Maladies infectieuses

Les souris employées ici portent une mutation qui permet de tuer sélectivement leurs propres cellules du foie par injection, et un système immunitaire délibérément détruit, deux conditions qui rendent possible la greffe d'hépatocytes humains. 8 800 d'entre elles vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à huit injections du composé qui tue leurs hépatocytes, une greffe de cellules par la veine porte, jusqu'à deux puçages sous anesthésie et des prélèvements sanguins répétés, le porteur signalant un risque hémorragique accru, une anémie possible et une gêne du transit intestinal. L'effectif ne repose sur aucun calcul statistique, le porteur l'établissant d'après les études des années antérieures et "en accord avec le plan commercial". 8 600 souris sont tuées, 200 réutilisées dans d'autres projets, dont une formation interne aux gestes techniques sur souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales (e.g. hépatites), le cancer du foie ou des maladies métaboliques telles que la MASH (Metabolic dysfunction-Associated Steato Hepatitis), ou encore de traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines (greffe d’hépatocytes). Dans certains cas, l’humanisation du système immunitaire, en complément d’un foie humanisé, est essentielle pour étudier des processus physiopathologiques complexes, notamment dans le cadre de maladies métaboliques (par exemple, la MASH) ou d’infections virales (comme la dengue). Pour répondre de manière optimale aux objectifs scientifiques et aux questions posées, une double humanisation des souris, incluant à la fois le foie et le système immunitaire, pourra être mise en œuvre. Les cellules hépatiques humaines, et le cas échéant les cellules immunitaires humanisées, pourront ensuite être utilisées pour des études ciblées, comme l’infection par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire fidèlement le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable, bien caractérisée sur le plan génétique. Une souche de souris au foie non humanisé sera utilisée. Elle présenten une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins par injection. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas d’insuffisance hépatique. Par ailleurs, étant fortement immunodéprimée, elle est également permissive, après myéloablation, à la greffe des cellules souches hématopoïétiques ou cellules immunitaires humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Lorsque nécessaire, il sera également possible d’humaniser simultanément les compartiments hépatique et immunitaire. Cette double humanisation constitue un avantage majeur, car elle permet de modéliser de manière plus fidèle les interactions complexes entre le foie et le système immunitaire humain, en particulier dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. Par ailleurs, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus spécifiques à l’humain, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, mieux caractérisée sur le plan génétique, et plus acceptable sur le plan éthique que l’utilisation de primates non-humains. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée offrent également des opportunités pour explorer les mécanismes d’insuffisance hépatique et développer des thérapies adaptées à cette pathologie. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’étudier les réponses immunitaires humaines dans des contextes complexes, tels que les traitements antiviraux ou les pathologies impliquant des mécanismes immunitaires.

Procédures

En fonction des besoins expérimentaux, les souris pourront recevoir, sous anesthésie générale, une puce classique et/ou une puce permettant la mesure de la température corporelle. En cas de perte ou de non-fonctionnement de leur puce électronique, elles pourront recevoir une nouvelle puce avec au maximum deux puçages pendant leur durée de vie. Des prélèvements sanguins seront réalisés avec ou sans anesthésies. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Un maximum de 8 injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches et permettant au moment de la greffe de réduire la présence des macrophages murins présent dans le foie et empêchant les hépatocytes humains de s’implanter. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. À l’issue des études, les animaux non intégrés aux essais précliniques seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par : -identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -injections : douleur abdominale transitoire, et pour l’agent myéloablatif effets hématologiques possibles -actes chirurgicaux : douleur, risque hémorragique, risque anesthésique, défaut de cicatrisation -traitements et prélèvements sanguins : douleur, hématome ou lésion au point d’injection, anémie en cas de prélèvements répétés -injection d’hépatocytes via la veine porte : gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant, risque hémorragique accru -imagerie sous anesthésie : hypothermie, déshydratation, sécheresse oculaire (gel ophtalmique en prévention).

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Dans le cadre d’une réutilisation et afin d’affiner le protocole, les animaux issus des procédures « Humanisation du foie des souris via injection splénique d’hépatocytes » et « Humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte » pourront être utilisés dans la procédure « Mise au point d’un modèle de double humanisation : foie + système immunitaire » de ce même projet.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de 5 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de l’implantation d’un patch contenant des hépatocytes humaines, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes de cette procédure, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins par injection. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas d’insuffisance hépatique. Par ailleurs, cette souche étant fortement immunodéprimée, elle est également permissive, après myéloablation, à la greffe des cellules souches hématopoïétiques ou cellules immunitaires humaines. De plus, cette souche et ses dérivés présentent une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins par injection. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 12 semaines. Il a été néanmoins décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non. L'insuffisance hépatique pourra être induite chez la souris immunodéficiente par exemple par une ou plusieurs injection(s) causant la mort des hépatocytes murins, permettant ainsi d’étudier l’effet d’un implant contenant des hépatocytes.

17 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une infection pulmonaire bactérienne, virale ou fongique leur est inoculée sous anesthésie par voie oropharyngée, intratrachéale ou intranasale, puis viennent les administrations répétées : jusqu'à quatre gavages par jour pendant quatorze jours, six injections sous-cutanées ou intraveineuses quotidiennes, une injection rétro-orbitaire que le porteur réserve au "dernier recours", et jusqu'à sept prises de sang par tranche de vingt-quatre heures, dont une coupe de l'extrémité de la queue. Une partie des souris est rendue neutropénique, privée d'une part de ses défenses immunitaires, pour mesurer l'action des molécules indépendamment de la réponse de l'organisme. Le porteur répartit ce total entre 1 170 souris pour la mise au point des protocoles et 16 710 pour l'évaluation de candidats médicaments, chiffre qu'il présente comme "une estimation haute".

