Cancers

Maintenues éveillées dans un tube de contention, les 648 souris du projet reçoivent toutes une injection dans la veine de la queue, et 192 d'entre elles une injection dans l'abdomen, sans anesthésie elle aussi. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une thérapie cellulaire destinée à accélérer la reconstitution du système immunitaire après une greffe de cellules souches. Selon les groupes, 48 sont irradiées éveillées, 128 reçoivent une injection dans le sinus orbital sous anesthésie générale et 48 sont gavées chaque jour pendant trois semaines, une chimiothérapie étant aussi prévue sans effectif précisé. Le porteur écrit pourtant que les injections peuvent provoquer un stress "nécessitant une anesthésie générale au préalable". Toutes sont tuées en fin d'expérience pour l'analyse de leurs organes, 192 après une prise de sang dans le sinus orbital sous anesthésie.

Objectifs

La greffe de cellules souches offre des perspectives de guérison aux patients atteints d’hémopathies malignes (cancer du sang) et à d'autres troubles hématologiques comme les déficits immunitaires. La transplantation avec des cellules souches peut être autologue (provenant des propres cellules du patient) ou allogénique (provenant d’un donneur sain et compatible avec le receveur). La greffe allogénique est limitée par le manque de donneurs compatibles. Lorsqu’un patient est atteint d’un cancer du sang, celui-ci subira des chimiothérapies et/ou irradiation réduisant à néant son système immunitaire avant d’être injecté par des cellules souche. Mais la durée de restauration d’un système immunitaire efficace et fonctionnel après la greffe peut aller jusqu’à deux ans. Durant cette période, le patient n’a pas d’immunité pleinement fonctionnelle et peut contracter de multiples infections représentant une des principales causes de mortalité. Nous proposons de réduire cette période de risque chez les patients en proposant une approche thérapeutique innovante pour accélérer la reconstitution d’un système immunitaire fonctionnel. De cette façon, le délai de reconstitution est réduit à 3 mois (au lieu de deux ans) permettant de réduire les durées d’hospitalisation et les risques d’infections opportunistes. Dans cette perspective, les résultats précliniques doivent être consolidés par des données pharmacologiques dans un modèle murin adulte mimant la condition clinique des patients. La souris représente un modèle pertinent pour l’étude. Ces souris nécessitent un conditionnement par chimiothérapie et/ou irradiation comparable à ceux utilisés chez les patients avant d’être greffés. Ces souris représentent un modèle indispensable afin de tester in vivo les stratégies thérapeutiques proposées dans des conditions similaires à celles utilisées chez les patients. Il s’agit d’une étape indispensable à l’application de nouvelles stratégies innovantes dans les protocoles cliniques.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et de justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant l’injection de cellules immunitaires pour lutter contre les cancers du sang. L’acquisition de ces données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. De plus, les études de régénération d’un thymus chez les souris âgées peuvent ouvrir la voie à une nouvelle perspective thérapeutique chez les patients souffrant de complications liées au processus de vieillissement, au SIDA, ou aux radiations dues à une catastrophe nucléaire. En effet, dans tous les cas cités, les personnes sont susceptibles de perdre leurs systèmes immunitaires et l’approche thérapeutique proposée permettrait de régénérer de façon rapide et efficace une défense immunitaire fonctionnelle.

Procédures

Les interventions se limiteront à : 1. Irradiation : L’irradiation durera moins de 5 minutes sur les animaux vigiles. 48 souris seront irradiées 1 fois. 2. Une seule injection intraveineuse dans le sinus orbitale gauche et/ou droit sous anesthésie générale. L’injection durera 1 minute / animal sur 128 souris 3. Une injection intraveineuse dans la veine caudale de la queue des souris vigiles maintenues dans un tube de contention. L’injection durera

Impact sur les animaux

De façon général, les médicaments de chimiothérapies et/ou irradiation peuvent occasionner chez l'animal des symptômes cliniques de type amaigrissement et anémie. Les injections peuvent provoquer une légère douleur localisée et un stress nécessitant une anesthésie générale au préalable. Le gavage peut provoquer un stress et une douleur au niveau de l’œsophage chez l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérience pour le prélèvement et l’analyse des organes nous permettant de conclure sur l'efficacité du traitement.

Remplacement

Des études de différenciation in vitro ont été réalisées afin d’optimiser les conditions de préparation des cellules à injecter et de s’assurer de leur potentiel à donner des cellules fonctionelles. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus expérimental de mises au point. Les études précliniques de pharmacologie (mode d’administration, effet dose-réponse, efficacité de colonisation du thymus âgés) sont demandées par les autorités règlementaires avant les essais cliniques et ne peuvent pas être substituées ou mimés in vitro.

Réduction

La méthode de chimiothérapie et/ou irradiation la plus adaptée sera préalablement choisie avant les études de dose réponse. Ces études permettront de choisir une condition de greffe optimale et ainsi de diminuer les échecs de greffe. Le modèle animal choisi et le plan expérimental sont inspirés de plusieurs études similaires très bien documentées dans la littérature. Cela confirme la pertinence du modèle expérimental et renforce la validité de nos hypothèses évitant des étapes intermédiaires de mise au point chez l’animal. Le nombre d’animaux par groupe dans les différentes procédures a été calculé selon une méthode fiable et très utilisée dans la littérature permettant de fournir des données statistiquement exploitables. Les expérimentations seront regroupées au maximum et dans la mesure de la faisabilité technique, afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Une partie des animaux pourra ne pas être utilisée en fonction des résultats obtenus pour permettre l’ajustement de la dose des traitements (168 souris potentielles).

Raffinement

Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton de nidification et de rouleaux en carton pour favoriser les cachettes et le jeu. Le nombre de souris sera limiter à 5 animaux par cage. Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de l'étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés. La mise à mort sera précédée par une anesthésie générale pour éviter le stress et la souffrance. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable ou souffrance à l’issue de la greffe des cellules immunitaires au sinus retro-orbital chez les animaux greffés. Toute chimiothérapie et/ou irradiation sera suivie rapidement par une greffe de cellules et toute manifestation de signes de douleur sera scrutée selon les critères de définition des points limites de la présente étude. En cas de signe de souffrance et selon les résultats de la grille préétablie, le personnel qualifié et le responsable scientifique de l’étude pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement du systéme immunitaire. En effet, le système immuno-hématologique murin est très similaire au système humain dans sa fonctionnalité et son développement permettant une extrapolation des résultats obtenus. Cette espèce est facile à élever en animalerie et présente une grande homogénéité génotypique. Souris adultes de 6 à 12 semaines (et souris adultes âgées de plus de 9 mois) car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier son développement.

Une souris chez qui une perte de poids liée à une baisse d'alimentation et une mobilité réduite deviennent prononcées en même temps est mise à mort, tout comme celle qui montre des signes de douleur avec une tumeur de grande taille. 540 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées au plus tard après huit semaines pour prélever leur tumeur et leur sang. Elles reçoivent sous anesthésie une injection de cellules de mélanome sous la peau du flanc, puis, une fois la tumeur de la taille d'un petit pois, trois injections d'immunothérapie dans l'abdomen, éveillées, et jusqu'à quatre prises de sang à la joue sans anesthésie. Certains groupes reçoivent en plus une injection quotidienne dans l'abdomen, cinq jours par semaine, d'un inhibiteur de la protéine étudiée, et la tumeur peut s'ulcérer, modifier la respiration ou réduire la mobilité. Le projet cherche si un récepteur des cellules cancéreuses favorise la résistance aux traitements du mélanome, et le porteur avance qu'à terme ce récepteur "pourrait être un marqueur prédictif de réponse" chez les patients.

