Maladies infectieuses

Infectées sous anesthésie par Mycobacterium abscessus, puis soumises pour certaines à une ou deux injections quotidiennes d'antibiotiques pendant dix jours, 2 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées, au plus tard trente jours après l'infection, pour mesurer la charge bactérienne dans leurs organes. Le porteur écrit que la bactérie persiste plusieurs semaines "sans donner de signes de maladie", et décrit par ailleurs des injections répétées susceptibles de provoquer un grattage, une inflammation locale ou une plaie. Il ajoute que l'impact de ces injections sur le bien-être des souris sera évalué au cours de deux expériences préliminaires, menées sur des souris elles aussi injectées.

Objectifs

Mycobacterium abscessus est une bactérie responsable d'infections chroniques et de la détérioration des poumons chez les patients atteints de mucoviscidose ou d’autres affections pulmonaires. L'éradication de cette bactérie est extrêmement difficile car elle est résistante à un large éventail d'antibiotiques. Le traitement de la maladie pulmonaire causée par cette bactérie nécessite l'administration à long terme de plusieurs antibiotiques, ce qui entraîne des effets indésirables graves. Cependant, même les antibiotiques cliniquement pertinents ne sont pas très efficaces et l'infection à Mycobacterium abscessus est toujours considérée comme une maladie chronique incurable pour la plupart des patients, ce qui souligne le besoin urgent de développer des stratégies thérapeutiques alternatives. Au-delà de la résistance, nous émettons l'hypothèse que la tolérance aux antibiotiques, c’est-à-dire la capacité à survivre aux antibiotiques pendant une période de temps plus ou moins longue, contribue également aux mauvais résultats du traitement des infections à Mycobacterium abscessus. La tolérance est un phénomène adaptatif en réponse à des conditions de stress environnemental. Plusieurs études chez différents pathogènes bactériens ont établi que la tolérance aux antibiotiques a des implications cliniques importantes dans la gestion des infections chroniques, car elle contribue à allonger la durée du traitement antibiotique, à l'échec du traitement et à la rechute des infections chroniques, et à l'émergence de mutations conférant la résistance aux médicaments. Cependant les fonctions et adaptations qui contribuent à la tolérance aux antibiotiques chez Mycobacterium abscessus restent largement méconnues. Ce projet s’inscrit dans ce contexte et vise 1) à identifier les fonctions et adaptations bactériennes qui favorisent la tolérance aux antibiotiques chez cette bactérie lors de l’infection, 2) à tester si les traitements antibiotiques in vitro et chez les patients sélectionnent des bactéries qui survivent mieux aux antibiotiques et si ces bactéries ont un comportement différent chez l’hôte, et 3) à évaluer si bloquer les fonctions contribuant à la tolérance augmentent l’efficacité des traitements in vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'acquérir de nouvelles connaissances scientifiques sur la tolérance aux médicaments chez Mycobacterium abscessus et le lien entre la tolérance et la persistance chez l’hôte traité ou non-traité. Les résultats attendus devraient également fournir des informations sur l'effet synergique de la réponse immunitaire et des antibiotiques sur des souches recombinantes de Mycobacterium abscessus altérées pour la tolérance aux médicaments. Ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques intéressantes contre les infections mycobactériennes dans le but de réduire leur durée.

