuellement pour mesurer les effets sur la croissance tumorale.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les peptides candidats ont été sélectionnés sur des modèles de sphéroïdes 3D. Ainsi seuls les peptides à fort potentiel seront testés. Ainsi l’étude considérée dans sa globalité est susceptible de concerner un nombre maximal de 80 souris mâles, réparties en 4 groupes et 2 procédures : 1 groupe contrôle, 3 groupes de test. Afin d’obtenir des résultats significativement robustes, un nombre maximal de 10 souris par groupe sera utilisé. L’analyse statistique se fera avec le test U de Mann-Whitney bidirectionnel.

Raffinement

Préalablement à la mise en place des expérimentations, les animaux seront hébergés dans des cages. L'eau et la nourriture seront mis à disposition ad libitum et la litière changée régulièrement. Afin de limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies de divers équipements d'activité (tubes de jeu, niche, papier...). À leur arrivée dans l’animalerie et avant toute manipulation, les souris subiront une phase d’acclimatation aux conditions d’hébergement du laboratoire durant une période de 7 jours. Le suivi du protocole et de sa réalisation sera effectué par les responsables du projet en concertation avec la structure en charge du Bien-être animal et les animaux seront anesthésiés lors des procédures pouvant apporter un stress (jusqu'à l'euthanasie), de manière à n'induire aucune souffrance. Durant la phase d’anesthésie, si une détérioration irréversible de l'état de l'animal est observée (accélération anormale du rythme cardiaque ou suffocation ou hypothermie importante), alors l'animal sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle choisi est la souris. Il s’agit du modèle de référence pour l’étude de la croissance tumorale.

Irradiées 90 secondes sans anesthésie, 1 860 souris dépourvues de système immunitaire reçoivent le lendemain des cellules de leucémie humaine, par la veine de la queue ou directement dans la moelle osseuse de la patte. Chacune peut ensuite subir jusqu'à dix ponctions de moelle osseuse et douze prélèvements de sang à la joue, plus un gavage ou une injection quotidiens par cycles de 28 jours répétés jusqu'à trois fois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie ces procédures de "rapides, non invasives et maîtrisées", tout en décrivant la prolifération leucémique comme une source de souffrance annoncée par une perte de poids et des diarrhées. Toutes sont tuées, au plus tard douze mois après la greffe, pour prélever la rate et la moelle osseuse et conserver les cellules leucémiques en vue d'"utilisations mutualisées".

Objectifs

Les leucémies aiguës (LA) sont des cancers agressifs du sang affectant les différents types de cellules de notre système immunitaire. Notre objectif est de générer des modèles d’étude de ces leucémies humaines en injectant les cellules leucémiques humaines provenant des prélèvements faits sur les patients dans des souris dépourvus de système immunitaire (absence de rejet de greffe). L’établissement de ces modèles nous permettra d’élucider les mécanismes biologiques de ces leucémies et de tester l’efficacité thérapeutique de molécules déjà utilisées en médecine humaine dans le but d’améliorer les traitements proposés aux patients atteints de leucémies.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la transformation des cellules normales en cellules leucémiques mais aussi des mécanismes responsables des résistances aux traitements par la chimiothérapie et des rechutes. L’amélioration de ces connaissances devrait nous permettre d’identifier des molécules déjà utilisées en médecine humaine pour d’autres pathologies qui pourraient présenter un avantage thérapeutique aussi pour le traitement des leucémies. A terme, ce projet devrait permettre d’améliorer les thérapeutiques futures en proposant des traitements ciblés plus efficaces et moins toxiques dans le but d’améliorer le devenir des patients.

Procédures

Pour mettre en place le modèle d’étude, des souris dépourvues de système immunitaire et non anesthésiées seront d’abord soumises à une irradiation de 90 secondes afin de réduire le nombre de cellules sanguines murines et faciliter la greffe, survie et prolifération des cellules leucémiques humaines injectées. Le lendemain les cellules leucémiques humaines seront injectées en une fois soit par voie intraveineuse dans la veine de la queue de la souris non anesthésiée (durée 30 secondes) soit directement dans la moelle osseuse au niveau de la patte des souris anesthésiées et analgésiées. (durée 3 min maximum). Afin de suivre le développement du cancer, des prélèvements de moelle osseuse dans la patte des souris anesthésiées et analgésiées (3 minutes maximum) seront réalisés une fois par mois et au maximum 10 fois ; en alternant la patte prélevée. En complément, des prélèvements de sang au niveau de la veine de la joue des souris (30 secondes maximum) sans anesthésie seront réalisés 2 fois par mois et au maximum 12 fois. La dose, la fréquence et la voie d’administration des molécules thérapeutiques testées peuvent être variables. Les molécules thérapeutiques seront administrées quotidiennement aux souris sans anesthésie soit oralement (avec une sonde de gavage ; durée 1 min) soit par voie intraveineuse (dans la veine de la queue ; durée 30 sec) soit par voie intrapéritonéale (dans la cavité abdominale ; durée 30 sec). Des cycles de traitement d’une durée de 28 jours seront réalisés et pourront être répétés au maximum 3 fois De l’imagerie non invasive sur souris anesthésiées (ayant reçu une injection intrapéritonéale d’une molécule permettant la visualisation des cellules leucémiques) pourra dans certains cas remplacer les prélèvements de sang ou de moelle osseuse pour le suivi de la réponse aux molécules thérapeutiques testées (durée de l’imagerie= 15 min).

Impact sur les animaux

Les procédures réalisées sont rapides, non invasives et maîtrisées par l’ensemble du personnel. Cependant, l’irradiation des souris peut causer du stress et des diarrhées. L’implantation des cellules leucémiques peut causer une douleur légère et brève au niveau du site d’injection. Les prélèvements de sang et moelle osseuse peuvent causer une douleur légère et brève au niveau du site de prélèvement. L’implantation et le prélèvement dans la moelle osseuse peut potentiellement entrainer une perte de mobilité sur une très courte durée. L’administration de molécules thérapeutiques peut causer un stress ainsi qu’une douleur légère et brève au site d’injection. L’administration répétée de molécule thérapeutique par gavage peut potentiellement causer une irritation. La prolifération des cellules leucémiques peut causer une souffrance pour l’animal qui pourra se manifester par une modification du comportement ou de l’apparence physique en cas de manque de toilettage ; le plus souvent une perte de poids et des diarrhées précéderont ces évènements.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures expérimentales (et au plus tard 12 mois après l’implantation des cellules leucémiques humaines ou l’arrêt du traitement en cas d’absence de greffe) afin de collecter les différents organes tels que la rate et la moelle osseuse. Cela permettra de réaliser des analyses complémentaires sur les cellules leucémiques mais également de les conserver afin de permettre des utilisations mutualisées.

Remplacement

Les lignées de cellules leucémiques existantes ne permettent pas de représenter la diversité des leucémies observées chez les patients ni de modéliser les étapes de transformation de cellules normales en cellules cancéreuses ni les mécanismes biologiques responsables des résistances aux traitements et des rechutes. De plus à ce jour il n’existe que quelques modèles de culture en milieu artificiel (in vitro) qui permettent seulement de maintenir temporairement des cellules leucémiques humaines mais leur pertinence reste partielle car cela ne récapitule pas la complexité de l’environnement physiologique ou pathologique des cellules humaines. Au contraire, l’utilisation d’un modèle animal entier vivant assure la présence d’un environnement complexe récapitulant les conditions retrouvées chez les patients. Ainsi l’utilisation d’un modèle utilisant un animal entier vivant est donc nécessaire et indispensable pour étudier la biologie des leucémies et tester des molécules thérapeutiques dans le but d’améliorer les traitements proposés aux patients.