Objectifs

Le mélanome est un cancer de la peau ayant un mauvais pronostic et une incidence croissante, ce qui en fait un problème majeur de santé publique. De nouvelles thérapies ont permis d’améliorer la prise en charge du mélanome lorsque celui-ci s’est propagé dans d’autres organes, cependant l’échappement thérapeutique et la toxicité sont des phénomènes très fréquents qui limitent grandement leur bénéfice clinique. Ainsi, l’identification de nouveaux marqueurs de la résistance à ces thérapies reste un enjeu considérable. Il a déjà été démontré qu’un récepteur présent à la surface des cellules de la peau, est impliqué dans la progression du mélanome et que son expression est associée à un mauvais pronostic avec une diminution de la survie des patients. Nous souhaitons donc évaluer si ce récepteur est impliqué dans la résistance aux traitements dans le cancer de la peau et pourrait être utilisé comme molécule permettant d’anticiper la non réponses aux traitements des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de démontrer le rôle du récepteur dans la réponse aux traitements et ainsi confirmer son rôle de cible thérapeutique dans le mélanome. A terme, ce récepteur pourrait être un marqueur prédictif de réponse à ces thérapies chez les patients atteints de mélanome.

Procédures

La mise en place du modèle d’étude consiste dans un premier temps à injecter une seule fois sous la peau des souris (au niveau du flanc) des cellules de cancer de la peau où la protéine d’intérêt est exprimée ou non. Cette injection se fait sous anesthésie et dure environ 1 minute. Lorsque la tumeur sera détectable (taille d’un petit pois), les souris recevront le traitement (3 injections, sur souris éveillée, dans l’abdomen espacées de 3 jours ; durée de l’injection : 15s). Des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la joue (sans anesthésie ; durée : 1 min) seront réalisées avant le début du traitement, puis 1 fois par semaine (4 prélèvements maximum). Pour les groupes de souris où il y a la combinaison des molécules inhibitrices de la protéine d’interêt, en plus des 3 injections d’immunothérapies espacées de 3 jours, s’ajouteront une injection quotidienne (5 jours par semaine) sur souris éveillée, dans l’abdomen d’un produit inhibant la protéine d’intérêt (durée : 15s). Les tumeurs seront mesurées deux fois par semaine (durée 30s). Au bout de 8 semaines maximum, les souris sont euthanasiées afin de prélever les tumeurs.

Impact sur les animaux

Suite à la croissance des tumeurs et/ou au développement de métastases, une perte de poids peut être observée. Un développement trop important de la tumeur peut également induire une ulcération, un changement de la respiration ou encore une agressivité. Le point d’injection des cellules tumorales étant sur le flanc, les souris peuvent présenter une mobilité réduite si la tumeur atteint une taille trop importante. Enfin, l’immunothérapie peut se révéler légèrement toxique, ce qui se manifestera par une perte de poids principalement ou un gonflement de l’abdomen.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures expérimentales afin de collecter la tumeur et le sang, qui seront analysés et conservés afin de caractériser au niveau cellulaire l’effet de la thérapie en présence ou non de la protéine d’intérêt.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences en utilisant des cellules en culture (in vitro, sans utilisation d’animaux) qui ont montré que le récepteur avait un impact sur la réponse aux traitements anti-cancéreux. Cependant, pour obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe dans le corps humain, nous devons passer à des tests dans des modèles animaux vivants (in vivo). Ces modèles intègrent des caractéristiques importantes des tumeurs humaines, telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, la présence de tissus sains et des barrières qui peuvent limiter l’efficacité des traitements. Il est donc impossible de poursuivre la validation de nos résultats in vitro sans utiliser un modèle animal entier vivant.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Pour cela nous nous sommes basés sur des tests statistiques.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant une fois par semaine une grille d'évaluation prenant en compte la taille de la tumeur, l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. En effet, tout signe de souffrance et/ou douleur caractérisés par une réduction de l’alimentation avec une perte de poids ou une réduction de la mobilité donneront lieu à une mise à disposition de croquettes humidifiées dans les cages avec une surveillance quotidienne. Si ces signes sont observés d’une manière prononcée la surveillance de l’animal sera bi-quotidienne avec une mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage et la mise en place d’une analgésie injectée une fois par jour afin de soulager la potentielle douleur. Si deux de ces signes sont observés de manière prononcée simultanément, l’animal sera euthanasié selon une méthode réglementaire. En cas de signe de douleur (expression faciale, posture voutée) et de tumeur d’une taille importante (définie dans la grille de score) avec ou sans ulcération, la souris sera immédiatement euthanasiée selon une méthode réglementaire.

Choix des espèces

Le modèle de greffe de cellules cancéreuses est bien décrit dans la littérature scientifique et est pertinent pour l’étude de l’effet de thérapies sur la croissance des cellules cancéreuse. Pour mener à bien ce projet, nous utiliserons des souris adultes, afin qu’elles disposent d’un système immunitaire complétement développé. Cela nous permet d’être dans des conditions comparables à ce qui est observé chez l’Homme, le cancer de la peau étant un cancer observé chez l’adulte. Le mélanome étant un cancer qui se développe chez l’adulte, ainsi des souris mâles adultes âgées de 7-8 semaines seront utilisées lors de l’expérimentation, ce qui permettra également un suivi durant une période suffisamment longue.

Humanisées par injection de cellules souches ou de globules blancs humains, les souris de ce projet développent une maladie du greffon contre l'hôte, les cellules humaines finissant par attaquer leur organisme. 1 240 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur humaine sous anesthésie générale, jusqu'à deux administrations par jour pendant huit semaines, des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital ou à la veine caudale, et une ponction intracardiaque terminale. Le porteur classe la maladie du greffon contre l'hôte en gravité modérée au motif que la perte de poids importante déclenche la mise à mort de l'animal avant la suite.

Objectifs

L'immunothérapie a révolutionné le traitement des cancers depuis 10 ans, avec des taux de survie à long terme sans précédent, mais ses bénéfices restent limités. La particularité de cette approche est qu'elle ne cible pas directement la tumeur comme les autres stratégies thérapeutiques (chimiothérapies, radiothérapie,…), mais vise à utiliser les cellules du système immunitaire pour défendre l’organisme en reconnaissant et détruisant les cellules cancéreuses grâce notamment à des anticorps qui vont réveiller le système immunitaire (anticorps inhibiteurs de points de contrôle immunitaire) ou obliger des cellules dites « tueuses » à attaquer directement les cellules cancéreuses (anticorps bispécifiques). Mais comme tous les types de tumeurs et tous les patients ne répondent pas ou deviennent résistants aux médicaments existants, il faut identifier de nouveaux traitements qui pourraient prolonger les réponses ou améliorer le taux de patients répondeurs. Il y a donc une demande importante de modèles expérimentaux plus prédictifs et pertinents, pour améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans la réponse ou la résistance aux immunothérapies actuelles, et permettant d’évaluer de nouveaux traitements immunothérapeutiques. La particularité de ces traitement nécessite l'utilisation de modèles expérimentaux spécifiques possédant des cellules immunitaires capables de détruire la tumeur. Pour cela nous projetons de travailler avec deux types de modèles souris humanisées qui sont des modèles de choix pour étudier les interactions entre cellules immunitaires et cellules tumorales humaines greffées conjointement: - des souris humanisées par injection de cellules souches capable de recréer un système immunitaire humain chez la souris; - des souris humanisées à l'aide de cellules immunitaires présentes dans le sang (appelées Leucocytes ou globules blancs)