Procédures

Tous les animaux seront anesthésiés avant d’être infectés (durée 2 à 3 minutes). Les bactéries utilisées persistent dans les organes pendant quelques semaines sans donner de signes de maladie chez les animaux infectés. La durée de l'expérience n’excèdera pas 30 jours. Certains groupes d'animaux recevront quotidiennement une ou deux doses d’antibiotiques administrée(s) par injection sur des animaux vigiles (durée 1 minute) pendant une durée maximale de 10 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus à deux niveaux dans nos expériences: 1) lors de l’anesthésie et de l’infection des animaux, et 2) lors des traitements antibiotiques (effets secondaires). Pour le 1er niveau, il s’agit de nuisances modérées (piqûre et contention) d’une durée d’environ 1 min/injection. Enfin, concernant les antibiotiques, les animaux subiront une ou deux injections quotidiennes (1min/injection) pendant 10 jours. Si plusieurs antibiotiques sont utilisés, ils seront injectés en même temps dans 1 injection. L’impact de ces injections sur le bien-être des animaux sera évalué lors d’expériences préliminaires mais les injections répétées pourraient conduire à un grattage, une inflammation locale ou une plaie. Le niveau attendue de ces nuisances est modéré.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour évaluer la charge bactérienne dans différents organes.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas à l’heure actuelle de rendre compte de la totalité des étapes de l’infection d’un hôte par les mycobactéries pathogènes, tel que Mycobacterium abscessus. Ainsi il n’existe aucun modèle cellulaire pertinent pour l’étude des phases tardives de l’infection telles que la persistance ou la transmission et pour l'étude de la réponse bactérienne aux stress rencontrés dans celles-ci. Le modèle animal est donc incontournable à l’heure actuelle. Dans ce contexte, le modèle animal le plus couramment utilisé est le modèle souris. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique bon nombre des observations faites chez l’homme.

Réduction

Les différentes phases du projet seront suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats. Nos expériences antérieures nous ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Toutes les expériences impliquant des animaux font l’objet d’un protocole expérimental écrit et validé par le responsable de l’animalerie. Nous utilisons des lots d’animaux homogènes pour réduire la variabilité.

Raffinement

Des mesures seront prises pour réduire au minimum les nuisances: anesthésie et analgésie lors de l’infection, limitation au minimum des temps de contention lors de l'infection et des injections d’antibiotiques, surveillance accrue après chaque geste, mise en place d'une grille de scoring et de points limites précoces. Pour l’expérience impliquant une injection quotidienne d’antibiotique, nous réaliserons deux expériences préliminaires pour évaluer le stress et la contrainte sur les animaux. Au cours de ces expériences préliminaires, nous déterminerons le temps le plus précoce auquel un effet des antibiotiques est détecté. Un suivi particulier des animaux sera réalisé pour évaluer les nuisances associées à ces injections et d’éventuelles réactions secondaires : inflammation locale, grattage, plaie. Les injections seront réalisées en alternance sur 4 sites des flancs avec des seringues à insuline. En première intention, les injections seront réalisées sur animaux vigiles (rapidité et absence d’hypothermie). En cas de stress important des animaux, nous pourrons utiliser un anesthésique.

Choix des espèces

Pour notre projet visant à étudier la persistance en présence ou absence d’antibiotiques, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'existence et de l'excellente caractérisation des fonds génétiques de résistances variables à la pathologie, ii) du fort degré de convergence avec les paramètres de l'immunité protectrice chez l'homme, iii) de la prédominance des outils d'analyse (réactifs immunologiques disponibles) par rapport aux autres espèces envisageables. Pour ces raisons, le modèle souris est généralement le modèle utilisé en première intention dans les études précliniques. Dans cette étude, notre laboratoire utilisera une lignée de souris qui présente une bonne résistance à l’infection par Mabs mais dans laquelle le pathogène peut persister pendant plusieurs semaines. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, par soucis d’homogénéité, âgées entre 6 et 10 semaines. L’objectif est que les souris aient un système immunitaire mature et que les groupes soient homogènes en âge.

Les 24 rats de ce projet arrivent déjà opérés, vingt avec un cathéter dans la veine fémorale, quatre avec une double pose dans le canal cholédoque et le duodénum. Tous vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tués à l'issue, les uns après un prélèvement de sang terminal, les autres parce que le porteur indique qu'une fois opérés ils ne peuvent plus entrer dans un autre projet ni rester longtemps en vie. Les quatre rats doublement cathétérisés restent trois jours seuls en cage à métabolisme, le temps de collecter bile et urine. Il s'agit de mesurer la pharmacocinétique d'un principe actif non nommé, et le porteur précise qu'aucune approche statistique n'a été réalisée.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de déterminer les paramètres pharmacocinétiques du principe actif testé et d'identifier un profil métabolique via l'analyse d'échantillons de bile et d'urine.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de déterminer les paramètres pharmacocinétiques du principe actif et de pourvoir également identifier des métabolites s'il y en a .

