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Etude de la tolérance et de l’efficacité d’un gel lubrifiant en prophylaxie contre l’infection par le VIH chez le macaque cynomolgus
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Pour tester un gel lubrifiant censé prévenir la transmission sexuelle du VIH, 25 macaques à longue queue femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à huit applications du gel, 25 anesthésies, 25 prélèvements sanguins, trois biopsies de tissus et trois colposcopies vaginales. Seize d'entre elles au maximum sont exposées au virus une fois par semaine pendant huit semaines, avec fièvre, diarrhées persistantes et perte de poids attendues en phase aiguë. Celles du test de tolérance sont réintégrées dans l'étude d'exposition, les animales infectées étant tuées pour mesurer la charge virale dans leurs tissus.
Objectifs
Les infections sexuellement transmissibles (IST) constituent un problème majeur de santé publique, avec plus de 1 million de nouveaux cas recensés chaque jour dans le monde, particulièrement chez les femmes. Malgré les efforts déployés à l’échelle mondiale, le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) reste un pathogène majeur à l’échelle mondiale. Il est donc nécessaire de développer des stratégies permettant de réduire et de prévenir ces infections. Le préservatif reste aujourd’hui le moyen de protection le plus efficace contre ces infections. Toutefois, son usage reste insuffisant dans certaines populations, pour des raisons sociales, culturelles ou liées à l’impossibilité de négociation au sein du couple. Dans plusieurs régions à forte incidence, notamment en Afrique subsaharienne, les jeunes femmes représentent 80 % des nouveaux cas de VIH. Le développement de moyens de protection autonomes, en particulier pour les femmes, ne nécessitant pas de négociation préalable avec le partenaire, représente ainsi un enjeu important de santé publique. Dans ce contexte, le projet vise au développement et à l’évaluation préclinique de gels lubrifiants microbicides pour prévenir de l’infection au VIH, conçus pour reproduire les propriétés protectrices du mucus naturel au niveau des muqueuses génitales. Dans un premier temps, la compatibilité du gel avec les tissus muqueux et les paramètres biologiques généraux de l’organisme au gel seront évalués après administration dans le vagin . Dans un second temps, la protection du gel contre l’infection sera évaluée par l’analyse des paramètres virologiques et immunologiques. Le modèle retenu est le macaque cynomolgus femelle, référence pour l’étude de la transmission muqueuse du VIH, en raison de la proximité de son système immunitaire avec celui de l’être humain, de la proximité anatomique et physiologique de son appareil reproducteur, de son cycle menstruel et de sa sensibilité à l’infection par un virus simien reproduisant les caractéristiques de l’infection HIV.
Bénéfices attendus
Le projet permettra le développement de nouvelles approches pour la confection de gel lubrifiant microbicide contre les infections sexuellement transmissibles (IST). Tout d’abord contre l’infection VIH chez la femme, et à long terme dans le développement d’un produit à plus large spectre contre les IST pour les femmes et les hommes.
Procédures
Les interventions prévues dans ce projet sont : • Administration du gel lubrifiant candidat ou contrôle (jusqu’à 8 administrations, sur 25 animaux, 1x par semaine, 2min) • Anesthésie des animaux (jusqu’à 25x, sur 25 animaux, 30min) • Prélèvements sanguins (jusqu’à 25x, sur 25 animaux, 5 min) • Biopsie de tissus (maximum 3, sur 25 animaux, 30min). • Suivi de l’environnement vaginal (récolte de fluides vaginaux, jusqu’à 25x, sur 25 animaux 2min) • Infection de 16 animaux maximum, (jusqu’à 8 infections à une fréquence d’une exposition par semaine, 2min) • Colposcopie vaginale, (3x maximum sur 25 animaux, 10min)
Impact sur les animaux
Nuisance liée au traitement Suite au traitement, une réaction locale d’inflammation peut apparaitre : démangeaison, douleur de façon transitoire. Nuisances liées aux prélèvements sanguins et biopsies tissulaires -Une réaction locale après prélèvement sanguin -Une réaction locale, suppuration, démangeaisons/douleur peuvent apparaitre après une biopsie tissulaire de façon transitoire. Nuisance liée à l’anesthésie Les anesthésies répétées peuvent entrainer une baisse de l’alimentation et par conséquent une perte de poids. Nuisance liée à l’infection sexuellement transmissible Les animaux infectés peuvent développer de la fièvre, des diarrhées persistantes, une perte de poids et une baisse du niveau de lymphocytes T de façon transitoire en phase aigüe (durée : quelques semaines). Nuisances liées aux colposcopies La colposcopie n'est pas un examen douloureux mais des crampes peuvent être ressenties après l’examen.
Devenir
Les animaux issus du test de tolérance seront gardés en vie et ils pourront être inclus dans l’ étude de protection afin de réduire le nombre d’animaux utilisés après avis du vétérinaire. Les animaux exposés au virus seront euthanasiés pour l’évaluation de la charge virale tissulaire et des réponses immunitaires dans les tissus.
Remplacement
L es études de tolérance et de l’efficacité d’un produit prophylactique contre des virus aussi critiques que VIH, ne peuvent pas être testées directement chez l’ être humain mais doivent montrer une efficacité dans des conditions proches de ce qui ce qui passe chez l’être humain. L’étude de tolérance et d’efficacité d’un produit au niveau vaginal implique un modèle proche de l’humain au niveau anatomique, du système immunitaire et de sa capacité à être infecté par le VIH. Aucune méthode alternative ne permet actuellement d’évaluer simultanément : • La tolérance locale sur une muqueuse génitale fonctionnelle ; • La protection induite dans un modèle d’exposition répétée au virus reproduisant les conditions de la transmission sexuelle.
Réduction
La taille des groupes a été réduite au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés pour pouvoir conclure de la tolérance et de l’efficacité de traitements prophylactiques candidats tout en prenant en compte une certaine variabilité individuelle.
Raffinement
Hébergement Les animaux seront hébergés en groupes avant le début des expérimentations et pendant le test de tolérance. Pendant la phase d’infection, les animaux seront en hébergements individuels proches afin d’éviter la surexposition virale tout en permettant des interactions sociales entre eux. L’enrichissement sera renforcé pour les animaux hébergés individuellement (distribution 2 fois/semaine d’enrichissements destructibles ou de sachet surprise au lieu d’1). En plus, du raffinement (nourriture plus variée, compléments alimentaires) sera mis en place quotidiennement. Anesthésie Les interventions (administrations, prélèvements de tissus, colposcopies) et les prélèvements de fluides seront regroupés autant que possible et réalisés sous anesthésie générale afin d’éviter le stress et d’éventuelles douleurs. Les anesthésies répétées pouvant entrainer une baisse de l’alimentation, une diversification et complémentation de celle-ci pourront être instaurées. Le recours à des techniques d’analgésie et d’antalgie pourra être mis en place lors d’apparitions de signes particuliers. Prélèvements sanguins et tissulaires En cas de signes cliniques liés aux biopsies tissulaires => signalement au vétérinaire, afin de mettre en place un traitement symptomatique en local. Traitement intravaginal Le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques (rougeurs, démangeaisons) afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Infection lors du test d’efficacité Les animaux seront observés quotidiennement. Les expositions virales seront interrompues dès confirmation de l’infection. En cas de modifications majeures des paramètres biologiques après analyses des prélèvement sanguins (, associées à l’apparition de signes cliniques, un avis vétérinaire sera demandé. Examens colposcopiques Des colposcopies permettront de déterminer l’intégrité de la muqueuse vaginale et des signes d’inflammation avant et après traitements. Les colposcopies seront effectuées sous anesthésie pour éviter le stress, aucune douleur n’est attendue lors de cet examen.
Choix des espèces
Le macaque cynomolgus femelle de plus de 3 ans a été choisi en raison de la pertinence scientifique de ce modèle pour l’étude de la transmission muqueuse du VIH retrouvé chez la femme. L’environnement vaginal et le système immunitaire varie au cours de développement et de l’âge de l’animal et ont donc un impact sur la susceptibilité à l’infection virale et sur les effets d’un traitement prophylactique. Ces études seront donc réalisées chez des macaques cynomolgus femelles de plus de 3 ans possédant un système immunitaire « mature ». Le macaque Cynomolgus partage à la fois une grande similarité avec l’être humain au niveau anatomique et morphologique du système reproducteur féminin, mais aussi au niveau de son système hormonal, et de son cycle menstruel. De plus le macaque cynomolgus possède un système et une réponse immunitaire proche de l’ être humain. Ce modèle est susceptible à l’infection par le virus simien, et développe une physiopathologie proche de celle observée chez l’humain atteint du VIH. Aucun autre modèle animal ne permet d’évaluer simultanément la tolérance au niveau de la muqueuse, l’impact hormonal et l’efficacité prophylactique dans un contexte d’exposition virale répétée.
Rôle des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans l’immunité antibactérienne et la vaccination chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
2 998 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont gavées trois fois à une semaine d'intervalle avec des salmonelles atténuées, puis une fois avec la souche sauvage, reçoivent des injections intrapéritonéales de bioparticules et des prises de sang, dont certaines par ponction rétro-orbitaire. Une partie voit ses pattes arrière irradiées sous kétamine et xylazine, le reste du corps protégé par un écran de plomb, avant de recevoir une greffe de moelle osseuse. Le porteur prévoit perte de poids, pelage hirsute, yeux larmoyants, posture voûtée, prostration et anorexie, et note qu'une mortalité aiguë peut survenir sans aucun signe clinique préalable.
Objectifs
Salmonella enterica est une bactérie intracellulaire qui infecte les humains et les animaux et constitue une menace majeure pour la santé publique, étant l’une des principales causes de maladies d’origine alimentaire dans le monde. De la gastro-entérite auto-limitée à la bactériémie mortelle, chaque année elles touchent plus d’un milliard de personnes. L’augmentation des résistances aux antibiotiques souligne le besoin urgent de nouvelles stratégies, notamment de vaccins, dont il n’existe actuellement aucun pour les souches non typhiques. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont des cellules immunitaires innées reconnues pour leur rôle dans les réponses antivirales. Cependant, leur contribution à la défense contre les bactéries a été sous-estimée et reste peu comprise. Nos travaux récents montrent que Salmonella peut activer ces cellules et induire une inflammation. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle murin pour comprendre comment ces cellules contribuent à la défense contre Salmonella et comment elles peuvent participer à la réponse immunitaire après vaccination. Nous déterminerons d’abord leur fréquence, leur activation et leur statut métabolique lors de l’infection. Ensuite, nous évaluerons le rôle des pDC dans les réponses antibactériennes in vivo, présentant un déficit sélectif de ces cellules, ainsi que l’importance de certains récepteurs pour cette réponse. Nous utiliserons également deux plateformes vaccinales afin de comparer comment les pDC contribuent à l’immunité protectrice selon différents modes d’activation immunitaire, depuis la stimulation induite par le pathogène jusqu’à la délivrance d’antigènes via des micro-technologies.
Bénéfices attendus
Les infections bactériennes chroniques représentent un fardeau majeur pour la santé publique, avec des niveaux élevés de morbidité et de mortalité, ainsi que des impacts économiques et sociaux importants. L’absence de vaccins efficaces et la dépendance actuelle aux antibiotiques rendent le contrôle de ces maladies particulièrement difficile. Le développement de stratégies visant à stimuler la réponse immunitaire de l’hôte constitue une approche prometteuse pour améliorer la protection contre les infections, comme la salmonellose, tout en réduisant les effets secondaires et la durée des traitements antibiotiques. Ce projet permettra d’identifier de nouveaux mécanismes et cibles pour développer des stratégies alternatives renforçant l’immunité contre les bactéries intracellulaires, avec pour objectif ultime de réduire l’infection et d’améliorer la santé publique. Salmonella sera utilisé comme pathogène modèle, avec la possibilité d’étendre cette approche à d’autres bactéries intracellulaires d’intérêt médical. Ces travaux ont des implications thérapeutiques importantes, notamment face à la hausse des souches bactériennes multirésistantes. En outre, considérant la salmonellose comme une maladie zoonotique, les résultats pourraient également être pertinents pour la médecine vétérinaire, s’inscrivant dans le concept One Health qui favorise une approche intégrée de la santé humaine et animale pour une meilleure prévention et prise en charge des maladies. Enfin, l’analyse fonctionnelle et phénotypique des pDC lors d’infections bactériennes intracellulaires est encore très limitée. Ce projet sera l’une des premières études à explorer le rôle des pDC murines au cours d’une infection bactérienne intestinale, avec un objectif mécanistique clair.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à des procédures chirurgicales. 1- Le gavage des souris sera effectué avec les salmonelles selon le schéma expérimental suivant : pour l’immunisation avec les salmonelles atténuées, l’administration sera réalisée trois fois, à une semaine d’intervalle, tandis que le challenge avec la souche sauvage sera effectué une seule fois sur des souris vigiles. Les gavages seront pratiqués sur souris vigiles pour maintenir le réflexe de déglutition 2- L’injection intrapéritonéale des biopuces (10 secondes par injection) sera réalisée une à trois fois, à une semaine d’intervalle, sur des souris vigiles. 3- Dans certaines expériences, nous préleverons du sang chez les souris immunisées ou infectées. Cela sera réalisé une fois par semaine dans le cadre du schéma d’immunisation, et une seule fois chez les souris infectées, juste avant mise à mort, sur des animaux anesthésiés sous gaz (isoflurane). 4- Pour certains expériences, les pattes arrière des souris dépourvues de pDC sont irradiées, tandis que le reste du corps est protégé par un écran en plomb (« shield »). Les souris « shield » sont préalablement anesthésiées sous kétamine et xylazine afin d’éviter tout mouvement pendant l’irradiation. Une fois l’irradiation terminée, les souris sont immédiatement reconstituées par injection intraveineuse avec les cellules de moelle osseuse du donneur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de courte durée attendus (incluent le stress, un inconfort léger et la douleur modérée) sont les anesthésies sous gaz nécessaires à l'injection des biopuces, aux prélèvements rétroorbitaux ainsi qu’aux injections intrapéritonéales et gavages sur des souris vigiles. Dans des études précédentes, nous avons démontré que l’injection de ces bioparticules n’induit aucun effet nuisible et est bien tolérée. Le procédé de génération de chimères de moelle osseuse est considéré comme présentant un niveau de douleur léger. Pour la procédure impliquant une infection par les salmonelles, les symptômes classiques de la maladie chez la souris, seront observés chaque jour dès le début de l’infection (signes extérieurs : perte de poids, pelage hirsute, yeux tirés larmoyants, posture voûtée, dos rond, prostration, anorexie). Une mortalité aiguë peut survenir sans signes cliniques dans les infections fulminantes chez les individus très sensibles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure et les tissus d’intérêt seront prélevés en vue d’analyses immunologiques (cytométrie en flux, mesure des cytokines et des anticorps), moléculaires (séquençage de l'ARN en cellule unique (scRNA-seq)) et microbiologiques (charge bactérienne).