Bénéfices attendus

Ce projet a donc pour objectif le développement de modèles de souris humanisées portant à la fois un système immunitaire humain et des tumeurs humaines nécessaires pour déterminer l'efficacité d'immunothérapies (anticorps thérapeutiques) développées ou en cours de développement dans un contexte préclinique. Ces modèles devraient permettre d'identifier et d'évaluer de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que de valider de nouveaux anticorps dirigés contre ces cibles afin d'améliorer la prise en charge des patients pour lesquels il n'existe pas de solutions thérapeutiques à l'heure actuelle, et/ou d'apporter de nouvelles solutions thérapeutiques à des patients pour lesquels les traitements actuels sont insuffisants.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale (greffe de tumeurs) qui dure 1 à 2 minutes. Les animaux seront manipulés une à trois fois par semaine si leur état général ne nécessite pas une surveillance renforcée: les souris seront pesées minimum 1 fois par semaine et les tumeurs seront mesurées jusqu'à 3 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale suivie jusqu’à 12 semaines. Les cellules immunitaires humaines servant à humaniser les souris seront injectées une seule fois. Selon les traitements expérimentaux, les animaux recevront au maximum 2 administrations quotidiennes pendant 8 semaines maximum. Des prélèvements de sangs seront effectués au niveau du sinus retro-orbital (sous anesthésie gazeuse) ou de la veine caudale dans le respect des directives européennes. Des ponctions intracardiaques seront pratiquées lors de prélèvements terminaux, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Suite à l’anesthésie et la chirurgie, des douleurs post-opératoires et un risque d’infection peuvent être attendus. Ces nuisances sont transitoires et peuvent donc être classées en modérées. Si ces nuisances devaient persister, elles déclencheraient l’euthanasie de l’animal par atteinte d’un point limite. Dans le cas de l’injection de cellules immunitaires humaines, les cellules humaines finissent par attaquer la souris, il s'agit de la 'maladie du greffon contre l'hôte' ou GvHD. Elle se manifeste quelques semaines après l’injection et se traduit d’abord par une perte de poids importante, puis une voussure dorsale et/ou une mobilité réduite. Cette nuisance peut être classée comme modérée dans la mesure où la perte de poids importante déclenche l’euthanasie de l’animal par atteinte d’un point limite.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet étant porteur de tumeurs, à l'issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés. Leur réutilisation n'est pas possible compte tenu des procédures expérimentales que ces animaux ont subies (greffe de tumeurs, injection de cellules immunitaires humaines).

Remplacement

La production de nouveaux traitements permettant de lutter contre le cancer nécessite la réalisation de tests pré-cliniques afin de valider leur effet antitumoral. De nombreuses lignées cellulaires originaires de tumeurs de patient ont été dérivées pour la réalisation de tests in vitro, et depuis quelques années l’utilisation de modèles cellulaires en '3D' (organoïdes) est en plein essor. Ces modèles sont très utiles mais sont plutôt utilisés en amont des tests sur les animaux dans le processus de développement de médicaments contre le cancer. Ces tests in vitro contribuent à une évaluation plus complète des candidats médicament et à une réduction de l'utilisation d'animaux dans la recherche. Cependant, il est difficile de remplacer entièrement les tests sur les animaux par des tests in vitro, d'une part car les tumeurs sont des environnements complexes et les tests in vitro ne capturent pas pleinement cette complexité. Dans le cas spécifique de ce projet utilisant des souris humanisées, il est nécessaire de pouvoir caractériser les cellules du système immunitaire capables d'infiltrer la tumeur et celles présentent dans la circulation pour comprendre l’impact d’un traitement sur les cellules immunitaires présentes et les cellules tumorales. Et ces interactions système immunitaire/tumeurs ne peuvent être évaluées de manière optimale qu'in vivo

Réduction

La connaissance parfaites des modèles de tumeurs utilisés dans ce projet permet de mettre en place une stratégie expérimentale n’utilisant que le nombre strictement nécessaire d’animaux pour obtenir des résultats pertinents. Les traitements retenus pour ce projet auront été sélectionnés au préalable lors d’études de caractérisation poussées in vitro pour ne tester que des traitements potentiellement efficaces chez l'animal.

Raffinement

Lors de l’acte chirurgical, pour éviter le risque d’hypothermie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant. Afin d’éviter les risques d’infection en suite de chirurgie, un antiseptique (Biseptine®) sera appliquée sur la peau de l’animal préalablement à l’incision réalisée lors de la greffe. Les agrafes permettant de refermer l’incision après la greffe seront également aseptisées avec de la Biseptine®. Le matériel utilisé lors de la greffe (ciseaux, pinces, puces) sera préalablement stérilisé par autoclave. En cas d’une perte de poids supérieur à 15% du poids en début d'expérimentation, une supplémentation sous forme de gel alimentaire sera ajoutée dans la cage jusqu'à ce que la perte de poids soit inférieure à 10% du poids en début d'expérimentation. Si une sécheresse oculaire est observée lors des prélèvements, un protecteur oculaire (Ocry-Gel®) sera administré à l’animal.

Choix des espèces

On considère que passé l'âge de 6 mois (soit 26 semaines) les souris sortent de la catégorie "adulte mature" et commencent à montrer des signes de sénescence. Pour rester au plus près de cette catégorie d’adulte mature et du fait des contraintes de temps liées à l’utilisation d’animaux humanisés par injection de cellules souches, les animaux utilisés ne devront pas dépasser l’âge de 31 semaines. En effet, la période nécessaire au développement du système immunitaire étant de 12 à 13 semaines après injection des cellules sur des animaux de 4-5 semaines, les tumeur seront greffées sur des animaux de 17 à 19 semaines en fin de période d’acclimatation et la croissance tumorale suivie jusqu'à 12 semaines après la greffe, ce qui nous amène à un âge des animaux maximum de 31 semaines. Dans le cas des souris humanisées par injection de Leucocytes (ou globules blancs), les animaux utilisés seront tous des animaux adultes âgés de 6 semaines en fin de période d'acclimatation et âgés de moins de 13 semaines au moment de la greffe et la croissance tumorale sera suivie jusqu’à 12 semaines après la greffe. La durée de chaque procédure correspond donc au suivi de la croissance tumorale, elle est donc de 12 semaine maximum.

Greffées sous la peau du flanc avec des cellules de mélanome de l'œil, puis injectées dans l'abdomen trois fois par semaine sur animal vigile et sans anesthésie, pendant jusqu'à seize semaines, 422 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes seront tuées pour récupérer les tumeurs et les organes porteurs de métastases. Le porteur décrit une croissance tumorale pouvant entraîner poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration et nécrose de la peau, auxquelles s'ajoutent rougeurs, infections et nécroses au point d'injection. Il annonce par ailleurs que la lignée cellulaire créée à cette occasion servira à des expériences in vitro permettant de "s'aligner sur le bien être animal".

Objectifs

Le mélanome oculaire est une tumeur cancéreuse de l’œil se développant à partir des cellules « les mélanocytes », responsables de la production de mélanine (le pigment de notre peau et de nos yeux). Ce cancer est le plus fréquent dans la population adulte. La majorité de ces mélanomes a pour origine l’uvée, un tissu de l’oeil. Si la tumeur primaire peut être traitée par énucléation ou irradiation, il a été mis en évidence que des micrométastases se propageaient via la circulation sanguine plusieurs années avant le diagnostic. Ces métastases sont fortement résistantes aux traitements par chimiothérapie ainsi qu’à la radiothérapie. L’absence de traitement efficace pour ces tumeurs entraine une mortalité à 90% dans les 6 mois qui suivent la découverte des métastases. Actuellement, il n’existe pas de traitement approuvé pour le mélanome uvéal métastatique. Il faut donc continuer à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression de cette tumeur pour identifier des cibles thérapeutiques et des traitements efficaces. Pour ce faire, nous avons réalisées des études du profil d’expression des gènes qui nous ont permis d’identifier de nouveaux candidats cibles intéressants. De plus, l’absence de modèles expérimentaux (cellulaires, animaux) de mélanome uvéal ne permet pas de tester l’efficacité préclinique de drogues dans un contexte de système immunitaire complet. Pour améliorer cela et pouvoir proposer des traitements personnalisés pertinents, nous désirons mettre en place un modèle de souris qui repose sur la greffe de cellules issues de biopsies de mélanome uvéal de souris dans des souris immuno-déficientes.

