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Etude du rôle de la pression interstitielle sous-cutanée dans la fuite capillaire au cours du choc septique. Essai de traitement innovant sur un modèle de choc septique chez le porc.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
72 cochons vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Un choc septique leur est provoqué, puis ils restent sous anesthésie vingt-quatre heures, avec des cathéters posés en une heure de chirurgie, des prélèvements toutes les deux heures et jusqu'à 200 ml de sang retirés. Le but est de tester une compression élastique de la peau censée limiter la fuite de liquide hors des vaisseaux, un dispositif déjà employé en clinique humaine. Les cochons pèsent environ 60 kg, ce qui permet, écrit le porteur, d'utiliser les mêmes produits et les mêmes volumes de perfusion que chez un patient de réanimation, et il juge "nécessaire" ce passage par l'animal alors que la compression a déjà montré des résultats encourageants chez des patients humains.
Objectifs
Les formes sévères des infections communes (pulmonaires, rénales…) sont la première cause d’admission en réanimation (hors chirurgie). Les cas les plus graves évoluent vers un syndrome appelé « choc septique » qui se manifeste principalement par une défaillance circulatoire avec baisse de la pression artérielle, ainsi qu’une baisse de la perfusion sanguine des différents organes, entrainant la mort dans environ 40% des cas. Au cours du choc septique, il se produit une fuite de liquide à travers la paroi des petits vaisseaux sanguins, conduisant à une baisse du volume sanguin. Cette fuite capillaire explique en partie la baisse de pression artérielle et de perfusion des organes, et explique l’apparition rapide d’œdèmes importants. Ces œdèmes s’accumulent dans tous les organes, mais le volume le plus important est retrouvé au niveau sous-cutané. A ce jour, aucun traitement n’est efficace pour lutter contre les différents phénomènes conduisant au choc septique et il n’existe aucun traitement pour réduire la fuite capillaire et les œdèmes qui l’accompagnent. Ce projet vise à proposer une approche thérapeutique innovante qui repose sur l’application préventive d’une faible pression au niveau cutané pour empêcher l’apparition d’œdèmes et la fuite de liquide en dehors des vaisseaux : la compression interstitielle sous-cutanée (SIPT). Si ce traitement a pu montrer des résultats encourageants dans une petite étude sur des patients humains en choc septique, nous avons besoin de confirmer l’efficacité de la compression dans un modèle préclinique (preuve de concept). Notre objectif final est de démontrer que la SIPT permet une amélioration globale des défaillances d’organes et in fine, une diminution de la mortalité. Ainsi, si la preuve de concept était apportée au terme de notre étude, cela pourrait ouvrir la voie à un changement de paradigme dans le traitement du choc septique. Ce projet permettra aussi de mieux comprendre les phénomènes reliant la pression au niveau du tissu interstitiel et les transferts de liquides entre compartiments. Les paramètres mesurés chez les animaux pendant les expériences permettront d’augmenter les connaissances sur la maladie. D’autant que le choc septique est le plus souvent étudiée sur des modèles animaux beaucoup plus éloignés de la réalité car la prise en charge n'est pas réalisée avec les fluides de remplissage comme c’est le cas dans le modèle que nous souhaitons mettre en place.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est la démonstration de faisabilité de la compression interstitielle sous cutanée (SIPT) avec une réduction des défaillances d’organes et de ce fait, une diminution de la mortalité. Si les effets attendus de la SIPT sont confirmés, cela pourrait conduire à un changement de paradigme pour le traitement du choc septique. Par ailleurs, ce projet nous permettra également d’acquérir de nouvelles connaissances non négligeables dans le rôle de l’interstitium dans la fuite capillaire au cours du sepsis.
Procédures
Les animaux vigiles seront tout d’abord tranquilisés puis l’animal est intubé est placé sous anesthésie générale tout le long de l’expérimentation. Les différents gestes chirurgicaux (pose de cathéters) et tous les prélèvements seront réalisés sur un animal sous anesthésie (sédatif + analgésique). La partie chirurgicale correspondant à la pose des cathéters devraient durer 1 heure environ. Des prélèvements seront réalisés toutes les 2h maximum, à l’aide des cathéters mis en place. Le volume sanguin prélevé tout au long de l’expérimentation ne dépassera pas les 200 ml, ce qui correspond à moins de 5% du volume sanguin total d’un porc de 60 kg. La durée totale de l'anesthésie à partir de l'induction du choc est de 24h et les animaux sont surveillés en permanence pendant toute cette période.
Impact sur les animaux
Durant cette étude, la seule nuisance attendue est la procédure de tranquilisation qui nécessite une injection en intramusculaire. Par la suite, l'animal sera constamment placé sous anesthésie générale à l'aide d'une molécule hypnotique et d'un morphinique.
Devenir
A la fin des différentes procédures sans réveil, les animaux sont tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. En effet, nous avons besoin de prélever des organes afin de réalisés des dosages.
Remplacement
Afin de répondre aux objectifs du projet, il est nécessaire d’avoir un modèle permettant d’évaluer les effets de notre traitement sur la formation des œdèmes, les défaillances d'organes systémique, la microcirculation et les paramètres hémodynamiques ainsi que la mise en jeu du système immunitaire au cours du choc septique. Il n'est pas possible d'avoir ce type de réponse sur des modèles in vitro. La validation de méthodes d’investigation clinique ou leur application d’une espèce à une autre ne peuvent être réalisées par définition qu’in vivo à l’aide de modèles animaux. Le choix du modèle porcin est le plus pertinent car il permet de se rapprocher au maximum de la prise en charge clinique en utilisant le même matériel et les mêmes protocoles de prise en charge que chez le patient humain en service de réanimation. Ce modèle nécessite également une anesthésie de plus de 24 heures, qui est faisable chez le porc avec les mêmes protocoles que chez l’homme. De plus, l’intervention thérapeutique qui sera testée consiste à réaliser une compression sur la peau par des bandages élastiques, déjà utilisés chez l’homme en pratique clinique moins adapté sur d'autres espèces.
Réduction
Afin de réaliser cette étude nous procéderons par étapes afin de valider un protocole robuste, répétitif et reproductible. Pour estimer le nombre d’animaux nécessaires nous nous sommes basés sur la littérature pour la mise en place du modèle ou sur le critère principal de la balance hydrique pour lequel nous avons réalisé un test statistique (test de puissance). A chaque étape, si les résultats sont satisfaisants avec un nombre plus faible d'animaux que le nombre d'animaux maximum prévu, la procédure s'arrête et le nombre d'animaux utilisé est alors automatiquement réduit. Par ailleurs, nous prévoyons de récolter et stocker des échantillons biologiques qui pourront servir pour d’autres projets de recherche scientifique.
Raffinement
Les animaux sont acclimatés à l’animalerie et maintenus en groupe tant que c’est possible. En effet, les deux premières procédures seront réalisées sur un seul animal à la fois. Ainsi, le dernier animal du groupe sera forcément hébergé seul pendant maximum 48h. Dans ce cas-là, nos visites quotidiennes seront plus nombreuses et un miroir pourra être fixé en dehors de la cage, de façon à ce que l'animal puisse y refléter son image sans risque de se blesser. Par ailleurs, pour le porc, la recherche de nourriture repose essentiellement sur le comprtement de fouissage dans le sol, c’est pour cela que nous enrichissant leur cage avec des copeaux et que nous parsemons une de la nourriture au sol. De même, nous disposons des jouets dans leur cage afin de diminuer leur stress. Par ailleurs, notre modèle expérimental est conçu pour limiter le stress et la douleur des animaux, dans un contexte de la mise en place d’un choc septique. Après la phase d’acclimatation, les animaux seront opérés. Il s’agit d’une intervention sans réveil pendant laquelle un suivi attentif de la douleur est réalisé avec une prise en charge de la douleur grâce à un traitement antalgique fort à base d'opiacés.
Choix des espèces
La plupart des études translationnelles sur le sepsis ont été réalisées chez des rongeurs et ne reflètent pas les mécanismes du sepsis humain ni le rôle des différents traitements tels que le remplissage vasculaire. Quel que soit l'effet qui sera observé avec le SIPT, ces données apporteront de nouvelles connaissances qui pourraient être traduites en applications cliniques. Les porcs utilisés dans cette expérimentation pèsent environ 60 kg, équivalent au poids humain. Ainsi, tous les produits utilisés lors de l’anesthésie, l’intubation seront similaires à ceux utilisés chez des patients humains. Il en est de même pour la prise en charge, en particulier le volume du liquide injecté afin de maintenir la PAM : en 24h, le volume total de liquide utilisé devrait atteindre 4 à 10 L, un volume qui permet de déceler une différence entre 2 groupes d’animaux et qui ne peut pas être appliqué chez des modèles de petits animaux. De plus, l’intervention thérapeutique qui sera testée consiste à réaliser une compression sur la peau par des bandages élastiques, déjà utilisés chez l’homme en pratique clinique. Ces bandages ne seraient pas adaptés à une autre espèce, que ce soit une espèce plus petite (rongeurs, félins, lagomorphes), ou une espèce à fourrure (mouton).
Evaluation de l’efficacité in vivo de fragments d’anticorps polyclonaux contre le virus Nipah en modèle hamster
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
Une mortalité soudaine de 80 % est attendue chez les animaux non traités, précédée de troubles neurologiques, d'une perte de tonus et de mousse aux orifices buccaux et nasaux. 120 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Pendant cinq semaines, ils subissent cinq anesthésies, une infection au virus Nipah par le nez ou l'abdomen, des écouvillonnages buccaux, puis un prélèvement de sang dans le cœur qui précède la mise à mort, pour tester des fragments d'anticorps contre un virus sans vaccin ni traitement. Le porteur décrit le hamster doré comme le modèle de référence depuis vingt ans et affirme que les tests in vitro ne portent que sur un organe, l'étude d'un anticorps passant "obligatoirement" par un modèle animal.