Réduction

Afin d’obtenir des différences statistiques significatives tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons réalisé une estimation du nombre d’animaux nécessaires et suffisants définie à l’aide d’une analyse statistique. Pour certains modèles, de l’imagerie in vivo non invasive sera réalisée permettant de faire un suivi en direct de l’évolution de la maladie et de l’efficacité des traitements. De plus cela permettra d’anticiper les signes cliniques visibles.

Raffinement

Une surveillance quotidienne visuelle sera réalisée par l’animalier ou les expérimentateurs. Nous serons également attentifs en veillant à ce que tous les animaux soient maintenus autant que possible en groupe et que l’enrichissement du milieu soit adapté, notamment pour les animaux qui se retrouveraient isolés en cours d’expérience. Toutes les cages auront un enrichissement (papier kraft, tunnel, buchette de bois). Les animaux dépourvus de système immunitaire seront hébergés dans des conditions permettant d’éviter tout risque d’infections. Une surveillance clinique hebdomadaire du comportement, de l’apparence physique, du poids sera effectuée par les expérimentateurs dès l’implantation des cellules leucémiques humaines et jusqu’à la fin de la procédure (ou au plus tard 12 mois après l’implantation en cas d’échec de greffe). Une surveillance biologique mensuelle par prélèvement de moelle osseuse et bimensuelle par prélèvement de sang sera également effectuée afin de détecter et quantifier la prolifération des cellules leucémiques humaines implantées. Le suivi des animaux se fera en à l’aide d’une grille de points limites définis, suffisamment précoces et prédictifs avec un système de scores. Toute souris présentant des signes de souffrance ou atteignant les points limites pendant la durée de l’expérience sera euthanasiée sans attendre et analysée. Néanmoins certains signes cliniques observés pourront entraîner des actions comme le renforcement du suivi clinique pendant 1 semaine, une réhydratation. De plus, le recours à de l’imagerie in vivo non invasive permettra de suivre en direct l’évolution de la maladie et d’anticiper les signes cliniques visibles.

Choix des espèces

L’utilisation de souris adultes dépourvues de système immunitaire est largement décrite dans la littérature scientifique depuis de nombreuses années comme étant le meilleur modèle pour la greffe de cellules leucémiques humaines. Ce modèle permet également d’étudier la biologie des leucémies humaines, et de servir de modèles précliniques permettant de tester de nouvelles molécules thérapeutiques dans un environnement tumoral complexe se rapprochant de ce qui se passe chez les patients. De plus, nous avons une bonne connaissance des signes de douleur et de souffrance des souris et donc de leur prise en charge Nous utiliserons des souris adultes, âgées de 7 à 12 semaines, afin de garantir une prise de greffe maximale des cellules leucémiques humaines.

Pour arrêter la formulation définitive d'un anticancéreux avant sa production à grande échelle, 125 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis trois injections intraveineuses hebdomadaires du composé testé, avec pesée et mesure de la tumeur trois fois par semaine pendant cent jours. Le porteur indique avoir déjà évalué cette molécule, seule et encapsulée, dans le même modèle tumoral, avec de "très bonnes réponses anti-tumorales". Il refait l'expérience pour ajuster l'enveloppe du produit aux contraintes industrielles, en affirmant devoir mesurer son effet sur un "organisme entier".

Objectifs

Le système immunitaire joue un rôle essentiel dans le développement des cancers. Récemment, de nouvelles immunothérapies permettant la modulation du système immunitaire ont permis une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Dans ce sens, une molécule contenue dans les bactéries a été mise en évidence pour son efficacité à stimuler le système immunitaire. La détoxification de ce composé et son encapsulation ont permis d’améliorer sa pharmacocinétique et réduire sa toxicité pour permettre son injection intraveineuse. Ce projet vise à déterminer la meilleure formulation pour encapsuler notre molécule dans un modèle de cancer colorectal implanté en sous-cutané chez la souris immunocompétente. Les cancers colorectaux font partie des types de cancers les plus répandus. C’est le 3e cancer le plus fréquent chez l’homme après ceux de la prostate et du poumon, et c’est le 2e cancer le plus fréquent chez la femme après celui du sein. Nous avons déjà évalué dans ce même modèle tumoral notre molécule seule ou encapsulée. Dans les deux cas nous avons obtenu une très bonne tolérance et des très bonnes réponses anti-tumorales. Afin d'évaluer notre molécule dans des essais cliniques et pour répondre aux contraintes de la production à grande échelle, nous devons optimiser notre formule pour l'encapsuler. Ce projet a pour objectif de déterminer la formulation définitive de notre produit

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir la composition finale de notre formulation avant son évaluation en clinique. Cette approche thérapeutique permettra au mieux de guérir les patients atteints de cancers colorectaux, sinon de ralentir la progression tumorale. Ces résultats sont nécessaires afin de procéder à l’évaluation ultérieure de ces molécules dans le cadre d’études cliniques précoces chez l’Homme, prévues en 2026.

Procédures

Pour chaque souris : - 1 injection sous-cutanée de cellules tumorales sous vapeur d’isoflurane (3,5 %) - durée < 1minute. - à chaque administration du traitement (1 fois/semaine, 3 fois) : 1 contention + 1 injection intraveineuse (animal vigile) du composé testé - durée < 5 minutes - à chaque pesées et mesures des volumes tumoraux (3 fois/semaine) : 1 contention < 1min.

Impact sur les animaux

- douleur lors d’injection de cellules tumorales en sous-cutané (durée de quelques minutes, une fois), - gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral atteint le point limite. Il n’y a pas de métastase attendue avec les modèles tumoraux utilisés. - stress lié à la contention et aux mesures des volumes tumoraux cutanés (durée de quelques minutes) - douleur lors d’injection dans la veine caudale (durée de quelques minutes, trois fois)

Devenir

Les animaux seront mis à mort 100 jours post-greffe après si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai afin d’observer et quantifier la réponse anti-tumorale sur le long terme.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, l’efficacité de notre molécule et de notre formulation ont déjà été validées sur des modèles in vitro par toutes les techniques pertinentes pour l'étude de nos produits. Nous devons passer maintenant à l'in vivo pour évaluer son effet sur un organisme entier. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anti-cancéreux dépend fortement du microenvironnement. Par ailleurs plusieurs paramètres impactants sur l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur nécessitent de travailler sur un organisme entier. Pour toutes ces raisons nous devons effectuer les études d’efficacité sur la souris.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé à l'aide d'un outil statistique et la procédure sera réalisée sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x)manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contenant une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. L’état général des souris sera aussi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation. Les animaux seront observés quotidiennement en surveillant leur état général. Des points limites détectés via une grille de score (détaillée dans le paragraphe dédié) permettront, en fonction des observations, la mise en place des mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux.