Bénéfices attendus

Le premier but de ce projet est de développer une lignée de cellules de mélanome uvéal murin qui sera utile à la communauté internationale. Ce modèle sera utile à l’ensemble de la communauté scientifique travaillant dans ce domaine pour des études in vivo mais aussi in vitro permettant de s’aligner sur le bien être animal. Une fois ce modèle établi, il sera aussi possible d’étudier l’efficacité de certaines molécules dans des animaux ayant un système immunitaire complet dans le but de lutter contre la progression du mélanome uvéal.

Procédures

Les souris seront toutes injectées en une fois en sous-cutané (sous la peau) sur le flanc avec des cellules de mélanome uvéal murin. Après observation de la croissance tumorale, les souris sont traitées trois fois par semaine avec les différents produits décrits, par injection intra-péritonéale (au niveau de l'abdomen) en alternant les côtés à chaque injection. La durée de traitement sera définie par la croissance tumorale et l’expérience sera arrêtée lorsque la tumeur aura atteint un volume défini (ou un maximun de 16 semaines après injection des cellules). Cette intervention ne nécessite pas d’anesthésie et est effectuée sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection de traitement. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…). L’injection des traitements pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose,..). Le site d’injection sera également surveillé.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs de mélanome et/ou les organes (foie, poumons,...) présentant des métastases afin de réaliser des analyses in vitro.

Remplacement

En termes de remplacement, il n'est pas possible de s'affranchir complètement de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives qui permettent la survie de cellules de mélanome oculaire murin fraichement isolées à partir d’une biopsie et de travailler de façon intégrée où l’écosystème tumoral est reproduit. Cependant, la nouvelle lignée cellulaire de mélanome oculaire murin pourra être utilisée pour des expériences in vitro.

Réduction

En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaire à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test statistique. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs de mélanome et/ou les organes (foie, poumons,...) afin de réaliser des analyses in vitro. Il est fort probable que le nombre d’animaux utilisés soit très inférieur à la fin du projet. En effet, certaines procédures ou parties de procédures pourront être abandonnées, ou le nombre d’animaux réduit, en fonction des résultats obtenus. Dans le meilleur respect du bien-être animal et dans le but de réduire, nous utiliserons des souris immunodéprimés mâles et femelles provenant de notre élevage.

Raffinement

En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi et observées quotidiennement par les animaliers et de façon exhaustive deux ou trois fois par semaine par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, stress ou inconfort. Les manipulateurs, habitués à l’expérimentation sur les souris, éviteront tout dommage à l’animal lors des injections.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes avec l’homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établi ainsi qu’une petite taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Les deux modèles de souris que nous utiliserons dans ce projet sont commercialisés, bien connus et de nombreuses études ont déjà été réalisées à partir de ces modèles. Pour les procédures expérimentales, les souris sont utilisées au stade adulte (7 semaines). Elles sont commandées à 6 semaines, puis l’expérience commence après une semaine d’acclimatation à l’animalerie. Ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà faites dans l’équipe et les données de la littérature.

Une greffe de glioblastome humain dans le cerveau, au moins dix séances d'imagerie sous anesthésie, dix séances de radiothérapie, douze administrations du composé testé et un test d'éviction d'obstacle trois fois par semaine : 164 souris immunodéprimées vont subir ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur cérébrale implantée provoque des effets délétères que le porteur qualifie lui-même de non réversibles, et la répétition des anesthésies peut entraîner une accoutumance obligeant à augmenter les doses administrées. L'objet du projet est de vérifier si l'augmentation d'une protéine, combinée à son activation par une molécule, ralentit la croissance tumorale et améliore la réponse aux traitements standards, les retombées annoncées pour les patientes et les patients restant renvoyées au conditionnel. 116 souris sont tuées dès l'atteinte d'un point limite, et 48 autres, dites "satellites", plus tôt encore, à la fin du schéma de traitement, pour analyser leurs tissus.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment l'augmentation de la quantité d'une protéine affecte la croissance des tumeurs cérébrales chez les souris, et favorise leur réaction aux traitements anticancéreux habituels. L'objectif final est d'appliquer cette méthode aux patients. Des études précédentes sur des données de patients ont montré que plus cette protéine est présente, meilleure est la survie des patients, surtout chez les femmes. En laboratoire, nous avons aussi observé que lorsqu'on augmente la quantité de cette protéine, le nombre de cellules tumorales diminue de moitié. De plus, nous avons constaté qu'un activateur de cette protéine a un effet antitumoral sur des tumeurs greffées sous la peau de souris, qu'elles soient mâles ou femelles. Notre objectif est maintenant d'étudier comment une augmentation de la quantité de cette protéine combinée à son activation par une molécule spécifique affecte la croissance tumorale et la réponse aux traitements anticancéreux standards dans un modèle de tumeur intracérébrale chez la souris (qui se rapproche de la réalité chez l'humain). Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet constitueront une base pour comprendre le rôle de la protéine étudiée dans l’augmentation de la survie des patients et éventuellement proposer l'utilisation de l'activateur de cette protéine pour le traitement des glioblastomes chez les patients dont la tumeur présente une forte quantité de cette protéine. Cette étape est indispensable pour soutenir le transfert clinique de nos travaux en lien avec une thèse de doctorat et les financements de la Ligue contre le cancer et du CNRS. En effet, ce projet innovant (très peu décrit dans la littérature) permettrait à terme de mieux comprendre les processus responsables des différences d'apparition des glioblastomes et de réponse au traitement entre les hommes et les femmes. En cas de résultats probants, cela permettrait d'apporter de nouvelles voies thérapeutiques pour la recherche clinique, notamment en employant des inducteurs (qui augmentent la quantité) et des activateurs (qui augmentent la fonctionnalité) de cette protéine dans le cas du traitement de tumeurs chimiorésistantes marquées par un échec thérapeutique (chimio-sensibilisation).