Objectifs

Le projet a pour objectif principal d’évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-infectieuses dans des modèles murins d’infections pulmonaires d’origine bactérienne, fongique ou virale. Ces infections représentent un enjeu majeur de santé publique en raison de leur fréquence, de leur sévérité et de l’émergence de résistances aux traitements existants. Dans ce contexte, le projet vise à développer et utiliser des modèles animaux pertinents permettant de reproduire les principales caractéristiques physiopathologiques des infections pulmonaires humaines. Ces modèles permettront d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments, de caractériser leur profil pharmacocinétique et pharmacodynamique (PK/PD), et d’optimiser les schémas thérapeutiques. Plus précisément, les objectifs sont : - d’établir et de caractériser des modèles d’infection pulmonaire robustes et reproductibles, incluant la détermination de l’inoculum, de la cinétique d’infection et des paramètres cliniques associés ; - d’évaluer l’activité anti-infectieuse de candidats thérapeutiques dans ces modèles, en conditions contrôlées, en comparant différentes doses, voies et modalités d’administration ; - de caractériser les relations PK/PD afin d’identifier les paramètres d’exposition associés à l’efficacité ; - d’étudier, lorsque nécessaire, l’influence du statut immunitaire de l’hôte (modèles immunocompétents ou immunodéprimés) sur la réponse au traitement ; - de compléter ces approches par des études d’exposition contrôlée en perfusion, permettant d’atteindre des profils pharmacocinétiques stables et d’affiner la compréhension des relations exposition–effet. Les données générées contribueront à la sélection et à l’optimisation de candidats médicaments, ainsi qu’à la définition de schémas posologiques pertinents en vue des études précliniques réglementaires et du développement clinique. Ainsi, ce projet s’inscrit dans une démarche translationnelle visant à améliorer la prise en charge thérapeutique des infections pulmonaires tout en appliquant les principes de remplacement, réduction et raffinement.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet vise à évaluer de futurs traitements contre les infections pulmonaire d’origine bactérienne, virale ou fongique afin de vérifier leur efficacité. Pour cela, nous utiliseront différents modèles de souris spécialement conçus pour reproduire les principales caractéristiques de l’infection humaine. A long terme, ce travail permettra d’accélérer l’arrivée de nouveaux traitements contre les pneumonies. Les données obtenues aideront à comprendre comment éliminer le plus efficacement l’infection. L’objectif est de développer des thérapies et d’identifier les schémas thérapeutiques plus efficaces, au bénéfice de la santé publique. L’objectif est de développer des thérapies plus performantes que celles actuellement disponibles, répondant notamment aux enjeux liés à l’émergence de résistances antimicrobiennes, et d’améliorer la prise en charge des patients. Ce projet s’inscrit ainsi dans une démarche visant à apporter un bénéfice significatif pour la santé publique.

Procédures

1) Gestes réalisés sur tous les animaux : Pesée (≤2 fois/jour, 30 sec) sur animal vigile. Injection sous-cutanée ou orale (1 fois, 30 sec) sur animal vigile. Inoculation de l’agent infectieux (1 fois, 30 sec) par voie oropharyngée, intratrachéale ou intranasale sur animal anesthésié. Mise à mort par surdose d'anesthésique injectable. 2) Gestes réalisés selon les études : Écouvillonnage buccal (1 fois, 30 sec), vigile ou anesthésié. Prélèvements sanguins (30 sec) : fréquence variable selon l’étude. Sites : veine submandibulaire (anesthésié), veine caudale ou coupe terminale de l’extrémité de la queue (≤7 fois/24h, ≤20 µL/prélèvement). Administration de composés thérapeutiques (fréquence adaptée aux propriétés du composé, conforme à la réglementation) : Sur animal vigile : gavage (≤4/j jusqu’à 14 jours puis ≤2/j), intrapéritonéal (≤2/j jusqu’à 7 jours), sous-cutané (≤6/j), intraveineux caudal (≤6/j sur 24h puis ≤4/j). Sur animal anesthésié : intradermique (≤2/j), rétro-orbitaire (1/j, en dernier recours), intranasal (≤6/j), intratrachéal (≤2/j), oropharyngé (≤3/j), intramusculaire (≤2/j). Aérosolisation par nébulisation (≤1h, ≤2/j, max 3 jours consécutifs) sur animal vigile afin de limiter le stress lié à la contention répétée.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des souris seront utilisées pour étudier l’infection pulmonaire bactérienne, virale ou fongique et tester de futurs traitements anti-infectieux. Les infections induites peuvent entraîner une altération de l’état de santé des animaux, qui se manifeste le plus souvent par des signes cliniques légers à modérés. Ces signes évoluent généralement progressivement avec le développement de l’infection. Les effets les plus fréquemment observés incluent : - une perte de poids modérée ; - une diminution de l’activité ou de la mobilité ; - un aspect du pelage altéré (poil ébouriffé) ; - une posture légèrement voûtée ; - une diminution de la prise alimentaire ou hydrique, pouvant s’accompagner d’une déshydratation modérée ; - une augmentation de la fréquence respiratoire ou des signes respiratoires légers tels que des sifflements. Les gestes expérimentaux nécessaires (administration de substances, prélèvements ou contention) peuvent également entraîner un stress transitoire, une gêne légère au niveau des sites d’injection ou des irritations locales, notamment lors des administrations par voie respiratoire (intranasale, oropharyngée, intratrachéale ou aérosol). Aucun effet grave n’est attendu avec les candidats médicaments testés sur la base des données préalables disponibles. Toutefois, comme il s’agit de phases précoces de recherche, des effets imprévisibles peuvent survenir occasionnellement, tels qu’une perte de poids plus marquée, des variations de température ou des modifications du comportement. L’ensemble de ces effets reste en majorité de sévérité légère à modérée, et leur durée est limitée dans le temps grâce à une surveillance clinique rapprochée et à la mise en place de mesures adaptées permettant de prévenir toute aggravation de l’état des animaux (cf Annexe 2).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issue des études afin notamment de prélever des organes d’intérêts qui feront l’objet d’analyses (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques, quantification de la charge bactérienne/virale/fongique). Les modèles décrits ne permettent pas la réutilisation des animaux infectés.

