Maladies infectieuses
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Évaluation de l’immunogénicité et de l’efficacité d’un vaccin nasal contre l’infection au virus influenza dans un modèle préclinique murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
4 712 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant recevoir deux vaccinations sous anesthésie, une infection grippale intranasale et quatre ponctions du sinus submandibulaire à l'état vigile. Les procédures vont d'un niveau de souffrance léger à sévère, cette dernière classification portant sur l'infection grippale, que le porteur décrit avec une perte de poids, une prostration, une anorexie et un pelage hirsute entre le deuxième et le neuvième jour, et une mortalité possible chez les souris non vaccinées, le suivi comportemental annoncé après l'infection restant sans détail. Aucun antidouleur ni anti-inflammatoire ne leur est administré, le porteur indiquant que ces traitements modifieraient les résultats de l'étude. Les retombées annoncées, des formulations "transposables à l'Homme" et un renforcement des stratégies prophylactiques, sont renvoyées à l'issue du projet, quand la mortalité et les pertes de poids, elles, sont attendues dès les premières semaines.
Objectifs
Malgré la disponibilité de vaccins prophylactiques, les infections virales respiratoires restent insuffisamment contrôlées à l’échelle mondiale. L’efficacité limitée des stratégies actuelles s’explique notamment par la grande diversité antigénique des virus, leur capacité à franchir la barrière d’espèce, la durabilité restreinte de l’immunité induite par l’infection ou la vaccination, ainsi que par une réponse vaccinale souvent suboptimale chez les populations vulnérables. À cela s’ajoutent des facteurs sociétaux tels que l’hésitation vaccinale. Ces limites soulignent la nécessité de développer des approches antivirales alternatives et/ou complémentaires. Dans ce contexte, notre projet vise à développer une plateforme innovante dédiée à la prévention des infections virales respiratoires, avec un focus particulier sur le virus de l’influenza A (grippe). S’appuyant sur des données préliminaires solides et sur l’expertise conjointe de spécialistes en vaccination et en administration par voie respiratoire, ce projet ambitionne de concevoir de nouvelles stratégies d’immunoprophylaxie ciblant directement les muqueuses respiratoires. L’objectif principal est de concevoir et d’évaluer des candidats vaccins par la voie respiratoire, afin d’optimiser la réponse immunitaire locale et systémique. Ces approches seront administrées par voie nasale ou pulmonaire, dans le but d’induire une protection rapide, efficace et durable au niveau du site d’entrée des pathogènes. Ce projet vise ainsi à répondre à des enjeux scientifiques et cliniques majeurs, en proposant des solutions mieux adaptées à la prévention des infections respiratoires, notamment dans des contextes d’émergence virale ou chez des populations à risque.
Bénéfices attendus
Le projet vise à développer et évaluer une vaccination nasale contre le virus influenza A (grippe), ciblant directement les muqueuses respiratoires pour limiter l’infection initiale et la transmission. Il permettra de caractériser les réponses immunitaires locales et systémiques, d’analyser leur durabilité et d’évaluer l’intérêt d’un rappel nasal en complément des vaccins classiques par exemple. Les résultats contribueront à valider des formulations transposables à l’Homme et à renforcer le développement de stratégies prophylactiques innovantes contre les infections respiratoires.
Procédures
Au maximum, chaque souris pourra être soumise à deux vaccinations, réalisées soit par instillation intranasale, soit par administration oro-trachéale, sous anesthésie gazeuse (isoflurane). Chaque intervention durera environ 2 à 5 minutes, incluant l’induction anesthésique et le geste technique. Une semaine après la dernière vaccination, les animaux des procédures concernées pourront être soumis à une infection intranasale par le virus Influenza, sous anesthésie gazeuse, d’une durée d’environ 2 à 5 minutes. Tout au long de l’expérimentation, une prise de sang hebdomadaire pourra être réalisée (4 prélèvements maximum au total selon la durée du protocole), chaque prélèvement durant quelques secondes à 1 minute maximum. Pour les animaux soumis à l’infection influenza (procédures concernées), un suivi clinique post-infection sera réalisé, comprenant pesée, observation comportementale et score clinique, en quelques minutes par animal. La fréquence et le nombre exacts d’interventions dépendront de la procédure expérimentale concernée.
Impact sur les animaux
La vaccination intranasale a été administrée, dans notre laboratoire, chez des souris BALB/c et K18-hACE2 sans effet secondaire observé. Classée légère, cette procédure implique une manipulation respiratoire et une anesthésie ; toutes les précautions sont prises pour limiter gêne et stress. La vaccination oro-trachéale (intrapulmonaire) permet une délivrance reproductible de la solution dans les poumons. Réalisée sous anesthésie gazeuse à l’aide d’un cathéter, elle est classée modérée en raison de son caractère invasif et des risques respiratoires potentiels. Le prélèvement sanguin, classé léger, est effectué par ponction du sinus submandibulaire sur animal vigile. La douleur est limitée à la piqûre, le stress est généralement très bref. Cependant ce geste, peut entrainer un hématome au site de ponction. Le nombre de prélèvements est limité à 1 ponction maximum par semaine et par animal, en respectant les volumes sanguins autorisés (100μL de sang maximum). Les infections respiratoires sont généralement peu douloureuses car le poumon n’est pas un organe nociceptif. Toutefois, elles entraînent une inflammation et une gêne respiratoire pouvant devenir douloureuse selon l’intensité. Dans le modèle d’infection grippale chez la souris, les signes cliniques apparaissent entre J2 et J5 post-infection selon la dose et l’effet vaccinal, avec un pic entre J7 et J9. Ils incluent une perte de poids liée à une altération des comportements (prostration, anorexie, réduction de la prise d’eau, pelage hirsute). L’amélioration survient progressivement entre J10 et J12 avec retour au poids initial. Cette procédure est classée comme sévère en raison du stress physiologique et d’une mortalité possible chez les animaux non vaccinés.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.
Remplacement
L’étude des réponses immunitaires de l’hôte ne peut pas être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement biologique (interaction cellulaire, recrutements cellulaires, etc.). Cependant, nous investiguerons au maximum possible la mise en place d’étude in vitro complémentaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum nécessaire. Avant toute expérimentation chez l’animal, les candidats vaccins sont d’abord testés en laboratoire sur des modèles in vitro. Seuls les candidats les plus prometteurs sont ensuite évalués chez l’animal. Le protocole expérimental a été conçu de manière à obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux. Plusieurs types d’analyses sont réalisés à partir d’un même animal (réponse immunitaire, analyses des tissus, présence du pathogène), et les organes prélevés sont utilisés pour différentes études. Cette approche permet de maximiser les informations obtenues sans augmenter le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux par groupe ainsi que l’organisation des expériences ont été soigneusement calculés afin d’assurer la validité scientifique des résultats tout en évitant toute utilisation excessive. Les deux sexes sont inclus dans l’étude afin de prendre en compte les différences biologiques éventuelles entre mâles et femelles. Chaque groupe comprend un nombre équilibré d’animaux des deux sexes. Les résultats sont analysés à l’échelle du groupe, avec la possibilité d’examiner également l’influence du sexe si nécessaire. Dans l’ensemble, ce projet vise à trouver un équilibre entre la qualité scientifique des résultats et la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages enrichies (matériaux de nidification et éléments favorisant leur comportement naturel). Tout au long de l’étude, leur état de santé est surveillé plusieurs fois par jour par du personnel formé, afin de détecter rapidement tout signe de gêne ou de souffrance. Une attention particulière est portée dans les jours suivant l’infection, période durant laquelle les effets sont les plus susceptibles d’apparaître. Des mesures sont mises en place pour faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau, notamment pour les animaux les plus affectés (par exemple, mise à disposition de nourriture adaptée directement dans la cage). L’utilisation de traitements antidouleur ou anti-inflammatoires n’est pas possible dans ce modèle, car ils pourraient modifier les résultats de l’étude. Toutefois, des critères d’arrêt stricts sont appliqués afin de prévenir toute souffrance excessive et garantir le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Ce projet est réalisé avec des souris adultes, dont le système immunitaire est pleinement développé. La souris est un modèle couramment utilisé pour l’étude des réponses immunitaires et du développement de vaccins. Elle présente des similitudes importantes avec l’Homme, ce qui permet d’obtenir des informations pertinentes pour la recherche en santé. Différents types de souris sont utilisés afin d’étudier de manière complémentaire les différentes composantes de la réponse immunitaire. Cela permet d’évaluer à la fois la production d’anticorps et les réponses immunitaires plus complexes. L’utilisation de l’animal est nécessaire dans ce projet, car la réponse immunitaire implique de nombreux mécanismes et interactions entre différents organes, notamment les voies respiratoires. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits entièrement en laboratoire sur des modèles non animaux. Ce modèle permet également de suivre l’évolution de l’infection et de la réponse immunitaire dans le temps, dans un organisme entier. Enfin, les expériences sont conçues de manière à optimiser les données obtenues à partir de chaque animal, notamment en réalisant plusieurs analyses à partir des mêmes échantillons, afin de limiter le nombre total d’animaux utilisés.
Etude des séquelles métaboliques de la malaria cérébrale par imagerie 1/2
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à huit examens d'imagerie sous anesthésie gazeuse, dont quatre de quatre-vingt-dix minutes, dix injections intrapéritonéales quotidiennes et six gouttes de sang prélevées à la queue : 84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Celles qui sont infectées développent une perte de poids, des poils hérissés, une léthargie, une chute de la température corporelle, une faiblesse musculaire et des troubles de la conscience, et une partie d'entre elles est tuée après un unique examen, sans traitement. Il s'agit de mesurer par imagerie comment le cerveau utilise le glucose après guérison d'une malaria cérébrale, et de chercher une inflammation résiduelle. Le porteur retient la souris parce que les déficits neurologiques y ressemblent à ceux des enfants, et parce que le parasite employé, spécifique de cette espèce, a selon lui l'avantage "de ne présenter aucun risque pour l'expérimentateur humain".