Choix des espèces

Les souches murines sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs de par la disponibilité de modèles tumoraux, de réactifs et permettent de constituer des groupes d’effectifs compatibles avec des résultats statistiquement significatifs. Les souris immunocompétentes sont particulièrement utilisées pour l’étude de l’efficacité antitumorale dans le cas de la stimulation du système immunitaire comme immunothérapie antitumorale. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

Greffées de cellules leucémiques prélevées chez des enfants, par voie intraveineuse ou directement dans le fémur sous anesthésie générale, 3 842 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à douze prises de sang, trois ponctions de moelle osseuse, une irradiation sub-létale de sept minutes et un gavage quotidien pendant quatre semaines. Les souris développent une leucémie qui provoque perte de poids et affaiblissement général, et toutes sont tuées, pour analyse post-mortem ou parce qu'elles sont transgéniques. Le projet se donne pour objectif d'identifier des approches alternatives à l'utilisation d'animaux non-humains pour l'étude des leucémies pédiatriques, tout en prévoyant 3 842 souris sur sa durée.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloblastiques de l’enfant et de l’adolescent sont des cancers des cellules sanguines, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Le traitement standard comprend une polychimiothérapie, parfois associée à une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour les patients de haut risque ou en rechute. La greffe de cellules souches hématopoiétiques (CSH) est un traitement lourd, source de séquelles à long terme. Des progrès sont donc nécessaires pour réduire le taux de rechute, améliorer la survie et limiter les séquelles. L’objectif de nos études est de caractériser les mécanismes mis en jeu dans les leucémies l’enfant à mauvais pronostic. Pour tester l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, il est essentiel de pouvoir travailler sur les cellules tumorales les plus proches possibles de celles présentes chez les patients afin de prendre en compte la complexité génétique des tumeurs. La xénogreffe dérivée du patient développée après transplantation de la tumeur primaire humaine directement dans divers modèles murins immunodéprimés a été utilisée largement pour modéliser différents types de cancer. En effet, ces tumeurs conservent les caractéristiques histologiques des tumeurs parentales, reflètent mieux l'hétérogénéité de l'échantillon du patient et constituent une plate-forme pour évaluer les médicaments anticancéreux (molécules pharmacologiques et immunothérapies, dans des conditions physiologiques. Le projet a également pour objectif d'identifier des approches alternatives à l’utilisation de modèles animaux pour l’étude des leucémies pédiatriques. Pour cela, nous utiliserons des modèles de cellules pluripotentes induites humaines cultivées in vitro pour caractériser les propriétés tumorales des cellules exprimant les oncogènes des leucémies issues des cellules souches en comparant les cellules obtenues in vitro et in vivo à celles provenant des patients. A terme, l'utilisation de cellues souches pourrait permettre de réduire l’utilisation d’animaux pour réaliser certaines approches exclusivement in vitro. Nous utilisons des outils statistiques permettant de définir le nombre minimal d'animaux à utiliser pour obtenir des conclusions significatives pour chaque approche.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'améliorer les modèles utilisés afin d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Spécifiquement, nous attendons du projet qu'il permette : -D'amplifier des cellules leucémiques de patients afin de réaliser leur analyse moléculaire et définir l'efficacité de réponse à plusieurs molécules pharmacologiques qui seront identifiées par les analyses moléculaires. -D'identifier la trajectoire de transformation entre une cellule normale et une cellule leucémique afin de caractériser les spécificités des cellules leucémiques exprimant différents oncogènes. -De définir si des cellules souches pluripotentes induites pourraient, à l'avenir, être utilisées à la place des cellules humaines primaires et dans les approches in vitro pour réduire l'utilisation de souris. -De caractériser l'efficacité anti-tumorale d'approches précliniques, incluant certaines immunothérapies . -D'améliorer les modèles développés dans le but de réduire le nombre de souris utilisées et de définir les prérequis pour le replacement de certains modèles murins in vivo par des approches in vitro.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Injection intra-veineuse sous anesthésie locale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal). Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-veineuse de molécules sous anesthésie locale: injections dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être biheddomadaires sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-fémorale sous anesthésie générale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal) et chaque injection prend 3 à 5 minutes. -Gavage oral: dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être journalier sur une durée de 4 semaines. Chaque gavage prend 10-20 secondes. -Prélèvement de sang sous anesthésie locale: jusqu'à 12 prélèvements par souris avec une fréquence ne dépassant pas 1 fois/semaine. Chaque prélèvement prend ~1 minute. -Prélèvement de moelle sous anesthésie générale : jusqu'à 3 prélèvements par souris avec une fréquence d'au moins 15 jours. Chaque prélèvement prend 2 à 3 minutes. Irradiations sub-léthale, une seule fois, durée 7 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont dues au développement d'hémopathies malignes. Chez les animaux qui présentent une pathologie avancée, cela se traduit par une perte de poids et un affaiblissement général. Les interventions répétées de type injection ou prélèvements de sang peuvent éventuellement occasionner rarement des hématomes ou des lésions locales. Les injections intrafémorales ou les prélèvements de moelle dans le fémur peuvent rarement occasionner des douleurs persitantes et des boîteries. Les irradiations sub-léthales n'ont aucun effet indésirables au-delà des manipulations légères pour les pratiquer.

Devenir

Tous les animaux du projet sont transgéniques et seront donc euthanasiés. De plus, beaucoup développeront des maladies de type leucémie et seront euthanasiés pour analyses post-mortem.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : 1-La génération/maturation terminale des lignées hématopoïétiques à partir de cellules souches n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro; 2-Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients; 3-Les approches précliniques in vivo sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères; 4-Pour mettre en place des modèles de remplacement (ex: modèles de leucémie à partir de cellules souches pluripotentes induites), il est indispensable avant tout, de démontrer que les cellules obtenues par cette approche sont capables de reproduire in vivo des leucémies proches de celles observées chez les patients.

Réduction

De nouvelles lignées de souris immunodéficientes sont développées régulièrement par d'autres laboratoires et certaines sont rapportées comme ayant un taux de greffe des cellules hématopoïétiques humaines supérieur et donc permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces approches. Nous comparerons l'efficacité de ces modèles à celui du modèle de référence pour la prise de greffe de nos échantillons leucémiques afin de sélectionner le modèle qui permettra de réduire le nombre de souris utilisées pour les greffes primaires. Des méthodes statistiques seront utilisées pour déterminer précisément le nombre d'animaux nécessaire et suffisant et pour analyser les résultats. Au cours des années passées, nous avons identifié un modèle plus réceptif aux greffes de cellules hématopoïétiques primaires ou issues de cellules souches pluripotentes induites. Nous utilisons donc maintenant régulièrement cette souche qui permet de réduire le nombre de souris utilisées. Nous poursuivrons la comparaison avec de nouvelles souches de souris immunodéficientes qui deviendraient disponibles au cours du projet. Dans le cas où elles montreraient une efficacité, nous serons donc amenés à utiliser de nouvelles lignées et à diminuer le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Afin de réduire l’invasivité des prélèvements, nous introduisons des rapporteurs luminescents dans les cellules humaines utilisées pour les approches précliniques afin de pouvoir suivre la prise de greffe et l’efficacité des traitements par des approches d’imagerie corps entier sans prélèvements (ex: sang ou moelle) permettant une meilleure quantification de l'efficacité globale du traitement.