Remplacement

Avant d’avoir recours aux animaux, toutes les solutions permettant de les remplacer seront examinées. Des tests in vitro permettront d’évaluer d’abord si les traitements envisagés sont efficaces contre le pathogène ciblé. Ces approches permettent d’identifier les candidats les plus prometteurs et d’éliminer rapidement les molécules inefficaces, évitant ainsi l’utilisation inutile d’animaux. Une analyse des données déjà disponibles dans la littérature scientifique ainsi que des bases de données spécialisées est également réalisée afin d’éviter la duplication d’expériences déjà menées. Des approches complémentaires, telles que la modélisation ou l’utilisation de données pharmacologiques existantes, sont prises en compte lorsque cela est possible. Cependant, certaines questions ne peuvent pas être résolues sans recourir à un modèle animal, notamment celles impliquant les interactions complexes entre un agent infectieux et l’organisme dans son ensemble, ou l’évaluation de l’efficacité d’un traitement dans un contexte physiologique complet. Dans ces situations, l’expérimentation animale reste nécessaire pour obtenir des résultats pertinents et transposables à l’Homme. Lorsque des tests sur animaux sont indispensables, des modèles de souris spécialement développés pour reproduire l’infection seront utilisés, car ils offrent des résultats plus fiables tout en limitant le recours à d’autres espèces. L’ensemble de ces démarches assure que les animaux ne soient utilisés que lorsque cela est réellement nécessaire pour faire progresser les connaissances et le développement de nouveaux traitements.

Réduction

Dans ce projet, le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum grâce à une démarche rigoureuse dès la conception des études. Chaque protocole expérimental est soigneusement défini afin répondre à la question scientifique posée, en utilisant le modèle le plus adapté. Cela permet d’éviter la répétition d’expériences inutiles et de limiter le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant la qualité des résultats. Lorsque cela est possible, plusieurs types d’informations sont recueillis chez un même animal, par exemple le suivi de l’évolution de l’infection, l’analyse de biomarqueurs ou la mesure de concentrations de traitement dans le sang ou les tissus. Cette approche permet d’obtenir un maximum de données à partir d’un nombre limité d’animaux. En amont, les traitements potentiels sont systématiquement évalués par des méthodes in vitro (sans animaux), afin de sélectionner uniquement les candidats les plus prometteurs. Cette étape permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés en éliminant les molécules inefficaces avant toute étude in vivo. Les résultats obtenus lors des premières étapes du projet (développement et caractérisation des modèles) sont également utilisés pour optimiser les études suivantes. Cela permet d’ajuster précisément les doses, les durées et les effectifs nécessaires, et ainsi d’éviter l’utilisation d’animaux en nombre excessif. Sur l’ensemble des cinq années du projet, le nombre total maximal d’animaux est estimé à 17 880 souris, réparties entre environ 1 170 souris pour le développement des modèles et 16 710 souris pour l’évaluation des traitements. Ce nombre correspond à une estimation haute intégrant les besoins du projet, et sera ajusté si les données obtenues permettent de réduire les effectifs. L’ensemble de ces mesures garantit une utilisation raisonnée et limitée des animaux, en conformité avec le principe de réduction.

Raffinement

Dans ce projet, des mesures de raffinement sont mises en place à chaque étape afin de réduire au maximum la douleur, la détresse et les contraintes subies par les animaux. Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation, en groupes sociaux (3 à 5 souris par cage) avec un environnement enrichi comprenant des abris, des matériaux de nidification et des objets à manipuler. Une période d’acclimatation adaptée est respectée avant toute expérimentation afin de limiter le stress. Le nombre de manipulations est réduit au strict nécessaire et les procédures sont réalisées par du personnel formé et expérimenté. Les interventions potentiellement inconfortables (infection, certaines administrations, prélèvements) sont réalisées sous anesthésie appropriée afin de limiter la douleur. Une surveillance clinique rapprochée est mise en place tout au long des études, avec plusieurs observations par jour. L’état de chaque animal est évalué à l’aide d’une grille de score standardisée (poids, mobilité, posture, respiration, alimentation), permettant de détecter précocement toute dégradation de l’état de santé. Des mesures de soutien sont mises en place dès l’apparition de signes cliniques (alimentation facilitée, hydratation, environnement chauffé). Des critères d’arrêt précoces sont définis afin d’éviter toute évolution vers un état sévère, avec mise à mort si nécessaire. Dans la procédure 3, des mesures spécifiques sont appliquées en lien avec l’utilisation de cathéters implantés et l’administration en perfusion. Les animaux sont fournis déjà cathétérisés. Une surveillance spécifique du site du cathéter est réalisée afin de détecter toute complication locale. En cas de dysfonctionnement ou d’inflammation importante, l’animal est retiré de l’étude. Lorsque la présence du dispositif le nécessite, un hébergement individuel temporaire est mis en place afin de protéger le cathéter, compensé par un enrichissement adapté et une surveillance renforcée. Les études de perfusion étant de courte durée (environ 26 heures), l’exposition aux contraintes est limitée. L’ensemble de ces mesures permet de garantir une amélioration continue des conditions expérimentales et de limiter au maximum l’impact des procédures sur le bien-être animal.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce type de recherche. De nombreux modèles bien établis permettent de reproduire les différentes étapes des infections pulmonaires humaines et d’évaluer à la fois l’action du traitement sur le pathogène et la réponse de l’organisme. Certains modèles utilisent des souris immunocompétentes, permettant d’étudier l’efficacité des traitements dans un contexte proche de la situation clinique. D’autres modèles dits « neutropéniques », dans lesquels le système immunitaire est temporairement affaibli, sont également utilisés. Ces modèles sont considérés comme une référence dans la recherche sur les anti-infectieux, car ils permettent d’évaluer directement l’activité propre des traitements indépendamment de la réponse immunitaire de l’animal. Ils sont particulièrement utiles pour comparer l’efficacité des molécules et mieux comprendre leur mécanisme d’action. Sur le plan pratique et éthique, la souris est un petit animal facile à héberger et à suivre, ce qui réduit le stress et les souffrances. Son utilisation respecte les principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) : elle évite de recourir à des espèces plus sensibles, limite le nombre d’animaux nécessaires et permet d’adapter les protocoles pour améliorer leur bien-être. Enfin, la souris est déjà largement utilisée dans la recherche sur les maladies infectieuses, et de nombreux outils et marqueurs sont en place pour étudier la réponse de l’organisme ce qui garantit des résultats fiables et comparables pour la suite du développement de nouveaux traitements. Les souris sont âgées au moins de 6-8 semaines afin de permettre des infections et des traitements homogènes des lots d'animaux. Il s’agit donc de rongeurs matures au niveau du système immunitaires.