Objectifs
Le virus Nipah est un agent hautement pathogène ayant émergé dans les années 90 en Asie du Sud- Est, contre lequel il n’existe pas à l’heure actuelle de vaccin ou de traitement. Ce virus est responsable d’encéphalites sévères et/ou de syndromes respiratoires chez l’humain, avec un taux de mortalité relativement élevé (jusqu’à 75% selon les souches). Ce pathogène constitue un problème de santé publique majeur. La maladie induite par ce virus figure sur la liste de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) des maladies prioritaires en matière de recherche et développement. Dans le cadre de la collaboration entre une équipe de recherche et une société développant le traitement, une série d’anticorps polyclonaux dirigés contre une protéine du virus a été produite. L’activité neutralisante des anticorps sera évaluée dans un premier temps par test de seroneutralisation. Ce projet propose d’évaluer le potentiel de protection des anticorps. L’efficacité du traitement sera évaluée sur modèle hamster doré, en comparant des groupes traités à un groupe contrôle d’animaux non traités. L’objectif est de déterminer la voie d’intérêt d’infection par le virus, l’efficacité de la dose et le schéma d’administration (dans le temps) du traitement.
Bénéfices attendus
Dans le contexte d’absence de traitement ou de vaccin, le développement et l’évaluation de ces anticorps permettraient d’identifier un candidat à visée thérapeutique. Ces anticorps pourraient ensuite être potentiellement utilisés chez l’Homme en contexte de traitement post-exposition chez les personnels de santé ou manipulateur du virus, ou en traitement curatif chez les patients.
Procédures
Les animaux de chacune des procédures seront en expérimentation pour une période de cinq semaines. Les animaux seront soumis à un nombre de 5 anesthésies (durée de 10 à 15 minutes), à une infection virale par voie intra-nasale ou intra-péritonale sous anesthésie (durée de 5 minutes), à un prélévèment par écouvillonnage buccal sous anesthésie (durée de moins de 5 minutes), et à un prélèvement sanguin par voie intra-cardiaque sous anesthésie qui sera suivi par l'euthanasie. Au cours de chaque anesthésie, les animaux seront pesés.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont une inflammation locale légère et transitoire au niveau de la zone d’injection, une gêne à la respiration suite à l’infection par voie intranasale et une irritation des muqueuses buccales suite aux prélèvements. Les animaux seront soumis à un maximum de 4 anesthésies générales sur une période de 28 jours (infection virale, traitement à Jour 0 et/ou Jour 1 post-infection et prélèvements buccaux) ce qui peut induire une hypothermie, un stress lié à l’induction de l’anesthésie dans la boite. Une légère anxiété peut être attendue suite à la manipulation quotidienne pour la pesée. Chez les modèles d’études caractérisés, l’infection par le virus engendre des atteintes neurologiques et des troubles respiratoires, relativement comparables à ceux observés chez les humains. Les animaux contrôles devraient développer les signes cliniques caractéristiques d’une infection par le virus, tels que de la fièvre, une perte de poids, une diminution de la locomotion et du toilettage, une perte de tonus ainsi que des troubles respiratoires et de potentiels signes neurologiques. Ces signes peuvent être accompagnés d’une mortalité soudaine (80%) avec très peu de signes précurseurs : l’observation de pavillons développés, redressés (c’est à dire placement des oreilles vers l’avant), de troubles neurologiques et/ou de présence de mousse au niveau des orifices buccaux/nasaux. Les animaux traités devraient présenter moins ou aucun signe clinique contrairement aux animaux contrôles.
Devenir
L'étude implique que les organes et les tissus puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux de l'étude (n=120), ceux-ci étant répartis en divers groupes infectés et traités. Par conséquent, seule la mise à mort des 120 animaux de l'étude permettra d'obtenir des données statistiquement robustes.
Remplacement
Les méthodes alternatives dérivées de la culture cellulaire ou de l’animal tendent à recréer artificiellement ou à maintenir les interactions inter-cellulaires que nous pouvons retrouver dans un organisme mais ne permettent de se focaliser que sur un organe et pas sur un organisme vivant entier. Suite au développement et à la caractérisation des anticorps, la quantité d’anticorps sera déterminée par technique ELISA et l’activité neutralisante de ces anticorps sera évaluée par seroneutralisation par l'équipe collaboratrice afin d'obtenir les données préliminaires. Afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de ces anticorps, ils doivent ensuite être confrontés dans un modèle plus complexe mimant l’infection par le virus. En effet ces tests in vitro ne permettent pas actuellement de répondre à des questions globales telles que la mise en place de la pathologie, le développement symptomatologique ou la mise en place de réactions immunitaires suite à un traitement et à une infection virale. L’étude de l’activité d’un anticorps sur un virus passe donc encore obligatoirement par l’utilisation d’un modèle animal.
Réduction
Afin de mesurer l’efficacité de la protection induite par le traitement suite à l’infection, l’ensemble des animaux sera mis à mort en fin de procédure afin de collecter des échantillons biologiques pour analyser les différents paramètres virologiques et immunologiques des animaux traités par rapport aux animaux non traités. Grâce aux résultats obtenus lors de précédentes études, les signes cliniques caractéristiques d’une infection par le virus chez les animaux non traités sont connus, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux contrôles à 6 pour chacune des voies d’infection, en respectant la parité (n= 6 animaux infectés par voie intra-nasale et n=6 animaux infectés par voie intra-péritonéale).
Raffinement
Les animaux seront hébergés par 3 dans des cages adaptées au système d’hébergement. Les conditions d’hébergement classiques sont maintenues. Des observations journalières seront réalisées afin d’évaluer l’état de chacun des animaux selon les signes cliniques attendus. Un système de vidéosurveillance permettra de visualiser les animaux pendant les périodes où les membres de l’équipe ne seront pas présents en laboratoire. Cette surveillance est réalisée dès que souhaité et en période de week-end (sur animaux avant infection). En cas de doute sur l’état d’un ou plusieurs animaux, une entrée en zone sera programmée pour procéder à une observation des animaux et à une possible décision d’arrêter le protocole.
Choix des espèces
Le hamster doré est le modèle de référence pour l’étude du virus Nipah. Il a été développé il y a quasiment 20 ans au laboratoire puis utilisé dans le cadre de divers projets collaboratifs et publié par de nombreuses équipes internationales. Les animaux seront agés de 7 à 8 semaines selon la disponibilité. Ces âges correspondent aux stades de développement des hamsters utilisés par la communauté scientifique pour les études pré-cliniques dans ce contexte et permet d’évaluer la réponse mise en place suite au traitement par anticorps sur système immunitaire mature.
Utilisation de probiotiques dans la prise en charge des infections à Clostridioides difficile
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont identifiées par un trou dans l'oreille ou une puce sous-cutanée, gavées une fois par jour pendant dix-sept jours avec des souches probiotiques, infectées par Clostridioides difficile lors d'un gavage unique et rendues plus réceptives à la bactérie par une injection d'antibiotique. Le porteur annonce des diarrhées et une perte de poids, avec recueil quotidien des selles, la mise à mort finale servant à prélever les organes. Il conclut que le recours à l'animal est "indispensable" pour valider l'effet thérapeutique et qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité du microbiote, tout en indiquant que la vérification in vivo est de toute façon exigible réglementairement.
Objectifs
Clostridioides difficile (C. difficile) est une bactérie impliquée dans la plupart des cas de colites associées aux antibiotiques, notamment dans les établissements de santé (24000 cas par an dont 14% de formes compliquée en France). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l’ordre de 3%. Les ICD représentent également un coût sanitaire important en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours hospitaliers et des surcoûts associés à leur prise en charge particulière. C. difficile a ainsi été classée comme « menace urgente » dans le dernier rapport du centre de prévention et de contrôle des maladies portant sur les menaces liées à la résistance antibiotique. Trois molécules antibiotiques sont utilisées actuellement pour le traitement des ICD. Bien que généralement efficaces elles présentent des inconvénients tels que le risque de sélection de bactéries résistantes, coût important voir échec thérapeutique. En effet, les ICD sont caractérisée par un taux de récidive important de l’ordre de 20% avec parfois des récidives multiples particulièrement invalidantes pour les patients. Les antibiotiques font partie des molécules les plus prescrites dans le monde et il a été démontré qu’elles peuvent induire des modifications du microbiote. La perturbation du microbiote intestinal appelé dysbiose est un facteur de risque pour les ICD. En effet, l’implantation de ce pathogène est favorisée dans ce contexte. Il est donc capital de rechercher des thérapeutiques complémentaires/alternatives aux antibiotiques telles que les probiotiques permettant d’épargner/restaurer le microbiote dans le cadre de la prise en charge des ICD. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Il a ainsi été montré que les probiotiques pouvaient participer au rétablissement du microbiote intestinale et de ce fait restaurant son effet de barrière contre les pathogènes. A ce jour diverses souches bactériennes et différentes combinaisons de ces souches ont été testées avec des effets variables pour traiter et prévenir le risque d’ICD. Ce projet de recherche a pour objet de développer des stratégies de lutte contre la colonisation intestinale de C. difficile grâce à l’utilisation de probiotiques ayant diverses propriétés. En effet, les mécanismes d’action des probiotiques peuvent être divers et nous allons tester plusieurs stratégies.
Bénéfices attendus
Le développement de nouvelles stratégies de lutte contre ce pathogène permettrait d’offrir de nouvelles options thérapeutiques aux patients et limiter le risque de récidives.
Procédures
Les souris seront identifiées par un trou dans l’oreille ou une puce insérée en sous-cutané avec un dispositif dédié aux rongeurs. Le modèle nécessite deux types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale des souches probiotiques (1 gavage/jour pendant 17 jours) ou la souche de C. difficile (un gavage unique durant la procédure) et une injection d’antibiotique sous anesthésie locale (une seule injection d’une durée de 10 secondes durant la procédure). De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé quotidiennement (au maximum), sur la durée de l'essai.
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux sont de classe modérée. Elles incluent les actes expérimentaux d’identification, de gavage et l’unique injection d’antibiotique ainsi que les nuisances liées à l’infection par la bactérie C. difficile pour les groupes d’animaux qui y seront exposés comprenant des diarrhées et une perte de poids des animaux. Les méthodes d’identification (trou dans l’oreille, puce) essentielles pour suivre les animaux au cours du temps occasionnent également des nuisances.
Devenir
Le prélèvement d'organes à la fin des procédures expérimentales nécessite l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Plusieurs tests in vitro ont permis de sélectionner les souches probiotiques présentant une activité anti C. difficile intéressante. L'étape de vérification de leurs activités in vivo est exigible réglementairement avant toute nouvelle phase de développement clinique. Le recours à l'animal est indispensable pour valider l'effet thérapeutique. La reconstitution des interactions entre le microbiote, l’hôte et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.