Choix des espèces

Les souris représentent une espèce relativement facile à élever qui permet l’obtention de résultats rapides du fait de leur temps de génération réduit. Elles possèdent un système hématopoïétique proche de celui de l’homme. Pour cette étude, nous utilisons des souris immunodéficientes, car ces souris permettent une prise de greffe efficace de cellules humaines, avec un risque de rmaladie du greffon contre l'hôte réduit et peuvent être utilisées pour les approches précliniques. Par le passé, nous avons contribué à des approches précliniques pour un composé qui ont conduit à des phases cliniques. Ces modèles sont également utiles pour le test d'immunothérapies. Nous utiliserons des souris adultes entre 6 et 10 semaines pour avoir des tests efficaces et reproductibles. Pour l'étude des pathologies de l’enfant, des article récents montrent l’importance d'utiliser des souris receveuses nouveau-nés. Ainsi, nous pourrons transplanter les cellules soit dans des receveurs nouveau-nés ou adultes pour comprendre l'importance de l'âge de l'organisme lors du dévéloppement des leucémies retrouvées chez l'enfant.

Tatouées et biopsiées de la queue avant huit jours, puis injectées quatre jours de suite dans la cavité abdominale, 688 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyses post-mortem. Le tamoxifène injecté peut provoquer chez les mâles un œdème testiculaire, voire une hernie inguinale. Deux à cinq prises de sang et jusqu'à deux ponctions de moelle osseuse au genou suivent l'apparition d'une leucémie lymphoblastique aiguë, dont le porteur écrit ignorer le délai, et qui dégrade l'état des souris en quelques jours: perte de poids, détresse respiratoire, anémie, masses sous la peau, prostration. Il présente ces prélèvements comme respectant "les délais réglementaires permettant une récupération complète des animaux", tout en indiquant que la ponction du genou peut léser le cartilage et perturber les déplacements.

Objectifs

Sur la base de données scientifiques obtenues au laboratoire à partir de patients atteints de leucémies aiguës lymphoblastiques B d’un sous-type particulier de mauvais pronostic, les objectifs de notre projet de recherche sont de déterminer l’implication, dans le processus leucémogène de cette hémopathie, de deux protéines retrouvées dans les cellules leucémiques de ces patients. Pour cela, nous développerons un modèle murin dans lequel ces deux protéines sont exprimées dans les cellules lymphoïdes pour voir si elles sont à l’origine de la maladie. Ce modèle, s’il mime cette hémopathie humaine, nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsable de l’émergence de ce type de leucémie chez l’Homme. Notre projet a pour but : (1) de caractériser les anomalies morphologiques, cellulaires et moléculaires dans le système hématopoïétique des souris qui expriment les deux protéines dans leurs cellules lymphoïdes, (2) de comparer ces anomalies aux anomalies décrites pour ce type de leucémies chez l’Homme, (3) d’étudier expérimentalement la pathogénicité de ces deux protéines. Ces connaissances nous ouvriront de nouvelles pistes pour développer des thérapies adaptées à ce sous-type particulier de leucémie lymphoblastique qui échappe aux thérapies conventionnelles.

Bénéfices attendus

Ce projet s’intégre dans une projet de recherche translationnelle, à partir d’observations cliniques, qui ont permis de mettre en évidence un sous-type particulier de patients atteints de leucémies lymphoblastique B de mauvais pronostic. Une meilleure compréhension des mécanismes de leucémogenèse de ce type particulier de leucémies permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Le projet décrit ici est intégré dans un projet plus vaste qui inclut plusieurs groupes de recherche et, entre autre, le criblage de molécules sur des lignées cellulaires de patients de ce sous-groupe de leucémie pour identifier de nouveaux médicaments qui permettraient de cibler ces cellules leucémiques particulières, et de guérir les patients.

Procédures

Les souris transgéniques seront tatouées et une biopsie de queue sera réalisée avant 8j. Les animaux au génotype d'intérêt seront soumis à quatre injections dans la cavité abdominale de produits chimiques (1 injection par jour pendant 4 jours sur animal vigile) au cours de la procédure. Pour suivre l’évolution de la leucémie attendue, 2 à 5 prises de sang, à raison d’une prise par ou au maximum deux prélèvements de moelle osseuse réalisés sur animal anesthésié), avec au minimum 2 mois entre les deux prélèvements, pourront être réalisés sur ces souris. Les souris immunodéprimées seront soumises à une injection de cellules de moelle osseuse murine (sur animal vigile en contention). Deux à quatre prises de sang, à raison d’une prise par mois (sur animal anesthésié ou vigile selon la voie de prélèvement choisie pourront être réalisées pour suivre l’évolution de la leucémie.

Impact sur les animaux

Le tatouage et la biopsie de queue induiront une douleur légère de courte durée. Les animaux transgéniques recevront une dose définie de tamoxifène par injection intra-péritonéale. Ceci peut s’accompagner d’une inflammation au site d’injection et de douleur abdominale au moment de l’injection. Chez les mâles, un œdème testiculaire peut apparaître secondairement, voire une hernie inguinale. De même, l’injection intra-veineuse de cellules de moelle osseuse murines dans les souris immunodéprimées peut s’accompagner d’inflammation au site d’injection. Etant donné l’immunodépression des souris , il ne devrait pas y avoir de réaction de rejet. Sur le plus long terme, notre hypothèse de travail est que les souris développeront des leucémies aiguës lymphoblastiques. Nous ne connaissons pas le délai d’apparition des symptômes. Lorsque la maladie se déclare, l’état de santé des souris se dégrade rapidement (quelques jours). Les cellules leucémiques se propagent, se multiplient et envahissent la moelle osseuse. Ceci entraine une forte perturbation de la production de cellules sanguines. Les souris perdent généralement du poids et, dans les stades avancés, présentent des signes de détresse respiratoire, d’anémie, parfois des masses sous la peau, deviennent inactives et prostrées, et leur pelage n’est plus bien entretenu. La ponction de moelle osseuse étant réalisée au niveau du genou, la souris peut avoir des lésions au niveau du cartilage qui perturbent ses déplacements. Enfin, il existe toujours un risque d’infection au niveau du point de ponction.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

La fonction des deux protéines dans la cancérogénèse sera étudiée sur les modèles animaux, en les exprimant dans leur environnement médullaire complexe difficilement modélisable in vitro ou ex vivo. Les études mécanistiques seront réalisées à partir de modèles de cultures ex vivo de cellules de moelle osseuse issues de ces souris et/ou de lignées cellulaires humaines exprimant ou non les deux protéines en culture. Nos collaborateurs disposent également de lignées de B-LAL du sous-type CDX2/UBTF. Mais ces lignées ne permettent pas répondre aux questions concernant l’émergence des leucémies dans une moelle saine.