Objectifs
La malaria, aussi appelée paludisme, est une maladie parasitaire grave transmise par les moustiques. En 2024, elle a touché 282 millions de personnes et causé plus de 610 000 décès, surtout en Afrique, selon l’Organisation mondiale de la santé. Les enfants de moins de 5 ans sont les plus vulnérables, en particulier lorsqu’ils développent une complication sévère touchant le cerveau appelée malaria cérébrale. La malaria cérébrale provoque des convulsions, une altération de la conscience pouvant aller jusqu’au coma et entraîner le décès. Même après guérison, certains enfants gardent des séquelles : troubles de la mémoire, difficultés à marcher ou à parler, crises d’épilepsie, ou problèmes de concentration. Ces séquelles, souvent ignorées, peuvent handicaper leur développement et leur scolarité, avec des conséquences durables pour eux et leur famille. Pour étudier les séquelles cérébrales à court et moyen termes, nous utilisons des souris comme modèle. Nous les infectons avec un parasite similaire à celui qui provoque la malaria chez l’humain, puis nous les soignons avec un médicament antipaludéen dès qu’elles montrent des signes de complication cérébrale. Grâce à des techniques d’imagerie médicale aussi utilisées chez l’humain, nous avons déjà observé des anomalies persistantes plusieurs mois après la guérison. Par exemple, le cerveau semble avoir des difficultés à utiliser correctement le sucre (glucose), qui est sa principale source d’énergie. Cela pourrait être dû à une inflammation cachée qui persisterait même après la disparition du parasite. Notre objectif est de mieux comprendre ces anomalies pour développer des traitements qui pourraient limiter les séquelles. Nous allons étudier comment le cerveau des souris ayant eu la malaria cérébrale utilise le sucre et s’il existe une inflammation résiduelle. Nous espérons que ces recherches permettront un jour d’améliorer la prise en charge des enfants touchés par la malaria cérébrale, afin qu’ils puissent grandir et s’épanouir sans les conséquences de cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les séquelles de la malaria cérébrale, une forme grave de la maladie qui touche principalement les jeunes enfants, notamment en Afrique. Pour cela, nous utilisons des souris comme modèle d’étude, car leur maladie ressemble beaucoup à celle des enfants. Grâce à des techniques d’imagerie médicale modernes, nous pouvons observer en détail ce qui se passe dans leur cerveau, de manière non invasive et avec des méthodes similaires à celles utilisées pour les humains. Des recherches antérieures par imagerie chez la souris ont déjà montré que la malaria cérébrale provoque un gonflement du cerveau, ce qui réduit l’apport en oxygène au cerveau, et représente la cause du décès chez les enfants. Ces observations ont été confirmées par la suite chez des enfants africains atteints de la maladie. Notre objectif principal est d’identifier les séquelles qui persistent chez les souris ayant survécu à la malaria cérébrale après avoir été traitées avec un médicament antipaludéen. Nous allons nous concentrer sur deux aspects importants : d’une part, les perturbations dans la manière dont le cerveau utilise le sucre, qui est sa principale source d’énergie, et d’autre part, la présence éventuelle d’une inflammation cachée qui pourrait persister même après la guérison et continuer à endommager le cerveau. Le sucre est essentiel au bon fonctionnement du cerveau, et un dysfonctionnement dans son utilisation pourrait expliquer certains troubles neurologiques observés, comme des difficultés d’apprentissage ou des crises d’épilepsie. Si nous parvenons à établir un lien entre ces perturbations métaboliques et une inflammation résiduelle, cela pourrait permettre de tester, dans de futures études, l’efficacité de traitements anti-inflammatoires pour réduire les séquelles chez les enfants. À plus long terme, cette étude pourrait aider à développer des outils pour mieux diagnostiquer les enfants à risque de complications après une malaria cérébrale, améliorer leur suivi médical en identifiant des signes précoces, et tester de nouveaux traitements pour limiter les dommages au cerveau. En somme, ce projet a pour but d’améliorer notre compréhension des effets durables de la malaria cérébrale afin de rechercher des traitements pour améliorer la vie des enfants touchés par cette maladie.
Procédures
Les animaux induits pour la malaria recevront une injection intrapéritonéale de globules rouges parasités. Ils subiront 2 prélèvements d’une goutte de sang espacés de 3 jours en moyenne, sur une période de 7 jours. Les animaux avec malaria qui seront traités par un médicament antipaludéen subiront deux prélèvements supplémentaires d’une goutte de sang chacun, effectués à 4 jours d’intervalle en moyenne, durant la période de traitement. Les animaux contrôles sains et les animaux avec malaria qui seront traités recevront au total 10 injections intrapéritonéales à l’état vigile (une injection quotidienne pendant 10 jours en alternant chaque jour le côté). Les animaux avec malaria non traités subiront un seul examen clinique par imagerie sous anesthésie gazeuse d’une durée de 45 minutes environ. Les autres animaux subiront, selon les groupes, soit une seule session de 4 examens cliniques par imagerie sous anesthésie gazeuse étalés sur une période de 10 jours, soit deux sessions de 4 examens (8 au total), chacune étalée sur une période 10 jours, le délai entre les 2 sessions d’imagerie étant de 60 jours. Pour chaque session d’imagerie, les deux premiers examens auront une durée d’environ 90 minutes et les 2 autres de 30 minutes. Deux des quatre examens d’imagerie de chaque session nécessiteront la mise à jeun des animaux pendant 4 heures ainsi que le prélèvement d’une à deux gouttes de sang pour mesurer la glycémie (3 gouttes au total pour une session d’imagerie, et 6 gouttes au total pour 2 sessions). Les animaux subiront 3 injections intrapéritonéales et une injection intraveineuse d’agents de contraste ou de traceurs sous anesthésie gazeuse, étalées sur 10 jours pour la réalisation de 4 examens d’imagerie (1 session). Pour 8 examens (2 sessions), ils subiront 6 injections intrapéritonéales et 2 injections intraveineuses effectuées sur une période de 3 mois.
Impact sur les animaux
Pendant cette étude, les souris pourraient subir plusieurs sources d’inconfort et de stress, bien que tout soit mis en œuvre pour limiter leur souffrance. D’abord, elles recevront des injections quotidiennes pendant 10 jours, alternativement sur chaque côté du corps, ce qui peut provoquer une gêne locale ou une légère douleur. Certaines souris subiront jusqu’à quatre injections différentes (médicaments, produits de contraste ou traceurs pour l’imagerie) selon les examens prévus. Les examens d’imagerie, bien que nécessaires, imposent aussi des contraintes : les souris seront placées sous anesthésie gazeuse à plusieurs reprises, ce qui peut causer un stress ou une désorientation au réveil. Certaines devront jeûner 4 heures avant certains examens, ce qui peut entraîner une sensation de faim ou d’inconfort. De plus, des prélèvements de sang (2 à 4 gouttes) seront effectués au niveau de leur queue, une procédure qui, bien que rapide, peut être légèrement douloureuse. Les souris infectées par le parasite de la malaria développeront des symptômes graves : perte de poids, poils hérissés, léthargie, puis une baisse dangereuse de leur température corporelle, une faiblesse musculaire et des troubles de la conscience. Certaines ne recevront pas de traitement et seront euthanasiées après un seul examen, tandis que d’autres, traitées avec un médicament, pourront malgré tout, souffrir d’une infection persistante.
Devenir
Les animaux utilisés en procédure 1 seront tous euthanasiés. Ces animaux atteints d’une forme mortelle de malaria ne peuvent survivre. Leur cerveau sera prélevé après le décès afin de collecter des informations sur le métabolisme du glucose et l’inflammation pendant la maladie afin de compléter les données d’imagerie in vivo. Les animaux utilisés en procédure 2 seront aussi tous euthanasiés. Leur cerveau sera prélevé après le décès afin de collecter des informations sur le métabolisme du glucose et l’inflammation après guérison de la malaria afin de compléter les données obtenues par imagerie in vivo. Ces données seront comparées à celles des souris contrôles de même âge.
Remplacement
Le recours à l’animal est incontournable car la détection des séquelles cérébrales et le suivi de leur évolution au cours du temps ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants. Il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro ou in silico. Notre projet a pour objectif d’étudier à court et moyen terme l’évolution du neurométabolisme et de l’inflammation cérébrale. Le suivi des animaux sur plusieurs mois devrait permettre d’identifier les anomalies immédiates et/ou plus tardives, les éventuelles récupérations/compensations, ainsi que les effets combinés de l’âge.
Réduction
L’utilisation de techniques d’imagerie non invasives permettra de réduire le nombre d’animaux, grâce au suivi longitudinal de chaque individu. Un grand nombre de données sera recueilli sur un même animal dans des conditions de stress minimal, l’examen clinique par imagerie étant réalisé sous anesthésie gazeuse. La taille des groupes a été calculée à partir de données antérieures en utilisant un test statistique. Les données seront analysées au moyen d’une analyse statistique adaptée aux petits échantillons. Nous devrions ainsi générer des données robustes en utilisant le minimum d'animaux permettant de vérifier les hypothèses scientifiques du projet.
Raffinement
Le raffinement concernera toutes les procédures du projet ainsi que les conditions d’hébergement des animaux et devrait permettre de réduire le stress, l’angoisse et la douleur. En ce qui concerne l’induction de la malaria cérébrale et son traitement par la chloroquine, un examen clinique quotidien ou biquotidien permettra de déceler sans retard des signes d’aggravation neurologiques qui nécessiteraient de recourir à l’euthanasie en accord avec les points limites prédéfinis. Tous les examens cliniques par imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse avec monitoring physiologique. Un délai d'acclimatation minimum de 14 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec cycle jour/nuit, nourriture et boisson ad libitum et enrichissement environnemental. Les cages contiendront des rondins de bois à ronger, du coton pour la nidification, un refuge, et une roue fast-track avec igloo afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels.
Choix des espèces
L’inoculation du parasite de la malaria chez la souris est un modèle validé et reconnu de la malaria cérébrale pédiatrique. De plus, les déficits neurologiques et cognitifs décrits dans ce modèle après guérison sont très proches de ceux rapportés chez l’Humain. Enfin, le parasite spécifique de la souris possède l’avantage de ne présenter aucun risque pour l’expérimentateur humain.
Etude de la pharmacocinétique sanguine d’un nouveau peptide antimicrobien OMN après administration intraveineuse chez le lapin et mise au point d’une exposition humanisée
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Tous tués à la fin de la procédure parce que le cathéter veineux central finirait par s'obstruer et qu'il est impossible de l'ôter sans provoquer un risque hémorragique, 12 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une injection intramusculaire d'anesthésique, une chirurgie de trente minutes sous anesthésie générale pour la pose du cathéter, l'implantation d'une puce de température, puis jusqu'à douze prélèvements sanguins en vingt-quatre heures. Un gilet sur mesure les empêche d'arracher le dispositif de perfusion. Le lapin remplace ici la souris parce que le peptide antimicrobien testé y disparaît trop vite du sang, ce qui obligerait à l'injecter trop souvent pour approcher l'exposition humaine, et le porteur indique que les données déjà obtenues chez la souris ne sont pas concluantes.
Objectifs
La propagation rapide de la résistance aux antimicrobiens à l'échelle mondiale rappelle le besoin important de développer des traitements innovants pour lutter contre les bactéries multirésistantes. Dans ce contexte, un nouveau peptide antimicrobien est actuellement en développement, pour traiter les infections sévères à Acinetobacter baumannii multi-résistants. Ce composé a déjà fait l’objet d’un bon nombre d’études in vitro et également in vivo chez la souris. Il présente une activité très intéressante mais chez la souris, il est rapidement éliminé de la circulation sanguine, ce qui nécessite de l’administrer trop fréquemment par voie intraveineuse pour espérer une exposition suffisante et comparable à celle observée chez l’homme. C’est la raison pour laquelle le lapin constitue un modèle de choix, parce qu’il permet des simulations d’exposition aux anti-infectieux plus proches de l’homme. L’objectif de ce projet consiste donc à évaluer l’exposition sanguine du composé en étude, après administration intraveineuse directe ou en perfusion prolongée « humanisée » chez le lapin sain.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus permettront d’améliorer les connaissances sur la pharmacocinétique de ce nouveau composé chez le lapin, car ultimement, son efficacité sera évaluée dans un modèle de pneumonie à Acinetobacter baumannii chez le lapin.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs gestes susceptibles d’entraîner des nuisances modérées : - Une injection intramusculaire d’anesthésique (10 secondes) - Intervention chirurgicale (pose de cathéter veineux) sous anesthésie générale et anti-douleur (30minutes) - Inconfort lié au port d’un gilet de protection et système de perfusion (sur mesure) pour éviter l’arrachage du cathéter - Administration du composé test (bonne tolérance chez la souris mais à vérifier chez le lapin) : légère augmentation de la température corporelle, baisse de la prise alimentaire - Stress lié aux prélèvements sanguins itératifs (mais indolores sur le cathéter ), 12 prélèvements maximum seront réalisés sur 24h, à raison d’une minute par prélèvement
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à plusieurs procédures susceptibles d’entraîner des nuisances modérées : • Douleur très transitoire liée à l’injection de l’anesthésique • Douleur légère au site chirurgical • Légère réaction lors de l’administration intraveineuse du composé anti-infectieux
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure ; en effet, les animaux ne pourront pas être ré-utilisés pour un autre projet en raison de la pose de cathéter veineux central, lequel finirait par s’obstruer au cours du temps, et qu’il est par ailleurs impossible d’ôter sans provoquer un risque hémorragique.