Remplacement
Des expériences in vitro utilisant des cellules immunitaires primaires sont systématiquement réalisées afin d’évaluer les mécanismes d’activation des pDC, ainsi que la cytotoxicité, l’activation cellulaire et les doses optimales des biopuces ICARO. Ces approches in vitro et ex vivo permettront de réduire de manière substantielle le nombre d’animaux nécessaires pour le projet. Cependant, l’évaluation de l’efficacité protectrice et des corrélats immunitaires de cette stratégie vaccinale innovante, ainsi que l’étude de la dynamique des réponses des pDC lors d’une infection par Salmonella, nécessite l’utilisation d’un modèle murin entier, reproduisant fidèlement l’infection systémique et l’immunité de l’hôte observées chez l’homme (recherche préclinique). Des expériences in vitro supplémentaires avec des pDC humaines et des lignées cellulaires sont également développées au sein de notre équipe afin d’étudier la biologie des pDC et les mécanismes sous-jacents, ce qui réduira drastiquement le nombre de souris nécessaires dans le cadre de ce projet.
Réduction
Le projet est organisé de façon à réduire au strict nécessaire le nombre de tests et donc de souris utilisées. Par exemple, chaque souris permet l’analyse de différents organes (par exemple : plaques de Peyer, lamina propria, ganglions lymphatiques mésentériques, rate, foie), maximisant ainsi les informations obtenues. De plus, Les procédures correspondant à l'étude des mécanismes moléculaires (génération de souris chimères SBMC et analyse de l'effet de la délétion de gènes candidats dans les pDC) ne sera réalisée que si les résultats des étapes précédentes sont positifs, pour l’analyse du rôle des pDC au cours de l’infection par Salmonella et lors des réponses immunitaires induites par un vaccin vivant atténué ou par des biopuces, évitant ainsi l’utilisation inutile d’animaux. L’utilisation de souris de fond génétique pur réduit la variabilité interindividuelle et permet de constituer des groupes expérimentaux de taille réduite comparé à des fonds génétiques mixtes. Le nombre estimé de souris nécessaires à ce projet a été calculé à l'aide de méthodes statistiques validées afin d’obtenir une puissance statistique. Ce calcul inclut le regroupement d’échantillons pour les analyses transcriptomiques ainsi que la réalisation de mesures multiples par animal afin de réduire le nombre total de souris utilisées.
Raffinement
Afin de limiter leur stress, les souris seront acclimatées à leur nouvel environnement pendant une semaine avant toute expérimentation. Elles seront hébergées dans des cages de 530 cm² avec la nourriture et l’eau fournies à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Les souris seront anesthésiées à l'isoflurane pour réaliser les injections des biopuces et les prélévements sanguins rétroorbitaux. Lors des expériences d’injection des biopuces et d'infection par les salmonelles sur les animaux vaccinés ou non avec les biopuces, le poids et l’apparition des symptômes de la salmonellose seront suivis quotidiennement en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. Le score de souffrance animale sera calculé à l’aide d’une grille de scoring, en fonction des points limites des 4 catégories suivantes : apparence générale (absence de toilettage, poils hirsutes, dos rond, yeux mi-clos), prise alimentaire et poids corporel, détection de signes cliniques (difficulté respiratoire plus ou moins importante) et comportement général (mouvements ralentis, isolement, atonie, prostration). Les points limites ont été définis dans chaque procédure. De la nourriture en pâte sera aussi fournie directement dans la cage pour aider à l'alimentation des animaux affaiblis. Suivant les cas des mesures complémentaires seront prises en concertation avec le SBEA et le vétérinaire référent. Tout le personnel impliqué sera formé et autorisé à la manipulation des animaux ainsi qu’au suivi de leur bien-être. L’utilisation d’animaux génétiquement modifiés préalablement caractérisés constitue une approche pertinente pour affiner les études animales, car elle permet d’éviter l’utilisation de médicaments destinés à bloquer un processus biologique susceptible d’entraîner des effets secondaires imprévus.
Choix des espèces
En raison de la nature et de la complexité des interactions cellulaires au cours des réponses immunitaires, le recours à un modèle organisme est indispensable pour approfondir nos connaissances des réponses des pDC. Le modèle murin est le modèle idéal pour effectuer les expérimentations prévues dans ce projet. Son infection orale par Salmonella enterica Typhimurium est en effet connue pour mimer une infection systémique par les salmonelles chez l’homme et est donc idéale pour évaluer le rôle fonctionnel des cellules immunitaires in vivo et leur impact sur l’efficacité vaccinale dans un modèle préclinique. Le modèle murin permet également d’étudier les réponses immunitaires spécifiques aux antigènes bactériens et modèles utilisés dans le cadre de ce projet et d’analyser précisément les populations immunitaires et leur état d’activation, grâce au grand nombre d’anticorps disponibles sur le marché pour cette espèce. Afin de limiter les variations expérimentales qui seraient dues à des différences d'âge, les souris seront utilisés à l'âge adulte entre 6 et 8 semaines. Cet âge est suffisant pour que le système immunitaire soit mature et que les animaux soient de taille suffisamment grand pour faciliter les manipulations requises pour la procédure.
Développement d’un modèle murin d’infection cutanée par Borrelia afzelii
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Faute de modèle animal existant pour une complication cutanée tardive de la maladie de Lyme, ce projet en construit un avec 105 souris sans poils, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour prélever leurs organes. Le geste infligé tient en une seule injection de Borrelia afzelii sous la peau, de quelques secondes, sur animal éveillé. La souffrance attendue vient donc de l'infection elle-même, réaction inflammatoire locale puis arthrite possible, et non de l'acte. Le porteur écrit que l'absence de douleur au point d'injection dispense d'analgésie, sans indiquer combien de temps les souris seront gardées infectées, alors que la lésion visée survient chez l'humain des années après la piqûre de tique.
Objectifs
L'Acrodermatite Chronique Atrophiante (ACA) est une manifestation cutanée tardive de la borréliose de Lyme européenne due quasi-exclusivement à l’espèce Borrelia afzelii. Elle représente 3 à 5% des cas de borréliose de Lyme et survient des années voire parfois des décennies après un érythème migrant (EM) non traité, souvent au même site anatomique, ce qui suggère que cette bactérie a à la fois une capacité notable à persister pendant une longue durée dans la peau humaine sans être détectée et le potentiel d'induire une inflammation destructrice chronique tout en résistant à l'éradication par le système immunitaire. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle animal d’ACA qui pourrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques sous-jacents. Les souris utilisées comme modèle d’étude sont des souris sans poil non consanguines utilisées en cancérologie et dermatologie car les lésions cutanées sont plus facilement observables. Aucune étude des conséquences cutanées d’une infection de ces souris par des souches de Borrelia afzelii provenant de patient ayant présenté une ACA n’a été réalisée à ce jour. L’objectif principal de ce projet de recherche est de mettre au point un modèle d’infection cutanée de souris sans poil par des souches pathogènes de Borrelia afzelii afin de permettre l’étude des mécanismes impliqués dans l’ACA. L’objectif secondaire de ce projet est de caractériser l’infection chez cette souris : dissémination, séroconversion (apparition d’anticorps anti Borrelia).
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de mettre au point un modèle murin d’acrodermatite chronique atrophiante afin de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie, encore très peu connue, notamment dû à l’absence de modèle existant. La mise en place d’un modèle murin d’ACA pourrait dans un second temps permettre de décrire les facteurs d’hôte (par exemple système immunitaire) et bactériens expliquant la persistance de Borrelia afzelii dans la peau et l’inflammation tardive de ce tissu.
Procédures
Injection, 1 seule fois par souris, sur souris vigile, quelques secondes
Impact sur les animaux
Dans les suites de l’injection intradermique de Borrelia une faible réaction locale inflammatoire peut apparaitre. Dans un second temps, une arthrite peut potentiellement se manifester. Un léger stress peut être ressenti par la souris lors des manipulations
Devenir
Les souris ne peuvent être réutilisées, puisque le prélèvement de leurs organes est nécessaire à l’expérimentation. Elles seront donc mises à mort.
Remplacement
Les explants de peau ou les organoïdes ne sont pas utilisables pour répondre à la question scientifique pour 2 principales raisons : -Ils ne permettent pas d’observer des lésions cutanées tardives (maintien en culture de l’explant a une durée limitée de 10-15 jours) -Ils ne permettent pas d’étudier la dissémination de la bactérie (autres zones cutanées, autres organes) et les effecteurs du système immunitaires recrutés à partir du sang dans le tissu cutané.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour ce protocole a été calculé au minimum des exigences de publications internationales. Cependant, dans un but de réduction, le nombre de contrôle a été réduit à son maximum.
Raffinement
Concernant le bien être général des souris, elles disposeront d'un tunnel, d'un barreau à ronger, de coton et du carton ciselé pour réaliser un nid et seront regroupées en groupes sociaux. Après le sevrage et avant la procédure, les souris s'acclimatent à une manipulation douce selon, visant à réduire le stress via des interactions et des caresses. Concernant : - L’inoculation intradermique : l'absence de douleur au point d'injection élimine le besoin d'analgésiques, même si un inconfort lié à l’inflammation de la piqûre peut être observé à la suite de celle-ci. En cas de réaction inflammatoire qui serait trop importante un médicament anti-inflammatoire sera administré et un avis vétérinaire sera pris si l’évolution est défavorable. - L’apparition d’une d’arthrite. Si une gêne douloureuse de la souris est observée, un suivi sera réalisé et un médicament anti-inflammatoire sera administré et un avis vétérinaire sera pris si l’évolution est défavorable. - Les souris sans poil étudiées possèdent des vibrisses, mais les cils sont soit extrêmement rudimentaires, soit totalement absents. Une attention particulière sera portée sur l’observation des yeux et l’apparition d’une éventuelle conjonctivite. De plus, l’enrichissement utilisé ne produit pas particulièrement de poussière. Les souris sont mises à mort à 1 mois, 6 mois ou à 1 an selon leur groupe ou si elles présentent des lésions évocatrices d’une ACA. Pendant toute la durée expérimentale, l’état des souris est évalué quotidiennement, des points limites ont été déterminés afin de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance inutile.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les hôtes naturels des larves et des nymphes de tiques. Les souris « contrôle » sont sensibles à l’infection par Borrelia sl et sont classiquement utilisées en recherche scientifique sur ce sujet. Les souris étudiées dans notre protocole sont sensibles à l’infection par Borrelia afzelii, et constituent le meilleur modèle d’observation d’une éventuelle pathologie cutanée en raison de leur absence de poil. Des animaux sevrés à partir de 3 à 4 semaines seront utilisés. Pour le bon développement des souris, il est important qu’elles soient sevrées avant d’être séparée de leur mère. Il semble dans la littérature que l’inoculation des souris jeunes par Borrelia permet des manifestations cliniques plus marquée par rapport à une inoculation à 12 semaines.