Réduction
Une planification statistique minutieuse basée sur les expériences passées du laboratoire et les publications scientifiques du domaine a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. En utilisant des logiciels statistiques spécifiques nous avons ainsi déterminé que pour pouvoir conclure à l'issue de ces expérimentations sans avoir besoin de les répéter, 10 animaux par groupe seront ainsi nécessaires. Ainsi le nombre total d’animaux est de 300 pour minimiser le nombre d’animaux tout en préservant la validité statistique de l'étude.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 5 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées de façon hebdomadaire et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques locaux permettant de limiter la souffrance des animaux lors des injection intrapéritonéales. Une procédure d’euthanasie anticipée est mise en place et des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Enfin, à terme, les souris seront identifiées par une puce insérée en sous cutanée permettant à la fois l’identification et le relevé de la température ». Le puçage avec relevé de température est une méthode nouvelle dans l’équipe permettant d’avoir un critère supplémentaire permettant d’objectiver l’état de santé de l’animal et pouvant constituer un point limite supplémentaire (fièvre ou hypothermie).
Choix des espèces
La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation par C. difficile.
Investigation de l’activité antibactérienne d’anticorps polyclonaux dans un modèle murin de sepsis
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Infectées par Pseudomonas jusqu'au sepsis, les souris traversent quarante-huit heures que le porteur décrit comme les plus critiques en douleur et en mortalité, le modèle conduisant à la mort de l'animal en l'absence de traitement. 560 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objet est de tester l'activité antibactérienne d'anticorps polyclonaux contre une bactérie responsable de près de 10 % des infections nosocomiales et souvent résistante aux antibiotiques. Le porteur annonce une analgésie et une surveillance trois fois par jour pendant les deux premiers jours, sans préciser la dose bactérienne administrée, le nombre de groupes, ni le calcul qui aboutit à 560 souris, dont il écrit seulement que l'effectif "doit permettre de faire des analyses statistiques robustes".
Objectifs
Pseudomonas est une bactérie responsable de près de 10% des infections nosocomiales. Les infections à pseudomonas sont en augmentation et sont généralement associées à des résistances aux antibiotiques. Elles représentent ainsi une réélle menace pour la santé publique. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'activité antibactérienne d'anticorps polyclonaux dans un modèle murin de sepsis (réponse inflammatoire généralisée associée à une infection grave).
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de valider l'activité antibactérienne des anticorps polyclonaux et de proposer une alternative thérapeutique dans un domaine ou le besoin médical est important. Ce projet pourrait aussi ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de lutte contre les infections bactériennes.
Procédures
Les traitements se feront par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée. Une contention légère sera faite par du personnel qualifié sur les souris pour l'administration des traitements, afin de ne pas engendrer de stress sur les souris. Ces manipulations ainsi que les piqures ne dureront que quelques secondes et la souris sera rapidement remise avec ses congénères.
Impact sur les animaux
Le modèle utilisé ici conduit à la mort de l’animal en l'absence de traitement. Il s'accompagne d'une l’inflammation locale et systémique, source de douleur et d’inconfort. Il est donc classé comme procédure sévère. Les premières 48 heures qui suivent le challenge bactérien sont les plus critiques en termes de douleur et de mortalité. A partir de 48h, l’état des souris s’améliore avec une chute des nuisances et de la mortalité.
Devenir
Après chaque expérimentation, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêt pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
Si des tests in vitro permettent d'évaluer l'activité des nouvelles thérapies, les études chez l'animal restent indispensables pour valider leur potentiel thérapeutique dans un environnement physiologique. Ces études permettent aussi de repérer une éventuelle toxicité des traitements et éclairent sur les modes d'action engagés.
Réduction
Le nombre d'animaux prend en compte le besoin de réduction (règle des 3R) et les contraintes statistiques liées au modèle et aux analyses qui seront réalisées. Le nombre d’individus par cohorte doit permettre de faire des analyses statistiques robustes.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 12 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des frisottis sont placés dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Des signes cliniques et points limites ont été définis afin de monitorer objectivement la souffrance des animaux au cours du modèle. La douleur sera évitée par injection d'analgésiques en fonction des signes cliniques observés ou en euthanasiant les animaux. Les premières 48h qui suivent le challenge bactérien sont les plus critiques en termes de douleur et de mortalité. Une attention particulière sera donc apportée durant cette période avec une surveillance des souris 3 fois par jour. Cette surveillance pourra être renforcée avec augmentation de la fréquence des passages si besoin. Une analgésie sera aussi appliquée 3 fois par jour durant les 48 premières heures du modèle (la première injection sera réalisée 15 minutes avant le challenge bactérien). A partir de 48h environ, l’état des souris traitées doit s’améliorer. L'analgésie sera alors décidée en fonction de l'état des animaux en prenant en compte les éléments suivants: morphologie générale, poids, paupières, aspect des larmes, aspect de la zone urogénitale, apathie, comportement en groupe, activité de la respiration.
Choix des espèces
Le modèle de sepsis décrit dans ce projet a été validé et caractérisé dans des publications. Nous travaillerons avec des souris femelles (les souris femelles étant plus légères elles permettent d'utiliser moins d'anticorps).
Etudes fondamentales et appliquées des interactions entre bactériophages et bactéries chez l’animal
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
Instillations dans le nez ou la trachée sous anesthésie, gavages jusqu'à six fois dans la même journée, injections dans le ventre ou dans la veine, infections bactériennes du poumon ou de l'intestin : 14 416 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées, sans possibilité d'être réutilisées ni adoptées, parce qu'elles ont été infectées par une bactérie pathogène qu'elles pourraient porter et transmettre. Le projet vise à comprendre comment les bactériophages, virus qui n'infectent que des bactéries, se comportent chez un hôte vivant, en vue d'élargir leur usage thérapeutique face à l'antibiorésistance. Le porteur annonce des groupes de six souris au maximum et trois répétitions par expérience, sans expliquer comment on arrive à 14 416 souris.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de faire avancer les connaissances sur l’utilisation thérapeutique des bactériophages. Les bactériophages sont des virus qui infectent uniquement les bactéries. Ils peuvent donc être utilisés pour tuer les bactéries résistantes aux antibiotiques. Ils présentent l’intérêt d’être très spécifiques des bactéries ciblées. D’autre part, les bactériophages font partie de la flore naturelle au même titre que les bactéries. Très abondants dans le tube digestif des animaux ils jouent un rôle important dans le maintien de la santé de l’appareil digestif. Leur utilisation (transplantation virale) pour rétablir une homéostasie intestinale est soutenue par des données cliniques préliminaires encourageantes. Ainsi, nous étudierons les interactions dynamiques entre les bactériophages et les bactéries dans deux organes cibles : les poumons et les intestins. Les connaissances qui seront acquises au cours de ce projet permettront de mieux appréhender le potentiel thérapeutique des bactériophages dans le but de permettre leur utilisation plus large en clinique.
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés sont la compréhension des mécanismes mis en jeu lors d’une phagothérapie. Ces mécanismes recouvrent non seulement les interactions entre les bactériophages et les bactéries mais aussi celles avec l’hôte et notamment son système immunitaire. La meilleure compréhension de l’utilisation thérapeutique des bactériophages permettra d’augmenter le nombre de patients traités dans des conditions optimales d’efficacité. Permettre à des patients d’accéder à ce type de traitement alors que les antibiotiques ne sont plus efficaces permettra de réduire le nombre d’impasses thérapeutiques et le coût des frais hospitaliers mais surtout d’améliorer les conditions de vie de ces patients.
Procédures
Les prélèvements sur animaux vigiles seront limités à un seul prélèvement sanguin (quelques secondes), ou des prélèvements fécaux (chaque animal est placé dans une boite pendant quelques minutes et jusqu’à 2 fois par jour). Les administrations par gavage (quelques secondes) seront limitées à 2 par jour.
Impact sur les animaux
Nous veillerons dans nos expériences à impacter le moins possible le bien-être des souris. Les expériences consistent essentiellement à - des injections intrapéritonéales ou intraveineuses une fois ou sur quelques jours. La piqure d'aiguille pour effectuer ces injections entraine une douleur légère de courte durée. - des gavages intragastriques jusqu’à six fois sur une journée qui nécessitent une contention brève - des installations intranasales ou intratrachéales sur animaux anesthésiés - des protocoles infectieux qui entraineront un inconfort et une douleur de sévérité modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptible de la transmettre s’ils étaient réutilisés. De plus, la plupart d’entre eux seront mis à mort pour analyser des organes vitaux.
Remplacement
L’évaluation des différents points évoqués dans le résumé du projet ne peut malheureusement pas s’envisager dans des systèmes in vitro, qui sont inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). Par ailleurs, s’agissant de bactériophages, l’évaluation pharmacocinétique ne peut s’appuyer sur l’existence de modèles mathématiques. De même, l’étude in vitro des communautés microbienne d’un tube digestif prenant en compte la structuration spatiale des organes n’est pas encore disponible.
Réduction
D’une part, en amont des expériences conduites chez l’animal nous effectuons de nombreuses expériences in vitro afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. D’autre part, autant que possible, le nombre maximal de paramètres sera collecté pour chaque animal de façon à limiter le nombre total d’animaux utilisé. Un maximum de 6 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 3 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. Pour les données quantitatives, la distribution normale des variables sera vérifiée et les tests statistiques appropriés seront alors choisis. Pour les variables qualitatives d’autres tests seront effectués. Les éventuels effets confondants (sexe et cage par exemple) seront pris en compte au moment de l’analyse en utilisant des modèles linéaires à effets mixtes. L’outil de bioluminescence sera utilisé pour évaluer l’évolution de l’infection in situ, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.
Raffinement
Les animaux infectés seront observés 2 à 5 fois au cours du premier jour puis au moins une fois par 24h durant les 2 jours suivants puis ensuite une fois par période de 48h. Ils seront pesés au moins une fois par période de 48h dès le début du protocole. Une grille d’évaluation à 3 niveaux (0, 1, 2) permettra de suivre l’état de santé de chaque animal. Le score de 1 déclenchera l’ajout d’un diet gel pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Le score 2 sera attribué aux animaux ne bougeant plus et ayant une posture prostrée, ou présentant une perte de poids supérieur à 20%, ou présentant de signes de diarrhée pendant plus de 48h. Tout animal présentant un score de 2 pour l’un des critères sera mis à mort. Au cours des expériences, toute modification des procédures visant à réduire la douleur des animaux (par exemple, réhydratation sous-cutanée, chauffage des cages) sera évaluée avant d’être mise en place.