Remplacement
La principale stratégie de remplacement de l’expérimentation animale reposerait sur l’utilisation de modèles in vitro. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire fidèlement la complexité physiologique d’un organisme vivant, notamment les processus d’absorption, de distribution, de métabolisme et d’élimination des molécules. La caractérisation pharmacocinétique du composé testé nécessite l’évaluation de ses concentrations plasmatiques dans un organisme entier afin de déterminer les paramètres essentiels à la définition d’un schéma thérapeutique pertinent. Le lapin ne peut être remplacé par la souris, puisque des études de pharmacocinétique ont déjà été réalisées chez la souris et ne sont pas concluantes.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera de 12 lapins. Ce nombre a été limité au minimum nécessaire permettant d’obtenir des résultats scientifiquement interprétables. Également, notre étude ne nécessite pas d’analyse statistique à proprement parler et se base sur l’expérience passée acquise sur la simulation de la pharmacocinétique humaine d’un large panel d’antibiotiques chez le lapin. Chaque animal sera ré-utilisé pour une seconde et une troisième administration du composé, cela étant rendu possible grâce à l’installation du cathéter central et de la fenêtre thérapeutique qui sera pratiquée entre chaque régime. De plus, des données de tolérance pourront être obtenues en parallèle, permettant ainsi d’épargner des animaux supplémentaires.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé et compétent afin de limiter le stress et la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés dans des conditions adaptées à leurs besoins physiologiques et comportementaux, dans des cages enrichies. Une surveillance quotidienne (voire pluriquotidienne pendant la période de traitement) sera réalisée. Dans un objectif de raffinement, la procédure de pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie générale par du personnel qualifié. Également, les animaux recevront des traitements anti-douleur avant et après l’intervention. L’animal sera équipé d’un gilet sur mesure en post-opératoire, de façon à garantir le maintien du cathéter et sa libre circulation dans sa cage sans risque d’arrachement. Une puce de température sera implantée en cours d’anesthésie et permettra de mesurer les variations de température corporelle sans déranger l’animal, grâce à un lecteur. Tous les prélèvements sanguins seront indolores puisque réalisés via le cathéter central. Enfin, un score clinique sera mis en place, ce qui permettra de suivre l’état de l’animal de façon très rapprochée au cours de l’étude.
Choix des espèces
Le lapin est un modèle de choix pour les essais de simulation de la pharmacocinétique humanisée des antibiotiques en particulier. En effet, sa taille facilite la mise en place de matériel médical tels que les cathéters et l’administration de molécules en plus grandes quantités. A terme, le composé sera évalué dans un modèle infectieux développé chez le lapin, d’où le choix du lapin. Les lapins seront utilisés lorsqu’ils auront atteint un poids de 3kg minimum (soit plus de 12 semaines), en prévision du modèle infectieux dans lequel le composé OMN sera testé par la suite. En effet, dans ce modèle, le poids et l’âge de l’animal sont primordiaux.
Imagerie de l’encéphalopathie septique et investigation de la perméabilité de l’axe cerveau-poumon dans différents modèles murins de SDRA
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
Les souris qui perdent plus de 15 % de leur poids ou dont le score de douleur dépasse 1,5 sont mises à mort. 498 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour, indique le porteur, ne pas laisser une souffrance méconnue perdurer. Selon les groupes, elles subissent une injection intrapéritonéale de toxine bactérienne, une instillation pulmonaire, une injection intracérébrale ou une chirurgie d'infection digestive, puis des injections quotidiennes pendant sept à dix jours, la pose d'un cathéter et des séances d'imagerie de trente minutes sous anesthésie. Les groupes chirurgicaux peuvent perdre jusqu'à 15 % de leur poids et présenter des difficultés respiratoires. Le choix des lignées suit l'effet recherché, des souris SWISS pour l'inflammation généralisée et l'infection digestive, des C57BL6/J mâles pour l'inflammation pulmonaire, les femelles étant décrites comme protégées de cette inflammation.
Objectifs
Le choc septique représente le stade ultime d'une infection aiguë, et est responsable d'environ 11 millions de décès chaque année dans le monde. A ce jour, les infections respiratoires restent la première cause de choc septique. Parmi ces patients, la dysfonction cérébrale aiguë (encéphalopathie) apparaît dans environ 40% des cas et s'associe défavorablement au pronostic. Néanmoins, à ce jour, les facteurs tant prédictifs que pronostics sont encore largement méconnus, et le diagnostic de l'encéphalopathie repose sur des échelles cliniques pouvant être prises en défaut (utilisation de médicaments sédatifs...). Afin de visualiser la neuroinflammation, il est possible d'utiliser l'IRM ou l'imagerie à particules magnétiques (une modalité d'imagerie récemment introduite) après injection de particules dirigées contre des marqueurs d'inflammation. Lors d'une inflammation, la perméabilité des vaisseaux sanguins change par le niveau d'expression d'une molécule appelée PLVAP. Nous souhaitons donc utiliser une approche utilisant des particules ciblant PLVAP afin de mettre en évidence l'inflammation et la perméabilité de l'axe poumon-cerveau dans différents modèles d'infection chez la souris, afin d'offrir une caractérisation non invasive de l'encéphalopathie. Ceci permettrait de valider la possibilité de diagnostiquer et de suivre la survenue d'une encéphalopathie au cours du sepsis par une imagerie non invasive chez l'Homme.
Bénéfices attendus
La survenue d'une encéphalopathie au cours d'un séjour en réanimation est un évènement pronostic majeur, bien que les éléments diagnostiques soient peu spécifiques et sujets à des facteurs confondants, au premier rang desquels l'utilisation de médicaments sédatifs. L'utilisation d'une technique d'imagerie avec l'observation d'éléments objectifs permettrait de s'affranchir de ces limites, de diagnostiquer plus rapidement l'encéphalopathie et de proposer une prise en charge rapide, permettant probablement de limiter les séquelles ultérieures. Par ailleurs, l'utilisation d'une technique basée sur la reconnaissance de changements vasculaires permettra une meilleure compréhension des phénomènes à l'origine de l'encéphalopathie chez ces patients, et d'offrir ainsi de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : induction d'un modèle d'inflammation systémique aiguë par injection intrapéritonéale unique (30 secondes), induction d'un modèle d'inflammation pulmonaire par instillation (2 minutes) et modulation thérapeutique par injection quotidienne pendant 7 jours (30 secondes par injection), induction d'un modèle d'inflammation cérébrale par injection intracérébrale unique (30 minutes) et modulation thérapeutique par injection quotidienne pendant 10 jours (30 secondes par injection), induction d'un modèle d'inflammation pulmonaire non infectieuse par instillation unique (30 secondes) et modulation thérapeutique par injection intrapéritonéale quotidienne pendant 7 jours (30 secondes par injection), induction d'un modèle chirurgical d'infection digestive (10 minutes), pesées quotidiennes (inférieur à 5 minutes), pose d'un cathéter pour l'administration de produit de contraste sous anesthésie (environ 10 minutes), réalisation d'examens d'imagerie sous anesthésie (environ 30 minutes).
Impact sur les animaux
Le modèle de d'inflammation généralisée par injection de toxine bactérienne est susceptible d'occasionner une perte de poids chez les animaux. Compte-tenu de notre expérience, la perte de poids est attendue inférieure à 10% et de courte durée (3 jours environ). Les modèles par instillation intra-nasale ou injection intracérébrale occasionnent une perte de poids plus modérée. Les modèles chirurgicaux d'infection digestive et par instillation sont susceptibles d'entraîner une perte de poids importante jusqu'à 15%, un inconfort et une souffrance de durée possiblement prolongée (quelques jours), ainsi que des difficultés respiratoires.
Devenir
A l'issue des procédures, les animaux seront mis à mort pour ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer.
Remplacement
Des tests in vitro ont été réalisés pour évaluer la spécificité du produit de contraste sur des cultures de cellules de vaisseaux sanguins. Ils ont permis de confirmer la surexpression de PLVAP au cours de l'inflammation, et la possibilité pour notre produit de contraste de se lier à sa cible in vitro. Néanmoins, il reste nécessaire d'étudier le produit de contraste à l'échelle de l'organisme, d'étudier le rapport signal/bruit à l'échelle de l'organisme, de comparer les données obtenues avec celles d'une imagerie sans produit de contraste spécifique. Les procédures expérimentales décrites sont donc nécessaires afin de pouvoir valider la faisabilité de notre approche à l'échelle d'un organisme complexe, avant de pouvoir envisager une translation à l'homme. D'autres méthodologies expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux ne permettraient pas l'obtention du même niveau d'information.
Réduction
Le nombre d'animaux à utiliser dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures utilisant le même type d'animaux et les mêmes modèles, ainsi que des données de la littérature. En fonction de l'expérimentateur (expérience, habitilité) et du taux de mortalité obtenu, le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. Enfin, l'utilisation de techniques non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés en répétant les analyses d'image à différents temps.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d'un temps d'acclimation d'une semaine afin de permettre une réduction du stress. Les animaux seront hébergés par groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. Le milieu sera enrichi par l'utilisation de matériel type boîte à oeufs, tunnel PVC ou igloo PVC, et coton. Dès l'initiation de la procédure, le suivi des animaux sera assuré deux fois par jour afin de rechercher l'apparition de signes de souffrance et de les prendre en charge. La douleur sera évaluée par l'utilisation d'échelles adaptées. Les animaux seront pesés quotidiennement. Les animaux des groupes chirurgicaux bénéficieront de compléments alimentaires humidifiés pour permettre une hydratation et une alimentation facilitée. Tous les animaux bénéficieront d'eau et de nourriture à volonté. Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer. Les animaux seront mis à mort si : perte de poids > 15% ; le score moyen l'échelle est supérieur à 1.5 ; l'animal est horripilé et recroquevillé ; l'animal est agité et/ou non alerte ; l'animal présente une respiration abdominale ; la provocation de l'applicateur n'entraîne pas ou peu de changement comportemental ; pendant les imageries ou chirurgies, un problème d'anesthésie survient, l'animal présente des saignement abondant, ou un arrêt respiratoire. Les animaux présentant une souffrance ne correspondant pas à un point limite recevront une antalgie. Au cours des différentes procédures expérimentales, les animaux recevront une antalgie, une anesthésie générale et une anesthésie locale.
Choix des espèces
La souris est l'espèce animale qui a le plus été étudiée dans le domaine des pathologies septiques. L'anatomie et la physiologie sont, dans ces pathologies, globalement transposables à l'homme. L'ensemble des connaissances acquises au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour l'étude de de la réponse au sepsis dans des conditions mimant ce qui est retrouvé chez l'Homme en soins critiques. Dans le modèle d'inflammation systémique, d'inflammation par injection intracérébrale, et d'infection digestive chirurgicale, les animaux utilisés seront des souris SWISS âgées de 8 semaines. Dans le modèle d'infection pulmonaire par instillation intranasale et d'inflammation pulmonaire non infectieuse, les animaux seront des souris C57BL6/J de 8 semaines, mâles car les femelles sont protégées de l'inflammation pulmonaire. Le modèle d'inflammation cérébrale par vascularite fera appel à des souris C57BL6/J de 8 semaines.