Procédures

- greffe intracérébrale (1 seule itération à J0) : durée=45 min (EU1) - Imagerie bioluminescence (au minimum 10 injections) : durée 15 min (EU2) - Traitement par radiothérapie (10 itérations) : durée 10 min pour chaque session (EU2) - Traitement par le composé d'intérêt (12 itérations) combiné ou nonà la chimiothérapie (10 itérations) : durée 1 min par traitement (EU1). - Test d'éviction d'obstacle (3 fois par semaine ) : durée 5 min (EU1)

Impact sur les animaux

La première nuisance attendue sur les animaux est liée à l'implantation même du glioblastome (apparition d'une tumeur cérébrale avec des effets délétères attendus non réversibles). Puis, le schéma de traitement par radiothérapie (itérations répétées) et l'imagerie par bioluminescence (2 ou 3 fois par semaine selon le timing dans le projet) nécessitent un transport et une anesthésie répétés des animaux. Lorsque les sessions de bioluminescence sont le même jour que la radiothérapie, une seule anesthésie sera réalisée, l'irradiation et l'imagerie se faisant sur le même site où est hébergé l'irradiateur. Une accoutumance liée à la répétition des anesthésies chimiques peut être observée, nécessitant une augmentation des volumes administrés : ce phénomène est maitrisé par le laboratoire. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de transport des animaux. Les administrations quotidiennes de l'activateur de la protéine conduisent à un dérangement journalier des animaux, le cycle jour/nuit de l'animalerie étant inversé, la gêne occasionnée sera faible, les animaux étant ainsi manipulés durant leur phase d'activité. Le site d'injection dans le péritoine sera alterné chaque jour (gauche-droite) pour éviter les réactions liées à l'injection et des aiguilles très fines seront utilisées pour l'injection.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue des procédures. Ainsi 164 souris au maximum seront mises à mort dès lors de l'atteinte d'un point limite (étude efficacité/survie : 58 souris femelles et 58 souris mâles) ou plus précocement à l'issue du schéma de traitement de chaque groupe (48 souris "satellites" : 24 souris femelles et 24 souris mâles ). La mise à mort des souris "satellites" à la fin du schéma de traitement est justifiée de part la nécessité de réaliser une analyse des tissuss pour pouvoir caractériser l'impact de chaque modalité de traitement.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement et la réponse à un traitement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus, la mise en place d'une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires. En outre, la réponse d'une tumeur traitée par un médicament dépend de la quantité de médicament qui parvient à la tumeur. De plus, notre projet est directement associé à l'impact du statut hormonal engendré par le sexe des animaux. L'ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu'in vivo sur un modèle animal. Il est donc primordial de conforter ces résultats sur un modèle "in vivo" de façon à se rapprocher le plus possible de la réalité clinique.

Réduction

Chacune des 3 étapes sera d’abord réalisée chez des animaux femelles puisque la surexpression de la protéine d'intérêt est de bon pronostic essentiellement chez les femmes, puis éventuellement testée chez des animaux mâles pour évaluer la pertinence de cette modulation hormonale pour les hommes. Dans le cadre de ce projet, les expérimentations seront menées étape par étape, tout d’abord en réalisant l’étude sur les animaux "femelles" associés à l'étape 1 qui concerne la comparaison in vivo de la croissance tumorale de cellules avec une forte quantité de protéine par rapport à des cellules tumorales ayant une quantité modéré de la protéine étudiée. Nous implanterons d'abord la concentration habituelle de cellules : si cette dernière offre un bon taux de prise tumorale et une croissance tumorale acceptable cette concentration sera validée et les animaux du groupe suivant ne seront pas utilisés. A l'inverse, si cette concentration s'avère insuffisante, les souris du groupe 3 seront greffées avec une concentration double. La concentration "optimale" retenue sera celle utilisée dans le reste de l'étude. Notre démarche consistera à réaliser successivement plusieurs séries d’animaux. Concernant le nombre de souris satellites, il s’agira de comparer, indépendamment chez les mâles ou les femelles, l’effet des traitements par rapport au groupe contrôle par l’analyse de marqueurs dans les tissus prélevés : ces analyses sont fiables et ne nécessitent qu’un effectif réduit pour révéler un effet, s’il existe. Ainsi on estime -à priori- que même si l’effet des traitements est faible, un effectif de 6 souris / groupe sera suffisant pour assurer une puissance statistique suffisante (simulation par logiciel de calcul de puissance). Concernant le nombre de souris en suivi de croissance tumorale, la comparaison se fera aussi indépendamment chez les mâles et les femelles. Ainsi, sur la base de nos précédentes études, on estime que l’effet des traitements aura un effet faible sur la croissance tumorale. Au minimum 6 mesures d'imagerie seront réalisées en suivi de traitement. Le nombre minimum d’animaux nécessaires par groupe est ainsi trouvé 10 animaux par groupe pour assurer une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux, d'une part lors de l'implantation de la tumeur (réalisée sous anesthésie chimique, désinfection plaie, chirurgie aseptique, suivi post opératoire rigoureux) puis à la suite de la greffe (pesée 3 fois/semaine, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, suivi de la croissance tumorale). Une vigilance accrue sera également menée lors de l'administration des traitements (pesée quotidienne, vérification du comportement et de l'état sanitaire individuel des animaux, conditions de transport de façon à éviter au maximum stress des animaux). Un suivi quotidien garantissant le bien-être optimal des animaux sera mené (température d'hébergement optimale, eau de boisson et nourriture ad libitum, enrichissement sous forme de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger). Quel que soit le groupe, nous réaliserons la mise à mort dès que les points limites définis apparaitront (perte de poids et problème de motricité essentiellement).

Choix des espèces

Dans les études menées pour comprendre le développement des cancers, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines, car du fait de leur immunodéficience, il n'y a pas de réaction de rejet du greffon tumoral implanté. Les souris mâles ou femelles seront âgées de 7 semaines au moment des greffes (20 à 26g), les animaux jeunes étant plus adaptés au développement de tumeurs cérébrales. L'intérêt lié au choix de cette tranche d'âge est également lié au fait que les animaux ont atteint leur maturité sexuelle et que leur système hormonal est fonctionnel.

Aucune souris n'est gardée plus de vingt-huit jours après l'injection des cellules leucémiques, ni au-delà du point limite si elle l'atteint avant. 32 souris NSG, dépourvues de système immunitaire, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent la leucémie dans la veine de la queue, puis un traitement cellulaire une semaine plus tard, trois prises de sang caudales et des séances d'imagerie sous anesthésie après injection d'un produit dans le ventre. Le porteur décrit la maladie qu'il leur donne, poils hérissés, baisse d'activité, perte de poids et parfois début de paralysie des pattes arrière, pour comparer deux thérapies cellulaires dont l'une pourrait, à terme, persister plus longtemps chez les patients.

Objectifs

La thérapie anti-cancéreuse appelée CAR-T cells, est produite à partir des cellules du patient. Ces cellules sont modifiées génétiquement pour les armer contre les cellules cancéreuses, ce qui permet de traiter la leucémie. Bien qu’elles soient efficaces et arrivent à tuer les cellules cancéreuses, leur efficacité disparait à court terme. De plus, leur préparation est complexe, longue et présente un risque potentiel de contamination par des cellules malades. En conséquence, la production de ces cellules à partir de donneurs sains se développe, pour les rendre immédiatement opérationnelles. De plus, nous souhaitons utiliser une nouvelle source de cellules provenant de donneurs sains et qui sont anti-virales (VST) : celles-ci sont capables de persister à long terme chez les patients. Aussi, nous souhaitons fabriquer des cellules anti-cancéreuses à partir de ces VST. Nous obtiendrons des CAR-VST qui permettraient d’apporter un bénéfice majeur par rapport au traitement de référence par CAR-T car persistant plus longtemps dans l’organisme. Nous devons donc d’abord vérifier qu’elles sont aussi efficaces que les cellules thérapeutiques CAR-T classiques. Pour cela, nous souhaitons étudier ce nouveau traitement en comparaison au traitement actuel par CAR-T cells et montrer premièrement qu’elles sont aussi efficaces que le traitement actuel.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de déterminer si les CAR-VST possèdent un effet anti-leucémique et s’il est comparable au traitement de référence par CAR-T cells. Nous souhaitons voir un effet comparable dans cette expérimentation et valider l’acquisition de cette fonctionnalité anti-tumorale. Puis, dans une prochaine saisine, nous souhaiterions montrer que nos cellules persistent plus longuement dans un modèle de leucémie.