Réduction

Les chiffres indiqués dans le dossier correspondent au nombre estimé maximal d’animaux utilisés pour les expériences envisagées. Comme il s’agit d’études exploratoires, il est difficile de prévoir exactement l’impact des de l’expression des deux protéines étudiées sur la leucémogenèse. Sur la base de notre expérience et de la littérature, et en tenant compte de la variabilité observée dans les études précédentes entre les animaux eux-mêmes, un nombre d’animaux minimum et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a été estimé à n=4 à 20 animaux par groupe expérimental en fonction de l’étude. Le nombre d'animaux nécessaire par expérience a été déterminé par fonction mathématique à 10 animaux par groupe pour obtenir des résultats robustes et fiables statistiquement. De plus, la possibilité d’analyser la numération sanguine des animaux par prise de sang et d’immunophénotyper les cellules de moelle osseuse ponctionnées au niveau du genou permet une étude longitudinale et ainsi, de diminuer le nombre des animaux utilisés. Dire seulement qu’une partie du projet repose sur une étude longitudinale avec réalisation de prélèvements répétés sur les mêmes animaux en respectant les délais réglementaires permettant une récupération complète des animaux entre chaque prélèvement.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans des conditions sanitaires contrôlées et permettant un bien-être optimal dans des portoirs ventilés (baton, coton et frisure pour faire un nid). Ils seront acclimatés au moins deux semaines après leur arrivée à l’animalerie et avant le début de toute procédure. Les procédures ont été établies afin de réduire au maximum le stress et la souffrance des animaux soumis aux expérimentations. Une anesthésie sera pratiquée pour certain protocole pour limiter le stress et la douleur. Les animaux seront surveillés quotidiennement durant les procédures. En cas de signes d’infection, la plaie sera traitée avec un antiseptique local. En cas de signes de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Des points limites précoces ont été définis afin d’interrompre les procédures et garantir le bien-être animal en évitant des souffrances inutiles.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus) qui représente l’espèce animal la plus propice pour ce type d’étude pour les raisons suivantes : •nombreux protocoles bien établis pour cette espèce •possibilité d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés •modèles mimant très bien les cancers hématologiques et qui ont déjà fait l’objet de nombreuses applications dans le domaine. Ce seront des animaux adultes de 8 semaines minimum qui seront utilisés car les potentielles applications thérapeutiques s'adresseront à une population humaine adulte.

Une anesthésie tous les deux jours pendant deux semaines, chacune précédée d'une injection intrapéritonéale: 936 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des organes. Elles reçoivent des cellules tumorales par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, développent des tumeurs pulmonaires ou péritonéales, et certaines déclarent une réaction du greffon contre l'hôte avec perte de poids et perte de poils. L'objet est de tester deux modifications génétiques de cellules immunitaires humaines, censées mieux attaquer les tumeurs solides. Le porteur décrit les cocultures en deux et trois dimensions déjà menées au laboratoire, puis conclut que le modèle animal reste "indispensable" avant toute application clinique.

Objectifs

Le développement des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) a révolutionné l'immunothérapie du cancer pour certains types de cancer. Ce nouveau type de traitement par immunothérapie consiste à prélever les cellules immunitaires du patient, de les modifier génétiquement en laboratoire pour qu’elles expriment le CAR, puis elles sont réinjectées au patient afin qu’elles reconnaissent et combattent les cellules cancéreuses. Cependant, des améliorations des thérapies CAR restent nécessaires afin de cibler d'autres types de tumeurs et d'assurer une fonction antitumorale durable des cellules modifiées. Nous proposons ici deux nouvelles stratégies de modification génique ciblant chacune des cellules immunitaires différentes, les lymphocytes T et les macrophages, dans le but d'amplifier leurs fonctions antitumorales. Ces cellules sont des leucocytes (globules blancs) qui ont pour but de détruire d’autres cellules : les lymphocytes T détruisent les cellules reconnues comme étrangères (immunité cellulaire) ; et les macrophages phagocytes « mangent » les cellules étrangères ou leurs débris et participent à la présentation des antigènes et à la libération de cytokines. Dans la première stratégie, nous augmenterons la fonction antitumorale des cellules CAR issues de lymphocytes T, augmentant leur production d'interféron (cytokine/protéine produite par les cellules immunitaires afin d’activer la réponse immunitaire chez d’autres cellules impliquées dans la réponse inflammatoire) grâce à de nouveaux mécanismes que nous avons récemment découverts. Dans la deuxième stratégie, nous améliorerons la survie des CAR issus de macrophages, en les dotant d'une protection anti-apoptotique (=mécanisme de mort cellulaire). Nos résultats in vitro dans des modèles de tumeurs en 3D sont très encourageants, il nous faut les confirmer in vivo au sein d’un organisme entier permettant les interactions avec tous les types cellulaires. Nous utiliserons des approches expérimentales similaires dans les deux stratégies, pour établir la preuve de concept d'une activité antitumorale accrue in vivo. De plus, ce projet ayant une visée clinique, il est essentiel d’évaluer certains critères tels que les toxicités, le dosage et l’efficacité grâce à un modèle in vivo. Nous voulons également comprendre davantage les mécanismes liés au contrôle tumoral et les interactions entre les différentes populations immunitaires permettant d’éliminer les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

L’immunothérapie cellulaire par récepteurs antigéniques chimériques (CAR) permet de cibler et de tuer les cellules tumorales. Néanmoins, elle représente deux limites i) elle n’a pas permis de cibler les tumeurs solides, ii) elle rencontre des rechutes et des résistances chez près de 50% des patients répondeurs à deux ans. Nous proposons donc deux stratégies pour contrer ces limites et améliorer les capacités à cibler les cellules tumorales, le tout en s'accompagnant de moins d'effets secondaires. La première stratégie permet l’amélioration de la fonction antitumorale des CAR-T (lymphocytes T modifier génétiquement). Cela est assuré par le contrôle de la production d’interféron par les cellules T. La forte production d’interféron induite par ces manipulations a permis l’augmentation de la capacité de destruction des cellules tumorales. La deuxième stratégie tend à améliorer la persistance et la survie des CAR-MAC (macrophages modifier génétiquement). Ces cellules sont prometteuses pour la thérapie cellulaire contre les tumeurs solides par leur capacité à se diriger vers la tumeur et leur capacité de phagocytose des cellules tumorales. La solution apportée pour améliorer leur survie a permis d’obtenir des effets thérapeutiques plus importants. De plus, elle a l’avantage de reposer sur une ingénierie génétique stable. Les monocytes ont non seulement la capacité de tuer directement les cellules tumorales via la phagocytose, mais aussi de sécréter des facteurs solubles qui peuvent à leur tour attirer d'autres cellules immunitaires. Celles-ci peuvent à leur tour rendre l'environnement de la tumeur plus accessible aux cellules « Natural Killer » du système immunitaire (sous-catégorie de lymphocytes, proches des lymphocytes T, qui ont un rôle cytotoxique). Une meilleure compréhension du mécanisme peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces.