Evaluation de l’immunogénicité de candidats vaccins contre le virus Nipah dans le modèle de la souris 129/S2SvPas
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Sept groupes de douze souris, six mâles et six femelles, chacun recevant un vaccin candidat différent contre le virus Nipah : 84 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leur sang et leur rate. La moitié de chaque groupe est tuée quinze jours après une injection unique, l'autre moitié reçoit une seconde injection à trente jours et est tuée quinze jours plus tard. Les souris sont identifiées par des encoches pratiquées dans les oreilles, geste qui provoque selon le porteur une douleur et un stress légers, et les prélèvements sanguins se font sous la mâchoire. Le projet ne mesure que l'immunogénicité, l'ampleur et la nature des réponses en anticorps et en lymphocytes, la protection réelle contre ce virus restant à établir dans des travaux ultérieurs.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de déterminer parmi les six candidats vaccins développés quels sont les plus immunogènes contre les antigènes majeurs du virus Nipah.
Bénéfices attendus
L’efficacité de la plateforme vaccinale utilisée dans ce projet a déjà été démontrée contre un premier virus très pathogène chez l’Homme. Cette plateforme a été utilisée à nouveau pour mettre au point différents candidats vaccins contre le virus Nipah, un virus hautement pathogène chez l’Homme. Grâce à l’analyse des prélèvements réalisés sur les animaux après chacune des deux injections de vaccins, nous pourrons mesurer l’évolution des réponses immunes aux antigènes du virus Nipah pour chaque vaccin et également comparer qualitativement et quantitativement ces différentes réponses immunes entre les vaccins. L’ensemble des résultats obtenus permettra de déterminer quels sont les vaccins les plus immunogènes, donc les plus susceptibles de protéger contre ce virus.
Procédures
Les animaux subiront les interventions suivantes : - Une identification (quelques secondes ) au sein d’un même groupe par encoches au niveau des oreilles. - La moitié des animaux subira une injection intrapéritonéale de vaccin, l’autre moitié subira deux injections de vaccin (injections durent quelques secondes réalisées à un mois d’écart). - Un prélèvement sanguin submandibulaire (quelques secondes) sera pratiqué sur tous les animaux quinze jour après chaque injection de vaccin.
Impact sur les animaux
L’identification des souris sera réalisée par des encoches aux oreilles ce qui peut provoquer une douleur et un stress léger chez les animaux. Des vaccins utilisant la même plateforme vaccinale ont déjà été utilisés chez la souris et aucun effets secondaires liés aux injections n’a été constaté. Les injections des vaccins peuvent néanmoins provoquer un stress, une douleur et un inconfort de sévérité légère et de courte durée. La manipulation des animaux peut induire une peur ou un stress physique de même que le prélèvement sanguin submandibulaire peut entrainer une douleur locale légère de courte durée liée à l’introduction de l’aiguille.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au cours de la procédure car leur sang et leur rate doivent être prélevés pour analyser les réponses immunitaires aux vaccins inoculés.
Remplacement
Les réponses immunes à des antigènes sont un ensemble de mécanismes cellulaires répartis dans de nombreux types de cellules immunitaires au sein de différents organes et qui évoluent au cours du temps. Il est impossible à l’heure actuelle de reproduire par des expérimentations in vitro ces réponses immunitaires. Le recours à des organismes entiers reste indispensable pour tester l’immunogénicité de candidats vaccins.
Réduction
Ce projet implique 7 groupes de 12 animaux chacun constitué de 6 mâles et 6 femelles. Chaque groupe sera inoculé avec un vaccin différent. La moitié des animaux de chaque groupe sera mise à mort 15 jours après la première inoculation pour effectuer des prélèvements qui permettront de mesurer les réponses immunitaires à la vaccination. L’autre moitié des animaux recevra une seconde injection 30 jours après la première injection et sera mise à mort 15 jours plus tard pour effectuer des prélèvements qui permettront de mesurer les réponses immunitaires après une seconde vaccination. La mise à mort de six animaux par groupe (3 femelles et 3 males) après chaque vaccination constitue un effectif minimum nécessaire pour évaluer la reproductibilité des observations d’un animal à l’autre et réaliser ainsi des tests statistiques robustes de comparaison de groupes (one way anova principalement) et pour s’assurer également que les résultats obtenus ne sont pas dépendants du sexe des animaux. Les résultats obtenus lors d’un précédent protocole basé sur des effectifs identiques ont montré que les résultats des mesures des paramètres immunitaires obtenus à partir des prélèvements sur les animaux pouvaient être assez dispersés mais que les effectifs étaient suffisants pour réaliser ces tests statistiques. La réduction du nombre d’individus dans chaque groupe pourrait altérer de façon significative la qualité de l’analyse des résultats, compromettant ainsi l’ensemble de la procédure et l’intérêt du recours à cet effectif animal pour comparer l’immunogénicité de ces vaccins.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé, conçu pour garantir leur bien-être et limiter tout risque de perturbation extérieure. Leur habitat sera régulièrement nettoyé et stérilisé, et leur alimentation ainsi que leur hydratation seront adaptées pour répondre à leurs besoins physiologiques. Des mesures spécifiques seront mises en place pour enrichir leur environnement (matériaux de nidification, cachettes, etc.) et favoriser leur confort, notamment en cas de besoin accru en eau ou en chaleur. Lors des manipulations (injections, prélèvements), des précautions rigoureuses seront prises pour minimiser les risques d’inconfort ou d’infection. Les zones concernées seront désinfectées avant et après chaque intervention, et les gestes techniques seront réalisés dans des conditions optimales de sécurité. En cas de réaction locale (rougeur, gonflement) au point d’injection, des soins adaptés (nettoyage antiseptique) seront appliqués sans délai. Un suivi quotidien sera assuré, avec une attention particulière dans les jours suivant chaque vaccination. Les animaux seront observés pour détecter tout signe de détresse, de douleur ou de modification de leur état général (perte d’appétit, changement de comportement, altération de l’apparence). En cas de perte de poids supérieure à 10 % par rapport au poids initial, ou d’apparition de signes cliniques persistants tels que la prostration, la fermeture partielle des yeux ou une inflammation locale au site d’injection, les animaux seront mis à mort. L’ensemble de ces mesures vise à garantir le respect des animaux tout au long du projet, en appliquant les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement) et en s’appuyant sur les bonnes pratiques reconnues en matière de bien-être animal.
Choix des espèces
La lignée de souris utilisée est un modèle largement employé pour analyser les réponses immunes induites par des vecteurs vaccinaux et que nous avons déjà utilisé. Les animaux utilisés seront des adultes (à partir de 2 mois). Il est nécessaire que le développement de leur système immunitaire soit mature pour évaluer au mieux la réponse immune mise en place suite à la vaccination.
Effet de régimes alimentaires et d’émulsifiants sur la virulence de souches E. coli associées à la maladie de crohn
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
Pour établir si des additifs alimentaires et des régimes déséquilibrés en fibres et en graisses favorisent l'implantation de bactéries Escherichia coli associées à la maladie de Crohn, 260 souris mâles porteuses d'un gène humain vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune suit un régime particulier pendant huit semaines dès le sevrage, reçoit par gavage les bactéries puis un traceur fluorescent, et subit deux prélèvements sanguins sous anesthésie, le second sans réveil. Les collectes de fèces imposent un isolement de dix minutes chaque semaine pendant six semaines, puis trois fois par semaine pendant deux semaines, et soixante souris reçoivent en plus quatorze gavages quotidiens de composés bactériens. Toutes seront tuées pour mesurer l'inflammation intestinale, l'épaisseur du mucus et la composition du microbiote, au service de traitements que le porteur présente comme contribuant au "bien-être" des patients, mot qu'il met lui-même entre guillemets.
Objectifs
Le microbiote intestinal joue un rôle clé dans le développement et l’entretien des pathologies inflammatoires chroniques de l’intestin telle que la maladie de Crohn. Certaines populations de bactéries dites ‘bénéfiques’ pour l’hôte sont diminuées au détriment de bactéries ‘agressives’ aux propriétés pro-inflammatoires. Une catégorie particulière de bactéries Escherichia coli adhérentes et invasives aux propriétés pro-inflammatoires, colonise anormalement l’intestin grêle de patients atteints de maladie de Crohn. La surexpression d’une protéine au niveau de la muqueuse de l’intestin grêle des patients favorise l’implantation de ces bactéries. Précédemment, il a été montré que l’expression de la protéine humaine au niveau de l’intestin grêle de souris favorise l’implantation de ces bactéries Escherichia coli, offrant un modèle d’étude précieux pour pouvoir tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. L’objectif du projet est d’évaluer les effets de divers facteurs alimentaires sur le microbiote de l’intestin grêle et plus particulièrement sur ces bactéries adhérentes et invasives. Ce projet permettra de mettre en évidence la capacité de certains additifs alimentaires ou régimes alimentaires déséquilibrés en fibres et en graisses à favoriser l’implantation des bactéries Escherichia coli et à augmenter leurs propriétés agressives. La compréhension des mécanismes sous-jacents permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques visant ces bactéries. La finalité du projet est d’utiliser l’ensemble de ces connaissances pour proposer 2 candidats d’intérêt (microorganismes ou produits issus du microbiote) qui seront testés dans ce modèle murin pour leur capacité à lutter contre le développement des Escherichia coli adhérentes et invasives et ainsi aider à améliorer le bien-être intestinal en rétablissant l’équilibre du microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Les investigations chez l’animal permettront de mieux comprendre les mécanismes qui permettent l’implantation des souches Escherichia coli adhérentes et invasives au niveau de la partie terminale de l’intestin grêle (leur zone de prédilection chez l’Homme) et leur répercussion sur l’écosystème intestinal et sur l’hôte de manière globale. Ce projet prend en compte également un facteur essentiel : l’alimentation. Ce projet permettra de mieux comprendre l’impact de certains régimes alimentaires et des additifs alimentaires sur le microbiote intestinal et sur les bactéries adhérentes et invasives. La finalité du projet est de proposer aux patients atteints de maladie de Crohn des stratégies thérapeutiques personnalisées, visant ces Escherichia coli. Ces options thérapeutiques personnalisées seraient proposées aux patients hébergeant ces bactéries délétères dans le but de maintenir les phases de rémission et/ou d’améliorer l’effet des traitements, contribuant ainsi à leur « bien-être ».
Procédures
Les procédures incluses dans ce projet, comprenant 260 souris, suivent toutes le même schéma expérimental incluant : -une administration de régimes alimentaires spécifiques sous forme de croquettes pendant 8 semaines à partir du sevrage -un prélèvement de fèces par semaine sur animal vigile pendant 6 semaines, puis 3 fois par semaine pendant 2 semaines (isolement des souris le temps de la collecte, maximum 10 minutes). -un gavage sur animal vigile avec les bactéries (préhension + geste = 10 secondes maximum) -un gavage sur animal vigile avec un traceur fluorescent (préhension + geste = 10 secondes maximum) -un prélèvement de sang (100-150µL) sur animal anesthésié -un prélèvement de sang (200-300µL) 7 à 10 jours après le dernier prélèvement de sang sur animal anesthésié, sans réveil. Une des procédure concernant 60 animaux inclut 14 gavages supplémentaires pour administrer les candidats thérapeutiques.