Procédures

Les animaux seront commandés déja opérés. 20 animaux reçus auront un cathéter au niveau de la veine fémorale. Cela est necessaire pour adminsitrer la formulation à tester ( administration intraveineuse perfusion de 1h). Durée de l'administration intraveineuse 1h. Puis les animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse ) et un prélèvement de sang terminal sera réalisé à T1h , T2h et T 4h aprés le début de la perfusion. Temps du prélèvement de l'ordre de la minute. Volume : au moins 2 mL. Les animaux seront euthanasiés à la suite du prélèvement sanguin conformément à la réglementation en vigueur. 4 autres animaux reçus auront une double cathétérisation au niveau du canal choledoque et au niveau du duodénum. La formulation a tester sera administrée par voie intraveineuse en bolus lent sous anesthésie gazeuse. Durée de l'administration de l'ordre de la minute. Puis les rats seront placés individuellement en cage à métabolisme pendant trois jours pour recueillir la bile et les urines. Recueil de bile et d'urine aux intervalles suivants: 0-2h, 2-6h, 6-12h, 12-24h, 24-48h et 48-72h. Durée des recueils environ 2 minutes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet il est necessaire de commander des animaux opérés. Les animaux auront donc subit une chirurgie en amont. La présence de cathéters et la suite post opératoire des animaux peuvent engendrer une gêne , une douleur pour l'animal. Dans ce projet, les animaux seront hébergés de manière individuelle pour chacune des procédures. Cela peut générer du stress, de l'inconfort , une gêne. ,

Devenir

Les 24 animaux prévus dans ce projet seront euthanasiés. Certains animaux auront un prélèvement de sang terminal. D'autres animaux auront subit une procédure chirurgicale. Ces animaux opérés ne pourront pas être inclus dans un autre projet et pour leur bien être ils ne peuvent pas être gardés en vie trop longtemps aprés cette chirurgie.

Remplacement

Pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques et identifier d'éventuels métabolites du principe actif administré il est indispensable de recourir à l'animal. Les méthodes ex vivo sur organes isolés et cultures cellulaires ne peuvent pas suffire. Seul l'animal dans son ensemble pourra présenter un profl métabolique et pharmacocinétique complet.

Réduction

D'un point de vue pharmacocinétique et pour avoir des résultats fiables et interprétables il est nécéssaire d'avoir un nombre d'animaux minimal de trois. Dans le premier cas: 3 animaux par temps pour chaque sexe sont prévu soit 6 animaux par temps ( 1h (fin de perfusion), 2h et 4h aprés le début de la perfusion). Soit un total de 18 animaux. Deux animaux supplémentaires sont prévus au cas ou d'un dysfonctionnement du dispositif chirurgical ( exemple cathéter bouché ou débranché). Dans le second cas: 3 animaux sont prévus pour déterminer les profils métaboliques. 1 animal de réserve est prévu dans le cas d'un dysfonctionnement du dispositif chiruirgical (cathéter duodénal ou choledoque débranché ou bouché). Soit 4 animaux au total. Dans le projet global, un nombre de 24 animaux est un nombre minimal. L'effectif de 3 animaux par groupe pour le premier cas ou 3 au total pour le second cas est le nombre minimal pour pouvoir avoir des resultats représentatifs qui prennent en compte les varaibilités intra et inter individuelles. 1 animal supplémentaire par type de chirurgie et le nombre minimal pour pallier aux problèmes post opératoires. Pas d'approche statistique réalisée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions individuelles dans des cages à métabolismes le temps de la perfusion pour une durée d'une heure dans le premier cas. Le reste du temps pendant les 3 jours d'acclimatation et jusqu'a 4 heure après le début de l'infusion les animaux seront placés dans des cages makrolons classique conformes à la réglementattion. Pour les animaux du second cas, ils seront hébergés de manière individuelle également mais resteront en cage à métabolisme 3 jours consécutifs pour la récolte de la bile et de l'urine. Pour la réalisation de l'administration intraveineuse en bolus lent, les animaux seront sous anesthesie gazeuse, le temps de l'injection. Pour le bien être des animaux, et maintenir une digestion normale, des sels biliaires seront administrés via le cathéter allant au duodénum. Débit en sels biliaires 1.2 mL/h, concentration 0.025% dans du NaCl. dans le premier cas, les points limites sont - Comportement de l'animal durant la perfusion (convulsion, tremblement, prostration) dans ce cas l'animal sera exclu de l'étude est euthanasié - Problème au niveau du dispositif (cathéter bouché ou débranché au niveau interne de l'animal). Dans ce cas l'animal sera exclu de l'étude est euthanasié. Problème d'infection post chirurgicale, écoulement au niveau des cathéters. Dans le second cas , les points limites sont: - Un problème du dispositif: Cathéter débranché au niveau interne de l'animal, cathéter bouché. Si le cathétéer est bouché un petit volume de NaCl sera administré pour débouché le cathéter ( environ 0.1 mL) - Problème d'infection post chirurgicale: écoulement au niveau des cathéters, douluers abdominale, abdoment gonflé, vocalise de l'animal à la palpation.