Evaluation de l’efficacité de 2 nouveaux peptides comparé à la colistine administrés par nébulisation dans un modèle d’infection pulmonaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Rendues neutropéniques par deux injections intrapéritonéales, puis infectées par une bactérie multirésistante déposée dans leur nez sous anesthésie, 70 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Deux heures après l'infection, elles passent dix à vingt minutes dans un nébuliseur, maintenues dans un tube de contention, pour recevoir l'un des deux peptides testés, la colistine ou du solvant. Toutes sont tuées par ponction cardiaque afin de mesurer la charge bactérienne dans leur sang et leurs poumons. Le projet est classé en gravité sévère, mais le RNT décrit ces mêmes procédures comme entraînant des "nuisances modérées", une gêne "transitoire" et des douleurs "légères".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de deux nouveaux peptides administrés par nébulisation dans un modèle murin d’infection pulmonaire aiguë à Acinetobacter baumannii, en comparaison avec la colistine, antibiotique de référence utilisé dans le traitement des infections à bactéries multirésistantes. Acinetobacter baumannii est un pathogène opportuniste responsable d’infections pulmonaires sévères, notamment chez les patients immunodéprimés ou hospitalisés en soins intensifs. L’augmentation des résistances aux antibiotiques rend nécessaire le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Le projet vise à déterminer si les peptides testés permettent de réduire la charge bactérienne pulmonaire et systémique après infection pulmonaire chez la souris neutropénique.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus permettront d’améliorer les connaissances sur l’efficacité de nouveaux peptides antimicrobiens administrés par voie inhalée dans le traitement des infections pulmonaires bactériennes. Ce projet pourrait contribuer au développement de nouvelles alternatives thérapeutiques contre les infections à Acinetobacter baumannii, notamment dans un contexte de résistance croissante aux antibiotiques conventionnels. L’administration par nébulisation présente également un intérêt potentiel pour cibler directement le site de l’infection pulmonaire, limiter l’exposition systémique et réduire les effets indésirables associés aux traitements antibiotiques classiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions expérimentales non chirurgicales au cours de l’étude. - Induction de l’immunosuppressiona neutropénie : 2 injections intra-péritonéale de 10 secondes - Une administration intranasale unique de la suspension bactérienne. Cette procédure sera réalisée sous anesthésie légère àgazeuse l’isoflurane afin de limiter le stress et d’assurer une administration correcte de l’inoculum. La durée de la procédure sera d’environ de 5 à 10 minutes par animal, incluant l’induction anesthésique et la récupération immédiate. - Deux heures après l’infection, une administration unique du traitement expérimental (peptides, colistine ou PBS) sera réalisée par nébulisation. La durée de l’exposition à la nébulisation sera d’environ 10 à 20 minutes selon les paramètres techniques utilisés pour l’aérosolisation, incluant la phase de préparation des animaux dans le nébuliseur, l’administration du composé et la récupération de l’animal. - Une anesthésie fixe par voie IP de 10 secondes - Un prélèvement intra cardiaque sous anesthésie fixe d’environ 1 minute et mise à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à plusieurs procédures susceptibles d’entraîner des nuisances modérées : • Induction de neutropénie pouvant entraîner une fragilité immunitaire transitoire, l’administration peut provoquer une douleur légère transitoire au site d’injection. • Administration intranasale de la suspension bactérienne sous anesthésie • Développement d’une infection pulmonaire aiguë pouvant provoquer une altération de l’état général, une diminution de l’activité ou une gêne respiratoire ; surtout dans la phase pilote, ces effets ne sont pas recherchés pour la phase d’efficacité • Administration des traitements par nébulisation pourra provoquer une gène transitoire car la souris sera dans un tube de contention souple le temps de l’administration. • Prélèvements terminaux sanguins sous anesthésie pouvant provoquer une douleur légère au site d’injection
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour évaluer la charge bactérienne dans le sang et dans les poumons.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire dans ce projet car les interactions complexes entre l’hôte, le pathogène et le traitement administré par voie inhalée ne peuvent pas être reproduites de manière satisfaisante par des méthodes alternatives in vitro ou in silico. L’évaluation de l’efficacité thérapeutique nécessite notamment l’étude de la diffusion pulmonaire des composés, de la réponse à l’infection bactérienne et de la dissémination systémique, qui dépendent d’un organisme vivant entier. Toutefois, les données disponibles issues d’études préalables in vitro sur l’activité antibactérienne des peptides ont permis de sélectionner les candidats les plus pertinents avant le recours au modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été limité au minimum nécessaire permettant d’obtenir des résultats scientifiquement exploitables et statistiquement interprétables. Les effectifs ont été définis sur la base de l’expérience acquise avec ce type de modèle infectieux et du nombre de groupes nécessaires à la comparaison des traitements expérimentaux avec les groupes contrôle. Une phase pilote restreinte permettra d’optimiser l’inoculum bactérien avant l’étude principale, afin d’éviter la répétition d’expériences inutiles.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé et compétent afin de limiter le stress et la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés dans des conditions adaptées à leurs besoins physiologiques et comportementaux par cage de 10 avec des frisottis ou des jeux et avec une surveillance quotidienne renforcée durant les phases critiques de l’étude. L’état clinique sera suivi régulièrement afin d’identifier précocement tout signe de souffrance. Des points limites seront appliqués et tout animal présentant une altération sévère de l’état général sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
Les souris représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la charge bactérienne en particulier dans les modèles d’infection pulmonaire déjà développés au sein du laboratoire. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 30-35g (même poids que pour les précédentes études).
Évaluations précliniques de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les infections multirésistantes bactériennes, fongiques ou virales MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 1500
Quatre-vingt-dix études prévues sur cinq ans mobilisent 5 250 souris et 1 500 rats, tous tués à l'issue, dont 3 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les animaux sont infectés une fois par un virus, une bactérie ou un champignon, puis traités une à quatre fois par jour pendant dix jours, avec pesées quotidiennes et prélèvements de sang hebdomadaires sous anesthésie. Selon les protocoles, ils reçoivent un cathéter intra-urétral, une administration intranasale ou une lésion cutanée provoquée, et développent fièvre, perte de poids, détresse respiratoire et mobilité réduite. Le rat est retenu parce que sa taille permet des prélèvements de sang répétés plus abondants, la souris parce que les lignées transgéniques y sont nombreuses.
Objectifs
Le projet propose l’évaluation préclinique de composés anti-infectieux pour déterminer leur efficacité contre des agents pathogènes, incluant des virus, des bactéries et des champignons. L’objectif principal est d’explorer le potentiel thérapeutique de ces traitements pour la diminution de la résistance aux antibiotiques et la découverte de traitement contre les infections virales et fongiques dans les secteurs de la santé humaine et animale. Le nombre d'étude envisagées sur 5 ans est 90. L'efficacité des traitements sera mesurée à travers des tests biologiques et cliniques sur les modèles animaux, en évaluant leur capacité à éliminer ou inhiber la prolifération des agents infectieux, tout en favorisant une réponse immunitaire appropriée. Ce projet s’inscrit dans une démarche de développement de nouvelles solutions thérapeutiques, dans une perspective de prévention et de traitement des infections.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont multiples avec un impact significatif sur la santé humaine et animales. En développant des composés anti-infectieux, le projet vise à répondre à des besoins non satisfaits dans la lutte contre les infections virales, bactériennes et fongiques, en particulier face à la résistance antimicrobienne et aux effets secondaires des traitements existants. Le projet permettra de concevoir de nouveaux traitements ciblant plus efficacement les infections, en particulier dans les contextes où les thérapies actuelles échouent. Cette innovation pourrait améliorer la gestion des infections résistantes et des maladies difficiles à traiter. Les résultats du projet auront un impact direct sur la santé humaine et animale, en réduisant la prévalence des infections et la résistance aux traitements, contribuant ainsi à améliorer la santé publique. A court terme, ce projet permettra l'identification rapide de composés prometteurs ayant une activité anti-infectieuse spécifique et une compréhension fine de la physiopathologie infectieuse, en particulier les interactions hôte-pathogène et les réponses immunitaires induites. A long terme, ces recherches autoriseront le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour des infections graves ou résistantes alternatives aux antibiotiques. La réduction de la mortalité et de la morbidité associées aux infections bactériennes, fongiques ou virales, en particulier dans les populations à risque (immunodéprimés, enfants, patients hospitalisés), favorisera l'amélioration de la préparation face aux pandémies par la mise au point de traitements adaptables à différents pathogènes et des avancées scientifiques transversales profitant à d’autres domaines (cancérologie, immunologie, microbiome, médecine personnalisée).
Procédures
Le projet implique une seule administration des virus, bactéries ou champignons pour l'ensemble des protocoles. Cette procédure n'excède pas 15 secondes pour chaque animal et est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les traitements avec les composés testés sont de 1 à 4 fois par jour pendant 10 jours maximum. Ce geste n'excède pas 10 secondes par animal. Pour l'ensemble des protocoles, des pesées journalières sont réalisées ; pour chaque souris, une contention de 20 secondes maximum est nécessaire pour cette mesure. Enfin, des prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (pendant 1 minute) sont pratiqués pour la mesure des paramètres inflammatoires. En prenant en compte le temps de récupération des souris, le nombre maximum de prélèvement est de 1 fois par semaine pour l'ensemble des procédures. 30 minutes avant le prélèvement, un traitement avec un analgésique est pratiqué pour réduire la douleur ; ce traitement est également réalisé pour les installations de cathéters et la génération de lésions cutanées.
Impact sur les animaux
Les nuisances principales concernent la douleur et l'inconfort induits par les injections, les inflammations et l'infection. Des efforts sont faits pour limiter ces impacts en suivant des protocoles de réduction de la douleur et du stress. L'anesthésie avec l'isoflurane induit un stress de courte durée (15 secondes). Les piqûres d’aiguille pour infecter ou traiter les animaux entraînent une douleur légère de courte durée (2 secondes). Lors d'infection urinaire l'installation d’un cathéter intraurétral peut induire une inflammation locale de la vessie, causant un léger inconfort temporaire (1 minute). L'administration par voie intranasale de molécules peut entraîner une inflammation : douleur modérée (10 secondes). La génération de lésion cutanée (modèle cicatrisation) induit une douleur importante de 2minutes ; cet effet indésirable majeur sera contrôlé par analgésique et anesthésie. L'infection par des agents pathogènes induit la pathologie avec des symptômes attendus comme la fièvre, la perte de poids, la diminution de la prise alimentaire et hydrique, détresse respiratoire et une mobilité réduite. Ces symptômes sont causés par la maladie elle-même, ce qui constitue une altération de l'état général de l'animal. La préhension répétée, bien que de courte durée (20 secondes), peut être perturbant pour les animaux et induit un stress, mais il est géré en limitant la fréquence et la durée de ces manipulations. Ceci peut affecter le bien-être psychologique des animaux pendant la durée de la manipulation. UNE PRIVATION DE NOURRITURE DE PLUSIEURS HEURES PROVOQUE UN STRESS MÉTABOLIQUE MARQUÉ PAR UNE CHUTE DE LA GLYCÉMIE ET UNE HAUSSE DES HORMONES DU STRESS. CET ÉTAT DÉCLENCHE UNE ALTÉRATION COMPORTEMENTALE, OSCILLANT ENTRE UNE AGITATION ANXIEUSE ET UNE LÉTHARGIE. LES SOURIS AYANT DES MALADIES METABOLIQUES AURONT PLUS DE NUISANCE, COMME L'ETAT GENERAL ET LA MOBILITE. LES NUISANCES ATTENDUES SONT LES SIGNES CLINIQUES DETAILLE DANS L'ANNEXE 1.
Devenir
A la fin de chaque procédure tous les animaux sont mis à mort et des prélèvements d'organes et de sang sont réalisés pour des mesures de charge microbienne, de paramètres inflammatoires et des études d'histologie.
Remplacement
Préalablement à toute utilisation d'animal, nous intègrons dans nos projets des modèles in vitro, tissulaires et des organoïdes, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d’optimiser les essais précliniques. Il existe plusieurs alternatives non animales dans la recherche sur les maladies infectieuses et inflammatoires, mais elles ne peuvent pas remplacer totalement les tests sur les animaux utilisés dans ce projet. 1. Modèles in vitro : Les cultures cellulaires humaines ou animales permettent d’étudier des interactions cellulaires et les réponses inflammatoires. Cependant, elles ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier, notamment les interactions multicellulaires complexes et la réponse immunitaire systémique. 2. Modèles ex vivo : Les tissus humains ou animaux (biopsies, organes) permettent d’étudier des processus biologiques en conditions plus réalistes, mais il manque des interactions entre plusieurs systèmes organiques, essentiels pour comprendre les maladies infectieuses et inflammatoires. 3. Modèles organoïdes et organes sur puce : Ces systèmes imitent des organes comme les poumons ou les reins pour étudier les réponses biologiques. Cependant, ils ne peuvent pas reproduire la réponse systémique d'un organisme complet. 4. Modélisation informatique : Les simulations informatiques peuvent modéliser certaines interactions pathogènes et immunitaires, mais elles ne peuvent pas simuler toutes les réactions biologiques complexes d'un organisme vivant. Ces alternatives ne peuvent pas complètement remplacer les animaux, pour les raisons suivantes : • Complexité biologique : Les modèles non animaux ne peuvent pas reproduire la complexité d’un organisme vivant complet, limitant leur capacité à simuler des réponses biologiques globales. • Interactions systémiques : Les maladies infectieuses et inflammatoires nécessitent l'étude des interactions complexes entre les systèmes biologiques, ce qui ne peut être simulé sans un modèle vivant.