Impact sur les animaux
-Suite à l’infection des souris par les bactéries adhérentes et invasives, nous attendons un faible impact sur le poids, pouvant être dû à un stress post-gavage, et une inflammation au niveau intestinal en raison de l’implantation des bactéries. -Chez les animaux infectés par les bactéries Escherichia coli, certains régimes alimentaires peuvent favoriser l'implantation intestinale de ces souches, induisant une inflammation intestinale supplémentaire. -Deux prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie sur l'ensemble des animaux, et peuvent induire un stress chez l'animal en périodes péri-anesthésiques et au moment de la contention de quelques secondes de l'animal sous anesthésie. -Lors des prélèvements de feces, les animaux sont isolés le temps de la collecte (10 minutes maximum) une fois par semaine pendant 6 semaines, puis 3 fois par semaine pendant 2 semaines, ayant pour conséquence d'induire un stress chez l'animal en raison de l'isolement. -Les animaux vont recevoir des bactéries ou composés par voie orale (gavage). Ce geste impose une contention de l'animal pendant 2-3 secondes ce qui induit un stress. L'administration quotidienne par gavage de composés bactériens thérapeutiques pendant 14 jours dans une des procédures de ce projet peut induire un stress supplémentaire chez l'animal.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés lors de ces procédures (260 mâles) sera mis à mort à la fin des expérimentations. Il sera prélevé un ensemble d’échantillons biologiques chez l’animal à l’issu de l’expérience pour compléter les données issues des observations cliniques ou encore les données inflammatoires suite à des dosages dans les fèces des animaux : niveaux d’inflammation au niveau des tissus intestinaux, analyses histologiques, mesures de l’épaisseur de la couche de mucus, analyse de microbiotes.
Remplacement
L’effet des régimes alimentaires sur le microbiote intestinal sera étudié en amont de ce projet en systèmes in vitro, telles que des micro-fermenteurs ensemencés avec des selles de patients atteints de maladie de Crohn. Cela permettra de tester un ensemble de régimes et d’additifs alimentaires pour leurs effets sur la stabilité d’un microbiote complet, sain ou pathologique, et sur la virulence de certaines bactéries. Cependant, le but ultime du projet est de se positionner au sein de l’écosystème complet de l’intestin grêle, site de prédilection de certaines bactéries impliquées dans l’inflammation chez les patients atteints de maladie de crohn. Les études en micro-fermenteurs ont une limite : ils ne prennent pas en considération l’hôte : la muqueuse de l’intestin grêle et le mucus qui la recouvre ainsi que le système immunitaire. Or, l’interaction entre l’hôte et le microbiote est cruciale : la réponse immunitaire de l’hôte façonne le microbiote intestinal, et les microorganismes et les produits de leurs métabolismes influent également sur l’hôte en modulant sa réponse immunitaire. L’alimentation est un autre facteur qui peut jouer un rôle fondamental dans cet équilibre, de manière bénéfique ou au détriment de l’hôte. Il est donc nécessaire de travailler à l’échelle de l’organisme entier pour pouvoir étudier les effets de régimes alimentaires spécifiques sur la virulence des de certaines souches de bactéries, dont les Escherichia coli adhérents et invasifs, et sur le microbiote de l'intestin grêle pour pouvoir ensuite proposer des stratégies thérapeutiques participant à rééquilibrer ce microbiote.
Réduction
-Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet (260 souris) a été réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Précédemment, une étude publiée dans le même modèle murin a montré qu’un nombre de 6 souris par lot était suffisant pour analyser le comportement des bactéries Escherichi coli adhérentes et invasives au niveau de l'intestin. Les coefficients de variation des données de colonisation obtenues lors de cette expérience étaient acceptables pour une étude exploratoire (10-40% en log10). Le projet concerné par cette DAP implique d’étudier l’impact de régimes et d’additifs alimentaires sur ces bactéries adhérentes et invasives. Or, les réponses vis-à-vis de régimes peuvent varier selon les individus, en particulier en raison de la composition de leur microbiote intestinal. En effet, une variabilité inter-individu a été observé dans un autre modèle murin placé sous un régime riche en sucre et en graisse. Pour pallier à cette hétérogénéité de la réponse biologique, nous avons décidé d'augmenter le nombre d’animaux à 10 individus par lot pour l’ensemble du projet, afin d'espérer conserver un coefficient de variation équivalent à l'expérience exploratoire (10-40%), voire de le diminuer. -De plus, dans le but de diminuer encore le nombre d’animaux au strict nécessaire dans le cadre de ce projet, une des procédures ne sera réalisée que si les effets biologiques recherchés dans la procédure précédente sont notables.
Raffinement
L’expérimentation débutant par la mise à disposition d’un régime alimentaire spécifique pendant 8 semaines dès le sevrage, la période d’acclimatation est de ce fait, intégrée. Pendant cette période, le poids des animaux est mesuré une fois par semaine. Lors de ce contrôle, un prélèvement de fèces est réalisé afin de détecter d’éventuels troubles digestifs en réponse aux traitements et de doser l’inflammation au niveau fécal. Ce contrôle entraine/habitue l’animal à la présence de l’expérimentateur et à la préhension. Lors des 2 à 3 dernières semaines des procédures, après infection des animaux, la surveillance est renforcée : les animaux sont contrôlés 3 fois par semaine. Une grille de score est utilisée pour le suivi des animaux. En fonction de ce score, il faut soit renforcer les surveillances, soit prévoir un mode de soulagement, soit modifier le protocole expérimental. Il sera administré aux souris montrant des signes de souffrance un traitement analgésique pour réduire leur douleur. En fonction de l’évolution de l’état général de l’animal dans les heures qui suivent, un deuxième avis peut être demandé, mais en l’absence d’amélioration, l’euthanasie est considérée. L’animal est immédiatement sorti du protocole, anesthésié et mis à mort selon la réglementation en cours.
Choix des espèces
Le modèle choisi est la souris, modèle fréquemment utilisé dans l’étude de ce type de pathologie et qui dispose d’un grand nombre d’outil de diagnostic et d’analyses. Nous disposons d’un modèle de souris transgénique exprimant une protéine humaine servant de récepteurs pour les bactéries Escherichia coli adhérentes et invasives qui sont étudiées dans le cadre de ce projet. L'expression de cette protéine humaine au niveau de l’intestin grêle chez l’animal est nécessaire pour favoriser l’implantation de ces bactéries. Concernant le stade de développement, les animaux doivent entrer dans le protocole dès le sevrage (environ la 4ème semaine de vie) afin d'être placés sous régime alimentaire spécifique dès qu'ils commencent à s'alimenter par eux-mêmes et ce, pendant 8 semaines. En effet, le microbiote intestinal va subir un changement radical dans sa composition au sevrage en raison du changement d'alimentation. De ce fait, pour ne pas risquer de masquer les effets des régimes alimentaires spécifiques à étudier, il est préférable d'administrer directement ces régimes post-sevrage, sans passer par un régime alimentaire transitoire.
Induction d’une réponse immunitaire spécifique dirigée contre le HIV chez un modèle murin par un co-traitement avec un vaccin et des anticorps neutralisants à large spectre.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Marquées à l'oreille, injectées deux fois sur animal vigile et trois fois sous anesthésie, saignées six fois, 192 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des pseudo-virus du VIH recouverts d'anticorps, des particules dépourvues de matériel génétique viral, associés à un vaccin, pour mesurer si la combinaison produit une réponse immunitaire plus durable que le vaccin seul. Le porteur indique avoir retenu la souris pour éviter le recours aux primates non-humains, le VIH n'infectant que peu d'espèces. Toutes sont mises à mort à la fin de chaque procédure, pour l'analyse complète de leur système immunitaire.
Objectifs
Le VIH est un virus qui attaque le système immunitaire. Aujourd'hui, les traitements antirétroviraux permettent de contrôler efficacement l'infection, mais ils ne permettent pas d'éliminer complètement le virus. De nouvelles approches thérapeutiques sont donc à l'étude pour aider le système immunitaire à mieux contrôler l'infection.Parmi elles, l'utilisation d'anticorps capables de reconnaître un grand nombre de variants du VIH a montré des résultats prometteurs. Ces anticorps se fixent sur les particules virales et facilitent leur reconnaissance par certaines cellules du système immunitaire. Ce mécanisme peut aussi contribuer à stimuler les défenses naturelles de l'organisme contre le VIH. Cependant, cette stimulation reste souvent insuffisante pour obtenir une protection durable chez la plupart des patients. Pour renforcer cette réponse immunitaire, il est envisagé d'associer ces anticorps à un vaccin thérapeutique conçu pour stimuler spécifiquement certaines cellules immunitaires capables de reconnaître et de combattre le VIH. L'évaluation de cette stratégie combinée est toutefois difficile, car le VIH infecte très peu d'espèces animales. Afin d'éviter le recours à des modèles primates non-humains, cette étude utilise chez la souris des particules appelées « pseudo-virus ». Ces particules ressemblent au VIH mais ne contiennent aucun matériel génétique viral. Elles ne peuvent donc ni infecter les cellules ni se multiplier, ce qui les rend sûres à utiliser en laboratoire. En administrant ces pseudo-virus préalablement recouverts d'anticorps, il est possible de reproduire certains mécanismes de reconnaissance du VIH par le système immunitaire et étudier la réponse immunitaire qui en résulte. L'objectif est de déterminer si l'association entre le vaccin et les anticorps permet d'obtenir une réponse immunitaire plus forte et plus durable que le vaccin seul.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus permettront notamment d'identifier les meilleures conditions d'administration de ces deux traitements, par exemple l'ordre dans lequel ils doivent être administrés ou le type d'anticorps le plus efficace. Ces connaissances pourront contribuer à la conception de futurs essais cliniques chez l'Homme visant à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le VIH allègeant le traitement actuel et donc favorisant une meilleure qualité de vie chez les patients vivant avec le virus.
Procédures
1x Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes) 6x Prélèvement de sang sur animaux vigiles (quelques secondes) 2x injections sur animaux vigiles (quelques secondes) et 3x injections sur animaux anesthésiés (quelques minutes)
Impact sur les animaux
Les souris ressentiront une légère douleur aux moment du marquage à l'oreille et au moment des injections et des prélèvements de sang.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour une analyse complète de leur système immunitaire.
Remplacement
A ce jour, il existe des modèles d’induction et stimulation de réponse spécifiques chez l’homme sur des cellules dérivés du sang périphérique mais seuls les animaux vivants permettent une analyse de la réponse cellulaire mémoire induite lors d’une vaccination, le paramètre d’intérêt de cette étude.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été déterminé de manière à obtenir des résultats scientifiquement fiables tout en limitant leur utilisation au strict nécessaire. La taille des groupes ont été calculés à partir de données expérimentales préalables afin de garantir que l'étude puisse détecter une amélioration statistiquement significative de la réponse immunitaire. La composition des groupes a été réalisée dans le but de minimiser leur nombre tout en garantissant que les effets observés puissent être attribués au co-traitement et non à l'un des traitement seul.