Choix des espèces

Le rat est une espèce majoritairement utilisée pour ce type d'étude. Ces espèces sont bien décrites et caractérisées dans la littérature et leur utilisation est conseillée (OCDE) pour les essais de produits pharmaceutiques Jeune adulte . il est necessaire d'avoir un système métabolique stable et mature

Environ trente anesthésies et trente prélèvements sanguins par animal, quatre ponctions de moelle osseuse, quinze prélèvements urinaires dont trois par sonde vésicale : 168 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est infectée par le virus Zika ou par le chikungunya après immunisation avec des candidats vaccins, puis hébergée seule pendant quatre à huit semaines pour éviter les contaminations croisées. Aucun n'est tué à l'issue selon le champ de devenir, le porteur indiquant qu'ils seront gardés en vie sur avis vétérinaire et inclus dans d'autres projets, ce qui réduit le nombre d'animaux comptés dans chacun. Le macaque est présenté comme le "seul modèle" possible avant les essais chez l'humain, pour sa proximité phylogénétique et sa réponse vaccinale semblable.

Objectifs

Les agents du Zika et du chikungunya appartiennent à la famille des arbovirus, large famille de virus véhiculés par des insectes qui se nourrissent du sang d’animaux. Ils sont essentiellement transmis par les moustiques du genre Aedes (hémisphère Sud) et Culex (hémisphère Nord). . Restreint il y a encore quelques années à des zones tropicales, le moustique tigre se répand de plus en plus en Europe, étant maintenant implanté dans les pays du nord de la méditerranée (France, Italie, Croatie, Albanie, Grèce). Il pourrait être le point de départ de nouvelles épidémies. Actuellement, la surveillance sur le chikungunya et zika a été renforcée en France métropolitaine. Si la plupart des infections qu’ils provoquent sont sans gravité, ces virus peuvent parfois conduire à des complications sévères voire mortelles : - une microcéphalie chez des bébés nés de mères infectées par le virus Zika et dans de très rare cas des atteintes neurologiques (syndrome de Guillain Barré). - des douleurs articulaires persistantes et sévères en cas d’infection par le chikungunya. Le virus Zika est déjà à l’origine de plusieurs épidémies en Océanie (2006, 2013) et plus récemment sur le continent Sud-Américain en 2015. Le 1er février 2016, l’OMS a déclaré que le virus Zika constitue une urgence de santé publique. Le virus Chikungunya est endémique en Asie du Sud et en Afrique mais s’est étendu en 2005 dans l’océan indien, notamment à l’île de la Réunion suite à une forte épidémie. En 2007, la maladie est arrivée en Europe, avec des cas autochtones dans le sud de la France en 2010. Les facteurs tels que le réchauffement climatique, l’élargissement du biotype des vecteurs, l’émergence de cas autochtone de certains arbovirus en Europe, conduisent dernièrement à une menace accrue d’épidémie qui nécessite de chercher et tester des candidats vaccins, idéalement pouvant protéger contre plusieurs type d’arbovirus.L’objectif du projet est d’évaluer sur des modèles précliniques l’immunogénicité (le type de réponse immunitaire déclenchée) et l’efficacité de candidats vaccins lors d’infection par les virus Zika et Chikungunya.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats permettront de justifier le passage à des essais cliniques du candidat vaccin sélectionné. A long terme, la preuve de concept d’un vaccin ciblant plusieurs arbovirus permettrait d’envisager des constructions plus complexes, protégeant les populations selon les circulations endémiques des virus en une seule injection. Que ce soit pour les nourrissons et jeunes enfants, pour les populations ayant un accès limité aux soins ou même pour les touristes se vaccinant avant leur voyage, la simplification du régime vaccinal devrait être très bien accepté. De plus, économiquement, les coûts de développement et le prix final d'un vaccin unique seraient fortement réduit.