Toutes tuées à l'issue pour prélever organes et fluides, 840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une seule inoculation d'Escherichia coli, dans le péritoine pour une infection généralisée, dans la vessie ou dans le nez sous anesthésie générale pour une infection urinaire ou pulmonaire, avec un prélèvement de sang au bout de la queue sur souris éveillée, puis sept jours de suivi. Le porteur attend une inflammation de l'appareil urinaire et un affaiblissement de l'état général, et fait mettre à mort les souris qui atteignent un point limite fixé par un score clinique noté en aveugle. Il décrit des tests déjà conduits sur cellules en culture, puis affirme que le recours à l'animal reste "irremplaçable" parce qu'aucun tube à essai ne permet de suivre la dissémination de la bactérie entre les organes.

Objectifs

L'étude des facteurs de virulence d'Escherichia coli (E. coli) est importante pour mieux comprendre comment cette bactérie provoque des infections. E. coli est une bactérie naturellement présente dans l'intestin de l'Homme et de nombreux animaux. La plupart des souches sont inoffensives, mais certaines peuvent provoquer des infections parfois graves lorsqu'elles atteignent d'autres organes. Dans ce projet, l'étude porte sur plusieurs types d'infections causées par E. coli : les infections pulmonaires, urinaires et généralisées (septicémie). Ces infections sont de plus en plus fréquentes, notamment à l'hôpital, en particulier chez les patients fragiles, immunodéprimés ou intubés. L'utilisation de modèles murins permet d'étudier, dans un organisme vivant, les mécanismes qui rendent certaines souches de E. coli plus agressives que d'autres. Ces mécanismes comprennent notamment la production de toxines, la capacité de la bactérie à se fixer aux cellules de l'organisme ou à échapper aux défenses immunitaires. Ces recherches permettent de mieux comprendre le développement des infections causées par E. coli. Elles peuvent également aider à identifier de nouvelles cibles pour développer des traitements ou des stratégies de prévention. Cette démarche est particulièrement importante car certaines souches de E. coli deviennent de plus en plus résistantes aux antibiotiques. Mieux connaître les mécanismes qui leur permettent de provoquer une infection peut contribuer à mettre au point de nouvelles approches thérapeutiques, complémentaires ou alternatives aux antibiotiques actuels.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de cette étude sont multiples. Sur le plan fondamental, elle permettra d’identifier les déterminants moléculaires impliqués dans la capacité de certaines souches d’Escherichia coli à coloniser l'hôte, à induire une réponse inflammatoire excessive ou à échapper aux défenses immunitaires. Cette meilleure compréhension des interactions hôte-pathogène contribuera à élucider les mécanismes spécifiques qui différencient les souches commensales (innofensive) des souches pathogènes (qui induisent une maladie). Sur le plan appliqué, ces connaissances pourraient déboucher sur le développement de nouveaux outils diagnostiques permettant de prédire le potentiel pathogène d’une souche, ou sur l’identification de cibles thérapeutiques innovantes, notamment en dehors des approches antibiotiques classiques. À plus long terme, cette étude pourrait ainsi participer à la mise en place de stratégies préventives et thérapeutiques mieux adaptées aux infections à E. coli, en particulier dans un contexte de résistance croissante aux antimicrobiens.

Procédures

Les animaux sont répartis dans trois modèles d'infection selon l'objectif de l'étude : Infection généralisée : injection intrapéritonéale d'une suspension d'Escherichia coli (environ 1 minute), avec ou sans administration d'antibiotique selon le protocole (environ 1 minute). Infection urinaire : administration d'une suspension bactérienne dans la vessie par voie intravésicale sous anesthésie générale (environ 1 minute) avec ou sans administration d'antibiotique selon le protocole (environ 1 minute). Infection pulmonaire : administration d'une suspension bactérienne par voie intranasale sous anesthésie générale (environ 2 minutes) avec ou sans administration d'antibiotique selon le protocole (environ 1 minute). Chaque animal ne subit qu'une seule inoculation bactérienne. Un prélèvement sanguin à l'extrémité de la queue peut être réalisé sur animal vigile (environ 1 à 2 minutes) afin d'étudier la réponse immunitaire de l'organisme. Les animaux sont suivis jusqu'à 7 jours avec une surveillance clinique régulière. À la fin de l'étude, ou si un point limite est atteint, les animaux sont mis à mort selon une méthode réglementaire afin de permettre le prélèvement des organes pour les analyses.

Impact sur les animaux

Certaines de ces procédures expérimentales pourront entrainer des effets indésirables chez l’animal avec des effets locaux (inflammation de l’appareil urinaire) ou encore systémiques (affaiblissement de l’état général par exemple). Pour les effets locaux nous prévoyons d'utiliser un anesthésiant local, pour les effets systémiques nous aménagerons l'environnement de la souris pour qu'elle ait un accès facilité à la nourriture et la boisson. La gestion de la douleur engendrée par ces différentes procédures sera suivi à l’aide d’une grille d’évaluation de score clinique. Lorsqu'un point limite sera atteint l'animal en questionsera mis à mort et autopsié.

Devenir

À l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des organes et fluides biologiques nécessaires aux analyses microbiologiques, histologiques, immunologiques et moléculaires prévues dans le projet. Ces analyses nécessitent la collecte de tissus qui ne peut être réalisée sur des animaux maintenus en vie. Aucun animal ne pourra donc être réutilisé, replacé ou maintenu en vie à l’issue de la procédure.

Remplacement

L'utilisation de méthodes alternatives in vitro ont été préalablement réalisées pour démontrer l'impact des différentes souches mutées ou des inhibiteurs sur les cellules eucaryotes en culture. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ou tube à essai ne permet d’examiner la dissémination bactérienne entre les différents organes. De plus les objectifs sont de découvrir le(s) rôle(s) des différents facteurs de virulences sur la colonisation de E. coli, ainsi que d’identifier des inhibiteurs de E. coli qui permettront de diminuer sa virulence et enfin de mesurer les effets des facteurs environnementaux sur leur expression in vivo. En effet suivant l’organe cible de E. coli, l’environnement sera forcément très différent (exemple vessie vs poumons). Or on sait que les interactions entre la bactérie et son environnement vont être très importants et non négligeables dans notre étude, et cette interaction complexe ne peut être modélisée in vitro.