Raffinement
Les gestes expérimentaux impliquant une douleur chez l'animal et un potentiel dommage chez l'animal sont les injections ainsi que les prélèvements de sang. Les injections se feront sous anesthésie gazeuse par inhalation d'isoflurane, les animaux seront observés jusqu'à leur réveil complet de l'anesthésie et feront l'objet d'une vérification de l'absence de saignement persistant, de détresse ou de complication locale. Suite à l'injection, si des signes de lésions sont observés, un traitement par un antiseptique sera appliqué. Suite à l'injection du vaccin ou aux prélèvements de sang , si des signes de lésions cutanées sont observés, un traitement par un antiseptique cutanée sera appliqué. La surveillance des animaux sera un suivi visuel de leur comportement et morphologie 3 fois par semaine durant l’ensemble du traitement et portera sur l'évaluation de leur état global et l’apparition des points limites généraux. Les signes précoces d’une détérioration de la santé de l’animal tels qu'une diminution de l'activité, une altération du toilettage une posture anormale, des signes d’un manque d’alimentation et le cas échéant des soins seront prodigués tel que une complémentation alimentaire et un accès à la nourriture facilité, un enrichissement par l'ajout d'un carré de coton favorisant la confection d'un nid et diminuant le stress de l'animal. Les animaux seront surveillés quotidiennement jusqu'à la disparation des symptômes.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Les études précédentes montrent que le vaccin est immunogène chez la souris où de nombreux outils sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire. Des souris de 5-6 semaines d’âge seront utilisées. Il est admis qu’à partir de l’âge de 5 à 6 semaines, le système immunitaire des petits rongeurs est considéré comme mature et que les réponses immunitaires induites peuvent être considérées comme comparables à celles induites pendant la vie d’adulte et permettant des conclusions pouvant être appliquées à l'Homme.
MODIFICATION : ETUDE CHEZ LA SOURIS, IN VIVO, DE L’IMPACT DE GENES DE VIRULENCE DE MYCOBACTERIUM BOVIS SUR LA PHYSIOPATHOLOGIE DE LA TUBERCULOSE
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système respiratoire
264 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever poumons, foie, rate, cerveau et ganglion médiastinal. Les souris reçoivent une puce d'identification, une infection intranasale par Mycobacterium bovis sous anesthésie, puis une prise de sang par semaine et deux pesées hebdomadaires. Parmi les bénéfices attendus, le porteur place la mise au point d'une vidéosurveillance des animaux infectés en isolateur, présentée comme un moyen de détecter plus tôt les comportements annonçant les points limites. Il indique partir de vingt-quatre souris pour en conserver six au dernier jour du protocole, un quart des animaux contrôlant l'infection en formant des granulomes, les dix-huit ou dix-neuf autres se dégradant jusqu'aux points limites et étant tués entre le vingt et unième et le trente-cinquième jour.
Objectifs
La tuberculose bovine est une pathologie majeure en santé animale. L'espèce mycobactérienne adaptée aux animaux, Mycobacterium bovis (Mb), est le principal agent pathogène responsable de la tuberculose bovine en Europe et au Royaume-Uni. C'est un pathogène zoonotique multi-hôtes capable d'infecter les ruminants (bovins, caprins, ovins), la faune sauvage et l'homme. Les programmes de surveillance et d’éradication, basés sur des campagnes de tests et l'abattage systématiques des bovins réactifs, n'ont pas permis d'éradiquer la tuberculose bovine (bTB). La bTB représente donc un risque direct pour les économies agricoles, la santé animale et humaine et la biodiversité dans les pays touchés. Il existe une hétérogénéité dans la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par Mb, ce qui influence directement le risque de transmission par les bovins infectés et la faune sauvage. Une meilleure compréhension des interactions hôte-pathogènes lors des infections à Mb est essentielle pour développer de nouvelles approches visant à éradiquer la tuberculose bovine. Le projet a pour objectif de comprendre comment Mb interagit avec le système immunitaire de l’hôte et comment cette bactérie module la progression et la transmission de la maladie. Pour cela, nous souhaitons identifier les gènes de Mb essentiel pour sa persistance et sa dissémination. Pour cela nous souhaitons i) Comparer la virulence de mutants de Mb (ii) Suivre la réponse immunitaire et le développement du granulome en réponse aux différents mutants.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous mettrons au point pour la première fois la vidéosurveillance d’animaux infectés en isolateur pour raffiner nos points limites (détection plus précoce de comportements). La validation du matériel, son installation, et de la méthode d’analyse permettra de proposer ce suivi pour nos prochains projets. Les résultats permettront de caractériser le rôle de 3 gènes de virulence pour la physiopathologie et la dissémination de Mb. Enfin, nous nous attacherons à une description exhaustive des réponses immunitaires chez les animaux infectés par les différentes souches.
Procédures
Pose de la puce d’identification et télémétrique : 1 fois et 1min/animal. Anesthésie par administration médicamenteuse par voie intrapéritonéale + infection par voie intranasale : 1 fois et 15 min/animal. Prise de sang : 1 fois par semaine et 3 min/animal/prélèvement. Pesée : bi hebdomadaire et 1min/pesée/animal. Les prises de sang peuvent engendrer un hématome et la contention peut engendrer du stress pour l’animal.
Impact sur les animaux
Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourraient être observés. Nous savons par expérience que les souris sont sensibles aux infections mycobactériennes. Ces animaux sont plus susceptibles d'atteindre les points limites lors d'infections avec la souche M.bovis de référence. Nous pourrons observer une perte de poids assez rapide associée à une prostration des animaux. Afin d'assurer un bon suivi de ces animaux, une grille d'évaluation de bien-être des animaux a été mise en place basée sur une observation quotidienne et une pesée bi-hebdomadaire.
Devenir
L'ensemble des animaux du projet seront euthanasiés à la fin du protocole afin de permettre le prélèvement post mortem des organes (poumons, foie, rate, cerveau, ganglion médiastinal) et fluides biologiques (sang, urine et fèces). Ces prélèvements nous permettront d'effectuer l'ensemble des analyses souhaitées comme l'analyse de charge bactérienne, des lésions, du recrutement cellulaire ou de la sécrétion de médiateurs biochimiques.
Remplacement
A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants a été réalisé. Pour les données mesurées que ce soit le recrutement cellulaire, cytokines secrétées, nous obtenons une puissance de test pour un effectif de 6 animaux de 87% pour un test statisitique. Pour obtenir un groupe de 6 souris au dernier jour du protocole, nous savons qu’il nous faut partir d’un groupe de 24 animaux. En effet, tous les animaux ne réagissent pas pareil à l’infection, certains la contrôlent en formant des granulomes pulmonaires matures (25% des animaux), et les autres doivent être sacrifiés au fur et à mesure du protocole car ils atteignent les points limites (entre J21 et J35 classiquement). Chez ces animaux sensibles, des lésions désorganisées sont observables dans le poumon. En résumé, nos protocoles comprennent 24 souris, nous analysons les réponses immunitaires de deux groupes : les animaux résistants (5-6 souris) et sensibles (18-19 souris). Nous utilisons des souris consanguines dont la variabilité génétique est très faible. Nous utilisons des tests statistiques non paramétriques spécialement conçus pour comparer des groupes de petits effectifs. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène).
Raffinement
Les animaux seront élevés en communauté dans des cages enrichies avec du papier essuie tout, tunnel carton. Des visites des animaliers seront quotidiennes et la vidéosurveillance sera mise en place pour mieux suivre les souris. Les animaux seront 6 par cage de 530 cm2. Nous réduisons, et limitons au maximum l'inconfort, la douleur, pouvant être subie par les animaux. les animaux seront habitués en amont à la cellule d’expérimentation, une semaine avant le début de l’expérimentation Pour cela les animaux sont anesthésiés lors des infections et leur état général est suivi tout le long de l’expérimentation (poids, prostration…). Ainsi les animaux sont euthanasiés dès l’apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruités ou rondelle de banane séchée ou popcorn sera réalisée.
Choix des espèces
Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse immunitaire d'un organisme entier. De plus, les modèles murins d'infections mycobactériennes sont très bien établis et permettent de mimer la physiopathologie observée chez l'homme et le bovin. De plus le modèle murin permet une manipulation en animalerie A3 et nous avons à notre disposition de nombreux outils pour cette espèce. Le modèle murin nous offre la possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées pour les voies de signalisation ou cytokines impliquées dans les réactions immunitaires. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 semaines (sexe indifférent). Pour ce projet, il nous faut des animaux ayant un système mature compétent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop âgées. De plus nous utilisons un modèle validé par la communauté scientifique.
Détermination par imagerie de la cinétique de persistance nasale d’antiviraux administrés par spray nasal
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Mis à jeun, anesthésiés jusqu'à deux heures trente, aspergés d'un composé antiviral par spray nasal, douze macaques à longue queue subissent huit acquisitions d'imagerie par narine en deux heures, puis un prélèvement nasal et trois prises de sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet mesure combien de temps le composé reste présent dans la cavité nasale, en vue d'un futur essai clinique chez l'humain. Le porteur écrit qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les mouvements du mucus nasal, et que seuls les primates non humains offrent des résultats transposables. Après avis du vétérinaire, les douze animaux seront réattribués à une nouvelle procédure.
Objectifs
Les virus respiratoires représentent actuellement un enjeu majeur de santé publique, avec 3 virus principaux, le SARS-CoV-2, responsable de la COVID-19, le virus respiratoire syncytial ou VRS, responsable de la bronchiolite du nourrisson et enfin le virus de la grippe. Ces trois virus sont responsables chaque année de dizaines de milliers de décès et les estimations de leur impact économique dépassent le milliard d’euros en France pour 2024. Le SARS-CoV-2 et le virus de la grippe circulent très activement avec régulièrement de nouveaux variants laissant toujours la possibilité de l’apparition d’un nouveau pathogène viral très virulent. Notre approche vise à développer et caractériser des traitements antiviraux contre les virus respiratoires en ciblant la cavité nasale. Ces traitements antiviraux offrent un complément à la vaccination. Traiter la cavité nasale d’individus encontact avec des personnes infectées doit permettre de façon préventive de limiter la dissémination des virus respiratoires. Le problème majeur de cette approche est que les voies respiratoires possèdent un système naturel de « nettoyage » très efficace appelé clairance mucociliaire. Ce mécanisme permet d’éliminer rapidement le mucus et les particules qu’il contient afin de protéger les poumons. En effet, environ la moitié du mucus présent dans la cavité nasale est renouvelée en seulement 15 min. Pour pallier cette difficulté, nos collaborateurs ont développé des composés antiviraux capables de se fixer à un constituant majeur du mucus pour prolonger le temps pendant lequel ces composés antiviraux restent présents dans la cavité nasale. L’objectif principal de ce projet sera d’évaluer combien de temps ces composés antiviraux peuvent rester dans le nez à l’aide d’un modèle préclinique adapté.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de définir en combien de temps des composés antiviraux destinés à lutter contre certaines infections respiratoires humaines peuvent rester présents dans la cavité nasale. Grâce à des techniques d’imagerie peu invasives, ces résultats permettront de mieux déterminer l’intérêt de ces composés et d’évaluer leur potentiel pour un futur essai clinique chez l’être humain.
Procédures
Les animaux de ce projet seront soumis à aux interventions suivantes : - Anesthésie (3, durée 5 minutes à 150 minutes) - Administration du composé antiviral par un spray nasal (1, durée 5 minutes) Un suivi de la présence du composé antiviral dans les cavités nasales des animaux sera réalisé au cours des 2h suivant l’administration du composé grâce à un dispositif d’imagerie. 8 acquisitions d’imagerie seront réalisées par narine au cours de ces 2h permettant le suivi du composé antiviral dans le nez. Suite à la dernière acquisition, un prélèvement nasal sera effectué afin de déterminer la concentration finale du composé (1, durée 5 minutes). Des prises de sang seront également réalisée afin de contrôler la numération sanguine (3, durée 5 minutes).