Choix des espèces
A ce stade expérimental du développement de la phagothérapie, la souris représente l’espèce la plus pertinente pour l’évaluation des paramètres pharmacocinétiques et l’innocuité du traitement. Il s’agit d’un mammifère dont le système immunitaire est bien connu et comporte de très grandes analogies avec celui de l’homme. L’utilisation d’autres animaux plus proches de l’homme (primates) ou de références en pharmacocinétique (porc Yucutan) ne peuvent représenter des animaux de première intention à ce stade de nos travaux. De même, la disponibilité d’élevages de souris gnotobiotiques est un outil de choix qui n’est pas encore disponible pour d’autres espèces. Dans tous les cas, seuls des animaux adultes seront utilisés (>= à 7 semaines) car leur système immunitaire est arrivé à maturité au contraire d’animaux plus jeunes.
Mise en place de modèle murin de septicémies à E. Coli, K. Pneumoniae, A. Baumannii, P. Aeruginosa ou S. Aureus et évaluation de l’efficacité de traitements antibiotiques sur ces modèles.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
1 550 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 60 d'entre elles et modéré pour les 1 490 autres. Chacune reçoit une injection de bactéries, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa ou Staphylococcus aureus, destinée à provoquer une septicémie généralisée qui, sans traitement efficace, conduit à la mise à mort dans les 24 heures suivant l'inoculation. S'y ajoutent jusqu'à deux injections par jour pendant huit jours, des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire, à la veine caudale ou à la veine mandibulaire, et des séances d'imagerie de bioluminescence sous anesthésie. Le porteur annonce une surveillance jusqu'à trois fois par jour pour éviter toute souffrance inutile, et écarte dans le même texte les analgésiques anti-inflammatoires, qui biaiseraient le développement du modèle.
Objectifs
D’après le site de l’Organisation Mondiale de la Santé et des données scientifiques, en 2017, près de 50 millions de cas de septicémie et 11 millions de décès liés à cette maladie ont été recensés dans le monde. Cela représente encore près de 20% de l’ensemble des décès dans le monde dont près de la moitié ont été enregistrés chez les enfants de moins de 5 ans. Le sepsis est généralement causée par des bactéries nosocomiales, bien souvent résistantes aux traitements disponibles sur le marché, induisant rapidement un choc septique généralisé conduisant au décès du patient. Il y a donc une urgence dans la recherche et dans la découverte de nouveaux traitements efficaces contre ces bactéries multi-résistantes aux traitements. Ce projet consiste à développer et caractériser de nouveaux modèles murins de sepsis générés par infection avec des bactéries bioluminescentes ou non de type E. Coli, K. Pneumoniae, A. Baumannii, P. Aeruginosa ou encore S. Aureus. Ces modèles serontensuite utilisés dans le cadre du développement de nouveaux traitements des infections septicémiques non traitables et causées par des souches multirésistantes aux traitements (MDR).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier de nouveaux traitements antibiotiques permettant de mieux contrôler et d’améliorer la prise en charge des infections bactériennes responsables de septicémies rencontrées notamment dans les hôpitaux.
Procédures
Les animaux recevront des injections par voie intraveineuse dans la veine caudale, intrapéritonéale, par gavage ou sous cutané en interscapulaire sur animal vigile. Les injections sur animal vigile seront réalisées en quelques secondes (temps inférieur à 1 minute).Des injections en intramusculaires pourront être réalisées sur animaux sous anesthésie légère et dureront (en comptant l’anesthésie) environ 5 minutes. En cas de doses répétées, la fréquence des injections ne pourra dépasser 2 injections par jour et la dose de 5mL/kg par jour pour les intraveineuses, 10mL/kg par jour pour les intrapéritonéales, 5mL/kg par jour et ce pendant maximum 5 jours pour les injections sous-cutanées, 20mL/kg par jour pour le gavage et enfin 0.1mL/kg par site et par jour avec au maximum 2 sites par jour. La durée du traitement pourra s’étendre sur toute la durée de l’étude soit jusqu’à 8 jours. En cas d’utilisation de souches bactériennes bioluminescentes, des suivi de la bioluminescence seront réalisés sur animaux anesthésiés afin d’éviter tout mouvement des animaux pendant les phases d’acquisition des images. La durée de l’acquisition de bioluminescence, en comptant l’anesthésie, sera d’environ 10 minutes par animal. Des prélèvements (de sang à différents délais et d’organes uniquement après euthanasie) pourront être réalisés sous anesthésie en respectant les volumes et les fréquences de prélèvements classiquement décrits. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie et pourront être effectués au niveau du sinus rétro-orbitaire (SRO) en respectant une alternance entre les deux yeux entre deux prélèvements et un délai de 14 jours avant d’effectuer un nouveau prélèvement sur un même oeil, au niveau de la veine caudale, de la veine mandibulaire en respectant une alternance entre la veine gauche et droite entre deux prélèvements ou intracardiaque (uniquement à euthanasie et sous anesthésie de l’animal). Le choix d’une voie par rapport à l’autre se fera en fonction de la quantité des prélèvements ou injections prévus via cette voie. Les prélèvements d’organes (comme le cerveau, le cœur, les poumons, le foie, la rate, les intestins, les reins etc) ne seront effectués qu’après euthanasie des animaux afin de les peser, de réaliser des quantifications bactériennes ou tout autre analyse qui serait jugée utile à l’étude.
Impact sur les animaux
Les modèles de septicémies testés ici sont attendus comme étant des modèles d'infection généralisée pouvant induire, en l’absence de traitement efficace, l’euthanasie des animaux dans les 24 heures post-inoculation. Ainsi, un suivi extrêmement réguliers et vigilants de l’état de santé des animaux (jusqu’à trois fois par jour) sera mis en place pour éviter toute souffrance inutile de l’animal et une réaction rapide en cas de dégradation brutale et irréversible de son état de santé. Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes avec ou sans anesthésie susceptibles d’induire un stress : pesées, suivi clinique, injections et acquisition d’imagerie optique. Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés et selon les voies d’administration choisies pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques et/ou une perte de poids.
Devenir
Le modèle d’infection étant généralisé (septicémie) et les études d’efficacité ou de biodistribution d’un traitement nécessitant des prélèvements d’organes afin de réaliser des analyses, les animaux seront systématiquement euthanasiés en fin d’étude.
Remplacement
Malheureusement à ce jour, malgré les évolutions constantes des modèles in-vitro et in-silico, aucun modèle ne permet de remplacer totalement le modèle animal d’autant plus dans le cas d’une infection généralisée comme celui de la septicémie.
Réduction
L’utilisation de bactéries auto-bioluminescentes permettra de réaliser un suivi au cours du temps le niveau de charge bactérienne sur les mêmes animaux (sans nécessiter d’euthanasie) et donc de diminuer le nombre d'animaux utiles au projet. De plus, le nombre d’animaux inclus dans chaque étude fera l’objet d’une évaluation afin d’adapter le nombre d’animaux par groupe en fonction de l’état d’avancement du développement du candidat médicament. Pour les études pilotes permettant de déterminer la charge de l’inoculum bactérien, en fonction de la souche de bactéries utilisées et du modèle murin, à minima trois groupes de 5 souris seront constitués afin de déterminer la dose bactérienne appropriée à la souche de souris utilisée. A l’inverse, si des résultats préliminaires de dose infectieuse d’un inoculum bactérien auraient été obtenus par exemple sur une autre souche de souris et nécessiterait une confirmation afin de choisir la dose la plus appropriée pour la nouvelle souche de souris testée, seulement deux groupes de 5 souris pourraient alors être utilisés aux deux doses en balance. Pour les études de biodistribution à minima deux groupes de 5 souris seront nécessaires afin de comparer la localisation du traitement en présence et en absence d’une infection bactérienne. Ce nombre de groupe pourrait être augmenté dans le cas où la biodistribution du traitement d’essai serait évalué en plusieurs modèles d’infection ou comparé avec la biodistribution d’un traitement de référence. De même, pour les candidats médicaments testés en primo-attention des groupes de 5 souris minimum seront constitués. A l’inverse, pour les traitements ayant déjà été préalablement testés et dont les résultats seraient encourageants, le nombre de souris inclus dans chaque groupe pourrait être augmentée afin de mettre en évidence une ou des différence(s) statistique(s). Si un test paramétrique peut être utilisé, un test t de student sera utilisé pour comparer 2 groupes et une Anova avec test de Dunett sera utilisé pour comparer un groupe versus un groupe contrôle ou test de Newman-Keuls pour comparer des groupes entre eux 2 à 2. Si un test non paramétrique doit être utilisé, un test de Wilcoxon sera choisi pour comparer 2 groupes et un test de Kruskall-Wallis sera utilisé pour comparer n groupes versus un groupe contrôle et un test de Friedman pour comparer n groupes entre eux 2 à 2.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage en portoir ventilés autant que possible en groupes sociaux, seule la souris BKG non infectée (contrôle du bruit de fond de bioluminescence) sera isolée dès le début de l’étude, afin d’éviter une contamination par ses congénères. En cas d’agressivité, des enrichissements supplémentaires (cachette supplémentaire ainsi qu’un morceau de papier en cellulose de bois) seront ajoutés dans la cage afin de limiter au maximum l’agressivité et de ne pas avoir recours à l’isolement de l’animal agressif en première instance. En cas d’hébergement individuel, les cages seront organisées de manière à permettre à minima un contact visuel avec les animaux des cages adjacentes et un enrichissement supplémentaire pourra être apporté. Les actes techniques, en particulier ceux nécessitant une anesthésie des animaux seront, autant que possible, regroupés et limités à une fois par jour. Dans le cas où, toutefois, dans la même journée plusieurs anesthésie devraient avoir lieu, un gel oculaire serait appliqué afin de limiter le dessèchement cornéen. Au cours de ces études, pour éviter toute souffrance animale inutile, les animaux pourront être suivi par du personnel formé et qualifié jusqu’à trois fois par jour (poids, suivi clinique avec grille de scoring (décrites dans le § 3.3.2.2) et mesure de la température par puce implantée en sous-cutanée) en fonction de la virulence de la souche bactérienne inoculée ainsi que des stades de progression de l’infection. Cela permettra de détecter les stades précoces d’un état de santé dégradé et irrémédiable justifiant le recours à l’euthanasie éthique. Ce suivi renforcé pourra être complété par une visite vétérinaire. Le modèle voulant le développement d’une infection généralisée accompagnée d’une réaction inflammatoire, le recours aux analgésiques limitant l’inflammation ne pourra malheureusement pas être envisagé afin de ne pas biaiser le développement du modèle.