Réduction

L’ensemble des modèles décrit dans cette saisine sont déjà mis en place au laboratoire : modèle d’injection dans la vessie, du sepsis ou encore de l’infection pulmonaire. De plus nous utiliserons des inhibiteurs déjà testés in vitro et décrit dans la littérature ou utilisés chez l’homme dans d’autres contextes. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (signes cliniques, charge bactérienne, prélèvements de tissus et fluides lors de la nécropsie) pour réduire le nombre d’animaux nécessaires. De plus une étude longitudinale de la présence de bactérie sera réalisée avec un système de visualisation 3D sur animal vigile. Cet outil nous permettra de suivre le niveau d’infection des souris de manière longitudinale sans les euthanasier, nous permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées au nombre de 5 par cage en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 2 fois par mois (tous les 15 jours). Du coton ou du sopalin sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont 5-10 jours d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement et plus fréquemment pendant les phases aigues. Les points limites seront définis selon une valeur objective de score clinique obtenue par observation « en aveugle » de chaque animal (l’observateur n’a pas connaissance du groupe expérimental afin de réduire le biais cognitif). Si un point limite est atteint alors l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est le mammifère le plus facilement manipulable pour l’étude des facteurs de virulence de E. coli dans des conditions in vivo. De plus la littérature sur les différents modèles proposés avec E. coli est largement décrite. Nous utliserons des souris de 5 à 9 semaines suivant le modèle expérimental. Dans la littérature, les souris utilisées pour les différents modèles décrits sont classiquement âgées entre 6 à 9 semaines. Nous prenons une marge d’une semaine pour respecter la période d’acclimatation.

Les souris infectées par le virus de l'encéphalite à tiques sont mises à mort dès l'apparition de signes neurologiques. 3 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune porte sur le dos une capsule remplie de larves, de nymphes ou de tiques femelles qui se gorgent de son sang, ce qui provoque des démangeaisons, et 2 250 d'entre elles subissent trois prélèvements de sang par le sinus rétro-orbitaire, aux sixième, dixième et quatorzième jours, avant que sang, oreille et organes soient prélevés après la mort. L'effectif se déduit du nombre de tiques gorgées récupérables sur chaque souris, le porteur précisant qu'aucune analyse statistique ne sera réalisée sur le nombre de souris utilisées.

Objectifs

Les tiques sont les premiers vecteurs d’agents pathogènes en Europe et constituent un risque majeur pour la santé humaine et animale en transmettant la plus grande variété de microorganismes (bactéries, parasites et virus). La plupart des agents pathogènes transmis par les tiques sont zoonotiques (transmissibles de l’animal à l’Homme), certains ne touchent que les animaux mais avec un impact économique très important et d’autres sont découverts chaque année. Les principales maladies liées aux tiques en Europe sont la Borréliose de Lyme, l’Anaplasmose granulocytaire et l’Encéphalite à tiques, et leur vecteur est la tique Ixodes ricinus, qui présente une très large répartition géographique. Dans ce projet nous étudions la compétence vectorielle des tiques Ixodes ricinus vis-à-vis de différents agents pathogènes, en infection simple (un seul agent pathogène à la fois) et en co-infection (deux agents pathogènes à la fois). En effet la compétence vectorielle des arthropodes est un caractère sous contrôle génétique et peut varier selon la souche de tique, et la souche de l’agent de pathogène étudié. De plus, dans diverses études il a été mis en évidence que les co-infections dans les tiques (plusieurs microorganismes présents dans une même tique) pouvaient être très fréquentes. Chez l’Homme, des patients présentant une maladie de Lyme chronique rapportent également des co-infections par d’autres bactéries ou d’autres parasites. Enfin en laboratoire il a été démontré que chez des souris co-infectées par deux bactéries (Borrelia et Anaplasma) on constatait une différence de réponse immunitaire de la souris suite à l'infection, une différence de pathogénicité des bactéries chez la souris ainsi qu'un impact sur l'acquisition de ces bactéries par les tiques comparativement à des infections simples. Nos travaux visent à comparer la compétence vectorielle des tiques lors d’infection simple et de co-infection par des bactéries (Borrelia, Anaplasma) et des virus (différentes souches du virus de l’encéphalite à tiques). Pour étudier cette compétence vectorielle, il nous faut etudier 3 étapes clés en laboratoire : (i) l’acquisition de l’agent pathogène ; (ii) la transmission transstadiale de l’agent pathogène (c'est à dire la persistance de l’agent pathogène au fil des stades de développement) ; (iii) la transmission de l’agent pathogène de la tique infectée vers un hôté vertébré sain (souris naïve).

Bénéfices attendus

Les tiques sont d'importants vecteurs d'agents pathogènes qui provoquent des maladies graves chez l'Homme et les animaux. Les phénomènes de co-infections peuvent aggraver ces maladies mais ne sont pas étudiés en laboratoire. Notre projet vise à mieux comprendre le risque lié aux tiques pour l’Homme et l’animal, notamment en comparant les infections simples avec les co-infections.

Procédures

Pour 750 souris maximum, Pas de prélèvement durant l’expérimentation, uniquement récupération tiques gorgées. Pour 2250 souris maximum, a J6, J10, J14 = prélèvement de 10µL de sang par souris (sinus rétrorbital). Après mise à mort des animaux, récupération sang, biopsie oreille et organes souris.