Impact sur les animaux
Ce projet nécessitera l’anesthésie générale des animaux et de sessions d’imagerie au niveau nasal durant une période totale de 2h30 maximum. Cette anesthésie prolongée peut entraîner un léger stress pour l’animal accompagné d’une éventuelle douleur suite à l’injection de l’anesthésique et aux prélèvements sanguins. L’administration du composé antiviral sous forme de spray nasal ainsi que l’examen d’imagerie réalisé par voie nasale peuvent également provoquer une gêne (éternuements, irritation) au niveau du nez, mais celle-ci devrait être légère et de courte durée.
Devenir
Un unique examen d’imagerie, peu invasif sera réalisé sous anesthésie générale ; les animaux seront par conséquent réutilisés suite à cette procédure en accord avec le vétérinaire référent.
Remplacement
Le mécanisme naturel de nettoyage des voies respiratoires est dépendant de nombreux paramètres comme la présence de cellules spécialisées, la respiration, la température, et l’humidité mais surtout de la production et le déplacement du mucus. Il existe aujourd’hui des alternatives in vitro permettant de reproduire l’anatomie des voies respiratoires des humains et des animaux et de mimer certains aspects de la respiration. Cependant, à ce jour, aucun de ces modèles ne permet de reproduire ces mouvements de mucus qui se produisent naturellement dans la cavité nasale.
Réduction
12 animaux au total sont prévus dans ce projet, regroupés en deux groupes de 6 animaux qui seront comparés entre eux. L’analyse statistique est basée sur des groupes de 6 animaux afin de pouvoir évaluer les différences de répartition des deux composés antiviraux étudiés.
Raffinement
Les animaux seront systématiquement anesthésiés pour ce projet et leurs paramètres cliniques (fréquence cardiaque, taux d’oxygène, fréquence respiratoire, température) seront constamment suivis au cours des examens d’imagerie. Les animaux anesthésiés seront placés sur tapis chauffant tout au long de l’examen d’imagerie. Le suivi de la distribution du composé antiviral est réalisé par imagerie, qui se substitue à des prélèvements répétées. Des points limites associés aux paramètres suivis ont également été définis pour permettre un arrêt de la procédure le cas échéant.
Choix des espèces
Seuls les primates non humains (comme les macaques cynomolgus) présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques, métaboliques et immunologiques suffisamment proches de l’être humain au niveau des voies respiratoires pour obtenir des résultats transposables à l’être humain avant la mise en place d’essais cliniques. De plus les macaques cynomolgus reproduisent les pathologies liées aux infections par les virus respiratoires (SARS-CoV-2, grippe, VRS) ciblés par les composés antiviraux de ce projet. Les animaux utilisés seront au stade de développement adulte car ils ont une anatomie et un système immunitaire matures.
Rôle des macrophages dans la réponse immunitaire dérégulée à l’infection bactérienne chez l’adulte et le nouveau-né
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 996 souris vont être utilisées, chacune ne subissant qu'une contention de trente secondes pour recevoir des bactéries ou une molécule inhibitrice, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection qui suit peut provoquer une gêne respiratoire, un dos voûté, une prostration et une perte de coloration de la peau, chez des souris adultes comme chez des souriceaux de deux jours. Toutes seront tuées pour le prélèvement de leurs organes, et le sexe des nouveau-nés sera lu sur des tissus prélevés après leur mise à mort. Le porteur reconnaît que la manipulation des souriceaux peut conduire la mère à les rejeter ou à ne plus les nourrir.
Objectifs
Le sepsis est une réponse immunitaire dérégulée entraînant un dysfonctionnement organique potentiellement mortel. Malgré les connaissances actuelles et les progrès de la prise en charge médicale, le sepsis demeure la principale cause de décès dans la plupart des unités de soins intensifs du monde et ne dispose pas de traitements efficaces. Cette réponse immunitaire dérégulée touche particulièrement les nouveaux-nés pour des raisons qui restent encore peu connues. Il est donc urgent de mieux caractériser les mécanismes cellulaires qui régulent les différents aspects responsables du déclenchement et du développement du sepsis et ses complications à long terme. Nos travaux ont montré le rôle essentiel de cellules immunitaires appelées macrophages dans le maintien des tissus. Dans ce projet, nous étudierons la réponse de ces cellules dans des modèles murins d’infection bactérienne, principale responsable du sepsis chez l'adulte et le nouveau-né. Puis en utilisant des souris qui ne possèdent pas ces macrophages nous examinerons leur implication dans le dysfonctionnement des tissus associés au sepsis. Ce projet permettra d’ameliorer nos connaissances sur les mécanismes responsables du déclenchement et du développement du sepsis et d’identifier de nouvelles cibles pour des applications thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables du déclenchement et du développement du sepsis (une réponse immunitaire dérégulée) et à terme de proposer de nouvelles options thérapeutiques pour les patients souffrants de sepsis.
Procédures
Dans ce projet les animaux vigiles seront soumis à des contentions pour leur administrer des bactéries (30 secondes, 1 fois) ou de molecules inhibitrices (30 secondes, 1 fois).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. L'infection pourrait induire des comportements d’une gêne ou d’une souffrance (gêne respiratoire ou poils hérissés ou dos voûté ou mobilité réduite ou absence de toilettage ou prostration chez la souris adulte ou perte de couleurs du la peau chez la souris adulte et nouveau-née. La manipulation des souriceaux peut également induire un stress chez les souriceaux et la mère qui peuvent mener au rejet par la mère et/ou absence d'alimentation chez le nouveau-né.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour réaliser les analyses nécessaires à notre étude.
Remplacement
Les mécanismes responsables du déclenchement et du développement de la réponse immunitaire dérégulée (sepsis) et le dysfonctionement des organes associés au sepsis reposent sur un ensemble de changements cellulaires et moléculaires complexes induits par une infection qui sont étroitement influencés par le système immunitaire. A ce jour, il n’existe donc pas d’autre alternative intégrée, comparable à l’utilisation des souris pour l’étude in vivo de ces mécanismes conduisant au sepsis et de l'implication du systeme immunitaire dans ce processus, nous permettant de remplacer l'utilisation des modèles de souris.
Réduction
Dans un but de réduction, nous proposons de faire des études "pilotes" pour definir les conditions (dose de bactérie et cinétique de la réponse des macrophages) afin de sélectionner une dose et un temps après infection pour prélever les tissus et répondre à notre objectif scientifique. Pour les procédures utilisant des souriceaux, nous utiliserons toute la portée et tous les sexes. Le sexe des souriceaux sera determiné sur des tissues prélevés après leur euthanasie.
Raffinement
Après infection, les souris adultes et nouveau-nées seront remises dans leur cage et surveillés toutes les heures jusqu’à 8 heures post infection et deux fois par jour (le matin et l'après-midi) pour les temps 24 et 48 postinfection par les personnes en charge de l'expérimentation. Les cages seront déposées sur des tapis chauffant pour éviter l'hypothermie qui peut survenir suite à l'infection Pour les souris adultes, nous déposerons de l'eau gelifiée et les croquettes alimentaires sur la litière de la cage pour s'assurer de l'hydratation et l'alimentation des animaux. Pour les souriceaux, les infections par seront faites en utilisant des seringues très fines et précises pour injecter de petits volumes. Le sexe des souriceaux sera determiné sur des échantillons de tissus prélevés sur animal euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle d'étude de l'infection bacterienne in vivo et du sepsis. De plus, les systèmes de défense et en particulier, les réponses des macrophages de l'hôte vis à vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. De plus les modèles murins utilisés sont déjà établis dans notre institut de recherche. Les animaux utilisés seront soit des souriceaux nouveau-nés de 2 jours soit des souris adultes agées de 8-12 semaines pour étudier l'implication des macrophages dans les mécanismes responsables du déclenchement et du développement de la réponse immunitaire dérégulée (sepsis) chez le nouveau-né et l'adulte.
Maintien d’un élevage de tiques Ixodes ricinus et test d’un système de gorgement artificiel
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Lapins : 25
Anesthésiés, les lapins reçoivent quarante nymphes ou dix couples de tiques adultes par oreille, un manchon de tissu fixé au sparadrap et une collerette, puis restent isolés cinq à dix jours le temps du repas sanguin, sans accès à l'aire de jeux. Les souris, elles, reçoivent 50 à 100 larves sans anesthésie et passent trois à sept jours seules en cage avec un enrichissement appauvri. 750 souris et 25 lapins vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour entretenir un élevage de tiques Ixodes ricinus. Les lapins, jugés d'excellents candidats parce qu'ils ont vécu au contact d'humains, partent à l'adoption, les souris sont tuées dans les sept jours.
Objectifs
Le but de ce projet est de maintenir une lignée d’une espèces de tique (Ixodes ricinus), afin de disposer d’individus génétiquement proche et permet de standardiser les conditions expérimentales. Ces tiques constituront un matériel pour : - Analyser la transmission différentielle (entre espèces de tiques) de différents microorganismes aux animaux. En effet, bien que l'inoculation des microorganismes soit possible à la seringue, celle-ci reproduit de façon très imparfaite la transmission des agents infectieux par les tiques et ne permet pas de l’étudier. - Elles permettront également d’analyser les déterminants susceptibles de provoquer une attractivité plus importante des tiques chez certains individus. - Elles permettront enfin de tester un appareil de gorgement artificiel (nourrissage) - Pour ce faire, des souris et des lapins seront utilisés pour le nourrissage des tiques
Bénéfices attendus
Produire et entretenir des tiques possédant un fond génétique commun pour réaliser des expérimentations en santé humaine.
Procédures
- Lapin : dépôt des tiques (40 nymphes ou 10 couples d’adultes/oreille) confection du manchon en tissu et fixation à l’aide d’un sparadrap médical. Gestes réalisés sous anesthésie générale. Durée du dépôt des tiques inférieur à 30 minutes et repas sanguin compris entre 5 et 10 jours. - Souris : dépôt des tiques (50 à 100 larves/individu) sur animal vigile. Durée du dépôt des tiques inférieur à 5 minutes et repas sanguin compris entre 3 et 7 jours.
Impact sur les animaux
Concernant les lapins, les effets indésirables sont liés au repas sanguin (5 à 10 jours) - Douleur aigue induite par l’injection intramusculaire d’anesthésiques - réactions locales à la piqure de tiques pouvant s’observer jusqu’à 4 semaines après le repas sanguin - inconfort lié au port de la collerette - irritation du cou et/ou de la base des oreilles à cause du port de la collerette - Innacessibilité à l’aire de jeux des lapins pendant la durée du repas sanguin (5-10 jours). - A noter que lors du repas sanguin (7-10 jours) les lapins seront isolés sans accès à l’aire de jeux, pouvant générer un stress limité. Concernant les souris, les effets indésirables sont liés au repas sanguin et correspondent à des réactions locales à la piqure des tiques. A noter que lors du repas sanguin (5-7 jours) les souris seront isolées avec un enrichissement apauvri, pouvant générer un stress limité.
Devenir
Concernant les lapins, il n'ont pas été en contact avec des tiques porteuses de microorganismes, les lapins peuvent etre adoptés. De plus, ils ont été en contact avec l'homme pendant leur vie. Il font d'excellent candidats à l'adoption. Concernant les souris, elle ne peuvent être réutilisées et son difficilement adoptables, elles seront donc mise à mort.