Choix des espèces
L’espèce souris a été choisie car c’est un modèle standard et polyvalent (multiplicité des souches disponibles dont certaines sans poils), régulièrement utilisé dans les études d’infections bactériennes. De plus, sa taille réduite permet l’utilisation de technique d’imagerie optique corps entier ce qui est cruciale pour le suivi d’une infection généralisée. Les souches de souris sans poils (immunocompétentes ou immunodéficientes) seront privilégiées dans le cas d’utilisation de souches bactériennes OGM bioluminescentes afin d’obtenir les résultats les plus pertinents (absence de la bioluminescence naturelle des poils donc augmentation de la sensibilité). Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes d’environ 6 à 7 semaines au moment du démarrage d’une étude. Ce stade de développement est celui habituellement utilisé pour ce type d’étude (pas de contrainte spécifique liée à l’âge) et permet d’avoir des animaux d’un poids d’environ 20g en s’affranchissant de la période de croissance.
Développement d’une approche générique pour la création et la production de vaccins vivants atténués de nouvelle génération contre les virus à génome ARN
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Hamsters dorés : 1170
Aucun animal ne sort du laboratoire de confinement de niveau 3 : 3 420 souris et 1 170 hamsters dorés y sont tués, dont 4 266 après des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent sous anesthésie une injection de souche virale atténuée, puis, pour les expériences de challenge, une seconde injection destinée à les infecter, avec les arénavirus, alphavirus, phlébovirus et flavivirus responsables de fièvres hémorragiques et d'encéphalites. Le porteur reconnaît comme effets attendus la douleur des injections et la maladie liée à la "virulence résiduelle" des souches, sans détailler davantage. Il affirme que l'étude de l'atténuation virale rend "indispensable" le recours à l'animal vivant et qu'"aucune méthode alternative ne peut le remplacer".
Objectifs
Ce projet propose de développer plusieurs approches pour la création de vaccins vivants atténués de nouvelle génération contre les virus à génome ARN du genre Arenavirus, Alphavirus, Phlébovirus et Flavivirus présentant un intérêt majeur en santé humaine car à l’origine d’une morbi-mortalité importante chaque année. En effet, les virus ciblés ici entraines des pathologies diverses chez l’homme mais fortement incapacitantes incluant comme symptômes une forte fièvre ou des douleurs articulaires qui peuvent dégénérer pour certains virus jusqu’à l’apparition d’une encéphalite voire d’une fièvre hémorragique ou d’un syndrome de choc qui peuvent être à l’origine de la mort du patient. L’étude de l’atténuation virale rend, de fait, indispensable le recours à l’animal vivant. Aucune méthode alternative ne peut le remplacer.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de participer aux recherches sur le développement de candidats vaccins et d’obtenir des données robustes pour leur potentielle utilisation chez l’Homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections de souches virales atténuées par différents types de voies (intramusculaire, intradermique, sous-cutanée, intrapéritonéale) sous anesthésie gazeuse. Une seule injection pour les études des propriétés biologiques des virus étudiés et l'évaluation de l'immunité induite par les souches virales injectées, deux injections pour les expériences de challenge vaccinal pendant lesquelles nous allons évaluer la protection des animaux immunisés (première injection) contre une infection (seconde injection). Les injections prendront 3 à 5 minutes. Des prélèvements sanguins seront aussi réalisés sur animal anesthésié (2-3 minutes).
Impact sur les animaux
Pour l’ensemble des procédures, les effets indésirables attendus reposeront sur la douleur et les lésions associées aux actes d'injection et à la pathologie virale développée après l’infection due à la virulence résiduelle des souches virales atténuées.
Devenir
Les expérimentations seront réalisées au sein d'un laboratoire de confinement de niveau 3 avec des virus à haut potentiel infectieux. Les animaux ne pourront donc pas être réutilisés, replacés ou adoptés.
Remplacement
Notre projet s'inscrit dans le cadre de la recherche vaccinale dont les essais précliniques sont nécessaires pour sélectionner les meilleurs candidats. L’utilisation d’animaux est indispensable car elle permet d’évaluer l’efficacité du candidat vaccin en condition réelle, mettant en jeu le système immunitaire complet d’un être vivant.
Réduction
Afin de réduire la quantité d'animaux sans compromettre les résultats de l'expérimentation, nous avons déterminé l’effectif nécessaire par des tests statistiques adaptés en se basant sur la littérature et notre expertise. Une étude poussée des souches virales employées in vitro et in silico permettra de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisées.
Raffinement
Un temps d’acclimatation sera respecté entre la réception des animaux et le début des procédures. Les animaux seront hébergés par groupes de 6 souris ou 4 hamsters, sans privation d’eau et de nourriture et les cages seront enrichies (carrés de cellulose pour la nidification et bâtons à ronger). Les animaux seront surveillés quotidiennement et une grille d’évaluation permettra un suivi du bien-être animal. Des points limites précoces seront établis et un traitement analgésique adapté sera administré aux animaux présentant des signes d’infection ou de douleur. Si des critères sévères sont atteints, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Mus musculus et Mesocricetus auratus sont des modèles de référence pour les virus étudiés. Ces modèles de rongeur sont permissifs à l'infection par ces virus et leur système immunitaire est assez proche de celui de l'Homme pour obtenir des données précliniques robustes sur des candidats vaccins. Les animaux utilisés seront agés de 3 à 12 semaines. Ces âges correspondent aux stades de développement des animaux utilisés par la communauté scientifique pour l'étude des virus utilisés dans le cadre de ce projet.
Approches vaccinales et thérapeutiques contre les virus du Nil occidental et Usutu
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Les souris qui perdent 20 % de leur poids sont mises à mort, celles qui en perdent 15 % reçoivent de la nourriture hydratée dans leur cage. 2 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 540 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de vaccin candidat ou d'anticorps dans l'abdomen, puis une injection du virus du Nil occidental sous la peau, un virus dont le porteur indique qu'il tue les souris sensibles en moins d'une semaine par atteintes neurologiques. Le projet vise des moyens de prévention qui n'existent aujourd'hui sous aucune forme approuvée, quand la mort par atteinte du système nerveux est, elle, le résultat attendu du protocole chez une partie des animaux.
Objectifs
Les seuls outils pour lutter contre le virus du Nil occidental (WNV), un arbovirus transmis par les moustiques, reposent sur des barrières protectrices passives, comprenant notamment les répulsifs anti-insectes et les vêtements de protection. À ce jour, il n'existe aucune prophylaxie ou traitement approuvé pour lutter contre ce virus responsable d'atteintes neurologiques potentiellement sévères chez l'homme (avec plusieurs centaines de décès répertoriés ces 5 dernières années). L'objectif de ce projet est de définir l'efficacité des vaccins candidats et de l'activité d'anticorps neutralisants le virus sélectionnés par les partenaires de notre consortium dans le cadre d'approches prophylactiques et thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Chaque année le virus WNV est responsable de la mort de plusieurs dizaines de personne en Europe et son ère d'extension ne cesse de s'étendre, tout comme le virus USUV. Malgré leur impact potentiel sur la santé humaine et vétérinaire, les mesures disponibles pour contrôler ces virus ou traiter les personnes infectées sont limitées. La gestion des arbovirus repose en grande partie sur des activités de surveillance intégrée qui permettent de mettre en œuvre des mesures principalement préventives en cas de detection de cas positifs. La situation épidémiologique de ces virus pourrait changer dans plusieurs régions européennes, passant d'épidémies irrégulières à l'endémicité. Cette situation nécessite des programmes de recherche afin de développer des stratégies vaccinales ou prophylactiques adaptées. Nous espérons ainsi au travers de notre consortium développer de nouveaux outils de lutte contre ces virus émergents. Le développement d'un vaccin et d'un traitement prophylactique est ainsi d'un interêt majeur en santé humaine.
Procédures
1 Injection de vaccins ou traitements d'anticorps neutralisants en intrapéritonéal. 1 Injection intradermique de virus. Les injections seront effectuées sur animaux vigiles en moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
Le virus virus du Nil occidental provoque la mort des souris immunocompétentes infectées moins d'une semaine après l'infection en raison d'atteintes neurologiques. De son côté le virus USUTU ne provoque que peu de symptomes chez ces animaux avec un taux de mortalité réduit (autour de 5%).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort
Remplacement
Une partie du projet avec les anticorps neutralisant sera réalisé sur des cellules afin de déterminer la capacité de ses anticorps à bloquer l'infection par les virus du Nil occidental et Usutu. Néanmoins pour évaluer l'efficacité du vaccin/traitement sur l'apparition des atteintes motrices et sur le taux de survie nous devons effectuer une validation sur des modèles murins. Ceci notamment en raison de la complexité de la réaction du système immunitaire à l'infection et à la réponse vaccinale et phrophylactique que les modèles cellulaires disponibles actuellement ne peuvent que très partiellement reproduire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé ici a été fixé en se basant notamment sur les publications utilisant les mêmes approches. Des analyses statistiques ont été employées afin d'utiliser le plus petit nombre d'animaux possible. Par ailleurs les mêmes animaux seront utilisés pour effectuer à la fois les analyses histochimiques et biochimiques. De surcroît, les expériences d’injections et l'euthanasie des animaux seront toujours effectués par le même utilisateur afin de limiter la variabilité expérimentale et minimiser le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le mélange de deux types de litières (sciure + copeaux) constitue un enrichissement permettant aux rongeurs de creuser ou de se cacher dans des textures différentes. Les animaux aurront aussi à disposition des frisottis. De petites plates-formes sur lesquelles ils peuvent grimper seront mises à leur disposition ainsi que des petites maisons. Une surveillance quotidienne accrue par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l'animalerie sera maintenue afin de réduire au maximum les risques de douleur et d'angoisse avec un suivi individuel des animaux selon les paramètres de masse corporelle, d'activité, de comportement et de signes cliniques. En cas de perte de poids égal ou supérieur à 15% et avant l'attente d'une perte de 20% du poids initial, point limite, il sera ajouté de la nourriture hydraté et disponible ad libitum dans la cage. En cas d'atteinte d'un des points limites, en accord avec le personnel qualifié, le protocole sera immédiatement stoppé pour ces animaux qui seront euthanasiés.