Procédures

-Une injection de cellules leucémiques à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J0 (1min) -Une injection de cellules « traitement » à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J7 (1min) -Un prélèvement de sang au niveau de la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J14, J21 et J28 (1min) Imagerie des souris par signal lumineux des cellules tumorales : -contention manuelle et injection ventrale d’un produit d’imagerie permettant de suivre les cellules leucémiques, -pendant le temps où la substance agit (10min), induction de l'anesthésie pour que l’animal reste immobile pendant l’imagerie (30min max)

Impact sur les animaux

- L’injection intraveineuse est douloureuse mais de courte durée et elle peut induire un saignement léger après retrait de l’aiguille au point de ponction (arrêté par compression avec une compresse stérile). - Dans les jours suivants l’injection des cellules cancéreuses, les souris présenteront une maladie type leucémie avec des poils hérissés, moins d'activité et une perte de poids, et en cas extrême, un début de paralysie des pattes arrière. - Les animaux seront modérément stressés lors de l’injection dans l’abdomen du produit d’imagerie. Pendant la prise d'images, les souris seront endormies et ne ressentiront aucune douleur. - Le prélèvement sanguin au niveau de la veine caudale sera réalisé avant l’imagerie, avec contention douce.

Devenir

Les souris étant totalement dépourvues de système immunitaire et ayant reçu une injection des cellules leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animal, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 28 jours post injections ou en cas de point limite atteint.

Remplacement

Nous continuons à réaliser des expériences sur cellules pour générer des résultats sur le ciblage des cellules tumorales et valider leur potentiel anti-leucémique de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. La culture cellulaire à partir de cellules humaines est donc la base de notre projet pour produire des cellules traitement. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas reproduire la complexité des interactions entre les cellules leucémiques et leur environnement développé dans un organisme. Cette saisine permet de vérifier l’efficacité d’un nouveau traitement cellulaire par rapport à un traitement de référence.

Réduction

Nous utilisons un nombre de souris permettant de générer des résultats fiables et de sécuriser la mise en œuvre si des souris sont à exclure de l’étude du fait de la complexité des gestes techniques. Un effectif de 3 souris par groupe est suffisant selon la simulation d’un outil statistique (G-Power), mais nous souhaitons ajouter 2 souris supplémentaires dans les groupes traités, afin d’avoir une meilleure représentativité des échantillons et pouvoir mieux les caractériser. Nous aurons besoin de 16 souris pour cette saisine. Si les résultats ne sont pas probants, nous souhaitons répéter cette expérience une seconde fois. Cette saisine comprendra 32 souris au maximum.

Raffinement

Les souris seront logées dans une grande cage avec des jouets et des matériaux, avec 3 ou 5 souris par cage, pour qu'elles aient suffisamment d'espace. La pièce où les souris seront logées sera bien aérée, dans une zone spéciale pour les souris nécessitant un suivi quotidien, avec un contrôle de la température, de l'humidité et de la lumière pour qu'elles se sentent bien. Leur nourriture est préparée de manière à être ultra propre pour éviter les problèmes de contamination microbienne, et leur eau est stérilisée pour éviter les maladies. Chaque jour, une personne qualifiée vérifiera leur état de santé et détectera d’éventuels signes de souffrance. Si elles ne se sentent pas bien, une grille de score permet de savoir la conduite à suivre pour réduire ou stopper le mal être.

Choix des espèces

La souris NSG ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans les hémopathies malignes. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.

Une partie des souris utilisées est irradiée du corps entier pour éliminer ses défenses immunitaires, d'autres sont immunodéficientes de naissance et développeraient des maladies hors d'un hébergement protégé. 2 580 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit des cellules tumorales sous la peau, des injections sous-cutanées, intraveineuses ou dans l'abdomen sous anesthésie, et jusqu'à six séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie, certaines étant transportées vers un autre établissement pour l'irradiation. Toutes sont tuées en fin d'étude pour que la radioactivité soit mesurée dans les organes prélevés.

Objectifs

Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. Dans ce contexte, l’objectif de nos recherches est le développement de nouvelles techniques d’imagerie pour évaluer l’état d’avancement de la pathologie et permettre d’adapter les traitements de façon la plus individualisée possible à chaque patient grâce à un examen indolore d’imagerie médicale. Nous travaillons également sur une nouvelle modalité de traitement appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV) qui utilise la même chimie que les sondes d’imagerie. Nos développent donc des solutions pour mieux détecter et traiter le cancer en « attachant» une molécule radioactive à une molécule biologique qui joue le rôle de transporteur et va reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales. La différence réside dans le type de radioactivité utilisé : * pour la détection, on utilise de très faibles doses de radioactivité qui traverse le corps et est détectée par des caméras dédiées. * pour le traitement, on utilise de la radioactivité à très faible rayon d’action qui va détruire les cellules à proximité. Pour que le traitement par RIV soit efficace, il faut d’abord s’assurer qu’il se lie bien aux cellules tumorales, c’est pourquoi le développement de ces nouveaux traitements est souvent associé au développement d’un examen diagnostique. Il est également nécessaire de bien valider que le traitement ne va pas endommager les organes sains et qu’il exerce une action antitumorale. Nos objectifs sont donc triples : * Développer des outils diagnostiques qui serviront de socle pour déterminer si un traitement par RIV peut être développé sur une cible donnée (identifiée préalablement in vitro). * Evaluer l’efficacité antitumorale de traitements RIV visant la même cible. * En dernier lieu évaluer précisément les doses de radioactivité reçues à la tumeur mais également aux autres organes pour les extrapoler à l’homme afin de s’assurer que le traitement sera efficace sur la tumeur et sans danger sur les organes sains

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de caractériser précisément à la fois des traceurs diagnostiques d’imagerie nucléaire mais également des composés de thérapie. Il sera à terme ainsi possible de valider en amont du traitement si il se lie bien aux cellules tumorales du patient grâce à une imagerie non invasive afin de lui proposer un traitement parfaitement personnalisé par radiothérapie interne vectorisée, modalité thérapeutique actuellement en plein essor.

Procédures

* Pour certains animaux, une irradiation corps entier dans une autre EU avec transport agréé sans sortie de leur cage – une heure avec le transport. * Une injection sous-cutanée sous anesthésie – environ 5 minutes d’anesthésie et injection sur quelques secondes * Une injection intraveineuse sous anesthésie – environ 5 minutes d’anesthésie et injection sur quelques secondes * Au maximum 6 imageries sous anesthésie : au maximum 1 heure sous anesthésie pour une imagerie limitée à 55 minutes * Une injection intrapéritonéale sous anesthésie– environ 5 minutes

Impact sur les animaux

- L’irradiation corps entier chez certains animaux va éliminer les défenses immunitaires et fragiliser l’animal qui pourrait développer des infections s’il n’était pas maintenu sous des conditions sanitaires strictes. - le transport pour irradiation pourrait provoquer un certain stress. - l’implantation sous cutanée de cellules tumorales va mener à une masse sous cutanée qui pourrait si elle est menée trop loin, gêner l’animal dans ses mouvements et impacter son état général. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. - L’injection intraveineuse pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales si elle n’est pas maitrisée. - Les produits administrés pour le diagnostic ne devraient pas impacter l’état de santé des animaux car les doses sont très faibles. Pour la thérapie, les produits peuvent provoquer une perte de poids transitoire. - Certaines souris seront immunodéficientes et pourraient développer des pathologies du fait de leur manque de défenses immunitaires si elles n’étaient pas hébergées dans des conditions sanitaires protégées.

Devenir

Différentes mesures de radioactivité et analyses complémentaires réalisées sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de nos études. La totalité des animaux seront donc euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

Pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme et évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’études sur animaux. Des études préliminaires réalisées in vitro nous permettrons néanmoins de valider que la molécule étudiée atteint bien sa cible pour les études de biodistribution et que le traitement envisagé est bien efficace sur la lignée étudiée pour les études d’efficacité.