Réduction
Nous intègrons dans notre projet des modèles in vitro, tissulaires et des organoïdes, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d’optimiser les essais précliniques. Les modèles in vitro et tissulaires permettent de tester les composés anti-infectieux et immunomodulateurs sur des cultures cellulaires et tissulaires, évaluant leur efficacité, leur innocuité et leurs mécanismes d’action avant tout essai in vivo. Les organoïdes reproduisent des structures d’organes spécifiques, comme les poumons, la vessie et les reins, permettant d’étudier la réponse des tissus aux infections et traitements dans un environnement plus réaliste. En combinant ces approches, nous contribuons à la réduction des expérimentations animales, tout en garantissant la précision des résultats. Cette approche permet d'identifier les composés les plus prometteurs et de maximiser l'efficacité des traitements contre les infections virales, bactériennes et fongiques. De façon systématique des analyses statistiques sont effectuées pour déterminer le nombre d’animaux optimal afin de produire des résultats robustes pour chaque end point: généralement la charge virale, bactérienne ou fongique dans les organes ciblés, analyse de la survie, mesure de biomarqueurs (exemple: biomarqeur hépatique) et évaluation de l'inflammation.
Raffinement
Dans les expérimentations pour les maladies infectieuses et inflammatoires, la fréquence de surveillance des animaux est essentielle pour garantir leur bien-être. Les signes de détérioration de l’état de santé, sont particulièrement surveillés par l'observation de points limites en raison des effets des infections et inflammations. Après l'infection ou l'administration de traitements, une surveillance plus rapprochée (toutes les 2 à 4 heures) est mise en place dans les premières 12 heures, pour détecter rapidement des signes de détresse. Des critères d'arrêt stricts sont définis pour éviter la souffrance excessive des animaux. L’objectif est de garantir que l’état de l’animal est constamment suivi et que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux (injection par piqure...).
Choix des espèces
En infectiologie, les souris sont le modèle le plus documenté pour les infections bactériennes, fongiques et virales. Leur système immunitaire, bien caractérisé et très proche de celui de l’humain, permet l’analyse fine de la réponse hôte. Il y a une grande disponibilité de lignées transgéniques, utiles pour étudier des voies spécifiques des défenses immunitaires. Les rats ont une taille corporelle supérieure à celle de la souris, permettant des prélèvements répétés de sang en quantité suffisante pour des dosages biochimiques, hématologiques ou pharmacocinétiques. Ils présentent une meilleure tolérance aux manipulations, ce qui les rend adaptés aux études de suivi prolongé, à administration chronique. Les modèles infectieux bien établis pour certaines pathologies spécifiques, comme les infections pulmonaires et urinaires, sont parfois plus représentatifs chez le rat que chez la souris. Les animaux utilisés dans le cadre des modèles de pathologies infectieuses sont des jeunes adultes, âgées de minimum de 6 à 10 semaines. Ce stade de développement correspond à une maturité immunologique, métabolique et physiologique optimale, ce qui en fait un modèle préclinique pertinent et standardisé pour l’étude des maladies infectieuses et inflammatoires humaines. A partir de la 6e semaine, les animaux présentent un système immunitaire complet (réponses innée et adaptative), permettant une réponse fiable aux agents pathogènes étudiés (bactéries, virus, champignons). Les animaux sont sevrés, stabilisés, et moins sujets aux fluctuations hormonales ou de croissance rapides, ce qui renforce la reproductibilité expérimentale. La morphologie permet des manipulations techniques précises (voies d’infection, prélèvements sanguins, administration de traitements). La majorité des publications scientifiques et des recommandations réglementaires utilisent ce stade pour modéliser des infections systémiques, respiratoires, digestives ou cutanées.
Approche préventive par nanoparticules pour réduire les infections pulmonaires dans un modèle de granulomatose chronique septique
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
Infectées par Pseudomonas aeruginosa, les souris peuvent perdre du poids, cesser de s'alimenter, respirer difficilement et mourir dans les jours qui suivent. 509 souris génétiquement modifiées pour reproduire une granulomatose septique chronique vont être utilisées, 373 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 136 dans des procédures d'un niveau sévère, avec jusqu'à six séances d'imagerie sous anesthésie et une tonte du ventre. Le porteur décrit des interventions "brèves, espacées dans le temps" destinées à limiter la contrainte, tout en indiquant que la souffrance liée à l'infection reste "un aspect inévitable du modèle". 248 souris seront réutilisées comme support de formation technique pour entraîner du personnel aux gestes, les autres tuées pour des prélèvements post-mortem, celles qui ont survécu à une dose d'infection tuant un quart des animaux étant écartées de cette réutilisation.
Objectifs
La granulomatose septique chronique est une maladie génétique rare qui affaiblit les défenses naturelles de l’organisme contre les infections. Les personnes atteintes souffrent d’infections graves et répétées, surtout au niveau des poumons, pouvant entraîner un décès plus précoce que la normale. Une bactérie particulièrement dangereuse dans ce contexte est Pseudomonas aeruginosa, responsable d’infections pulmonaires sévères. Les traitements actuels reposent surtout sur les antibiotiques et la prévention des infections. Ils ne sont pas toujours efficaces, notamment en raison de la faiblesse du système immunitaire et de l’apparition de bactéries résistantes. Certaines options plus lourdes, comme la greffe de moelle osseuse, ne peuvent pas être proposées à tous les patients, et les nouveaux traitements sont encore en cours de développement. Dans ce contexte, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal reproduisant une forte sensibilité aux infections pulmonaires, afin de pouvoir étudier de manière pertinente l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques. Le projet consiste à tester une approche basée sur des nanoparticules destinées à renforcer les défenses naturelles des poumons contre les infections dans ce modèle. L’objectif est de vérifier si cette stratégie permet de réduire la gravité des infections pulmonaires et de fournir des informations utiles pour le développement de futurs traitements.
Bénéfices attendus
À court terme, l’objectif est de démontrer, dans un modèle animal pertinent, qu’il est possible de limiter efficacement une infection pulmonaire aiguë par Pseudomonas aeruginosa, un pathogène opportuniste. Cette approche repose sur des liposomes transportant des protéines capables de rétablir l’activité microbicide des macrophages alvéolaires, restaurer la production d’espèces réactives de l’oxygène et renforcer la réponse immunitaire locale. À long terme, cette stratégie pourrait devenir une nouvelle thérapie innovante pour l’Homme, améliorant la qualité de vie et l’espérance de vie des patients immunodéficients, tout en réduisant la dépendance aux antibiotiques et en limitant le risque de résistances.
Procédures
Les souris seront soumises à un nombre limité d’interventions réalisées sous anesthésie. Selon le schéma expérimental, chaque animal subira une à deux administrations (l’une pour le produit testé, l’autre pour les bactéries) et jusqu’à six séances d’imagerie, chacune durant environ 5 minutes. Ces imageries permettront soit de suivre la distribution du produit (6 séances), soit de suivre l’évolution de l’infection (3 séances). Chaque anesthésie durera au maximum une dizaine de minutes pour les administrations, et environ 5 minutes pour les imageries. Entre deux séances d’imagerie, les délais seront de 3, 18 ou 24 heures, selon les besoins du suivi longitudinal. Une tonte du pelage, localisée au niveau ventral, sera nécessaire pour les prises de clichés et sera réalisée pendant l’anesthésie. Toutes les interventions sont brèves, espacées dans le temps et réalisées sous anesthésie pour limiter au maximum la contrainte pour les animaux.
Impact sur les animaux
Les interventions sur les souris peuvent provoquer des gênes de courte ou moyenne durée et d’intensité variable. La contention nécessaire pour l’anesthésie provoque un stress très bref, inférieur à une minute, suivi d’une anesthésie courte (5 à 10 minutes). Le réveil peut entraîner une légère perturbation de la respiration ou des mouvements pendant quelques minutes, mais les animaux récupèrent rapidement. En revanche, l’infection bactérienne peut entraîner des effets sévères, apparaissant généralement dans les 24 à 48 heures et durant plusieurs jours : perte de poids importante, baisse marquée de l’activité et de l’appétit, posture voûtée, poils hérissés et respiration rapide ou difficile. Ces effets peuvent évoluer rapidement et entraîner la mort de certains animaux. La surveillance est constante pour suivre l’évolution de chaque animal et limiter au maximum sa détresse. La sévérité globale des interventions dépend surtout de la puissance de l’infection et de la répétition des anesthésies. Toutes les mesures possibles sont prises pour réduire la gêne liée aux manipulations, mais la souffrance liée à l’infection elle-même reste un aspect inévitable du modèle.
Devenir
À la fin de l’étude, les animaux seront soit réutilisés pour des activités d’enseignement lorsque cela est possible, soit euthanasiés lorsque l’expérience l’exige. En particulier, certains pourront, si l’occasion se présente, participer à des séances de formation technique (tutorat) destinées à former le personnel à des gestes maîtrisés sous la supervision d’un tuteur agréé. Les animaux ayant survécu à une infection par Pseudomonas aeruginosa à une dose induisant 25 % de mortalité ne pourront pas être réutilisés. Enfin, certains seront euthanasiés en fin de protocole pour des prélèvements post-mortem.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, la production de nanoparticules lipidiques actives et non toxiques, ainsi que leur efficacité, ont d’abord été évaluée in vitro sur des lignées cellulaires. Cependant, aucune méthode alternative in vitro ou ex vivo ne permet actuellement de reproduire la complexité physiopathologique d’un organisme vivant, ni d’évaluer la tolérance systémique et les réponses immunitaires globales. Le recours à un modèle murin ici est donc nécessaire pour évaluer l’efficacité et la sécurité d’une stratégie préventive avant toute transposition clinique.
Réduction
Les procédures ont été conçues pour utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Le suivi des mêmes animaux à différents moments permet d’obtenir de nombreuses données, tout en réduisant leur nombre total nécessaire. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir de données déjà connues dans la littérature ainsi que de résultats issus du laboratoire, évitant ainsi de multiplier les essais préliminaires. L’organisation progressive du projet, où chaque étape repose sur les résultats de la précédente, maximise également les informations obtenues pour chaque animal et contribue à réduire leur utilisation.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 jours. L’enrichissement sera adapté tout au long de l’étude pour garantir leur confort, leur thermorégulation et le maintien de relations sociales normales. Elles seront logées par petits groupes homogènes afin de préserver les interactions entre congénères tout en respectant les normes sanitaires. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel qualifié et, lorsqu’une anesthésie adaptée est nécessaire, elle sera toujours appliquée au préalable pour réduire le stress et la douleur. Après infection, des croquettes et de l’eau gélifiée seront placées au fond de la cage, en plus des sources habituelles, afin de limiter les efforts des animaux et prévenir toute déshydratation. Un suivi clinique quotidien permettra de détecter tout signe de souffrance, et en cas de détection, des actions visant à la supprimer seront réalisées sans délai. Ces mesures garantissent le respect du principe de raffinement, réduisant au maximum le stress et la douleur des animaux et limitant la durée ainsi que l’intensité des interventions, tout en permettant la collecte des données scientifiques nécessaires.
Choix des espèces
Pour étudier la granulomatose septique chronique ou l’infection pulmonaire par Pseudomonas aeruginosa, nous utiliserons des souris spécialement modifiées pour reproduire fidèlement les signes observés chez l’humain, tels que l’inflammation, la perte de poids et, dans certains cas, la mortalité. Les animaux choisis sont jeunes adultes, afin que leur système immunitaire soit mature et représentatif pour l’étude.
Caractérisation des atteintes neuromusculaires spinales dans des modèles murins de sepsis
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
500 souris mâles vont être utilisées, chacune opérée pour recevoir un traceur dans le muscle de la patte arrière, puis rendue septique. 240 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec une seconde chirurgie de l'abdomen, et le porteur annonce pour celles-là des effets plus marqués, moins d'activité, une perte de poids, des déplacements difficiles, une baisse de température et une douleur post-opératoire supplémentaire. Le bénéfice avancé reste de mieux comprendre pourquoi les patients qui survivent à un sepsis restent faibles, les pistes de prévention étant renvoyées au long terme. Toutes sont tuées pour récupérer la moelle épinière et les muscles.
Objectifs
Le sepsis est une maladie grave provoquée par une réponse excessive de l’organisme à une infection. Il peut entraîner des atteintes de plusieurs organes, mais aussi une faiblesse musculaire importante. Cette faiblesse gêne la récupération des patients, mais ses causes restent encore mal connues. Dans notre laboratoire, nous avons observé, chez la souris, que deux modèles expérimentaux de sepsis entraînent des troubles neuromusculaires associés à la présence de structures inflammatoires appelées « pièges extracellulaires » dans la moelle épinière. Ces structures pourraient participer aux anomalies observées, mais leur rôle exact reste à préciser. L’objectif de ce projet est d’étudier plus précisément les cellules nerveuses de la moelle épinière qui commandent un muscle de la patte arrière, le muscle gastrocnémien et de mieux comprendre comment le sepsis altère la commande nerveuse des muscles et quel rôle jouent les pièges extracellulaires dans ces atteintes.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes responsables de cette faiblesse musculaire, en particulier au niveau des cellules nerveuses qui commandent les muscles. L’étude portera plus précisément sur les neurones qui contrôlent le muscle gastrocnémien, situé dans la patte arrière. La comparaison entre deux modèles de sepsis chez la souris permettra de déterminer ce qui est commun aux deux situations et ce qui leur est propre. À plus long terme, ces travaux pourraient aider à identifier de nouvelles pistes pour prévenir ou réduire les complications neuromusculaires du sepsis et ainsi améliorer la récupération des patients.