Choix des espèces
Certains modèles cellulaires nous permettent d’effectuer des analyses partielles de nos traitements et vaccins, mais étant donné la complexité du système immunitaire et de l'infection virale, une étude in vivo est indispensable afin de valider nos hypothèses. L’étude se fera sur des souris sensibles aux virus du Nil occidental et usutu, ainsi que sur une autre souche de souris beaucoup plus sensibles aux infections virales. Nous utiliserons des souris de 4 semaines (âge habituellement utilisé pour les modèles infectieux des arbovirus) et sur des souris plus âgée (1 an) afin de voir l'effet de la sénescence du système immunitaire sur l'efficacité de ces traitements. En effet les patients les plus âgés sont les plus sensibles à l'infection par ces virus.
Étude de l’effet d’un virus provenant de chauve-souris australienne sur l’infection des souris.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Choisies parce que leur système immunitaire ne fonctionne pas complètement et utilisées avant six semaines, avant sa maturité, 100 souris reçoivent un virus de chauve-souris australienne par injection dans le cerveau, dans l'abdomen ou par inhalation d'une goutte. Quatre-vingt-seize d'entre elles relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées à la fin du protocole. Le porteur attend pour le groupe injecté dans le crâne des tremblements, une paralysie, une perte d'équilibre et "probablement la mort des animaux", et fixe comme point limite tout signe neurologique, coté 2 d'emblée. Il écrit par ailleurs que les injections n'induiront "pas plus qu'une gêne mineure de courte durée".
Objectifs
Les virus de la famille des henipavirus représentent un risque important pour la santé humaine et sont classés dans la liste des virus dangereux prioritaires de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Seul deux virus de cette famille sont connus comme étant très dangereux pour l'homme ; il s’agit des virus Nipah et Hendra, responsables d’infections touchant les systèmes nerveux (cerveau) et pulmonaires et qui sont souvent mortelles (75-100% de mortalité). Ces virus sont portés dans la nature par les grandes chauves-souris frugivores d'Asie, chez qui ils n’engendrent à priori pas de maladie. Il n’existe à l’heure actuelle ni vaccin, ni traitement, ces virus sont donc classés au plus haut niveau de sécurité biologique. De ce fait, les recherches menées sur ces virus sont donc de grande importance comme le souligne l'OMS, mais limitées et extrêmement onéreuses de par la nécessité d'utiliser de laboratoire de très haute sécurité. En 2012, un autre virus a été identifié chez des chauves–souris frugivores en Australie sans être responsable de maladie chez l'homme (le virus Cedar), les analyses ultérieures ont montré des différences importantes avec Nipah et Hendra qui explique son innocuité. Ainsi l’absence dans les cellules de plusieurs mécanismes de contrôles de la réponse immunitaire fait de ce virus un modèle intéressant pour étudier Nipah et Hendra sans toutefois présenter un risque biologique élevé pour la population. Ce virus a démontré une réplication extrêmement limitée chez plusieurs espèces (cobayes, souris, hamster, furet) associée à une absence de symptômes ce qui justifie son utilisation dans des conditions de confinement limité. Nous proposons ici d’étudier ce virus chez la souris déficiente pour une partie de son système immunitaire afin de pouvoir disposer d’un modèle de niveau de sécurité biologique modéré permettant l’étude des henipavirus. Ce modèle nous permettra d’analyser les cibles cellulaires du virus et comprendre son interaction avec l’organisme. Nous pourrons l’utiliser par la suite comme modèle pour l’évaluation de médicament en validant des preuves de concept. Il s’agira ici d’une initiative pionnière car aucun modèle de ce type n’existe à l’heure actuelle. Notre objectif principal est donc la caractérisation de ce nouveau virus et de ces effets chez l'animal afin de développer de nouveaux traitements contre les henipavirus.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra tout d’abord de comprendre les cibles cellulaires de ce virus dans ce modèle de souris. De plus, nous pourrons étudier la réponse immunitaire de la souris à ce virus et la comparer à celle que nous avons caractérisée contre les virus plus dangereux de la même famille. Nous pourrons ainsi mieux comprendre comment ces virus échappent le contrôle par la réponse immunitaire humaine. De plus, ce projet permettra d’établir un modèle utilisable pour évaluer médicaments et vaccins dans des animaleries conventionnelles avant d'avoir recours à des animaleries de haute sécurité.
Procédures
Dans les procédures 1 et 2, les animaux seront soumis à des injections dans le cerveau (32 souris, 1 minute / animal), dans l'abdomen (32 souris, 30 secondes / animal) ou l'inhalation d'une goutte de virus (32 souris, 30 secondes / animal). Dans la procédure 1, une prise de sang sera réalisée en piquant avec une aiguille en dessous de la mâchoire (48 animaux, 30 secondes / animal). De plus 4 animaux seront injectés avec une solution saline inerte (PBS) comme controle. Dans tous les cas, les actes d'injections seront réalisés sous anesthésie ainsi que les prélèvements sanguins sous mandibulaires et intracardiaques terminaux. Les injections réalisées auront peu d'impact sur la santé des animaux et il n'est pas attendu plus qu'une gêne mineure de courte durée.
Impact sur les animaux
Il est attendu selon les groupes l’apparition potentielle de paralysie, de tremblements, de vertige ou de symptômes respiratoires. Dans les cas des animaux IFNAR KO il est attendu, au minimum pour le groupe « injection intracraniale », l’apparition de symptômes neurologiques sévère tels que tremblements, paralysie et perte d'équilibre et probablement la mort des animaux. Dans les cas des infections intranasal ou intrapéritonéal, il est également possible qu'une atteinte neurologique sévère soit possible mais également des difficultés respiratoires mineures (atteintes pulmonaires) et une éventuelle perte de poids modérée. Dans tous les cas, il n'est pas attendu que les différentes injections induisent plus qu'une gêne mineure de courte durée. L'administration intranasale indura une gêne très légère et de très courte durée (inférieure à une minute). Le prélèvement de sang intermédiaire à J3 sera réalisé sous anesthésie gazeuse par piqure sous-mandibulaire avec une lancette et récolte de la goutte de sang avec un capillaire, cette étape n'induira pas de gène étant réalisé sous anesthésie.
Devenir
Les animaux étant infectés par un virus, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du protocole.
Remplacement
Il existe de nombreux modèles de culture in vitro ou ex vivo complexes dérivés de la culture cellulaire ou de l'animal pour cultiver les virus. Ces méthodes tendent à recréer artificiellement les interactions cellulaires que nous pouvons retrouver dans un organisme mais ne permettent pas de se focaliser sur un organe ou un organisme vivant entier (système immunitaire, flux sanguin, voies lymphatiques, ). Ces tests ne permettent pas de répondre à des questions globales, tels que la dissémination dans l'organisme, la mise en place de la pathologie ou bien encore les différentes réponses immunitaires. Ainsi l'étude de la physiopathologie d'un virus passe donc encore obligatoirement par l'utilisation d'un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons 8 animaux par groupe pour les protocoles infectieux (mâles et femelles) afin de garantir une fiabilité de nos résultats (notamment la comparaison avec des tests statistiques). Nous réaliserons les expériences de façon séquentielle, tout d’abord une première expérience exploratoire dans des souris au système immunitaire déficient et si cette expérience ne donne pas de résultats exploitables (pas de réplication du virus) alors l’ensemble du projet est arrêté.
Raffinement
Le personnel participant à cette étude aura été formé en interne à l’observation des signes de la maladie et à la cotation dans les grilles de score. Ces grilles contiennent différents aspects à quantifier (0, +1 ou +2) selon la gravité des symptômes observés. La grille évalue l'apparence, la perte de poids et la présence de syndrome neurologique. Pour l'apparence, un aspect normal sera coté 0, le poil ébouriffé, une expression faciale modéré, des mouvements réduits seront coté 1. Un dos vouté, une expression faciale sévère, ou l'absence de mouvement sera coté 2. Une perte de poids
Choix des espèces
Nous cherchons ici à caractériser le modèle de souris dont le système immunitaire ne fonctionne pas complétement en comparaison de souris normales. Nous utiliserons des souris car ces petits mammifères sont tous très similaires (grande lien de parenté) et de nombreux outils sont disponibles pour les étudier. Nous utiliserons des animaux jeunes de moins de 6 semaines, dont le système immunitaire n’est pas complètement mature, afin de se mettre dans des conditions les plus favorables pour le développement de l'infection virale, ce qui nous permettra la mise en place d’un modèle de petit animal d’étude de la pathogénèse virale.
Production en routine de parasites Plasmodium pour des tests in vitro à l’aide d’un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Infectées par le paludisme puis exposées quarante-cinq minutes durant aux piqûres de moustiques, une partie des 860 souris de ce projet est utilisée pour faire circuler le parasite entre rongeur et insecte. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, avec un affaiblissement et une anémie liés à l'infection, et des prises de sang tous les un à deux jours sur animal vigile. Le porteur présente pourtant cette production de parasites comme "une solution de remplacement", au motif que les sporozoïtes ainsi obtenus alimentent des cultures cellulaires qui auraient sinon exigé davantage d'animaux. Toutes sont tuées, les unes sous anesthésie au moment du prélèvement terminal destiné aux stocks congelés, les autres pour éviter qu'elles n'atteignent les points limites de l'infection.
Objectifs
L'objectif du projet est de produire des sporozoïtes de Plasmodium, les formes transmises par le moustique de l'agent du paludisme, à l'aide de modèles murins d'infection par Plasmodium yoelii et Plasmodium berghei. Les sporozoïtes produits serviront à des études in vitro en modèles cellulaires des stades pré-érythrocytaires de ces parasites. Ces études in vitro sont nécessaires pour mieux comprendre la biologie de ces parasites et les mécanismes d'infection, et pour évaluer l’activité de nouvelles molécules antipaludiques ou optimiser l’activité de molécules existantes. Les modèles d’études in vitro reposent sur l’infection de cellules hépatiques par des sporozoïtes isolés à partir de moustiques Anopheles préalablement infectés à partir de souris infectées. Ces modèles d’infection in vitro de cellules hépatiques par les parasites de rongeur P. yoelii et P. berghei reproduisent de nombreux aspects de la biologie des espèces de Plasmodium infectant l'homme, et permettent d’étudier le rôle de facteurs parasitaires ou de l’hôte au cours de l’infection, notamment à l’aide de parasites génétiquement modifiés, ainsi que d’évaluer l’efficacité de molécules à visée antiplasmodiale.