Impact sur les animaux

Le gorgement des tiques induit une gêne modérée (grattement) pour les souris utilisées mais afin de limiter l’inconfort lié à une démangeaison trop intense due aux piqûres de tiques, le nombre de tiques(larves/nymphes/femelles) par animal est limité. Lorsqu’une douleur ou gêne trop intense est vue chez la souris, nous enlevons les tiques qui ne se sont pas encore gorgées ou réduisons celles déjà attachées afin de réduire l’inconfort de la souris. Pour les souris potentiellement infectées par les bactéries Borrelia et Anaplasma, pas de signes cliniques attendus. Pour les souris infectées par le virus TBE, signe neurologique attendu, les animaux seront mis à mort dès que les signes neurologiques seront observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements. Pour les tests de transmission des agents pathogènes, le sang des animaux et les organes sont nécessaire pour rechercher les agents pathogènes par amplification de leur matériel génétique afin de valider la transmission par les tiques.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, un système de gorgement artificiel sur membrane a été développé, il peut être utilisé lors des essais d’acquisition ou de transmission des agents pathogènes. Ce système sera privilégié dès que possible mais ne fonctionne malheureusement pas pour tous les agents pathogènes (notamment ne fonctionne pas pour Borrelia et Anaplasma et donc ne fonctionne pas pour les coinfections utilisant une de ces bactéries). Les expérimentations de co-infection proposées dans cette saisine de peuvent malheureusement pas être réalisées sans l'utilisation d'animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été calculé en fonction du nombre de tiques gorgées que l'on peut récupérer sur l'animal (maximum 50% des tiques déposées dans la capsule) et par rapport à nos besoins en tiques pour nos différentes expérimentations. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements. Dès que nous obtiendrons le nombre de tiques gorgées nécessaire aux analyses et à la suite des expérimentations, la répétition de l'expérimentation pour chaque modèle de co-infection sera stopée. Le nombre annoncé de répétition (10) est le nombre maximal annoncé. Nous espérons pouvoir réduire ce nombre à 5 ou 6 répétitions par type de co-infection. Il n'y aura pas d'analyses statistiques réalisées concernant le nombre souris utilisées.

Raffinement

Les souris sont élevées dans les conditions naturelles d'élevage des souris avec une maison en plastique par cage, un support pour grimper (roue), des carrés de coton. Lors des manipulations, elles seront hébergées en condition individuelle car les souris auront chacune une capsule avec des tiques sur le dos et les souris sont capables d'enlever les capsules du dos des autres souris et de manger les tiques. Les souris individuelles seront hébergées avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (carré de coton, maison en plastique pour les souris, support pour grimper (roue)), et même si elles sont isolées elles pourront voir les souris des cages d’à côté. Les animaux sont isolés au maximum 21 jours.

Choix des espèces

Les souris (comparativement à d’autres modèles animaux) sont sensibles à l’infection par les 3 agents pathogènes que nous ciblons : Borrelia afzelii, Anaplasma phagocytophilum, Virus de l’Encéphalite à tiques. Les micromammifères étant notamment impliqués dans les cycles de transmission naturels de ces agents pathogènes, les souris représentent donc le modèle idéal en laboratoire. Dans les essais d'acquisition, les souris utilisées n'auront pas besoin d'être réceptives aux agents pathogènes, par contre, dans les essais de transmission, les souris utilisées devront être sensibles à l'infection par Anaplasma phagocytophilum, Borrelia et TBEV. Adultes. Minimum 4-5 semaines. Suffisamment grand pour pouvoir poser une capsule sur leur dos avec des tiques.

Treize écouvillonnages du nez et de la trachée, cinq lavages des bronches, deux ponctions de moelle osseuse et jusqu'à six prises de sang par semaine : 246 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 216 d'entre eux sont infectés par la grippe puis par un pneumocoque et seront tués pour analyse des tissus, les 30 autres pouvant être réutilisés dans d'autres études après récupération et avis vétérinaire. Le porteur décrit une ponction lombaire par macaque, pouvant provoquer un hématome sous-cutané et aller jusqu'à l'hémorragie intrarachidienne ou intramédullaire, et un hébergement individuel pendant la phase d'infection. Le choix de cette espèce tient, selon lui, à la proximité génétique et physiologique avec l'être humain, à un appareil respiratoire de structure et de dimensions voisines et à un système immunitaire qui réagit de façon similaire.

Objectifs

La grippe constitue un enjeu majeur de santé publique. Des complications sévères peuvent survenir notamment lorsque l’infection par le virus de la grippe est suivie d’une infection bactérienne, appelée « surinfection ». Dans ce cas, les défenses naturelles des poumons sont affaiblies par le virus, ce qui permet à certaines bactéries opportunistes de s’installer plus facilement et d’aggraver la maladie. L’une des bactéries les plus souvent impliquées est Streptococcus pneumoniae, responsable notamment de pneumonies. Les surinfections bactériennes surviennent le plus souvent chez les personnes les plus fragiles, comme celles hospitalisées pour une grippe sévère, les patients en réanimation ou ceux ayant déjà d’autres problèmes de santé. Dans ces situations, la combinaison du virus et des bactéries peut entraîner des formes graves de maladie, avec un risque accru de complications voire de décès. Ce projet cherche à réduire ces complications. L’objectif est d’évaluer la sécurité et l’efficacité de nouveaux traitements limitant la gravité de la maladie lorsque virus et bactéries sont présents en même temps.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, certaines bactéries, comme Streptococcus pneumoniae, deviennent de plus en plus difficiles à traiter, car elles résistent aux antibiotiques habituellement utilisés, ce qui rend les infections plus difficiles à traiter. Ce projet vise à évaluer de nouveaux traitements innovants pour lutter contre les infections à Streptococcus pneumoniae. Les résultats, obtenus dans un modèle animal proche de l’humain, fourniront des connaissances essentielles pour mieux comprendre ces infections et développer de nouveaux traitements. Ils permettront également de proposer des solutions plus efficaces aux patients et d’améliorer globalement leur prise en charge. Ce projet pourrait contribuer à mieux protéger la santé humaine face à un problème de plus en plus préoccupant à l’échelle mondiale : la résistance aux antibiotiques.