Procédures

Dans les trois procédures, nous visons à évaluer l’effet d’un traitement cellulaire sur la progression tumorale, par différentes étapes : A. Plusieurs lots (un par lignée tumorale) d’animaux vigiles recevront une injection de cellules tumorales par voie intraveineuse ou par voie intra-péritonéale (durée du geste inférieure à 30 sec, 1 fois au cours de l’expérience), puis 4 jours après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15 min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de comparer la cinétique de progression des différentes lignées tumorales. B. D’autres lots d’animaux vigiles recevront les cellules thérapeutiques par voie intraveineuse (durée du geste inférieure à 30 sec). 3 heures après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15 min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de déterminer la localisation et la persistance des cellules. C. D’autres lots d’animaux vigiles recevront une injection de cellules tumorales par voie intraveineuse ou par voie intra-péritonéale (durée du geste inférieure à 30 sec, 1 fois au cours de l’expérience), puis 4 jours après les animaux vigiles recevront un traitement par voie intraveineuse (durée du geste inférieure à 30 sec). 3 heures après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de déterminer l’efficacité de notre traitement sur la croissance tumorale.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à un stress et à une douleur minimale au moment des injections, mais nous nous efforçons de les maintenir à un niveau aussi bas que possible grâce à une manipulation professionnelle. L'un des effets attendus de ces essais est l'apparition de GvHD au cours de certains protocoles. La "Graft versus Host Disease" est une maladie dans laquelle les cellules immunitaires humaines transplantées attaquent le corps de l'hôte, ce qui entraîne des symptômes tels que la perte de poids et la perte de poils. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux développeront des tumeurs pulmonaires ou dans le péritoine, en fonction de la voie d’injection. Ces effets se manifesteront de façon croissante au cours de l’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration de cellules tumorales par voie intraveineuse ou intrapéritonéale seront celles liées à l’injection elle-même (gêne de courte durée).

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo.

Remplacement

Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet, avec des lymphocytes T et monocytes modifiés, ont déjà été évaluées in vitro à l’aide de méthodes alternatives telles que la coculture en 2D et la coculture 3D formant des sphéroïdes qui nous ont permis de sélectionner les meilleurs candidats prometteurs pour une efficacité contre les cellules tumorales. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action des monocytes modifiés. Néanmoins, malgré le développement de méthodes alternatives in vitro auxquelles le laboratoire a eu recours (coculture en 2D, coculture en 3D) l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet avant d'envisager une application clinique chez l'homme en thérapie cellulaire. Une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré est nécessaire. Cette étape est indispensable pour tester les mécanismes de régulation et d’action, ainsi que la toxicité éventuelle de cette thérapie cellulaire.

Réduction

En nous basant sur notre expérience dans le domaine de l'immunothérapie, nous pouvons déjà nous appuyer sur quelques résultats. Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 ou 8 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous observons la croissance des tumeurs dans l'abdomen à l'aide d'un système d'imagerie in vivo, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Néanmoins, nous allons travailler avec des cellules sanguines humaines primaires, ce qui entraîne souvent une grande variabilité. C'est pourquoi il est indispensable de répéter les expériences au moins trois fois avec des donneurs différents afin de pouvoir prouver les résultats de manière statistique. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. Les lignées cellulaires tumorales qu’on utilisera expriment la luciférase, ce qui permet de suivre la croissance tumorale par bioluminescence qui sera faite deux fois par semaine. Une corrélation entre le niveau de bioluminescence pour chaque lignée cellulaire utilisée et l’état général des souris (évalués à l’aide de la grille de score jointe) sera faite, afin de s’assurer que les tumeurs ne dépassent pas un niveau maximal de bioluminescence et éviter le mal-être des animaux. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score jointe au document. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des compléments alimentaires.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en recherche de thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La souris est aussi le modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins, et de la disponibilité de souches murines parfaitement définies. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (entre 6 et 10 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Pour chaque protocole expérimental on utilisera des groupes d’animaux d’âge identique.

Anesthésiés cinq minutes, amputés d'un morceau de nageoire caudale, puis isolés jusqu'à trois jours pour le génotypage, 910 poissons zèbres subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. D'autres reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous anesthésie, au stade larvaire, et sont tués au plus tard huit jours après la fécondation. Le porteur écrit avoir réduit à dix le nombre de poissons reproducteurs, tout en prévoyant qu'un grand nombre d'œufs sera produit puis trié avant cinq jours. Les poissons retenus pour perpétuer les lignées sont gardés en vie jusqu'à un an et demi, puis mis à mort.

Objectifs

La communication intercellulaire est indispensable pour réguler les grandes fonctions de l’organisme. Récemment, une nouvelle voie de communication prend une place croissante dans la plupart des processus physiopathologiques : les vésicules extracellulaires. Ces vésicules de 100nm à 1µm sont relarguées par tous les types cellules dans tous les organismes. Leurs propriétés ouvrent de nouvelles perspectives, aussi bien du point de vue fondamentale que thérapeutique, notamment dans leur utilisation comme marqueurs ou véhicules thérapeutiques. Ces vésicules sont impliquées dans la progression des cancers mais leur étude se fait principalement in vitro, du fait que leur taille limite leur étude et utilisation in vivo. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé un modèle de poisson zèbre qui permet de suivre ces vésicules en temps réel, à l’échelle de la vésicule unique par imagerie. L’utilisation du poisson zèbre apparait maintenant comme une solution incontournable pour étudier les vésicules dans la communication entre la tumeur et son micro-environnement, dans une situation la plus physiologique possible que ne permet pas les études in vitro. Notre projet aura pour but de générer différentes lignées transgéniques pour suivre ces vésicules et manipuler leur production et leur ciblage, en exprimant de façon stable des constructions d’ADN modifié. Nous pourrons alors étudier la communication médiée par ces vésicules entre différents types cellulaires et entre ces types cellulaires, des cellules cancéreuses greffées dans les larves obtenues à partir de ces lignées. L’évolution et le maintien de ces lignées seront suivis afin de parer à l’éventuelle apparition de phénotypes dommageables. Pour cela, une observation macroscopique quotidienne sera réalisée dès la microinjection, puis une vérification du génotype sera réalisée à partir du deuxième mois. Par la suite, pour perpétuer ces lignées, une sélection d’animaux reproducteurs sera réalisée après maturité sexuelle qui apparait vers 3 mois. Ces lignées permettront ensuite de caractériser les propriétés biologiques et fonctionnelles des vésicules in vivo en temps réel, dans des protocoles expérimentaux effectués dans des embryons de moins de cinq jours post fertilisation. Ce projet permettra alors une meilleure compréhension de la biologie des vésicules, notamment sur leur rôle dans la propagation des cancers et plus particulièrement dans le cancer de la prostate ou le cancer cérébral (glioblastome).

Bénéfices attendus

La création de ces nouvelles lignées contribuera à une meilleure compréhension de la biologie des vésicules extracellulaires chez l’animal et fournira des données cruciales sur leur rôle dans la progression tumorale in vivo dans un contexte physiologique (flux sanguin, barrière biologique). Nos études sur les embryons de poisson zèbre permettront également d’établir cet organisme modèle comme un modèle préclinique pour tester in vivo le potentiel thérapeutique notamment en tant que véhicules thérapeutiques dans le cadre des cancers.

Procédures

Prélèvement de morceau de nageoire caudale, en une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes. Isolement pour génotypage, en une fois, pendant 3 jours maximum. Injection de cellules, en une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes.

Impact sur les animaux

D’après la littérature, aucun phénotype dommageable n’est attendue par l’expression de nos constructions. Bien que peu probable, le ou les phénotypes dommageables pourront se traduire par : l’apparition de malformations de l’animal au cours de son développement (tératogenèse), la formation d’œdème, ou une altération du comportement. Les seules nuisances attendues seront le stress de l’anesthésie, la douleur liée au prélèvement pour le génotypage.