Bénéfices attendus
Le paludisme, avec près de 250 millions de cas annuels et plus de 600 000 décès, pour la plupart des enfants de moins de cinq ans, reste un problème majeur de santé publique. Ce projet, nécessaire pour assurer la production régulière des lots de sporozoïtes requis pour les études in vitro menées dans le laboratoire, devrait permettre d'améliorer nos connaissance des mécanismes fondamentaux d'infection par Plasmodium, afin de définir des cibles thérapeutiques et vaccinales innovantes et de permettre l’évaluation de l’activité de molécules à visée antiplasmodiale dans le but d’élaborer ou d’optimiser de nouveaux traitements antipaludiques.
Procédures
Un premier groupe d'animaux est engagé dans des protocoles de production de parasites pour la congélation, destinés à l'infection standardisée d'autres souris. Ces animaux seront soumis à une injection intra-veineuse unique d’une suspension de sporozoïtes de Plasmodium (durée d'environ 15 secondes, sous anesthésie gazeuse), puis seront soumis à des prélèvement d'une goutte de sang tous les 1 à 2 jours à partir du 4ème jour post inoculation des parasites, pendant au maximum 7 jours (durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles). Ces animaux seront finalement soumis à un ultime prélèvement de sang, sous anesthésie et analgésie, pour la constitution des stocks de parasites cryopréservés (acte unique, durée 10 minutes), et euthanasiés avant leur réveil à l'issu de ce prélèvement. Un autre groupe d'animaux sera engagé dans des protocoles de transmission du parasite plasmodium aux moustiques. Ces animaux seront soumis une à injection intrapéritonéale de parasites (1 injection unique de parasites issus des stocks cryopréservés/standardisé, préparés à partir du premier groupe d'animaux ; durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), puis seront soumis à des prélèvement d'une goutte de sang par jour à partir du 3ème jour post inoculation des parasites, pendant au maximum 3 jours (durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles). Ces animaux seront finalement exposés à des piqûres de moustiques pour transmettre les parasites aux moustiques (acte unique réalisé sous anesthésie et analgésie, durée 45 minutes), puis euthanasiés avant leur réveil.
Impact sur les animaux
Stress lié à la préhension/contention, douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales sur animaux vigiles, douleur de courte durée lors des prélèvements sur animaux vigiles, risques associés à l'anesthésie (hypothermie, détresse respiratoire), contraintes liées à l'infection elle-même (affaiblissement, anémie).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour la constitution des cryostocks de parasites dans le cadre de ce projet, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.
Remplacement
Ce projet vise à produire les parasites au stade sporozoïtes, nécessaires à des expérimentations in vitro pour étudier les stades préérythrocytaires du paludisme. Il s’agit d’une solution de remplacement puisque les expériences menées in vitro à partir de chaque lot de sporozoïte produit permettent de collecter de façon très robuste et reproductible de nombreuses données pour lesquelles il aurait été nécessaire d’utiliser un bien plus grand nombre d’animaux si l’on avait cherché à collecter ses données à partir d’expériences menées in vivo, chez la souris. En particulier, l’utilisation de systèmes de cultures cellulaires (lignées hépatocytaires et hépatocytes primaires) permet d‘analyser l'infection des cellules du foie par les parasites provenant des moustiques infectés. Si quelques protocoles décrivent la production axénique des sporozoïtes de Plasmodium, ils ne permettent malheureusement toujours pas de produire des sporozoïtes complètement matures et infectieux. Les protocoles décrivant la production des sporozoïtes de Plasmodium de rongeurs reposent de plus sur l’utilisation de gamétocytes (formes sexuées mâles et femelles), donc de stade sanguin, pour lesquels il n’existe pas de méthode de culture continue in vitro, et requièrent donc leur production chez l’animal.
Réduction
Au total ce projet utilisera 860 souris sur une durée de 5 ans. Ce nombre a été réduit au minimum pour permettre de réaliser les prélèvements nécessaires à la constitution des stocks de parasites et à l’infection des lots de moustiques nécessaires à la production des sporozoïtes destinés aux études in vitro sur 5 ans. Ces protocoles de production de parasites n'impliquent pas de tests statistiques. Le calcul des effectifs d'animaux nécessaires s'appuit sur une expérience de l'équipe acquise depuis plus de vingt ans dans la réalisation de ces protocoles.
Raffinement
Afin de contribuer au raffinement des procédures, les animaux sont hébergés avec leurs congénères (2 à 5 par cage) dans un milieu enrichi (lanières de papier Kraft ou équivalent). Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur ou le stress (inoculation de parasites par injection intraveineuse et expériences de transmission aux moustiques notamment). La présence de points limites définis permet d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection, en particulier lors de l’infection par le parasite de rongeur Plasmodium berghei, les souches de Plasmodium yoelii n’engendrant quant à elles que peu de symptômes. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, pour vérifier l’apparence et l’état clinique des animaux, la prise alimentaire et hydrique ainsi que leur comportement, afin de détecter toute modification suggérant une douleur, une souffrance ou une détresse.
Choix des espèces
Le modèle d'infection chez la souris par les parasites de rongeur Plasmodium yoelii et P. berghei reproduit de multiples aspects de l'infection par les parasites du genre Plasmodium, responsables du paludisme chez l'Homme. Ce modèle permet l'infection du foie par les sporozoïtes (la forme infectieuse du parasite transmise lors de la piqure d'un moustique infecté), une croissance parasitaire sanguine et la transmission de ces parasites aux moustiques pour la production de sporozoïtes infectieux selon le même schéma que ce qui est décrit chez l'Homme. L’infection in vitro de cellules hépatiques par des sporozoïtes de ces espèces parasitaires représente un modèle pertinent pour étudier la biologie des stades précoces du paludisme dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et vaccinales, et d’évaluer l’activité de molécules à visée antipaludique dans le but de développer de nouveaux médicaments. Dans ce projet, des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures sont utilisées, conformément aux protocoles classiques utilisés dans ce type d'étude.
Evaluation de nouvelles molécules dans un modèle murin de tuberculose par infection intranasale
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Des traitements administrés jusqu'à quatre fois par jour pendant six mois attendent 5 370 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour prélèvements post mortem. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'une suspension bactérienne déposée dans les narines sous anesthésie, geste que le porteur décrit comme non invasif tout en signalant qu'il peut entraîner une détresse respiratoire. Les souris non traitées développent la maladie et peuvent perdre du poids, l'objectif affiché étant de raccourcir un traitement humain de six mois et de contourner les résistances aux antibiotiques. Trois lignées sont utilisées, dont des souris nude, immunodéficientes, choisies pour mimer la co-infection par le VIH et présentées comme porteuses d'un "phénotype dommageable".
Objectifs
La tuberculose est une infection due aux bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis. Elle touche encore annuellement 10 millions de personnes dans le monde et provoque 1,5 millions de décès. Le traitement repose actuellement sur l’association de 4 antibiotiques sur une durée de 6 mois. La longueur et la complexité du traitement ainsi que l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques sont des causes d’échec. Dans ce contexte, le but de nos travaux de recherche est 1) de mettre au point de nouvelles stratégies thérapeutiques antibiotiques permettant de simplifier le traitement et d’être actif contre les souches ayant développé une résistance aux antituberculeux existants et 2) de mieux comprendre les mécanismes in vivo de virulence et d’émergence de résistance aux traitements. Ces types d’études sont longues voire impossibles à conduire chez l’homme. Le modèle murin permet donc de tester différentes hypothèses qui peuvent ensuite être confirmées chez l’homme voir même utilisées directement. Notre projet recouvre ainsi l’ensemble des expérimentations à réaliser in vivo dans le modèle murin pour étudier les mécanismes de virulence, d’émergence de résistance et évaluer l’activité des traitements.
Bénéfices attendus
La tuberculose touche encore annuellement 10 millions de personnes dans le monde et provoque 1,5 millions de décès. Le traitement repose actuellement sur l’association de 4 antibiotiques sur une durée de 6 mois. La longueur et la complexité du traitement ainsi que l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques sont des causes d’échec. Ce projet vise à évaluer de nouvelles molécules qui pourraient diminuer la durée du traitement ainsi que la fréquence de prise des antibiotiques et élaborer des stratégies pour réduire le risque d’échec due aux mutants résistants aux antibiotiques.
Procédures
Les animaux seront infectés par instillation intranasale (1 instillation par animal) afin de créer une infection bactérienne. Les animaux seront anesthésiés 1 fois avant instillation. La suspension bactérienne sera ensuite déposée au niveau des narines de l'animal anesthésié pour que la suspension soit inhalée lors de la respiration (geste d'une minute). Pour les traitements, les animaux vigiles seront maintenus en contention manuelle puis traités par voie orale ou sous cutanée (fréquence de 1 à 4 fois par jour sur 1 à 7 jours pour une durée de 1 à 6 mois) (geste de 30 secondes) . Pour les prélèvements sanguins qui ne concernera pas tous les animaux, les souris vigiles seront tenues en contention manuelle et un petit volume de sang sera prélevé (geste de 15 secondes). A la fin du prélèvement, une pression sera effectuée pour arrêter le saignement (geste de 30 secondes). Les animaux ne subiront qu’un seul prélèvement au cours de la cinétique. Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de suivi conformément au protocole ou en anticipé en cas d’atteinte de point limite.