Procédures

Les différentes interventions dans ce projet sont : - immunisation avec des candidats vaccins (pouvant aller jusqu’à 3 fois selon les résultats de l’étude pilote d’immunogénicité, 5 minutes, tous les groupes) - Infection par le virus Chikungunya (une fois, 5 minutes, groupes exposés) - Infection par le virus Zika (une fois, 5 minutes, groupes exposés) - Anesthésie des animaux (30 fois environ, 30 minutes, tous les groupes) - Prélèvements sanguins (30 fois environ, 5 minutes, tous les groupes) - Prélèvements de moelle osseuse (4 fois, 10 minutes, tous les groupes) - Prélèvements salivaires (15 fois, 2 minutes, tous les groupes) - Prélèvements urinaires (15 fois, 15 minutes, tous les groupes) - Implant puce de température (1 fois, 30 minutes, tous les groupes) - Sonde vésicale (3 fois, entre 2 à 30minutes, groupes exposés) - hebergement individuel (1 fois, 4 semaines pour les infections avec Zika et 8 semaines pour les infections avec Chikunguya, groupes exposés)

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent survenir selon le type d’intervention : Nuisances suite à l’immunisation (peu attendu) : Réaction locale, écoulement de pus, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’injection. Nuisances suite à l’infection (attendu pour les animaux non vaccinés, peu attendu pour les vaccinés) : Chikungunya : L’infection du macaque se caractérise, comme chez l’homme, par une infection par le virus transitoire détectable entre les jours 1 et 5, accompagnée d’un épisode fébrile (1 ou 2 jours d’après les précédentes études), d’un gonflement transitoire des articulations, principalement les chevilles et les poignets, 4 ou 5 jours entre les jours 6 à 10, d’une éruption cutanée transitoire diffuse et d’intensité variable pendant les 3 premiers jours ainsi que d’infiltrations persistantes de monocytes/macrophages (cellules immunitaires) infectés dans les tissus lymphoïdes et à un moindre niveau dans les muscles et les articulations. Ces nuisances ne sont pas accompagnées d’une modification de comportement et se résolvent en quelques jours. Zika : Nausées, vomissements, fièvre, déshydratation (évaluation du pli cutané lors des prélèvements). Nuisances suite aux prélèvements de sang, de moelle osseuse, urine et anesthésies répétées : Troubles de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Pour le prélèvement urinaire par sonde, les nuisances possibles sont un risque d’abrasion des muqueuses et de contamination avec la sonde. Nuisances suite à l’hébergement individuel : L’hébergement en individuel peut entrainer un stress. Nuisances possibles chez les animaux après la pose de puce de température: Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie sur avis vétérinaire et pourront être inclus dans d’autres projets compatibles avec la procédure suivie dans notre projet, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Remplacement