Procédures
Une partie des animaux subiront une chirurgie (chirurgie durant environ 15 min) consistant en une incision de la peau d’une des pattes arrière afin d’injecter le muscle gastrocnémien avec un traceur permettant d’identifier les motoneurones de la moelle épinière qui innervent ce muscle. Ils recevront ensuite 3 jours à une semaine plus tard une injection d’un composé permettant d’induire une inflammation systémique (durée pour réalser l’injection : 2 minutes). Une autre partie des animaux recevront la même chirurgie d’injection de traceur dans le muscle gastrocnémien. Ils recevront ensuite 3 jours à une semaine plus tard une deuxième chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie durant environ 20 minutes), permettant de créer le modèle de choc septique, afin de mimer la pathologie humaine. Juste avant la fin de l’expérience, une mesure fonctionnelle musculaire terminale non-invasive sera également réalisée pour évaluer la réponse neuromusculaire du muscle (évaluation durant environ 20 minutes)
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir des effets passagers liés aux différentes étapes de l’étude. L’injection du traceur dans le muscle de la patte arrière nécessitera une petite intervention réalisée sous anesthésie. Elle pourra entraîner une gêne temporaire, une légère douleur après le réveil et un petit inconfort pour se déplacer pendant un court moment. Les modèles de sepsis utilisés dans cette étude pourront aussi provoquer une dégradation transitoire de l’état général des animaux. Ceux-ci pourront être moins actifs, perdre un peu de poids, se déplacer plus difficilement et présenter une baisse de température. Dans le modèle le plus sévère, qui nécessite une chirurgie abdominale, ces effets pourront être plus marqués et s’accompagner d’une douleur post-opératoire supplémentaire. Les animaux des groupes témoins pourront, eux aussi, présenter des effets passagers liés à l’injection ou à la chirurgie contrôle.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole, et les tissus récupérés pour être utilisés dans des analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires.
Remplacement
À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’étudier en même temps les effets du sepsis sur l’inflammation, la moelle épinière, les cellules nerveuses qui commandent les muscles et le fonctionnement musculaire lui-même. Des méthodes réalisées uniquement sur des cellules ou des tissus isolés ne permettent pas de reproduire toute la complexité de ces phénomènes dans un organisme entier. L’utilisation de l’animal est donc nécessaire pour comprendre comment ces différents mécanismes interagissent au cours du sepsis.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Le projet a été conçu à partir de l’expérience déjà acquise par le laboratoire avec ces modèles de sepsis et en tenant compte des analyses prévues en fin d’étude. Seuls quatre groupes seront étudiés, avec pour 2 groupes expérimentaux et leur groupe témoin respectivement, afin de répondre à la question posée en utilisant le moins d’animaux possible.
Raffinement
Une attention particulière sera portée au bien-être des animaux pendant toute l’étude. L’injection du traceur dans le muscle sera réalisée sous anesthésie générale, avec des mesures adaptées pour limiter la douleur. Les interventions seront menées dans de bonnes conditions d’hygiène, avec du matériel approprié, afin de réduire au maximum l’inconfort et les effets liés au geste. Après chaque procédure, les animaux seront surveillés attentivement après chaque expérimentation jusqu’à leur réveil complet puis de façon régulière. Leur état général, leur déplacement, leur poids, leur température et l’aspect de la zone opérée seront contrôlés. Les animaux soumis aux modèles de sepsis bénéficieront d’un suivi renforcé. La chirurgie utilisée pour le modèle le plus invasif sera également réalisée sous anesthésie, avec prise en charge de la douleur avant et après l’intervention. Toutes les procédures seront effectuées par du personnel formé, afin de réduire autant que possible la douleur, le stress et la durée des manipulations.
Choix des espèces
La souris a été choisie car c’est une espèce couramment utilisée en recherche biomédicale, bien connue et bien adaptée à ce type d’étude. Elle permet de travailler dans des conditions standardisées, ce qui aide à obtenir des résultats fiables et comparables. Sa petite taille et son cycle de vie court facilitent également le suivi des animaux dans de bonnes conditions. Cette espèce est particulièrement utile pour étudier les effets du sepsis sur les muscles, les nerfs et la moelle épinière. Les modèles utilisés dans ce projet sont déjà bien décrits chez la souris, ce qui permet de mieux interpréter les résultats et de les comparer à ceux d’autres études. La souris est aussi adaptée aux techniques nécessaires ici, comme l’injection d’un traceur dans le muscle et l’analyse de la moelle épinière en fin d’étude. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes mâles, âgés de 8 à 12 semaines. Ce choix permet d’éviter les effets liés à la croissance ou au vieillissement, qui pourraient influencer les résultats. Il permet aussi de se rapprocher davantage de la situation étudiée chez l’adulte humain.
Etude de nouvelles formulations lipidiques pour une vaccination pulmonaire d’ARN messager chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
Pour mettre au point un vaccin à ARN messager administré directement dans les poumons, 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à modéré. Elles reçoivent le produit par dépôt dans la gorge sous anesthésie, des injections sur animal vigile jusqu'à quatre fois et autant de séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur affirme que la distribution des formulations et leur passage des barrières pulmonaires ne peuvent s'étudier que dans un "organisme vivant". Les retombées annoncées contre les maladies respiratoires et certains cancers restent renvoyées au long terme, quand la mise à mort pour prélever les organes est programmée pour toutes.
Objectifs
L’ARN messager (ARNm) est une molécule naturellement présente dans les cellules, qui sert à la fabrication des protéines. Ces molécules peuvent être utilisées dans certains vaccins, tels que ceux contre la COVID-19, où elles permettent à l’organisme de produire une protéine du pathogène afin de déclencher une réponse immunitaire contre ce dernier. Les formulations lipidiques ont démontré leur intérêt pour des approches de vaccination par leur capacité à protéger l’ARNm et faciliter son entrée dans les cellules du système immunitaire. Toutefois, ces vaccins ARNm actuellement administrés dans le muscle induisent une protection limitée au niveau des poumons, ce qui peut permettre la transmission de pathogènes malgré la vaccination. L’objectif de ce projet est de développer des nouvelles formulations lipidiques permettant une vaccination ARNm via une administration directement au niveau des voies respiratoires, principal site d’entrée de nombreux agents pathogènes, afin de renforcer la réponse immunitaire. Certaines questions essentielles, telles que la distribution des formulations dans l’organisme et leur capacité à franchir les barrières naturelles des poumons, ne peuvent être étudiées que dans un organisme vivant. Des expériences chez la souris sont ainsi nécessaires afin d’identifier la plus efficace pour une administration pulmonaire d’ARNm.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à sélectionner la meilleure formulation lipidique permettant une bonne expression de l’ARNm et un profil de distribution adéquat pour une vaccination pulmonaire. De plus, ce projet permettra de produire des connaissances nouvelles sur l’administration de vaccins à ARNm par voie pulmonaire, afin d’améliorer leur efficacité au niveau des voies respiratoires. Les résultats attendus pourront contribuer, à long terme, au développement de stratégies de prévention mieux adaptées contre les maladies infectieuses respiratoires et certaines pathologies cancéreuses.
Procédures
Une partie des animaux recevront une administration unique par dépôt dans la gorge et aspiration, sous anesthésie générale – durée 5 min. Une autre partie des animaux recevront une administration unique par dépôt dans la gorge et aspiration, sous anesthésie générale – durée 5 min. Les différents groupes recevront une injection réalisée sur animal vigile – durée 1 min, 4 fois maximum. L’imagerie des souris sera réalisée sous anesthésie générale – durée 10 min, 4 fois maximum.
Impact sur les animaux
L’administration peut occasionner une gêne respiratoire passagère, sans conséquence à long terme. Une réaction inflammatoire locale transitoire des voies respiratoires liée à l’administration pulmonaire des formulations ne peut être exclue et fera l’objet d’une surveillance. Les injections répétées peuvent induire un stress léger et transitoire lié à la contention et à l’injection. Les anesthésies générales de courte durée nécessaires au suivi par imagerie, lorsqu’elles sont répétées, peuvent induire du stress, ainsi que des effets secondaires légers tels qu'une hypothermie transitoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour étudier l’effet du traitement et analyser son impact sur les organes.
Remplacement
Des tests cellulaires seront effectués au préalable pour sélectionner les formulations lipidiques prometteuses. Cette première sélection permettra de ne tester chez l’animal que les formulations optimales. L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet car elle constitue un organisme modèle fiable pour évaluer la vaccination dans un système biologique complet Il n’existe actuellement aucune alternative capable de reproduire la complexité d’un organisme vivant.
Réduction
Les expériences ont été consciencieusement pensées et élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Ce nombre a été déterminé à l’aide d’une approche statistique. Pour l’analyse a posteriori des résultats, des tests statistiques seront utilisés. L’utilisation de l'imagerie nous permet de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
L’administration et les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. Après l’anesthésie, la souris sera placée dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération interventionnelle et post-examen d’imagerie. Des antalgiques sont prévus si l’animal présente un signe de souffrance. Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux.
Choix des espèces
La souris adulte, c’est-à-dire de 7 semaines, constitue un modèle pertinent pour l’étude de la délivrance pulmonaire d’ARNm en raison de la similitude de l’organisation des voies aériennes et de la présence de mécanismes de sécrétion de mucus et de clairance mucociliaire fonctionnels et comparables. Cette espèce est largement utilisée et validée dans la littérature pour l’administration pulmonaire par aspiration oropharyngée et l’évaluation de formulations lipidiques.
Effet protecteur des HDL dans un modèle de sepsis chez la souris C57BL/6J
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
Laparotomie, puis ligature et perforation de l'intestin pour déclencher un choc septique, mise à mort vingt-quatre heures après: 60 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Le choc provoque fièvre, frissons, hyperventilation et accélération du rythme cardiaque. Une partie reçoit ensuite des nanoparticules mimant les HDL, censées protéger de l'inflammation. Sang, bile et organes sont prélevés après la mise à mort.
Objectifs
Le sepsis est défini comme la réponse systémique à l’agression de micro-organismes et/ou toxines correspondant à un syndrome clinique complexe de réponse de l’hôte à l’infection. Il est caractérisé par l’activation de la réponse immunitaire qui est responsable de dommages endothéliaux et de dysfonctions d’organes impliquant divers médiateurs de l’inflammation tels que les cytokines, les polynucléaires neutrophiles, les prostaglandines, les leucotriènes, les espèces radicalaires de l’oxygène ou encore le monoxyde d’azote. Les HDL sont une association d’apolipoprotéines, majoritairement l’ApoA1 avec des phospholipides et leur principale fonction est le transport inverse du cholestérol, c’est-à-dire des organes vers le foie. De nombreuses études ont largement décrit une relation inverse entre taux de HDL chez l’homme et l’incidence d’évènements cardiovasculaires tels que le syndrome coronarien ou l’accident vasculaire cérébral, leur conférant ainsi un statut de protecteur cardiovasculaire. En plus de ces propriétés majeures, des études plus récentes ont révélé des effets anti-inflammatoires, anti-apoptotiques, anti-thrombotiques et anti-oxydants des HDL. Au cours du sepsis, plusieurs études fondamentales ou cliniques se sont intéressées à l’interaction entre HDL et les acteurs mis en jeu au cours du sepsis. Par exemple, certains auteurs ont démontré que les HDL ont la capacité de neutraliser le LPS (LipoPolySaccharide) qui est incriminé dans le développement du choc septique. Certains auteurs ont également montré que des peptides mimétiques de l’apoA1 pouvaient prévenir la dysfonction vasculaire et augmenter la survie dans un modèle de choc septique chez le rat. Une étude chez l’homme et chez le cochon a montrée la capacité des nanoparticules HDL mimétiques les CER001®, à réduire l’orage cytokinique associés au sepsis. Cette diminution des taux de cytokines pro-inflammatoire était conjointe à une augmentation de l’élimination du LPS vers la bile ainsi qu’un meilleur taux de survie.
Bénéfices attendus
Ce projet présente un fort potentiel dans la compréhension des mécanismes protecteurs des nanoparticules HDL mimétiques (CER001®) dans le sepsis, d’un point de vue fondamentale : explorer l’impact du sepsis sur la modification des lipoprotéines endogènes, et comprendre comment interviennent les CER001® sur ces modifications. D’un point de vue thérapeutiques elle pourrait fournir des éléments menant à des piste d’amélioration de ces nanoparticules.
Procédures
Toutes les souris subiront toutes une laparatomie, un prélèvement sanguin et seront mise à mort. Les souris des groupes contrôle et traitement subiront en plus la ligature et une ponction du caecum en plus, et développeront un choc spetique avec tous les symptômes associés. La mise à mort interviendra 24h après la chirurgie.
Impact sur les animaux
Les souris vont subir le protocole CLP qui consiste dans un premier temp en une laparotomie ainsi qu’une ligature et perforation du caecum, ce qui va engendrer une péritonite et tous symptômes caractéristiques d’un choc septique, un état fébrile, une sensation de malaise, de la fièvre, des confusions, des frissons, une hyperventilation, une augmentation du rythme cardiaque etc. Les souris recevront ensuite une injection de CER001® en intraveineuse dans la veine caudale.
Devenir
Toutes les souris seront mise à mort. Les organes, le sang et la bile des souris seront prélévé pour analyses. De l'immunohistofluorescence est prévue sur des coupes d'organes à la recheche des HDL endogènes ainsi que les HDL recombinantes, et des dosages des oxylipines seront réalisé dans le sang et la bile. La mise à mort des animaux est alors nécessaire y compris pour les groupe sham et contrôle.