Devenir

A la fin de la procédure 1, les animaux seront toujours utilisés notamment pour maintenir leur lignée et donc perpétuer les futures générations. Cependant, les animaux seront gardés en vie jusqu’à leur un an et demi, après cela, ils seront mis à mort. En ce qui concerne la deuxième procédure, les animaux seront mis à mort après observation de la propagation ou progression des cellules injectées (maximum 8 jours post-fécondation).

Remplacement

Ce projet repose sur la création de nouvelles lignées transgéniques de poissons zèbres pour l’étude du comportement des vésicules extracellulaire en temps réel chez un organisme vivant. En ce sens, aucune méthode de remplacement in vitro n’est possible pour cette question.

Réduction

Dans le but de réduire et selon des calculs de puissance ainsi que des différentes observations concernant le taux d’intégration d’ADN modifié et le pourcentage de survie de nouveaux descendants en général, nous estimons et avons réduit le nombre de poissons à 10, de manière à toujours avoir 90% de chance d’obtenir des différences significatives, bien que la morbidité et viabilité de ces nouvelles lignées transgéniques restent encore inconnues. Dans le but d’obtenir ces 10 poissons, il faut prendre en compte ces différents paramètres de viabilité et morbidité, ainsi théoriquement, un grand nombre d’œufs seront générés, mais seront triés avant les 5 jours post-fertilisation, pour leur expression de l’ADN injecté, de manière à réduire le nombre de poissons nécessaires. Dès l’obtention des 10 poissons avec autant de mâles que de femelles, le génotypage sera stoppé. Dans le cadre des greffes, nos études utilisent des approches de microscopie qui limitent le nombre de poissons à une dizaine de larves de 6 à 8 jours post-fertilisation par expérience.

Raffinement

Afin d’améliorer la qualité de vie des animaux, nous porterons une attention toute particulière à l’apparition très peu plausible de phénotypes dommageables. Nous effectuerons un enrichissement de milieu, notamment par l’utilisation d’un fond imagé lors des accouplements, mais également par l’approvisionnement en plancton une fois par jour, en fonction de la production de plancton au sein de l’animalerie. De la même manière, afin de limiter la souffrance et/ou stress de l’animal lors du prélèvement de nageoire pour le génotypage, un analgésique et un anesthésique seront utilisés. Nous veillerons également à réduire au minimum la quantité du prélèvement, pour cela nous prélèverons un morceau de 1mm au niveau de la nageoire caudale. Un système d’hébergement spécifique au génotypage sera également mis en place et relié au système aquatique, de manière, à ce que les poissons soient séparés les uns des autres mais qu’ils puissent se voir au travers de parois transparentes et bénéficie des mêmes conditions (alimentation en eau donc en oxygène continue) que les poissons hébergés dans le système aquatique. De plus, le temps d’isolement sera le plus court possible, c’est-à-dire le temps de la réalisation des techniques de génotypage, soit maximum 3 jours.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle animal où son développement rapide et en dehors de leur mère permet de réaliser facilement des manipulations génétiques pour l’obtention de lignées dont le génome a été modifié. Du fait de la transparence des embryons, l’observation des organes internes à l’échelle de l’organisme entier est facilitée. Cette caractéristique ainsi que la taille de ce modèle sont un grand avantage pour la visualisation des vésicules extracellulaires (notamment dans les fluides biologiques) et de leur interaction avec des tissus récepteurs. Les poissons seront utilisés jusqu’à leur un an et demi de manière à pouvoir vérifier le génotype de ces poissons, à partir de leur deuxième mois, lorsqu’ils auront une taille suffisamment grande ; mais également pour perpétuer les lignées dont le génome a été modifié, par reproduction sexuée.

L'objet déclaré est d'immuniser des souris pour en tirer des anticorps monoclonaux à usage recherche ou thérapeutique, à raison de cinquante études sur cinq ans. 1 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à cinq administrations d'antigène et quatre d'ARNm, plus des microprélèvements de sang jusqu'à deux fois par jour, avec pour effets annoncés des poils hérissés, une perte de poids transitoire et une modification du comportement. Celles dont la réponse immunitaire est jugée "satisfaisante" sont tuées pour prélever leurs organes lymphoïdes, les autres sont tuées aussi.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à immuniser des souris avec un antigène (peptide/protéine, plasmide, cellule ou vésicule) et/ou de l’ARNm transcrit in vitro (IVT) afin d’obtenir, in fine, des anticorps monoclonaux à usage recherche ou thérapeutique. Ces anticorps pourront devenir des candidats médicaments pour de la thérapie humaine ou des outils pour développer des méthodes analytiques nécessaires pour les études en oncologie.

Bénéfices attendus

Ces dernières années, les anticorps monoclonaux sont devenus de plus en plus importants dans de nombreux domaines et particulièrement dans celui de la thérapie humaine. Ces molécules émergent de plus en plus dans le domaine de l’immuno-oncologie afin de traiter les patients atteints de nombreux types de cancer différents. Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont la génération de potentiels candidats médicaments pour de l’immunothérapie ainsi que d’outils de développement de méthodes analytiques, nécessaires à un projet scientifique.

Procédures

• Sur animal vigile : Administration de l’antigène (5 fois maximum hebdomadairement ou quinzomadairement, 15 s) ; Administration de l’ARNm (4 fois maximum hebdomadairement, 15 s) ; Microprélèvement de sang (maximum 2 fois /jour, 30 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang (4 fois maximum, 30 s) ; Administration de l’antigène (1 injection, 15 s) ; Administration de l’ARNm (4 fois maximum hebdomadairement, 15 s).

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère lors de l’administration de l’antigène. Stress et douleur légère lors de l’administration de l’ARNm. Possibilité d’effets indésirables légers et/ou modérés liés à l’injection de l’antigène ou de l’ARNm : Poils hérissés, modification temporaire du comportement, perte de poids transitoire.

Devenir

Les animaux présentant une réponse immunitaire « satisfaisante », contre l’antigène d’intérêt, seront mis à mort pour la collecte des organes lymphoïdes. Ces derniers permettront, par la suite, la production in vitro des anticorps monoclonaux. Les animaux non-prélevés seront, quant à eux, euthanasiés afin de limiter les nuisances sur leur bien-être et éviter tout effet indésirable à long-terme. En cas d’atteinte de point limite justifiant l’euthanasie en cours d’étude, les animaux seront également mis à mort.

Remplacement

La génération d’anticorps est un mécanisme complexe issus d’une réponse immunitaire spécifique et adaptative à un antigène. Il nécessite l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires et permet ainsi d’aboutir à un anticorps de qualité dont la spécificité et la sélectivité sont généralement supérieures à un anticorps généré à partir de banques synthétiques. En effet, ce dernier nécessite une étape secondaire in vitro qui ralentit le développement des candidats médicaments de plusieurs mois et donc l’offre thérapeutique aux patients. Bien que ne garantissant pas la développabilité future d’anticorps, la génération d’un anticorps in vivo augmente les probabilités de réussite et permet de générer des candidats dont la séquence ne serait pas présente avec une banque synthétique, par définition plus restreinte. Par ailleurs, dans le cas où la production d’anticorps nécessite le développement d’hybridomes murins ou l’utilisation de protéine purifiée, il n’est pas possible d’utiliser de méthode alternative. C’est pourquoi, l’utilisation d’animaux reste, à ce jour, indispensable à la production de nos anticorps.