L’étude et la caractérisation de la réponse immunitaire induite lors de l’immunisation avec les vaccins candidats contre les maladies virales Zika et Chikungunya nécessitent l’exploration de fonctions physiologiques et d’interactions systémiques à l’échelle de l’organisme entier. A ce jour, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux. Les systèmes expérimentaux in silico et in vitro basés sur l’étude de cellules ou de tissus isolés ne permettant pas de construire des modèles pertinents des interactions hôte-pathogène, de la mise en place et de la persistance de la réponse immunitaire à une infection ou une vaccination. L’espèce macaque cynomolgus a été choisie pour sa proximité phylogénétique et physiologique de l’homme permettant ainsi une transposition des résultats. Les modèles d’infection par le virus Zika et par le virus Chikungunya ayant déjà été développés chez cette espèce, il est plus opportun de poursuivre chez celle-ci.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire. Des études préliminaires sont prévues avec des groupes réduits au minimum à 2 individus pour permettre de sélectionner les meilleures conditions pour les études d’efficacités. Pour ces dernières, le nombre d’animaux a été réduit à 6 animaux par groupe expérimental permettant une analyse statistique adaptés aux petits échantillons.Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique des résultats par des tests non paramétriquesstatistiques adaptés aux petits échantillons, comprenant 6 animaux par groupes expérimentaux.

Raffinement

Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie. Si possible, les prélèvements seront groupés lors d’une seule anesthésie. Si trouble alimentaire/anorexie suite aux anesthésies répétées, une diversification/complémentation alimentaire sera instaurée (monkey dough, fruits secs, fruits frais additionnels, fortimel etc.). Puce de température: Une réaction locale au site d’incision peut être observée comme un gonflement, suintement de la plaie (rare). Les réactions sont signalées au vétérinaire (traitement symptomatique). Prélèvements: Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. Si apparition de réaction locale un traitement symptomatique pourra être instauré. Immunisation Si réaction locale à l’injection du vaccin (écoulement de pus (suppuration), démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’injection) => signalement au vétérinaire, un traitement symptomatique local pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale si la douleur est marquée). Si la réaction locale est exacerbée (suppuration intense avec nécrose, absence de récupération après mise en œuvre des traitements), l’euthanasie de l’animal sera envisagée. Hébergement individuel: Les animaux seront hébergés individuellement pendant la phase d’exposition virale pour éviter une contamination croisée et/ou une surinfection. Un enrichissement complémentaire sera apporté lors de cet hébergement individuel. Infection: Suite à une infection avec le virus Zika, les animaux peuvent avoir des nausées, vomissements, fièvre et déshydratation. Un signalement au vétérinaire sera fait en cas d’apparition de ces symptômes. Si les symptômes sont plus sévères (type paralysie) la sortie d’étude de l’animal sera envisagée. Les données issues d’un projet précédent n’ont pas montré de dégradation de l’état de santé de l’animal ni de mortalité. Suite à une infection par le virus chikungunya, une surveillance accrue sera mise en place sur les 10 premiers jours avec suivi de la température des animaux, mesure des articulations proches des sites d’injection et d’éventuelles rougeurs cutanées. Ces nuisances n’entrainent pas de changement de comportement et disparaissent au bout de quelques jours d’après les données d’un projet précédent.

Choix des espèces

Le macaque cynomolgus est le modèle animal retenu pour ce projet car il est le seul modèle réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de candidats vaccins avant la mise en place d’essais cliniques chez l’homme, la réponse immunitaire et vaccinale étant similaire à celle de l’homme. De plus, il a déjà été utilisé dans des modèles specifiques de ces infections dans la littérature et au laboratoire pour étudier l’efficacité de vaccin avec des phases cliniques. Enfin, notre laboratoire maîtrise les techniques d’exploration de la réponse immunitaire et de la réponse vaccinale chez le macaque ce qui permet une exploration complète de ces réponses. Le suivi immunologique et la réponse à l’infection sont des paramètres majeurs dans ce projet, nous avons donc besoin d’animaux adultes avec un système immunitaire pleinement mature, au minimum 3 ans.

Pour tester un spray polymérique censé accélérer la cicatrisation, 336 souris subissent une incision chirurgicale de la patte droite, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour des prélèvements de tissus. Le porteur écrit que la douleur associée à la plaie "ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude". Chaque souris enchaîne jusqu'à vingt-trois tests comportementaux, dont le RNT ne précise pas la nature au-delà d'une évaluation de la douleur, des troubles moteurs et du bien-être, avec pour certains un isolement d'une nuit ou un jeûne de 24 heures. Le porteur indique qu'il lui est "malheureusement impossible" de remplacer le modèle in vivo, l'observation comportementale exigeant selon lui un animal vivant et vigile.