Remplacement
Le sepsis est un syndrome aigu complexe impliquant tous les organes qu’il est impossible de modéliser in vitro. Il existe plusieurs modèles de sepsis expérimentaux. Néanmoins, le modèle de CLP est un modèle de péritonite dont la physiopathologie se rapproche le plus de celui de l’homme. En effet, ce modèle respecte un certain nombre de conditions similaires à celles chez l’homme, à savoir le timing entre la perforation et la survenue d’un tableau de sepsis ; le caractère pluri-microbien de l’infection à des concentrations élévées et la co-infection bactérienne associant des bactéries Gram négatives, positives et par d'autres organismes tels que les levures. (Rittirsch et al. nature protocole. 2009)
Réduction
Le nombre total d’animaux prévu est de 65 souris C57BL/6J mâle et femelle. Ce chiffre correspond au nombre maximal et a été défini de manière à garantir la robustesse statistique tout en limitant l’utilisation au strict nécessaire. - Souris groupe SHAM + sérum physiologique= les souris vont subir une laparotomie puis seront refermée (n=20, 10 mâles et 10 femelles) nous voulons évaluer la réponse inflammatoire induites par le sepsis, notamment la composante lipidique, il est nécessaire d'être capable de discriminer la petite inflammation induite par la chirurgie de celle induite par la mise en place du sepsis, ce groupe sham fera office de contrôle négatif. - Souris groupe sepsis + sérum physiologique = groupe contrôle : les souris subissent une CLP puis une injection intra-veineuse de sérum physiologique (n=20, 10 mâles et 10 femelles). - Souris groupe sepsis + HDL recombinantes = les souris subissent une CLP puis une injection intra-veineuse de HDL recombinantes (n=20, 10 mâles et 10 femelles). Nous utiliserons 5 souris pour entraînement sur le modèle CLP. Un calcul d’effectif a été réalisé pour une comparaison entre deux groupes indépendants par test t bilatéral, avec un seuil α de 0,05 et une puissance de 80 %. En considérant une variabilité attendue de 25 % du critère principal, un effectif de 20 animaux par groupe permet de détecter une différence minimale d’environ 22 % entre les groupes. Cet effectif a donc été retenu pour mettre en évidence un effet biologiquement pertinent tout en limitant l’utilisation d’animaux. Ce nombre a déjà été utilisé dans d'autres études antérieur (Reconstituted High-density Lipoprotein Therapy Improves Survival in Mouse Models of Sepsis) Tanaka et al.
Raffinement
La semaine avant la chirurgie les animaux seront habitués aux conditions expérimentales et à la pièce d'expérimentation afin de diminuer le stress. Dès le début de l’acte chirurgical, l’administration d’un analgésique permettra de prévenir la douleur per et post-opératoire et de faciliter le réveil. Les animaux seront placés dans des cages individuelles sur des plateaux chauffants en post chirurgie. Pendant l’heure qui suit la chirurgie, l’animal sera observé : son comportement, son activité (s’il est isolé, passif), sa posture (s’il est prostré), son pelage (s’il est hérissé, s’il y a perte de poils), sa respiration (si le rythme est rapide ou saccadé), les mouvements qu’il effectue. En cas de signe de souffrance nous augmenterons la dose d’analgésique. Si le traitement ne suffit pas et qu’une souris est en décubitus latéral avec une détresse respiratoire, elle sera euthanasiée par dislocation cervicale.
Choix des espèces
La souris représente une espèce validée dans ce modèle de sepsis expérimental. La petite taille des souris permet l’injection de quantités limitées de produits thérapeutiques. Des souris C57BL/6J adultes de 10 semaines seront utilisées, pesant environ 25-30 grammes. La CLP est une procédure de classe sévère et il est nécessaire que les souris soit adulte mais pas trop âgées pour pouvoir supporter la chirurgie.
Greffes de hépatocytes primaires murins ou humains dans le foie afin de corriger un phénotype et de raffiner le processus d’humanisation
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rendues immunodéficientes pour éviter le rejet des greffes, 933 souris vont être utilisées pour fabriquer un foie partiellement humanisé, dans des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère, toutes tuées à l'issue. Les nouveau-nés reçoivent une injection de cellules hépatiques dans le foie, après tatouage d'un orteil et biopsie d'oreille pour le génotypage. Les animaux sont tués entre quatre et six mois pour prélever sang et organes, ceux gardés pour la reproduction étant tués plus tard, en fin de période reproductive. Le porteur reconnaît l'existence de modèles in vitro, mais les juge insuffisants pour reproduire un foie humain fonctionnel.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer une souris dont une partie des cellules du foie est remplacée par des cellules humaines. Ce type de modèle est essentiel pour mieux comprendre certaines maladies du foie qui ne peuvent pas être correctement étudiées sur des souris normales, comme les infections par certains virus, des maladies métaboliques ou encore des troubles touchant spécifiquement les cellules du foie. Cette souris permettra aussi de mieux évaluer comment des traitements ou des médicaments sont transformés par un foie fonctionnant de façon proche de celui de l’être humain. Pour rendre cette humanisation possible, une lignée de souris a été développée afin de créer, à un moment précis, un espace dans le foie permettant l’implantation de cellules humaines. Cependant, chez les animaux homozygotes (portant cette modification génétique sur les deux chromosomes), ce mécanisme se déclenche trop tôt, entraînant une dégradation du foie qui cause leur mortalité avant l’âge de 4 semaines. Actuellement, seules les souris hétérozygotes (qui portent cette modification génétique seulement sur un chromosome), qui sont en bonne santé, peuvent être utilisées. Pour produire ces animaux, un schéma d’élevage hétérozygote × souris « sans modification » est utilisé, ce qui génère des portées contenant environ 50 % de souris sans modification qui ne peuvent pas être utilisées pour l’humanisation du foie et sont ensuite mises à mort. Le projet vise à corriger le problème observé chez les animaux homozygotes en greffant des cellules de foie saines chez les nouveau nés, afin de rétablir un foie fonctionnel et de permettre à ces animaux fragiles de rester en bonne santé. S’ils survivent et se reproduisent normalement, ils pourraient remplacer les schémas d’élevage actuels et éviter la production de souris sans modification et non utilisables. Si la greffe réalisée chez les nouveau nés fonctionne, le projet examinera également si la greffe des cellules humaines peut être faites à cet âge. Cette approche serait une avancée importante, car elle remplacerait des méthodes plus lourdes appliquées chez l’adulte par une procédure simple et peu invasive pratiquée chez le nouveau né. À terme, ce travail permettra de créer un modèle plus fiable pour la recherche, tout en améliorant le bien être animal et en réduisant le nombre total de souris nécessaires.
Bénéfices attendus
Le développement d’une souris possédant un foie partiellement humain permettra d’étudier un large ensemble de maladies du foie qui ne peuvent pas être correctement reproduites chez les souris normales. Ce modèle pourra notamment servir à mieux comprendre les infections provoquées par certains virus qui n’infectent que les cellules humaines du foie, mais aussi des maladies métaboliques comme celles impliquées dans l’accumulation de graisses dans le foie, ou encore des atteintes chroniques touchant le fonctionnement global de cet organe. Un tel modèle est également utilisé pour étudier comment les médicaments sont transformés dans le corps humain, car le foie joue un rôle central dans l’élimination et la détoxification de nombreuses substances. Si ce projet donne les résultats espérés, il permettra d’améliorer la manière dont les souris sont élevées pour produire le modèle au foie humanisé. Aujourd’hui, suite schéma d’élevage hétérozygote × sans modification, une partie importante des souris nées sont des animaux non-modifiés, qui ne peuvent pas être utilisée et sont ensuite mises à mort. En rendant possible l’utilisation d’animaux homozygotes qui jusque là ne survivaient pas, le projet réduirait fortement ce nombre et rendrait l’élevage beaucoup plus efficace et respectueux des animaux. Le projet pourrait aussi remplacer certaines étapes plus lourdes du processus d’humanisation actuellement réalisées chez l’adulte par des procédures plus simples et moins invasives chez le nouveau né. Cela améliorerait considérablement les conditions de travail avec ces animaux et diminuerait l’inconfort lié aux traitements ou aux interventions nécessaires. Ainsi, ce projet présente à la fois un intérêt scientifique — en permettant de mieux étudier des maladies humaines du foie — et un intérêt éthique, puisqu’il contribue à réduire le nombre d’animaux utilisés et à rendre les procédures plus respectueuses de leur bien être.
Procédures
IDENTIFICATION ET GENOTYPAGE : Les souriceaux reçoivent un tatouage d’orteil pour leur identification individuelle. Une biopsie d’oreille est prélevée au même moment afin de permettre le génotypage. L’ensemble de la manipulation dure généralement entre 30 et 90 secondes. Dans de rares cas, un second prélèvement auriculaire peut être nécessaire si l’échantillon initial n’est pas exploitable. GREFFES DE CELLULES HEPATIQUES : Les greffes consistent en une unique injection intrahépatique transcutanée réalisée chez les nouveau nés. Cette intervention ne prend que quelques secondes et n’entraîne qu’une douleur minimale. Chez certaines souris hétérozygotes, des injections additionnelles d’un composé destiné à faciliter la reconstitution du foie peuvent être réalisées une fois les animaux sevrés. Chaque injection dure quelques secondes et provoque une gêne très limitée. Au maximum, une injection hebdomadaire est prévue, correspondant à un maximum de 14 injections si l’animal est suivi jusqu’à l’âge de 4 mois. PRELEVEMENTS SANGUINS : Chez les animaux greffés avec des cellules de foie humain, des prélèvements de sang peuvent être réalisés afin de suivre la progression de la reconstitution hépatique. Dans ce cas, 1 à 2 prélèvements par mois sont effectués, pour un maximum de 9 prélèvements par animal. Afin de réduire le stress et la douleur, tous les prélèvements sont réalisés sous anesthésie gazeuse. Les prélèvements durent quelques secondes, mais l’animal reste anesthésié pendant environ 5 à 10 minutes.
Impact sur les animaux
TRANSPORT : Les animaux sont transportés depuis un éleveur professionnel jusqu’à notre site. Bien que le trajet soit court, il peut provoquer un stress transitoire lié aux manipulations et au changement d’environnement. IMMUNODÉFICIENCE : Afin d’éviter le rejet des greffes de cellules de foie, les souris utilisées sont immunodéficientes, ce qui les rend particulièrement sensibles aux infections. Maintenues en conditions sanitaires strictes, elles restent cependant en bon état de santé. PHÉNOTYPE CHEZ DES HOMOZYGOTES : Avant que les cellules hépatiques saines ne recolonisent complètement le foie, les souriceaux homozygotes peuvent présenter des signes rappelant une insuffisance hépatique, tels qu’un retard de croissance, une baisse d’activité, une coloration cutanée altérée, une hypothermie ou un mauvais état général. Ces manifestations sont temporaires et diminuent à mesure que les cellules greffées prennent le relais. IDENTIFICATION ET GÉNOTYPAGE : À cet âge précoce, le tatouage des orteils et la biopsie auriculaire entraînent une douleur légère et brève. La principale nuisance est liée à la manipulation des animaux et à leur séparation momentanée de leur mère. INJECTION DE CELLULES HÉPATIQUES : Les cellules injectées ne provoquent aucune irritation ou toxicité. La seule nuisance associée à l’intervention est la douleur brève causée par l’insertion de l’aiguille lors de l’injection intra hépatique. INJECTION D’UN COMPOSÉ CHEZ LES HÉTÉROZYGOTES : Le composé administré à certaines souris hétérozygotes pour favoriser la recolonisation du foie peut entraîner une atteinte hépatique très légère et temporaire. Cela peut se traduire par une diminution transitoire de l’activité, un appétit réduit ou une hypothermie modérée. L’injection elle même provoque une douleur minime et de courte durée. PRÉLÈVEMENTS SANGUINS : Les prélèvements sanguins peuvent causer une douleur légère au site de ponction. Cette nuisance est fortement réduite puisqu’ils sont réalisés sous anesthésie, ce qui limite le stress et la gêne. STRESS : Toutes les interventions nécessitant une manipulation des animaux peuvent entraîner un stress temporaire, lié au contact, au changement d’environnement immédiat ou à la séparation brève d’avec leur groupe ou leur mère.
Devenir
Les animaux sont mis à mort lorsqu’ils atteignent un point limite, ou à la fin de la procédure, afin de permettre un prélévement de sang ou des organes pour effectuer des analyses plus approfondies. Selon la procédure concernée, cette étape se situe entre 4 et 6 mois d’âge. Les animaux destinés à l’élevage sont maintenus plus longtemps et mis à mort uniquement à la fin de leur période reproductive, soit vers 6 mois.