Impact sur les animaux
Lors de l’instillation intranasale, les animaux seront anesthésiés ce qui pourrait engendrer un stress thermique. Une douleur de courte durée liée à la piqûre de l’aiguille peut être ressentie par l’animal. La suspension à inoculer sera ensuite déposée au niveau des narines de l’animal anesthésié, sans geste invasif mais pouvant entraîner une détresse respiratoire. Les souris non traitées vont par la suite développer une tuberculose. L’évolution de la maladie peut engendrer une perte de poids et seules les souris des groupes non traités pourront donc présenter une perte de poids. L’administration des traitements se fera par administration orale sur animaux vigiles maintenus par une contention. Ces administrations pourront induire un stress en raison de la contention nécessaire. Enfin, les prélèvements de sang pourraient aussi être générateurs de stress et de douleur de courte durée due à la piqûre lors du prélèvement et entrainer un hématome. Les souris nude présentent un phénotype dommageable, elles sont immunodéficientes et peuvent donc être plus sensibles aux infections.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux à la fin de la procédure.
Remplacement
L’ensemble du projet vise à mesurer l’activité de nouvelles molécules afin d’améliorer le traitement de la tuberculose chez l’homme. En effet, les tests in vitro de mesure de l’activité d’antibiotiques contre le bacille tuberculeux menés en amont de notre projet ne prennent en compte que la bactérie et pas la réponse de l’hôte dans son ensemble. Il est donc nécessaire d’avoir recours au modèle murin avant de débuter un essai clinique chez l’homme.
Réduction
Le projet impliquera au plus un total de 5370 animaux. Les hypothèses testées dans le modèle murin seront uniquement celles qui ont franchi les étapes de sélection dans les modèles in vitro réalisés en amont. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum par groupe permettant de conserver une puissance statistique suffisante pour répondre aux problématiques. Notre projet utilisant une voie d’instillation en intranasal celle-ci permet de réduire la variabilité inter animale et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires dans les expériences.
Raffinement
Les procédures ont été établies dans le respect du bien-être animal en limitant la douleur (utilisation d’une analgésie et anesthésie quand cela est nécessaire) et le stress (période d’acclimatation, gestes réalisés par des personnes formées). Les animaux seront hébergés dans un niveau de confinement 3 et leurs conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation. Une période d’acclimatation d’une semaine est observée avant le début des expériences. Les animaux seront hébergés par 5 et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; un enrichissement sera proposé sous forme de lanières de kraft ou de coton (en fonction des procédures de l’animalerie dont dépend ce projet). L’animalerie dispose d’un cycle nycthéméral, d’une hygrométrie et de température surveillées. Les animaux sont suivis quotidiennement et des points limites ont été définis pour garantir le bien-être des animaux pendant toute la durée du projet.
Choix des espèces
Le modèle murin est utilisé depuis plus de 50 ans pour l’évaluation des antituberculeux. Il permet une prédiction de l’efficacité des antituberculeux chez l’homme car la pharmacocinétique choisie chez l’animal est équivalente à celle obtenue chez l’homme aux doses habituelles des antituberculeux. La variété des profils de résistance limite la reproductibilité d’études cliniques et la longueur des essais (supérieur ou égal à 10 ans) est aussi une limite à l’étude chez l’homme. En parallèle, les études in vitro ne renseignent que sur le versant de la bactérie mais pas sur celui l’hôte. Le modèle murin permet donc une évaluation plus courte et reproductible in vivo. Afin réduire la variabilité et donc mieux mettre en évidence les différences dans les études les souris consanguines balbc sont utilisées (3R : réduction et raffinement). Dans les étapes pré-cliniques et pour permettre de mimer la variabilité observée chez l’humain, les souris swiss non consanguines sont utilisées. Enfin, la co-infection tuberculose et VIH étant une problématique majeure de santé publique avec des enjeux spécifiques, pour mimer l’immunodépression, les souris nude sont utilisées. Tous les animaux auront 4 semaines à leur arrivée et entreront en procédure après une semaine d'acclimatation soit à 5 semaines.
Production de souris humanisées pour le système immunitaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Des souriceaux nouveau-nés, des souris juvéniles sevrées et des femelles gestantes sont commandés selon la demande d'utilisateurs académiques et industriels. 5 120 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, irradiées 218 secondes ou traitées chimiquement, puis greffées par injection de cellules souches humaines sous anesthésie. Environ 80 % passent le contrôle qualité et sont expédiées vivantes aux utilisateurs finaux qui poursuivront les expériences, les autres sont tuées dans les jours qui suivent puisqu'elles ne sont plus utilisables. Le porteur présente cette production de souris humanisées comme un "service" et la range dans la règle des 3R, au motif que ces animaux réduiraient le nombre d'individus utilisés plus tard.
Objectifs
Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules souches humaines capables de générer un système immunitaire humain. Le recours à ces souris humanisées permet de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine. Les objectifs du présent projet sont de générer une gamme de souris humanisées pour le système immunitaire afin de les distribuer à un large panel d’utilisateurs finaux (académiques et industriels) aussi bien dans une perspective de recherche fondamentale que d’évaluation préclinique industrielle dans des domaines tels que l’hématopoïèse, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccinologie, l’oncologie… Ce projet couvrira la génération de souris humanisées déjà validées en tant que "service" et également la génération de nouveaux modèles immunodéficients humanisés en tant que projet « nouveaux modèles en Recherche et Développement "R&D" ». Ceci permettra d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.
Bénéfices attendus
Le recours à ces souris humanisées devrait permettre de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine (souris humanisées pour des composants cellulaires et moléculaires du système hématolymphoïde).
Procédures
Procédure 1: Afin de rendre les souris permissives à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux immunodéficients seront soit injectés avec une molécule chimique (1 injection par jour pendant 2 jours d’une durée de 30 secondes), soit irradiés 1 seule fois pendant 218 secondes afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques puis, immédiatement traité avec un antibiotique pendant 2 semaines, dans le but de prévenir toute infection. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection intraveineuse de cellules souches humaines, et ce, après anesthésie générale gazeuse. Cette intervention dure 3 min pour la phase d’endormissement et 30 secondes pour la phase d’injection. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera suite à un unique prélèvement sanguin sur souris vigiles pour la partie « Service », ou suite à 9 prélèvements sanguins, toutes les 3 semaines sur une période de 23 semaines pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D". Le prélèvement sanguin dure 30 secondes par souris. Procédure 2: Afin de rendre les souriceaux permissifs à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux seront irradiés 1 seule fois (durée irradiation dépendante de la souche de la souris) afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection de cellules souches humaines dans le foie. Un prélèvement de phalange sera réalisé afin de permettre leur identification ainsi que leur génotypage. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera à l’aide de prélèvement sanguin à entre 9 et 12 semaines après l’humanisation.
Impact sur les animaux
Les effets néfastes du pré-conditionnement apparaissent sur environ 5% des animaux adultes humanisés et tardivement (6 mois après la greffe de cellules souches humaine). Ils se manifestent souvent par une perte de poids et une modification de l’apparence (extrémités blanches) et du comportement naturel de l’animal (animal sans énergie). Les animaux seront surveillés quotidiennement pour prévenir tout inconfort animal et prendre la décision appropriée selon notre grille d’évaluation de projet. Notre surveillance sera donc accentuée à 6 mois notamment pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D" » puisque les souris seront observées jusqu’à 32 semaines. De plus, du stress pourra être généré lors des prises de sang et du transport des animaux vers les utilisateurs finaux.
Devenir
Pour le Service : Tous les animaux humanisés validés par le ‘contrôle qualité’ soit environ 80% des animaux produits, présentant une proportion sanguine de leucocytes d’origine humaine >20% des leucocytes totaux sont expédiés aux utilisateurs finaux (utilisation continue chez l'utilisateur final). Les animaux ne satisfaisant pas le critère requis sont écartés de tout groupe expérimental ultérieur. Ces animaux sont mis à mort dans les jours suivants le contrôle qualité car ils ne pourront plus être utilisés dans d'autres protocoles expérimentaux. Pour les nouveaux modèles : A l’issue des 32 semaines, les animaux seront mis à mort pour caractérisation du système immunitaire reconstitué (=humain).
Remplacement
Ce projet vise à produire des souris humanisées comme modèle expérimental préclinique à destination d’utilisateurs finaux des secteurs académique et industriel. Un tel modèle correspond à une attente forte pour pouvoir tester de nouvelles approches thérapeutiques transposables à l’Homme. En proposant comme modèle la souris humanisée pour le système immunitaire, nous offrons la possibilité d’utiliser un modèle expérimental préclinique permettant le criblage d’approches thérapeutiques directement adaptées à la situation humaine. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine sans avoir recours aux modèles de primates non humains.
Réduction
Nous réalisons le projet d’humanisation en fonction des besoins exprimés ou pressentis de nos partenaires utilisateurs finaux. De plus, notre savoir-faire et l’optimisation de nos protocoles permettent d’utiliser peu d’animaux pour un rendement maximum. En exprimant le système immunitaire humain, la souris humanisée permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire dans ses applications ultérieures. Grâce au contrôle qualité systématique sur chaque souris implantée et au retour d’expérience qui en découle, nous optimisons sans cesse notre modèle de souris humanisée pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux à implanter pour obtenir le nombre de souris humanisée souhaité. De plus, la génération de nouvelles lignées humanisées permettra de se rapprocher au plus près du système immunitaire humain et d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera également à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Nous veillerons au bienêtre animal par une surveillance quotidienne des animaux par du personnel qualifié. Tout fait notable sera consigné sur une grille de score évaluant la souffrance et le stress des animaux. Les points limites sont clairement déterminés et les animaux identifiés par une alerte feront l’objet d’une surveillance accrue et des actions seront mises en place pour palier à divers problèmes tels qu’une observation bijournalière par le personnel expérimentateur ; l’ajout de gel Diet, l’ajout de coton…
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. De plus, les conditions zootechniques actuelle et le niveau d’ingénierie génétique des souris de laboratoire sont tels qu’il est possible de construire à façon, des lignées profondément immunodéficientes, une condition sine qua non pour une prise efficace et durable de xénogreffe hématopoïétique humaine. L’âge des animaux au moment de leur inclusion dans le présent projet dépendra de la demande et de l’objectif scientifique de l’utilisateur final. Le projet pourra donc utiliser aussi bien des souriceaux nouveaux nés que des souris juvéniles après sevrage (4 à 5 semaines). Les doses, volumes et voies d’administration seront adaptés au stade de développement des animaux utilisés. Dans le cas de la procédure 1 nous pourrons : recevoir directement des souris sevrées avant envoie (juvénile) ; ou recevoir des femelles gestantes et réaliser la procédure sur les nouveau-nés une fois l’âge de 4 à 5 semaines atteint.