Procédures

Les interventions prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et seront regroupés pour limiter les anesthésies (1 à 7x par semaine, 246 animaux, 30-45 minutes) : Prélèvements : - Prélèvements sanguins (1 à 6 10 fois par semaine, 246 animaux, 5 minutes). - Ecouvillonnages nasaux et trachéaux (13 fois, 246 animaux, 2 minutes) - Retrait de ganglions lymphatiques, (2 fois maximum, 216 animaux, 20 minutes) - Lavage broncho-alvéolaire (5 fois, 246 animaux, 10 minutes) - Ponction lombaire (1 fois, 216 animaux, 20min) - Moëlle osseuse (2 fois, 246 animaux, 10 minutes) Interventions - Implantation d’une puce de suivi de température (1 fois, 246 animaux, 30 minutes) - Infection par voie respiratoire, (2 fois, 216 animaux, 30 min) - Imagerie in vivo (5 fois, 246 animaux, 45 minutes) - Traitements avec des molécules thérapeutiques (jusqu’à 6 fois, 120 animaux, 5 minutes)

Impact sur les animaux

Les prélèvements et anesthésies répétés peuvent engendrer une perte d’appétit avec plus ou moins de perte de poids mineure, un hématome au niveau du site du prélèvement ou uneinfection au niveau du site de prélèvement dans les jours qui suivent le prélèvement. Après traitement, une réaction locale, des démangeaisons/douleurs dans les heures/jours suivant peuvent apparaitre. L’infection grippale peut causer de la fièvre, de la toux et un encombrement bronchique. Ces symptômes peuvent être augmentés par la surinfection par pneumocoque. L’état des animaux sera observé tous les jours et des points limites sont prévus dans le projet en cas de progression de la maladie ou d’éventuels effets inattendus du traitement. L’implantation de puces de télémétrie peut créer une réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons Les lavages bronchoalvéolaires, peuvent provoquer une toux, ou des difficultés respiratoires légères juste après le geste Les écouvillonnages nasotrachéaux peuvent provoquer un saignement nasal (léger à modéré) Le retrait de ganglions peut engendrer une réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours l’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui. La ponction lombaire peut amener à un hématome sous-cutané, pouvant aller jusqu’à l’hémorragie intrarachidienne ou intramédullaire.

Devenir

Tous les animaux infectés seront euthanasiés afin de réaliser des dosages et une analyse des tissus. Les autres animaux pourront être inclus dans d’autres études après récupération complète des animaux et sur avis favorable du vétérinaire.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d’évaluer la sécurité et l’efficacité de nouvelles stratégies de traitements contre des infections respiratoires complexes associant le virus de la grippe et Streptococcus pneumoniae. À ce jour, les méthodes alternatives telles que les études menées sur des cellules en laboratoire (approches in vitro), sur des modèles informatiques (in silico), ou encore sur des tissus isolés (ex vivo) ne permettent pas de reproduire toute la complexité anatomique du poumon humain, notamment les interactions entre les différents types de cellules et tissus, et le fonctionnement du système immunitaire dans son ensemble. C’est pourquoi, malgré les efforts pour privilégier ces alternatives, l’utilisation de modèles animaux reste nécessaire pour atteindre les objectifs du projet. Ce modèle animal permet de reproduire la complexité de l’ensemble des mécanismes biologiques impliqués dans cette double infection et d’évaluer de façon fiable la sécurité et l’efficacité de nouveaux traitements avant toute application chez l’humain.

Réduction

Dans ce projet, plusieurs mesures sont mises en place pour utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Les premières étapes du projet serviront à ajuster les conditions d’infection les plus pertinentes (par exemple la quantité de bactérie utilisée) afin de reproduire de façon la plus fiable les symptômes observés chez l’humain sans multiplier les essais et selon un procédé, étape par étape, déjà publié dans la littérature scientifique. Pour affiner les paramètres importants comme la sécurité, la dose ou la manière d’administrer les traitements, seuls de petits groupes d’animaux seront utilisés. Cela permettra de sélectionner les meilleures conditions avant de passer à des études d’efficacité. Enfin, pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux par groupe est strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats solides et interprétables. Ce nombre a été déterminé de façon à pouvoir détecter de réelles différences entre les groupes tout en évitant d’utiliser plus d’animaux que nécessaire.

Raffinement

Les prélèvements et interventions sur les animaux sont réduits au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Ils seront effectués sous anesthésie générale pour éviter le stress et d’éventuelles douleurs et seront regroupés au maximum lors d’une même anesthésie afin de réduire le nombre d’anesthésies. Les anesthésies pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation sera instaurée au besoin. L’état général des animaux sera observé quotidiennement. À chaque intervention, l’état de santé des animaux sera évalué à l’aide d’une grille d’observation. Si des signes de maladie apparaissent, le vétérinaire sera immédiatement prévenu afin d’adapter le suivi et les soins. Le recours à des médicaments anti-douleur pourra être envisagé si nécessaire. Les points limites seront raffinés en fonction des résultats obtenus au cours de la mise en place du modèle. Les prélèvements de sang et les biopsies pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale). Pour limiter l’irritation de la trachée liée à l’intubation lors du lavage pulmonaire, un spray anesthésique sera appliqué localement en amont de la manipulation. L’implantation de puces électroniques, permettant un suivi régulier de la température corporelle, peut induire une réaction au site d’incision. Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement analgésique sera appliqué avant la chirurgie. Les animaux seront hébergés en groupes avant infection et en hébergements individuels proches permettant des interactions sociales pendant la phase d’infection (conservation du contact sensoriel, et hébergements face à face séparés par 2 m). Le programme d’enrichissement sera étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, renforcement du contact positif. Cet hébergement individuel est nécessaire pour éviter les biais lors de l’évaluation de la température mesurée par puce électronique, pour éviter une contamination croisée et limiter le stress lié à la cohabitation d’animaux développant la maladie

Choix des espèces

Dans ce projet, le modèle primate non-humain est choisi pour sa proximité génétique, et physiologique avec l'être humain, ce qui en fait le modèle le plus pertinent pour l’évaluation de traitements. Son appareil respiratoire ressemble beaucoup à celui de l’être humain, aussi bien par sa structure que par ses dimensions. Son système immunitaire réagit de manière similaire, avec une sensibilité aux mêmes types d’infections. De plus, les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire sont disponibles et maitrisés chez cette espèce. Ces études seront réalisées sur des animaux adultes. Le traitement à tester étant destiné principalement à la population adulte et le système immunitaire évoluant en fonction du stade de développement et de l’âge des individus, des animaux au système immunitaire mature seront donc utilisés dans ce projet.