Remplacement
Des systèmes de gorgement artificiel de tiques ont été décrits pouvant potentiellement remplacer les animaux. Cependant leur mise en œuvre est difficile et les rendements sont moins bons que le gorgement sur animaux. Nous avons contacté des laboratoires utilisant ces systèmes et ceux-ci continuent d’utiliser le modèle animal pour le maintien de leur élevage, le système de gorgement étant utilisé pour l’infection des tiques par des agents pathogènes Un appareil pour gorgement a néanmoins été obtenu par le laboratoire. Le temps estimé nécessaire pour la mise au point des gorgements et la vérification de la possibilité de le réaliser sur les 3 stases (larves, nymphes et adultes, qui se déroulent sur une année complète) est d’au moins 5 années.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux utilisés pour le maintien de l’élevage de tiques est minimisé au mieux. L’expérience des années précédentes sur l’élevage de tiques ainsi que l’expérience de nos collègues nous permet d’estimer à 150 souris (C3H/HeN) et 5 lapins New-Zealand par an pendant la durée de ce protocole. Afin de minimiser l'utilisation des lapins, ils seront utilisés pour 3 nourrissages consécutifs.
Raffinement
Raffinement : Les souris sont maintenues en groupe jusqu’à leur utilisation. Elles sont gardées en cage individuelle (5-7 jours) pendant le repas sanguin où elles sont surveillées plusieurs fois par jour, ce qui permet d’observer leur état général et aussi de récupérer les tiques déjà gorgées. Les animaux sont nourris à volonté à toutes les étapes de leur vie. Lors de leur utilisation, bien qu’isolées, les souris seront en contact olfactif et auditif avec leurs congénères. Un tunnel en plastique et un barreau à ronger seront en place. En cas d’atteinte des point limites, les souris seront euthanasiées sans délai afin de soustraire les animaux à toute souffrance ou douleur inutile. Après le sevrage et pendant 24 jours, les souris seront habituées à être manipulées. Le dépôt des larves étant rapide, aucune procédure d’anesthésie n’est à prévoir. Une fois toutes les tiques récupérées et dans un délai de maximum 7 jours, l’euthanasie de l’animal sera pratiquée. Les lapins sont hébergés dans des clapiers individuels où ils restent en contact olfactif et auditif avec leurs congénères donc lorsque l'on dépose des tiques sur eux leur hébergement ne change pas. De plus, nous réalisons une période d’habituation des lapins avec une habituation à la manipulation par l’homme et à la collerette avant de passer aux manipulations à proprement parlé. Enfin, en dehors de la période de repas sanguin, les lapins sont mis ensemble dans une « aire de jeux avec enrichissement » au moins 3h/jour (papier, barreau à ronger, plateformes). Durant le dépôt des tiques, les lapins seront anesthésiés
Choix des espèces
Les rongeurs sont les hôtes naturels des larves et les nymphes de tiques. Les lièvres sont piqués par des tiques (tous les stases, y compris les femelles) dans la nature. Le lapin de laboratoire constitue donc une bonne alternative pour le repas sanguin des stases nymphales et adultes et les souris permettent le gorgement à la fois des nymphes et des larves. Nous utiliserons des souris et lapins adultes, après une phase de training (1,5 mois)
Evaluation de l’efficacité de nouveaux candidats vaccins contre la coqueluche chez le babouin juvénile.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Une trentaine d'anesthésies par animal, dix-sept séances d'imagerie, douze lavages broncho-alvéolaires et jusqu'à huit semaines d'hébergement individuel : 60 babouins juvéniles vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Tous reçoivent des candidats vaccins puis sont infectés par la bactérie de la coqueluche, avec une toux qui peut durer de trois à six semaines et des saignements après les écouvillonnages. Le porteur décrit le babouin comme la seule espèce reproduisant les symptômes coquelucheux humains, et retient des juvéniles sevrés pour représenter les réponses immunitaires des enfants. 40 babouins sont tués pour prélever leurs organes, les 20 autres restent vivants et pourront être réutilisés dans de nouveaux projets compatibles avec leur historique.
Objectifs
La coqueluche est une infection bactérienne des voies respiratoires responsable de 40 millions de cas et 300 000 décès par an dans le monde. Chez les patients les plus jeunes, les symptômes caractéristiques (fièvre, toux) peuvent évoluer vers une détresse respiratoire grave, voire entraîner le décès. Cette maladie affecte principalement les nourrissons et les jeunes enfants, dont le système immunitaire n’est pas encore pleinement développé. Depuis les années 1940-1950, des vaccins dits « ancienne génération » ont été développés afin d’immuniser les populations. Néanmoins, à partir des années 1990 et en raison de préoccupations liées aux effets indésirables (comme la fièvre et/ou des réactions inflammatoires au point d’injection), des vaccins « nouvelle génération » sont utilisés. Depuis quelques années, une recrudescence des cas de coqueluche a été observée. Des études épidémiologiques, cliniques et précliniques ont démontré que l’immunité conférée par la vaccination avec les vaccins de nouvelle génération diminue rapidement. Ils protègent contre la maladie, mais pas contre la colonisation bactérienne ni la transmission. Ceci a pour conséquence de permettre la transmission de la bactérie aux jeunes populations encore non protégées. Il apparaît donc nécessaire de développer de nouveaux vaccins capables d’induire une immunité durable, protégeant à la fois contre les symptômes, la colonisation bactérienne et la transmission. Dans ce projet, nous évaluerons l’efficacité de nouveaux candidats vaccins pour prévenir la maladie et la colonisation bactérienne chez des primates non-humains juvéniles, comme modèle des populations humaines pédiatriques à risque.
Bénéfices attendus
Les candidats vaccins qui auront montré des résultats satisfaisants chez le modèle primate non-humain pourront à court terme être utilisés lors d’essais cliniques chez l’être humain adulte. Ils pourront, à moyen-long terme, recevoir une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés dans les populations humaines adultes et pédiatriques.
Procédures
Les différentes interventions prévues dans ce projet sont réalisées sous anesthésie générale : - Anesthésie des animaux (31 fois environ, 30 minutes, 60 animaux) - Administration de solutions pour l’immunisation (3 fois environ, 5 minutes, 60 animaux) - Infection par la bactérie (1 fois, 15 minutes, 60 animaux) - Prélèvement de sang (31 fois environ, 5 minutes, 60 animaux) - Ecouvillonnage mucosal (27 fois environ, 1 minute, 60 animaux) - Lavage broncho-alvéolaire (12 fois environ, 10 minutes, 60 animaux) - Implantation d’une puce de suivi (1 fois, 30 minutes, 60 animaux) - Imagerie in vivo (17 fois environ, 45 minutes, 60 animaux) - Examen de mesure des variations de volume pulmonaire (11 fois, 10 minutes, 60 animaux) - Euthanasie (1 fois, au maximum 60 animaux) Hébergement individuel (jusqu’à 8 semaines maximum après exposition bactérienne, 60 animaux)
Impact sur les animaux
Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées à la vaccination (peu attendues) : Réaction locale, démangeaisons/douleur dans les heures /jours suivant l’administration. Nuisances liées à l’infection par la bactérie : Fièvre légère transitoire pouvant aller jusqu’à 1 semaine. Ecoulement nasal, toux, toux intense pouvant aller de 3 à 6 semaines. Nuisances liées aux anesthésies et prélèvements de sang : Trouble de l’appétit avec plus ou moins de perte de poids mineure ou absence de prise de poids, anémie transitoire (légère), hématome au niveau du site du prélèvement, jusqu’à une semaine. Nuisances suite aux écouvillonnages : Saignement pouvant aller de quelques secondes à minutes. Nuisances liées aux lavages broncho-alvéolaires : Irritation trachéale liée à l’intubation dans les heures suivant la manipulation. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : L’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui. Il sera limité au strict minimum (jusqu’à 8 semaines après l’exposition).
Devenir
40 animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d’intérêt dans le but de réaliser des analyses des tissus. L’accès à ces prélèvements permet d’analyser l’impact de la vaccination ou de l’exposition sur les organes, ce qui ne serait pas possible chez l’être humain. 20 animaux seront gardés en vie et pourront être réutilisés, sur avis vétérinaire, dans de nouveaux projets compatibles avec leur historique afin de réduire le nombre d’animaux naïfs utilisés en recherche.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, l’utilisation de l’animal de laboratoire est nécessaire pour reproduire ce qui est observé chez l’être humain développant une coqueluche, ainsi que l’immunité induite suite à la vaccination. La caractérisation de la maladie, y compris les impacts sur les organes, et la mise en évidence des vaccins à protéger de la maladie n’est pas réalisable avec les modèles actuels non animaux (cellules, organes, ou modélisation informatique). Bien que ces modèles puissent être utilisés pour répondre à des questions spécifiques, ils ne reproduisent pas encore la complexité du corps humain, comme le fonctionnement des organes ou du système de défense contre les infections, ni les interactions entre ces différents éléments à l’échelle du corps entier. En revanche, le primate non humain est très proche de l’être humain sur le plan biologique. Son utilisation permet donc une transposition rapide des résultats précliniques à la clinique humaine.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire. Afin de tester l’efficacité des candidats vaccins, le nombre d’animaux a été établi à 6 animaux par groupe expérimental permettant une analyse statistique valable des résultats obtenus.
Raffinement
Les interventions et prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. Un maximum de prélèvements et interventions seront regroupés lors d’une même anesthésie afin de réduire le nombre d’anesthésies. Les anesthésies pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation sera instaurée au besoin. Les animaux seront observés quotidiennement. En cas d’apparition de signes cliniques, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Si les points limites définis sont atteints, les animaux seront sortis de l’étude et l’euthanasie pourra être envisagée. Les prélèvements de sang pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale). Pour limiter l’irritation de la trachée liée à l’intubation lors du lavage pulmonaire, un spray anesthésique sera appliqué localement en amont de la manipulation. L’implantation de puces, permettant un suivi régulier de paramètres biologiques, peut induire une réaction au site d’incision. Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra décider du retrait de la puce et éventuellement de la sortie de l’animal de l’étude et appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement analgésique est appliqué avant la chirurgie. Les animaux seront hébergés en cages individuelles suite à l’exposition par la bactérie pour empêcher toute surinfection liée à une contamination croisée et le stress lié à la cohabitation d’animaux développant la maladie. Le programme d’enrichissement sera étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, renforcement du contact positif. La durée de l’hébergement en cage individuelle sera limitée à 8 semaines au maximum après l’infection.
Choix des espèces
Le babouin a été sélectionné pour ce projet car il est le seul modèle réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de l’infection par l’agent responsable de la coqueluche : c’est la seule espèce animale connue à reproduire les symptômes coquelucheux retrouvés chez l’être humain. Le système immunitaire de cette espèce est proche de celui des humains et les réponses vaccinales induites chez cette espèce sont semblables à celles observées chez l’être humain. C’est donc le seul modèle permettant d’évaluer à la fois l’immunogénicité et l’efficacité de vaccins. Ce projet a pour objectif d’étudier l’efficacité de nouveaux vaccins contre la coqueluche qui seront administrés à terme à des enfants. Ce projet repose donc sur l’utilisation de babouins juvéniles sevrés (>8 mois) comme modèle des réponses immunitaires des populations pédiatriques humaines.