Réduction

En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 5 souris maximum par stratégie d’immunisation seront utilisées. Plusieurs stratégies d’immunisation pourront être menées pour une même cible. Les volumes de prélèvement de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 50 études sera mené sur 5 ans. Le projet n’implique pas d'analyse statistique, et repose uniquement sur la présence ou non d’anticorps chez les animaux. Une fois l’étape de génération de l’anticorps in vivo chez l’animal effectuée, les organes d’intérêt seront prélevés et la production d'anticorps sera entièrement réalisée dans des systèmes de production cellulaire in vitro.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Certaines injections pourront être réalisées sous anesthésie gazeuse et la taille des aiguilles utilisées lors des injections sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. Des points limites précoces relatifs à l’apparence/comportement de l’animal ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L‘antigène ou l’ARNm injecté pourront induire une perte de poids de l’animal, plusieurs jours post-injection. Pour limiter l’impact de l’injection et faciliter la récupération des animaux, un gel aqueux enrichi en nutriments sera mis en place en pré et post-injection. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Après cette période, la fréquence d’observation et de pesée des animaux sera de nouveau réduite à 1 fois/semaine. Elle pourra être augmentée en cas de nouvelle dégradation de l’état de l’animal. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement) sera suivi lors des mesures de poids (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (minimum 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme animal est basé sur la bonne connaissance de son système immunitaire et sa capacité à générer des réponses antigéniques efficaces permettant d’obtenir des cellules B exprimant des anticorps spécifiques de haute affinité. De plus, sa petite taille, sa grande fécondité et son coût de production et d’entretien relativement peu élevés en font un animal de choix. La disponibilité de lignées de souris génétiquement altérées spécifiques permet, également, la génération d’anticorps humains sans passer par l’étape d’humanisation des anticorps générés. Dans le cas d’utilisation de myélome pour la production d’hybridomes, celui-ci est compatible avec la souche consanguine BALB/c, très largement utilisée pour la production d’anticorps monoclonaux à visée recherche ou thérapeutique. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 12 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature. En effet, il a été décrit que la souris développait une réponse immunitaire plus forte contre les antigènes externes à cet âge.

2 310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un carcinome ovarien leur est implanté par chirurgie ou par injection, puis elles subissent jusqu'à deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie et jusqu'à cinq administrations de traitement par semaine, pendant douze semaines, ainsi que des prélèvements de sang par ponction submandibulaire. Le porteur décrit un gonflement de l'abdomen avec ascite pouvant apparaître huit semaines après l'implantation, et prévoit alors la mise à mort de l'animal. Ce laboratoire travaille à la demande de chercheurs extérieurs et affirme qu'aucune autre méthode n'apporterait un niveau d'information équivalent, sans nommer les approches écartées.

Objectifs

Ce projet a pour but de mettre en œuvre, à la demande de chercheurs extérieurs à notre laboratoire, des modèles de cancer ovarien et de les étudier par imagerie in vivo, à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou à l'évaluation de nouveaux médicaments. Le cancer ovarien représente un défi majeur de santé publique en raison de son diagnostic tardif et de son impact sur la fertilité des femmes. Malgré des avancées significatives en termes de survie grâce aux chimiothérapies à base d’anticorps thérapeutiques, certaines patientes ne répondent pas ou peu aux traitements. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies afin d’améliorer l’efficacité antitumorale et de lutter contre les phénomènes de résistance. Le projet représente un ensemble d’études types qui pourront viser à comprendre des mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou à évaluer l'efficacité thérapeutique de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’étudier par imagerie in vivo des modèles de cancer ovarien à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou pour l'évaluation de nouveaux médicaments.

Procédures

Induction de cancer ovarien : 1 acte par animal soit par chirurgie (15min max d’intervention sous anesthésie générale) soit sans chirurgie : injection intrapéritonéale (quelques secondes), injection sous cutanée (quelques secondes sous anesthésie générale) Suivi par imagerie : au maximum 2 examens non invasifs par semaine pendant 12 semaines sous anesthésie générale Les examens d’imagerie ont une durée de 5 secondes à 30 minutes suivant le type d’imagerie. Traitements : au maximum 5 traitements par semaine pendant 12. Il faut 30 secondes au maximum pour administrer un traitement. Prélèvement de sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire : en 3 fois sur 24h ou en 1fois/jour sur 5 jours. Il faut environs 30 secondes pour effectuer ce type de prélèvement et appliquer un point de pression avec un crayon hémostatique au point de collecte pour arrêter le saignement.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus pour les animaux sont liés à la chirurgie lors de l’induction du modèle orthotopique et au développement de foyers tumoraux au niveau sous-cutané ainsi qu’au niveau de l’ovaire et des viscères. L’administration d’antalgique 1h avant et 24 h après la chirurgie et l’utilisation de l’anesthésie gazeuse permettent de réduire la souffrance animale due à l’incision des plans musculaires et cutanées. Une gêne pourrait apparaitre dans le modèle sous cutanée à partir du moment où la tumeur atteint un volume proche du point limite. Un gonflement de l’abdomen avec présence d’ascite peut apparaitre 8 semaines après l’induction lors de l’évolution des métastases péritonéales dans le modèle orthotopique et dans le modèle carcinose péritonéale. Cette nuisance sera prise en compte dans la grille de. Le point limite étant alors atteint, l’animal sera mis à mort. Nous n’attendons pas de douleur ou d’intolérance liées aux composés testés. Si des effets secondaires apparaissaient, le suivi des animaux via la grille de scoring permettra de les mettre en évidence et de prendre les mesures adéquates.

Devenir

Toutes les souris porteuses de cellules de carcinome ovarien seront mises à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.

Remplacement

L'étude de tumeurs ou métastases résulte de l’interaction de nombreux types cellulaires et ne peut pas être modélisée in vitro. Aucune autre méthode expérimentale ne serait en mesure d’apporter un niveau équivalent d’information que la procédure expérimentale impliquant l’utilisation d’animaux vivants.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en oeuvre des techniques d’imagerie qui permettent de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Cette approche permet de réduire de façon notable le nombre d’animaux nécessaires à 10 par groupe pour réaliser des tests statistiques pertinents. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris.

Raffinement

Les méthodes d'imagerie mises en œuvre sont non invasives et certains actes sont réalisés sous anesthésie ce qui limite la douleur et le stress infligé au cours de l’expérimentation. Par ailleurs, Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé, ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes. Elles seront hébergées au nombre de 6 animaux maximum dans des cages de type II (530cm²). Les cages sont enrichies avec des petits cylindres de coton pour la fabrication d’un nid. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. L'induction des modèles tumoraux sera réalisée sous anesthésie générale. Durant les actes de chirurgie, la douleur sera également prise en charge par l’administration d'anti inflammatoire le jour et 24h post opératoire. Les animaux seront observés quotidiennement et des grilles de scoring avec des points limites prédictifs nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Par ailleurs il existe des souris immunodéficientes bien adaptées pour les implantations de cellules d'origine humaine. Modèle de cancer réalisable chez la jeune souris (5 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.