Chacune des 96 femelles macaques à longue queue utilisées est anesthésiée une quarantaine de fois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent, par macaque, une infection vaginale par Chlamydia trachomatis, une à six injections de vaccin ou de placebo, l'implantation d'une puce de télémétrie, une quarantaine de prélèvements de sang, une trentaine d'écouvillonnages vaginaux, quinze biopsies vaginales et sept biopsies ganglionnaires. Le porteur attend des diarrhées, un amaigrissement, une cervicite avec écoulement purulent, une anémie transitoire et des infections cutanées aux sites de prélèvement, et prévoit des phases d'hébergement individuel dont il reconnaît qu'elles peuvent provoquer stress et ennui. Cinquante-deux macaques seront tuées pour analyse des organes cibles de l'infection, les quarante-quatre autres gardées en vie et réutilisées après vérification de leur état sanitaire par le vétérinaire.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre une infection sexuellement transmissible fréquente causée par la bactérie Chlamydia trachomatis, et à tester de nouvelles stratégies de vaccination pour essayer de la prévenir. Cette infection est très répandue dans le monde. Elle passe souvent inaperçue, en particulier chez les femmes, car elle ne provoque pas toujours de symptômes. Pourtant, elle peut avoir des conséquences graves, notamment sur la fertilité, en augmentant le risque de douleurs chroniques, de grossesse extra-utérine ou d’infertilité. Les traitements antibiotiques permettent de soigner l’infection, mais ils ne suffisent pas toujours à empêcher la propagation de l’infection dans la population ni à éviter certaines complications. Le développement d’un vaccin pourrait donc représenter un progrès important pour la santé publique. Le projet a pour objectif de mieux comprendre la manière dont cette infection se développe dans l’organisme et d’évaluer de nouveaux vaccins potentiels. Les nouveaux modèles d’infection développés dans ce projet permettront d’étudier une situation plus proche de celle observée chez l’être humain. Les candidats vaccins ayant montré des résultats satisfaisants chez le primate non humain pourront ensuite faire l’objet d’évaluations complémentaires en vue d’un possible développement clinique chez l’être humain. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles approches de prévention pour réduire les conséquences de cette infection dans la population.

Bénéfices attendus

Le modèle d’infection développé dans ce projet aidera à mieux comprendre comment la bactérie Chlamydia trachomatis infecte l’organisme et s’y développe. Il permettra de disposer d’un outil proche de ce qui se passe chez l’être humain pour tester de futurs vaccins. Les candidats vaccins les plus prometteurs, après des résultats encourageants chez l’animal évalué au cours de ce projet, pourraient ensuite être utilisés chez l’être humain. À plus long terme, ces recherches pourraient contribuer à développer de nouvelles méthodes de prévention contre cette infection, avec pour objectif de réduire ses effets sur la santé publique

Procédures

Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale (40 fois environ , entre 5 et 30 minutes sur tous les animaux) Les différentes interventions dans ce projet sont : - Injection des vaccins ou placebo (1 à 6 fois, tous les groupes vaccinés et contrôles, 5 min) - Infection vaginale avec la bactérie Chlamydia trachomatis (1 fois, tous les animaux, 15 min) - Prélèvement de sang (40 fois environ, tous les animaux, 5min) - Ecouvillonnage vaginal (30 fois environ, tous les animaux, 5 min) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, tous les animaux, 20 min) - Biopsies ganglionnaires (7 fois environ, 20 minutes, tous les animaux) - Biopsies vaginales (15 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux vaccinations et aux biopsies (peu attendues) : Réaction locale, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’administration ou les prélèvements. Nuisances liées à l’infection : diarrhée, amaigrissement, cervicite avec écoulement purulent (peu attendus). Nuisances liées aux anesthésies et prélèvements de sang : troubles de l’appétit avec plus ou moins de pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : l’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui.

Devenir

En fonction des résultats obtenus, certains animaux pourront être euthanasiés à la fin de la procédure pour des analyses plus approfondies des organes cibles de l’infection. Les autres animaux seront gardés en vie à la fin de l’étude et réutilisés une fois que l’état sanitaire des animaux aura été vérifié par le vétérinaire compétent.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation de l’animal de laboratoire est nécessaire pour mimer la pathologie observée chez l’être humain suite à l’infection par Chlamydia trachomatis. En effet, ce modèle animal permet de reproduire la réponse immunitaire induite par la vaccination et par l’infection dans un organisme entier, ce qui n’est pas réalisable avec les modèles ne recourant pas à l’animal de laboratoire (in vitro, in silico et ex vivo). Le primate non humain étant proche physiologiquement de l’être humain, son utilisation permet une meilleure extrapolation des résultats chez celui-ci.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats. Il a été ajusté au strict minimum nécessaire pour permettre une interprétation robuste des effets des conditions expérimentales, tout en prenant en compte la variabilité entre individus.

Raffinement

Les animaux seront suivis tous les jours, par une équipe dédiée. En cas d’atteinte d’un point limite, des mesures seront prises (arrêt des interventions, traitement, sortie d’étude), selon avis du vétérinaire et de la structure chargée du bien-être animal. En cas d’apparition de douleurs ou de signes cliniques liés aux prélèvements ou à l’infection, un traitement symptomatique pourra être mis en place. L’ensemble des interventions et les prélèvements seront regroupés au maximum et réalisés sous anesthésie générale des animaux. Les prélèvements sanguins, l’implantation de puces de télémétrie ou l’administration de vaccins peuvent entraîner des réactions locales (douleur, gonflement ou irritation). Si nécessaire, des soins appropriés, tels qu’une désinfection et un traitement contre la douleur, seront mis en place sur avis vétérinaire. Des phases d’hébergements en individuel seront nécessaires au cours du projet. Cet hébergement individuel pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie (distribution 2 fois/semaine d’enrichissements destructibles ou sachet surprise au lieu d’1 pour les hébergements en groupe). Cet hébergement individuel est nécessaire pour l’évaluation de certains paramètres biologiques notamment la température corporelle et pour limiter la surexposition bactérienne.

Choix des espèces

Seuls les primates non humains présentent des caractéristiques anatomiques et biologiques en termes de réponse immunitaire et vaccinale suffisamment proches de l’être humain pour permettre une étude pertinente de l’infection par Chlamydia trachomatis et de l’immunité. Nous avons choisi le macaque cynomolgus, modèle d’infection pour la bactérie d’intérêt déjà utilisé dans des études scientifiques précédentes et chez qui les techniques et outils d’exploration du système immunitaire sont disponibles et maitrisés. Notre étude, qui s’intéresse à l’infection vaginale par Chlamydia trachomatis nécessite d’avoir accès à des femelles adultes et matures.