Remplacement
Le projet présenté s’inscrit dans un programme visant à développer une souris à foie humanisé, utilisée pour l’étude de nombreuses pathologies du foie humain, notamment les infections par des virus hépatotropes, les maladies métaboliques, la toxicité hépatique et le métabolisme des médicaments. Des modèles in vitro existent, comme les lignées cellulaires humaines, les hépatocytes primaires, les sphéroïdes 3D ou les systèmes « organ‑on‑a‑chip ». Bien que précieux pour les études mécanistiques, ces outils ne permettent pas de reproduire l’organisation d’un foie dans un organisme entier, ni ses interactions avec la circulation sanguine, le système immunitaire ou les autres organes. Pour les recherches nécessitant une physiologie systémique, un modèle murin partiellement humanisé reste donc indispensable. Le projet vise à corriger le phénotype létal observé chez les souris homozygotes afin qu’elles puissent être utilisées dans l’humanisation du foie et pour affiner le processus d’humanisation. Dans ce contexte, aucune alternative non animale ne peut être utilisée. Toutefois, ce projet contribue directement à la réduction du nombre d’animaux nécessaires au modèle final et à un raffinement du processus d’humanisation, comme décrit ci‑après.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été limité au strict minimum compatible avec une analyse fiable, tout en incluant des animaux des deux sexes afin de garantir la pertinence biologique des résultats. La stratégie expérimentale repose d’abord sur une étude pilote. Les études suivantes ne sont réalisées qu’en cas de succès de cette phase pilote, ce qui évite d’utiliser des animaux dans des approches qui ne seraient pas scientifiquement justifiées. De plus, la restauration de la fertilité des homozygotes constituerait un levier majeur de réduction. Le fait de pouvoir remplacer le schéma d’élevage actuel, basé sur l’accouplement de souris hétérozygotes et non-modifiées — lequel génère environ 50 % d’animaux sans modification et non utilisables et ensuite mis à mort — par un accouplement homozygote × homozygote, dont 100 % de la descendance serait utilisable, réduirait fortement le nombre d’animaux produits. Cette diminution concernerait non seulement ce projet, mais également l’ensemble du programme visant à développer le modèle murin à foie humanisé.
Raffinement
IMMUNODÉFICIENCE ET HÉBERGEMENT : En raison de leur sensibilité accrue aux infections, les souris sont hébergées et manipulées en permanence sous des conditions sanitaires strictes. Elles sont maintenues en groupes sociaux stables dans des cages transparentes et enrichies et disposent d’un accès ad libitum à l’eau et à une alimentation adaptée. Ces conditions visent à réduire le stress, minimiser les risques sanitaires et maintenir un bon état général. PHÉNOTYPE HÉPATIQUE : Un suivi clinique quotidien permet de détecter rapidement les animaux atteignant un point limite. En cas d’hypothermie, des tapis chauffants sont utilisés. Après sevrage, une alimentation enrichie, complétée par de l’hydrogel si nécessaire, favorise la récupération des animaux présentant une atteinte hépatique. MANIPULATION DES NOUVEAU NÉS : Les manipulations sont effectuées rapidement pour réduire la séparation de leur mère. Les gants des techniciens sont frottés avec de la litière de la cage afin de préserver l’odeur familière et limiter le stress. Les souriceaux sont toujours manipulés sur une couche de litière pour éviter l’hypothermie. Les injections sont réalisées avec des aiguilles la plus fines possible et des volumes minimaux. Le tatouage et la biopsie auriculaire sont pratiqués à un âge où les procédures sont peu douloureuse et le saignement est faible voire absent. PRÉLÈVEMENTS SANGUINS : Les prélèvements sanguins sont réalisés exclusivement sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress. Ils sont limités au strict nécessaire et respectent les seuils éthiques internes, avec des périodes de récupération appropriées. Les sites de ponction sont alternés pour éviter les irritations ou lésions cutanées liées à des prélèvements répétés.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de référence pour le développement de modèles humanisés, car sa petite taille, sa facilité de manipulation et la disponibilité de nombreuses lignées génétiquement modifiées permettent d’obtenir des modèles fiables et reproductibles. Les souris immunodéficientes sont aujourd’hui indispensables pour l’humanisation du foie, car elles permettent la greffe durable de cellules humaines et offrent un système pertinent pour l’étude de maladies du foie, des infections ciblant les cellules hépatiques, ainsi que du métabolisme et de la toxicité de nombreux médicaments. Dans ce projet, les interventions sont réalisées au stade nouveau né (3 à 8 jours). Ce choix est essentiel pour prévenir l’apparition du phénotype létal observé vers l’âge de quatre semaines chez les animaux homozygotes, et pour permettre une reconstitution précoce du foie avant que la dégradation hépatique ne soit trop avancée. Ce même stade d’âge est déjà utilisé avec succès pour d’autres modèles humanisés, car les nouveau nés tolèrent très bien les greffes de cellules et récupèrent rapidement. Une fois la greffe effectuée, les animaux sont suivis jusqu’à l’âge adulte afin de vérifier la stabilité de la reconstitution hépatique et d’évaluer leur capacité reproductive. Les animaux greffés et en bon état général peuvent être maintenus jusqu’à environ 180 jours, ce qui permet d’observer le fonctionnement du foie reconstruit sur le long terme et de déterminer s’ils peuvent être utilisés pour l’élevage et la production du modèle final.
Identification des mécanismes de la réponse immunitaire innée dans les infections respiratoires
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Infectées par le nez avec des bactéries responsables de pneumonies, Streptococcus pneumoniae ou Klebsiella pneumoniae, sous anesthésie, 5 778 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'infection peut entraîner une perte de poids et une dégradation de l'état général, un score clinique déclenchant l'arrêt pour les animaux les plus atteints. Les souris sont ensuite tuées pour dénombrer les bactéries dans les poumons, la rate et la moelle osseuse. Le porteur reconnaît disposer déjà de tests in vitro, mais juge la souris "nécessaire" pour reproduire la complexité de l'infection.
Objectifs
Les infections des voies respiratoires demeurent un problème de santé publique majeur. Les bactéries, en particulier Streptococcus pneumoniae et Klebsiella pneumoniae, comptent parmi les principales responsables d’infection du tractus respiratoire et peuvent induire une pneumonie. Celle-ci peut évoluer vers une maladie invasive lorsque les bactéries pénètrent dans la circulation sanguine. Dans le cas de Streptococcus pneumoniae, la sévérité de la maladie est exarcerbée chez les patients infectés par le virus de la grippe. Des vaccins existent contre Streptococcus pneumoniae, mais leur efficacité est limitée, tandis qu’aucun vaccin n’est actuellement disponible contre Klebsiella pneumoniae. Ces bactéries sont considérées comme prioritaires par l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) en raison de l’apparition de souches très virulentes et/ou résistantes aux antibiotiques, qui rendent certains traitements inefficaces. Ces observations montrent la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Stimuler le système immunitaire apparaît comme une piste prometteuse pour surmonter les limites des traitements actuels. Pour se faire, il est donc essentiel de mieux comprendre comment l’organisme se défend contre les infections à Streptococcus pneumoniae et Klebsiella pneumoniae. Lors d'une infection bactérienne, les tissus détectent les pathogènes grâce à des récepteurs du système immunitaire et déclanchent rapidement de nombreux mécanismes de défense, contre lesquels les bactéries développent difficilement des résistances. Stimuler ces réponses représente donc une piste prometteuse pour traiter les infections respiratoires. Associée aux antibiotiques, l’immunothérapie pourrait offrir une stratégie plus durable, améliorant la prise en charge des patients tout en limitant la progression de l’antibiorésistance. Le projet comporte les objectifs suivants : 1- Identifier les mécanismes immunitaires activés par Streptococcus pneumoniae et Klebsiella pneumoniae, afin d'identifier ceux qui jouent un rôle protecteur. 2- Identifier les éléments de Streptococcus pneumoniae et Klebsiella pneumoniae qui déclanchent ou modulent ces réponses immunitaires 3- Utiliser ces connaissances pour proposer une nouvelle stratégie de traitement de ces infections respiratoires
Bénéfices attendus
Le principal objectif de ce projet est de mieux comprendre comment le système immunitaire réagit aux infections respiratoires. Identifier les composantes protectrices de cette réponse pourrait permettre de développer des immunothérapies capables de renforcer les défenses de l’organisme, utilisées seules ou en combinaison avec des antibiotiques. En parallèle, identifier les éléments des bactéries qui modulent cette réponse pourrait, à plus long terme, ouvrir la voie à de nouveaux vaccins. Ces avancées pourraient améliorer la prévention et la prise en charge des infections, réduire les complications et les décès, limiter l’usage des antibiotiques et ralentir l’antibiorésistance, avec un impact majeur pour la santé publique.
Procédures
Pour mimer l’infection pulmononaire, les animaux recevront la bactérie Streptococcus pneumoniae ou Klebsiella pneumoniae par administration intranasale sous anesthésie par injection intrapéritonéale. Ce geste dure moins d’une minute et conduit à une anesthésie courte qui maintient l'animal en sommeil environ 20 minutes. Pour mimer l’infection invasive à Klebsiella pneumoniae, les animaux recevront la bactérie par administration intrapéritonéale, geste qui dure moins d’une minute. Certaines analyses nécessiteront un prélèvement sanguin, geste qui dure moins d’une minute, et qui sera réalisé sur des animaux sous anesthésie gazeuse. L’efficacité des immunomodulateurs associés ou pas à des antibotiques sera également testé contre une infection pulmonaire à Streptococcus pneumoniae ou Klebsiella pneumoniae. Ces traitements peuvent être soit une injection intrapéritonéale soit un gavage oral, soit une injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse, chacun de ces gestes durant moins d’une minute. L’anesthésie gazeuse dure moins de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les expériences comprennent une étape d’infection pulmonaire avec la bactérie Streptococcus pneumoniae ou Klebsiella pneumoniae. Des analyses seront effectuées à des temps précoces, avant la survenue d’effets indésirables dûs à l’infection. Néanmoins, à des temps plus tardifs, les bactéries peuvent provoquer une infection respiratoire chez la souris qui peut se traduire par une perte de poids et/ou une altération de l’état général. Des critères d’arrêts de l’étude, évalués grâce à un score clinique, ont été définis afin de contrôler le bien-être des animaux. Ainsi, la mesure du poids de l’animal et l’inspection des signes physiques (pelage, respiration) et du comportement (mobilité) seront effectués de façon quotidienne, afin de détecter le plus précocément possible l’apparition de signes de souffrance. Les expérimentateurs sont formés à ces observations et procèdent à l’euthanasie des animaux si ces paramètres sont significativement détériorés, quel que soit le groupe expérimental. La dernière partie du projet consiste à traiter les animaux avec un immunomodulateur associé ou pas à un antibotique, pour ralentir/prévenir la survenue d’une infection pulmonaire. Dans ce cas, on s'attend à une amélioration de l’état général des animaux traités en comparaison à des animaux non traités.
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié afin d’analyser la réponse immunitaire dans différents tissus et/ou de déterminer le nombre de bactéries dans les poumons, la rate, la moelle osseuse. Les animaux développant des signes sévères d’infection seront euthanasiés.
Remplacement
Des études in vitro sont déjà en place pour étudier les interactions entre les cellules immunitaires et les bactéries. Néanmoins, à ce jour, la complexité des processus infectieux et immunitaires ne peut pas être intégralement reproduite dans des tests in vitro et l’utilisation de souris sera donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet, dans le respect des stratégies de réduction et de raffinement ci-dessous.
Réduction
- Modélisation in vitro : Des approches sont déjà en place pour analyser les interactions entre les cellules immunitaires isolées d’animaux et les bactéries. Une veille bibliographique sera réalisée afin d’identifier d’éventuels nouveaux protocoles d’isolement de cellules immunitaires, pour étudier leur interaction avec les bactéries. - L’utilisation de souris génétiquement identiques dans nos expériences permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats robustes. - La taille des groupes d'animaux dans les expériences réalisées est déterminée par des méthodes statistiques afin d’utiliser le strict nécessaire pour répondre à la question scientifique.
Raffinement
Lors de l’euthanasie, de multiples tissus (poumons, ganglions drainants, rate, moelle osseuse, sang) seront prélevés sur chaque animal afin de rassembler un maximum de données exploitables pour chaque animal. L’utilisation de techniques de mesures à moyen et haut débit (qui mesure plusieurs paramètres par échantillon) permettra également d’obtenir des données multiples sur chaque échantillon et de raffiner les analyses.
Choix des espèces
Le modèle de la souris est aujourd’hui l’un des plus utiles pour étudier comment le corps se défend contre les infections respiratoires. Nous disposons de nombreuses souris génétiquement modifiées, ce qui permet de mieux comprendre le rôle de certains mécanismes du système immunitaire. De plus, il existe des outils très performants pour analyser les cellules chez la souris, ce qui facilite l’étude détaillée de ces défenses. Pour les souris obtenues auprès de fournisseurs agréés, des animaux adultes âgés de 7 à 12 semaines en début d’expérience seront utilisés. Pour les animaux provenant de l’élevage local, les animaux pourront être âgés de 7 à 20 semaines. A ces âges, le système immunitaire des souris est considéré comme compétent. Enfin, la détermination des doses de bactéries nécessaire à l’infection pulmonaire a déjà été établi par l’ensemble de la communauté scientifique.
Impact du microbiote sur la réponse immunitaire du nouveau-né face à une infection respiratoire virale dans un modèle de primate non-humain.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
322 macaques à longue queue vont être utilisés pour étudier la réponse immunitaire du nouveau-né à une infection respiratoire, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les adultes subissent jusqu'à dix-sept anesthésies, vingt-trois prélèvements sanguins et des lavages broncho-alvéolaires, tandis que tous les nouveau-nés sont tués, parfois jusqu'à l'âge de trois ans, pour prélever leurs organes. Une partie des adultes, 214 individus, est gardée en vie et réutilisée après contrôle de leur état de santé. Le porteur qualifie le recours au primate d'"indispensable", aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui les interactions étudiées.