Réduction

Une sélection des composés avec la meilleure activité sera réalisée in vitro en amont de toute utilisation in vivo et permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaire à son strict minimum. L’effectif d’animaux dans les groupes expérimentaux a été adapté pour chaque type d’étude afin de mener à des résultats scientifiquement pertinents tout en réduisant l’effectif à son maximum. Par expérience, les groupes de n=5 souris sont suffisamment robustes pour permettre d’identifier le métabolisme et la pharmacocinétique dans les études de biodistribution. L’imagerie sera répétée et permettra d’éviter d’euthanasier des animaux pour chaque point de temps examiné et ainsi de réduire l’effectif d’autant. Les effectifs devront être étoffés à n=10 pour les études d’efficacité pour prendre en compte les variabilités de réponse au traitement et de pousse tumorale sur le long terme. Enfin, les 1ères données obtenues sur les études dosimétriques permettent d’optimiser les groupes avec n=7 souris pour s’assurer l’obtention de résultats interprétables. Enfin, la bonne connaissance de la pousse tumorale pour chaque modèle, permet d’optimiser le nombre d’animaux pour chaque étude et d’implanter uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des groupes porteurs de tumeurs de tailles homogènes.

Raffinement

L’imagerie utilisée dans nos études est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures (injection intraveineuse, intratumorale, et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance. La SBEA de l’établissement a mis en place une grille détaillée de suivi des animaux et identification des signes de douleur / souffrance permettant d’identifier au plus tôt les signes et de les prendre en charge. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 à 10 individus en fonction de la taille des cages et du nombre d’animaux par groupes. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera placé dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate).

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Enfin, elles sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie eux-mêmes très proches des appareillages humains, facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études d’oncologie. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant une assez bonne reproductibilité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine.

Ouverture de la cavité abdominale, implantation de cellules tumorales dans le pancréas ou le cæcum, ablation de la rate pour le modèle de métastases hépatiques, fermeture : trente minutes par souris. 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite transférées dans un second établissement, reçoivent une injection tous les sept jours sous anesthésie, passent une imagerie hebdomadaire, puis subissent une seconde ouverture de l'abdomen pour l'exérèse de la tumeur guidée par fluorescence, soit deux laparotomies par animal. Toutes sont tuées et autopsiées pour vérifier l'absence de reprise tumorale, au terme d'une démonstration que le porteur juge impossible autrement que sur des animaux porteurs de ces tumeurs.

Objectifs

Malgré l'émergence des thérapies personnalisées, la chirurgie joue toujours un rôle essentiel dans le traitement de nombreux cancers comme les cancers colorectaux et pancréatiques. Un problème majeur réside dans la difficulté de détecter les tumeurs et de visualiser les marges tumorales. La chirurgie guidée par fluorescence (FGS) permet aux chirurgiens une meilleure visualisation de la tumeur en temps réel. De plus, la FGS peut être améliorée en associant de l’imagerie nucléaire (SPECT) avant l’opération pour localiser avec précision les tumeurs. Dans le projet, nous proposons de faire la preuve de concept de l’intérêt d’utiliser des anticorps ciblant les tumeurs, conjugués à une sonde (Ac bimodaux) permettant de réaliser de l'imagerie bimodale (SPECT/fluorescence) afin d'améliorer l’analysé pré-opératoire de la tumeur (SPECT), la détection pendant l’opération des tumeurs et leur élimination (FGS) mais aussi d'améliorer le suivi post-opératoire (SPECT). L’utilisation de ces Ac bimodaux dans des modèles de tumeurs sous-cutanées a déjà été démontré, ils permettent la visualisation et l’élimination de cette tumeur facile d’accès. Pour prouver le potentiel thérapeutique de l’utilisation de ces Ac bimodaux en chirurgie par fluorescence, il nous faut maintenant démontrer l’intérêt de cette technologie dans des modèles précliniques mimant la pathologie humaine, tels que des modèles de cancer du côlon et du pancréas se développant sur ces organes, mais aussi des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales. Ces travaux sont en cours de réalisation dans des souris qui sont déficientes en système immunitaire et permettent de greffer des cellules cancéreuses d’origine humaine. Pour mimer encore plus ce que nous pouvons retrouver chez l’homme, nous utiliserons dans ce projet des souris présentant un système immunitaire pour vérifier que les résultats retrouvés seront similaires à ceux obtenus dans les souris immunodéficientes. Ce projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs, le premier dans lequel sera développé les modèles tumoraux, le second dans lequel l’imagerie et la chirurgie assistée par fluorescence seront réalisées.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est de pouvoir mettre au point des modèles précliniques, chez la souris immunocompétentes, mimant la pathologie humaine des cancers coliques et pancréatiques avec des tumeurs se développant sur les organes et mimant ainsi des tumeurs primaires et des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales d’origine colique. Les bénéfices attendus par ce projet sont de pouvoir développer des modèles précliniques de modèles de cancers afin de pouvoir démontrer l’intérêt de l’utilisation de la chirurgie assistée par fluorescence après administration d’Ac bimodaux. Ce projet devrait permettre une meilleure prise en charge chirurgicale des patients atteints de cancers primaires ou métastatiques en permettant une meilleure détection des tumeurs, facilitant leur élimination en épargnant le tissu sain et évitant ainsi une récidive tumorale.

Procédures

Trois des modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (30 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Dans le cas du modèle de métastases hépatiques, la rate de ces souris sera enlevée suite à l’injection des cellules tumorales. Pour le modèle de carcinomatose péritonéale, les cellules tumorales seront injectées en intrapéritonéale après anesthésie gazeuse des souris (1-2 min/souris). Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2. Les souris recevront 1 injection intrapéritonéale (1-2 min/souris) tous les 7 jours (sous anesthésie gazeuse) du composé permettant l’imagerie des tumeurs. Ces souris seront ensuite anesthésiées pour être imagées. Tous les animaux porteurs de tumeurs (orthotopiques ou métastases) subiront une chirurgie d’exérèse assistée par fluorescence après injection des Ac bimodaux (30 min/souris).

Impact sur les animaux

- L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris, d’injecter des cellules tumorales dans le pancréas ou le caecum, ou d’enlever la rate. Ces interventions chirurgicales pourraient entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. - Le développement de grosses tumeurs mais également de métastases pourrait avoir des effets indésirables, la taille de ces tumeurs sera estimée 1 fois par semaine par imagerie. - L’acte chirurgical d’exérèse nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris. Ces interventions chirurgicales pourraient également entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de pouvoir vérifier par autopsie l’absence de reprise tumorale.

Remplacement

La preuve de concept de l’utilisation de ces Acs bimodaux pour de la chirurgie assistée par fluorescence nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant chez des animaux pourvus d’un système immunitaire fonctionnel. Le but est de montrer que les tumeurs sont plus facilement détectables, qu’elles peuvent être éliminées plus finement et ainsi permettre une meilleure récupération post-chirurgie et enfin qu’il y a moins de récidive. Cette preuve de concept ne peut donc être faite que sur des animaux présentant ce type de tumeurs et sur lesquels sera fait la FGS. Tous les tests in vitro préalables ont déjà été faits, tout comme la preuve de concept sur des modèles plus artificiels d’animaux porteurs de tumeurs sous-cutanée, mais également dans des modèles de souris dépourvues de système immunitaire (en cours).

Réduction

Pour chaque Ac bimodal à tester (5), deux groupes de 5 souris (contrôle vs Ac bimodal) seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité de la chirurgie tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. La visualisation de la récidive par imagerie SPECT après injection du même Ac bimodal permet de réduire le nombre d’animaux qui sont leur propre contrôle. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Les interventions chirurgicales seront précédées d’une antibiothérapie préventive. Tout au long de l’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation du soin pré au post-opératoire. Des antalgiques sous forme injectable et sous forme de gel seront utilisés lors de la chirurgie puis sous forme injectable les jours suivant l’opération. A la suite de l’opération, chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. De plus, de la nourriture gélifiée sera mise dans la cage. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouveaux outils permettant de faire de la chirurgie assistée par fluorescence. Nous utiliserons des souris immunocompétentes, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines. Ces souris sont largement utilisées pour l’implantation de cellules cancéreuses murines en sous-cutanée mais également dans les organes d’origine. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

246 souris reçoivent une injection de cellules tumorales de mélanome puis un gavage quotidien pendant quinze à vingt semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur tumeur est mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine, et une partie d'entre elles reçoit en plus une injection tous les deux à quatre jours. Le porteur indique que le gavage quotidien peut irriter le larynx et gêner la déglutition, et que la tumeur peut finir par empêcher l'animal de se déplacer, de s'alimenter et de s'hydrater. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, au terme d'une étude qui vise à confirmer chez la souris un résultat déjà obtenu en culture cellulaire.

Objectifs

Les mélanomes avec mutations activatrices d’un gène particulier peuvent être traités par des thérapies ciblées entrainant une rémission rapide chez 65-70% des patients. Cependant, la majorité des cas développent des résistances au traitement, parfois au bout d’un an seulement. Certaines cellules de la tumeur,, appelées « cellules persistantes », auraient un rôle essentiel dans le développement de ces résistances. Les « cellules persistantes » sont en effet capables de survivre aux thérapies ciblées en engageant des changements qui leur permettent de s'adapter au traitement. Or, ces cellules constituent un réel problème clinique car elles peuvent évoluer en cellules qui résistent de façon permanente à la thérapie. Cette évolution vers des cellules résistantes implique l'introduction d'erreurs dans l'ADN, appelées mutations, qui leur permettent de proliférer et de survivre malgré le traitement. Une étude a mis en évidence que, pour survivre à la thérapie ciblée, les cellules persistantes de mélanome modifient le processus qui permet aux cellules de fabriquer des protéines à partir d'une copie de l'ADN, appelée ARN messager. En effet, lors de thérapie ciblée, il y a une augmentation de la production de certaines protéines, dont l’une d’elles peut potentiellement favoriser l’introduction des erreurs dans la séquence de l'ADN. Afin d'offrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour surmonter cette résistance chez les patients atteints de mélanome, ce projet a pour objectif de démontrer que l'inhibition de la production de cette protéine peut supprimer, ou au moins retarder, la résistance aux thérapies ciblées.

Bénéfices attendus

Environ 50 % des mélanomes présentent une mutation activatrice d’un oncogène (gène dont l’expression favorise la survenue de cancers) particulier. L'inhibition, par thérapie ciblée, de la protéine issue de cet oncogène, permet d'obtenir des réponses thérapeutiques efficaces. Cependant, ces réponses sont souvent limitées dans le temps et la moitié des patients rechutent après 12 à 15 mois. La compréhension des mécanismes à la base de cette résistance est nécessaire, et l'identification du déterminant moléculaire de cette résistance peut offrir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer le pronostic des patients. Les expériences in vitro dans les cellules de mélanome traitées par thérapie ciblée montrent un rôle de notre protéine clé dans l'augmentation de l'instabilité génétique, qui est la cause principale de la résistance aux thérapies. Ce projet a donc pour objectif de confirmer l’implication de notre protéine clé dans cette résistance dans un contexte in vivo. De plus, nos expériences in vitro ont permis d’identifier une molécule_actuellement utilisée dans des essais cliniques pour le traitement d'autres types de cancer_ qui peut empêcher les mutations lors de la réparation des dommages à l’ADN et donc limiter la résistance thérapeutique aux thérapies ciblées. Nous devons confirmer ces résultats dans un contexte in vivo. L'objectif à long terme est d'apporter des bénéfices aux patients atteints de mélanome en améliorant le taux de survie des patients .

Procédures

Dans une première procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience- durée du geste inf à 10 sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (administration des traitements par gavage sur animaux vigiles pendant environ 15-20 semaines-durée du geste inf à 10sec)). Dans une seconde procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour par gavage. Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois tous les 2 jours pendant 22 jours avec un second traitement (administration des traitements par injection aux animaux vigiles durée du geste inf à 10sec). Enfin, dans une troisième procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (administration des traitements par gavage sur animaux vigiles pendant environ 15-20 semaines durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront aussi traités à raison d’une fois tous les quatre jours pendant 3 semaines (administration des traitements par injection i sur animaux vigiles durée du geste inf à 10sec). Pour tous ces animaux, la croissance tumorale sera mesurée trois fois par semaine sur animal vigile à l’aide d’un pied à coulisse (durée du geste inf à 15 sec).

Impact sur les animaux

La greffe sous-cutanée de cellules tumorales peut amener une gêne qui peut s’amplifier avec le développement de la tumeur, pouvant aller jusqu’à une modification de l’état physiologique de l’animal (manque de toilettage, prostration, difficulté à se déplacer, s’alimenter et à s’hydrater). Ces effets ne sont attendus qu’en fin d’expérience. Le gavage quotidien peut amener une irritation du larynx pouvant amener des difficultés à s’alimenter, à déglutir. L’injection des médicaments peut entrainer une gêne liée à la piqûre elle-même juste après l’injection.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements post-mortem d'organes et de tissus aux fins d'analyses.

Remplacement

Notre étude in vitro utilisant différentes lignées cellulaires de mélanome a permis de déterminer l'implication du processus de production de notre protéine d’intérêt dans la résistance acquise du mélanome à la thérapie ciblée. De plus, nos résultats obtenus in vitro ont montré que l'inhibition de ce processus peut limiter la résistance acquise. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendent l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe et pour améliorer les stratégies préventives, de diagnostiques et thérapeutiques. De plus, Il n'existe, à ce jour, pas de modèle in vitro suffisamment robuste pour tester des synergies thérapeutiques. L'utilisation de modèles animaux comparables par de nombreux aspects au corps humain est donc indispensable pour l'évaluation des nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide d'outils statistiques.

Raffinement

Pour limiter le stress des animaux, l’attention est portée sur leurs conditions d’hébergement. De plus, un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place de la procédure expérimentale pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés tous les jours lors de la procédure , qui est raffinée par l’établissement de points limites précoces, entrainant et la mise en place de soins (supplément alimentaire, administration de solutés) voire la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. La présence de souffrance sera recherchée en utilisant les critères habituels (état général, sous-alimentation, état du pelage, prostration). Les souris seront également surveillées quotidiennement afin de déceler le plus précocement possible l’apparition de points limites. Trois fois par semaine, les animaux seront pesés et les tumeurs mesurées.

Choix des espèces

Le génome de la souris a été séquencé et de nombreux outils ont été développés pour étudier ce modèle. La souris est le modèle de choix pour les études de cancérologie : les souches sont parfaitement définies et la production de souris immunodéficientes nous permet de travailler sur des modèles cellulaires d’origine humaine. De plus, on observe une croissance tumorale rapide chez ce modèle. La souris est donc le modèle de choix pour l'étude des cancers. Le projet nécessite des souris adultes (5-8 semaines) sans plus de contraintes sur l’âge. Ceci se justifie par l’âge de la population humaine touchée par le mélanome et ciblée par les éventuels traitements.