Objectifs
L’objectif du projet est d’explorer le rôle du microbiote dans l’immunité à la naissance, et d’anticiper les effets délétères causés par son altération (dysbiose) précoce, notamment face à des infections respiratoires virales chez l’enfant. Le système immunitaire est immature à la naissance et se développe au cours des premières années par interaction avec l’environnement. Le microbiote intestinal, soit l’ensemble des micro-organismes peuplant nos intestins, est acquis principalement lors de l’accouchement par voie basse puis via l’allaitement. Il interagit avec le système immunitaire via la production de métabolites et module les composés produits par les cellules immunitaires hôte. Le microbiote, indispensable au rôle de barrière des muqueuses et à l’apprentissage de l’immunité locale, régule la reconnaissance des pathogènes et assure le bon fonctionnement du tissu. La littérature montre qu’une dysbiose altère la capacité du système immunitaire à répondre à une infection. Or, le microbiote peut être fragilisé par l’utilisation d’antibiotiques, pratique fréquente en pédiatrie. Malgré sa reconstitution, les conséquences à court et long terme de cette perturbation passagère restent mal comprises. Notre hypothèse est qu’une telle altération chez le nouveau-né contribue à la sévérité de certaines maladies respiratoires de la petite enfance. La compréhension du rôle du microbiote est donc déterminante pour envisager des stratégies thérapeutiques adaptées. Ce projet vise le virus respiratoire syncytial (VRS), principal agent responsable des bronchiolites aiguës chez l’enfant, dont les symptômes peuvent être très sévères. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du microbiote sur la réponse immunitaire à une infection virale chez le primate non-humain nouveau-né. Une procédure préliminaire sera menée chez des macaques juvéniles et adultes afin d’évaluer la quantité et la présence dans l’organisme des différents antibiotiques utilisés en pédiatrie. Une phase pilote sera ensuite réalisée chez des macaques juvéniles et adultes pour mettre au point le modèle d’infection par le VRS afin de limiter les études préliminaires chez les nouveau-nés. Puis nous comparerons des microbiotes altérés ou non par une antibiothérapie dans les premiers jours de vie. Enfin, des stratégies thérapeutiques fondées sur la vaccination maternelle ou sur une intervention néonatale (vaccinale ou probiotique) seront évaluées.
Bénéfices attendus
Ces travaux sur le primate non-humain permettront d’approfondir les connaissances en immunité pédiatrique actuellement limitées chez le nouveau-né humain pour des raisons évidentes d’éthique, mais également de difficulté d’accès aux différents compartiments (sang, muqueuses, moelle, poumons) et de volume disponible pour les échantillons. Le bénéfice attendu dans un premier temps est une meilleure compréhension des interactions et des mécanismes régulateurs entre système immunitaire et microbiote au cours des premiers temps de vie d’un nouveau-né. C’est au cours de cette période que se façonne la capacité du système immunitaire à réagir à une infection virale ainsi que sa mémoire immunitaire. En analysant ensuite l’impact d’un microbiote intacte ou altéré sur la réponse immunitaire à une infection, nous espérons pouvoir anticiper les effets délétères causés par un déséquilibre du microbiote (dysbiose) précoce. Enfin, l’exploration de stratégies préventives (vaccination maternelle ou administration néonatale de vaccin ou de probiotiques), permettra d’envisager l’ajustement de la prévention et le traitement des nouveau-nés. Au-delà des connaissances fondamentales attendues, ce projet vise également des applications pour la santé humaine. La collaboration avec les pédiatres a pour objectif de transposer ces résultats à l’amélioration des stratégies thérapeutiques lors des dysbioses précoces et à la prévention et la maitrise des infections respiratoires chez les enfants en clinique.
Procédures
Adultes pour pharmacocinétique : - Anesthésie : 17/animal (entre 30 min et1h) - Traitement antibiotique : 1 administration/jour (10min) jusqu’à 7 jours max/animal. - Prélèvements sanguins : 23/animal (5 min). - Écouvillonnages mucosaux : 9/animal (5 min). - Urines : 10/animal (récupération dans la cage sans intervention sur l’animal) - Imagerie in vivo : jusqu’à 6 sessions/animal (durée < 1 h). - Lavage broncho-alvéolaire (LBA) : 3 prélèvements (20 min). Juvéniles et adultes : - Anesthésie : 11/animal (30min à 1h) - Prélèvement de sang : 10/animal (5 min) - Ecouvillonnage des muqueuses : jusqu’à 10 fois par animal (5 min). - LBA : 5 max (20 min) - Exposition virale : 1 exposition, 30 min - Implantation d’une puce de suivi de la température : 1 fois, 30 min - Imagerie in vivo : 4 sessions max (< 1 h). - Suivi de la respiration : 3/animal (10 min) - Hébergement individuel : 1 fois, 4 semaines max Mères : - Anesthésie : jusqu’à 40/ animal (30 min-1h) - Echographies : 2-3 fois (intervalle 1 mois entre, 30 min) - Prélèvement de sang : Jusqu’à 25 fois en moyenne/animal (durée 5 min) - Ecouvillonnage des muqueuses : Jusqu’à 25 fois en moyenne (5min) - Lait maternel : 25 collectes (10 min) - LBA : Jusqu’à 7 lavages (20min) - Ponction de moelle osseuse : 5 ponctions (20 min) - Vaccination : 1 injection au cours de la gestation (5min) Nouveau-nés : - Anesthésie : jusqu’à 45/animal (15 et 30min) - Prélèvement de sang : jusqu’à 45/animal (5min par prélèvement) - Ecouvillonnage des muqueuses : jusqu’à 45/animal (5min) - LBA : jusqu’à 17 lavages (20min) - Ponction de moelle osseuse : jusqu’à 10 (20min) - Exposition virale : 1 exposition (30min) - Traitement antibiotique ou probiotique : 1 administration/jour pendant 1 à 4 semaines (20min) - Imagerie in vivo : 3 sessions (< 1 h)Euthanasie en fin d’étude
Impact sur les animaux
Nous distinguons les effets de l’expérimentation des effets liés aux infections et traitements. Chez les nouveau-nés, les juvéniles et les adultes, l’infection par le VRS entraîne, d’après la littérature, des formes le plus souvent asymptomatiques, légères ou modérées. Des symptômes pourront être relevés (fièvre, baisse d’activité, lésions pulmonaires) mais sont transitoires et résolus en moyenne après deux semaines. La vaccination maternelle et néonatale pourrait être associée à une réaction locale au site d’injection qui serait transitoire, avec rougeur et gonflement, résolue en quelques jours. Enfin l’administration de probiotiques par voie orale se fera autant que possible par succion et non par gavage, en respectant les volumes préconisés. Nous devons maîtriser la fréquence et la durée des interventions lors des premiers jours de vie afin de ne pas interférer avec la croissance du nouveau-né ni impacter la relation mère/nouveau-né. La fréquence et la durée des interventions lors des premiers jours de vie, sous anesthésie ou vigiles, peuvent engendrer une hypothermie transitoire, un stress, interférer avec la croissance du nouveau-né ou impacter la relation mère/nouveau-né voire un risque de rejet. De même, le sevrage peut entraîner un stress lié à la séparation avec la mère. Les prélèvements de sang répétés peuvent engendrer des perturbations transitoires du profil hématologique. Ce projet repose sur notre expérience passée qui a démontré que nous pouvons suivre un schéma expérimental tel que celui décrit, sans impacter la croissance des nouveau-nés ni la relation avec les mères.
Devenir
Les juvéniles et les adultes seront gardés en vie à la fin de l’étude pilote et réutilisés une fois que l’état sanitaire des animaux aura été vérifié. Tous les nouveau-nés primates non-humains seront euthanasiés, jusqu’à l’âge de 3 ans, pour accéder aux organes et ainsi à l’analyse fine des différents compartiments d’intérêt (charge virale, populations immunitaires, microbiote, métabolites, histologie…). Les femelles primates non-humains seront sorties du projet un mois après le sevrage et pourront être réutilisées sur avis vétérinaire. Elles servent de contrôle des différents systèmes matures et adultes, mais il n’est pas nécessaire d’accéder aux tissus, nos données de laboratoire seront utilisées si nécessaire.
Remplacement
Ce projet nécessite l’étude du système immunitaire et du microbiote en fonctionnement, et ces systèmes intégrés et leurs interactions ne peuvent pas être reproduits in vitro. De même, reproduire in vitro des symptômes dans le cadre d’une pathologie respiratoire n’est pas possible. Le recours à l’animal reste donc indispensable. Nous utiliserons un modèle de primate non humain, le macaque cynomolgus, pour sa proximité phylogénétique avec l’humain : il présente une forte homologie au niveau des acteurs et de l’organisation de la réponse immunitaire et vaccinale mais aussi de la composition microbiotique, contrairement à ce que l’on peut retrouver chez d’autres modèles animaux. Ce modèle, sensible à l’infection par le virus étudié, fera l’objet d’une phase pilote préalable destinée à optimiser les conditions expérimentales et à valider leur pertinence biologique dans ce contexte.
Réduction
Le nombre d’animaux a été ajusté au strict minimum nécessaire pour permettre l’interprétation des effets des conditions expérimentales, tout en tenant compte de la variabilité interindividuelle. Pour les études de pharmacocinétique et de mise au point du modèle juvénile/adulte d’infection, la réduction est obtenue par une évaluation séquentielle des conditions, avec des groupes de 2 animaux pour chaque combinaison testée. Cette approche permet d’écarter rapidement les conditions non pertinentes sans multiplier les groupes. Deux animaux supplémentaires ne seront ajoutés que pour la combinaison ayant montré les résultats les plus concluants, afin de confirmer les observations. Pour l’étude sur le modèle d’infection néonatale, l’effectif est limité à six animaux par groupe, correspondant au minimum requis pour l’analyse prévue. Les paramètres expérimentaux appliqués aux nouveau-nés sont ceux ajustés au cours de la phase préliminaire incluse dans ce projet, évitant ainsi toute répétition d’essais exploratoires à ce stade.
Raffinement
Les animaux seront suivis tous les jours avec une attention particulière pendant les deux premières semaines de vie. Des grilles d’évaluation permettront de suivre et détecter tout écart au bien-être animal. En cas d’atteinte d’un point limite, des mesures seront prises (arrêt des interventions, traitement, sortie d’étude), selon avis du vétérinaire et de la structure du bien-être animal. Également, en cas d’apparition de douleurs ou de signes cliniques liés aux prélèvements ou à l’infection, un traitement symptomatique pourra être mis en place. L’unité minimale d’hébergement des animaux sera le couple mère/enfant qui ne sera séparé qu’au-delà de l’âge minimal réglementaire (8 mois) de sevrage pour cette espèce afin de reformer de nouveaux groupes. Dans l’ensemble, le groupe social multifemelles et multi-nouveau-nés sera favorisé au maximum. Toute intervention sera faite sous anesthésie générale réversible pour permettre un réveil rapide des animaux, avec une anesthésie non systématique du nouveau-né lors des premières semaines de vie, lorsque la balance bénéfice/risque n’est pas favorable (risques d’hypothermie ou de rejet maternel trop importants) par rapport au temps nécessaire pour l’intervention. Enfin, toutes les techniques et analyses ont été miniaturisées pour la procédure chez les nouveau-nés, afin de réduire les volumes de sang nécessaires à prélever.
Choix des espèces
Ce projet a pour objectif final d’évaluer l’impact d’une perturbation du microbiote d’un nouveau-né sur sa réponse immunitaire à une infection respiratoire, et ainsi évaluer le bénéfice de certains traitements ou vaccins sur les effets délétères liés à cette perturbation. Seuls les primates non-humains présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et immunologiques, en termes de réponse immunitaire et vaccinale, suffisamment proches de l’humain pour permettre une étude pertinente de ces phénomènes. Nous avons choisi le macaque cynomolgus, qui a déjà été modèle d’infection pour nos virus d’intérêt dans des études scientifiques, et chez qui les techniques et outils d’exploration du système immunitaire et du microbiote sont disponibles et maitrisés. L’étude pharmacocinétique de molécules telles que les antibiotiques, ne nécessite pas d’être faite chez le juvénile ou le nouveau-né et se fera sur l’adulte car leur maturité physiologique permet une caractérisation stable et reproductible des profils d’exposition, ce qui facilite l’optimisation des doses et des modalités d’administration avant leur transposition aux animaux plus jeunes. Des animaux juvéniles et adultes sont également mobilisés pour la mise au point et la validation du modèle d’infection par le RSV, les juvéniles présentant un système immunitaire encore en développement, plus proche de celui des nouveau-nés que celui des adultes, tout en permettant des investigations expérimentales plus robustes et moins contraignantes. Cette étape est nécessaire pour établir les conditions d’infection, évaluer la pertinence immunologique du modèle et sécuriser son transfert ultérieur aux stades néonataux. Enfin, notre étude, qui s’intéresse à des développements in utero et néonataux, nécessite d’avoir accès à des femelles gestantes et aux nouveau-nés issus de ces gestations.