Objectifs

Une plaie chronique peut être définie comme une plaie qui n'a pas bien cicatrisé dans les 3 mois suivant la blessure. Les plaies chroniques sont souvent appelées ulcères et peuvent être définies comme des plaies de pleine épaisseur qui ont tendance à cicatriser lentement. Ces dernières, souvent masquées par des comorbidités, représentent une épidémie silencieuse qui touche une grande partie de la population mondiale. On estime que 1 à 2 % de la population des pays développés développera une plaie chronique au cours de sa vie. L'augmentation de la population vieillissante accroît ces chiffres, car la vitesse de fermeture des plaies est inversement corrélée à l'âge. Les plaies chroniques entraînent des incapacités qui aggravent les conséquences des blessures, ce qui crée un cercle vicieux. Les complications des plaies chroniques comprennent les infections telles que la phlébite infectieuse, la nécrose, les hémorragies voire les amputations des membres inférieurs. Pour les patients diabétiques atteints d’ulcères aux pieds, le taux d’infection avoisine les 40% et des améliorations dans l’offre de soin sont attendues par les professionnels de santé et les patients. Actuellement il n’existe pas de traitement péri ou post-opératoire satisfaisant permettant de diminuer la proportion de ces plaies. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'impact de l'efficacité d’une pulvérisation d’un mélange polymérique composé de polyarginine (PAR) et d’acide hyaluronique (HA) sur une incision dans un modèle de souris. Le but de cette étude sera d'évaluer en termes de sensibilité, de comportement et de locomotion l'effet d'un traitement par spray PAR/HA sur l'incision pendant le processus de cicatrisation, en comparaison avec un spray de solution saline.

Bénéfices attendus

Notre hypothèse est que la pulvérisation de PAR/HA peut avoir un effet positif sur la cicatrisation des plaies, en réduisant le temps de fermeture des plaies, en normalisant les seuils nociceptifs et en diminuant les déficiences locomotrices. Nous avons également ajouté des tests comportementaux pour évaluer si le spray lui-même peut avoir un impact sur le bien-être des animaux.

Procédures

Les animaux subiront donc une chirurgie au niveau de la patte droite d’une durée de 5 min environ sous anesthésie générale. Un groupe d’animaux recevra 4 pulvérisations d'un mélange polymérique: 2 pulvérisations au niveau du site de lésion pendant la chirurgie puis 1 pulvérisation 2h après sur la plaie et une dernière pulvérisation 24h après la chirurgie. Ces animaux subiront également plusieurs tests comportementaux durant de 3 à 10 min (maximum 23 tests par animal avec un délai de 24h minimum entre chaque test) afin d’évaluer leur douleur, leurs troubles moteurs et leur bien-être.

Impact sur les animaux

Il y a présence d’une plaie et d’une douleur associée qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie d’incision de la patte, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 6 jours après la chirurgie. La chirurgie incisionnelle va induire une réponse inflammatoire classique et attendue qui permet la mise en place de ce modèle d’étude. Pour un test, les souris seront isolées une nuit. Pour un autre test, les animaux réaliseront un jeûne préalable de 24h. Pas de nuisance particulière attendue par rapport à la pulvérisation du spray en lui-même en raison de l’absence de toxicité bien documentée dans la littérature des deux molécules.

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse de l’effet thérapeutique d’un mélange polymérique pulvérisable sur l’évolution d’une plaie et les troubles sensitifs et moteurs associés nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique interindividuelle, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 14 souris mâles et 14 souris femelles, le risque de variabilité lié à l’activité intrinsèque du mélange polymérique pulvérisable étant inconnu et non négligeable. Un calcul statistique a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides au plan statistique. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de tests comportementaux au sein d'une même procédure.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Une acclimatation de 2 semaines aux locaux et des habituations à l’expérimentateur (handling) et aux tests comportementaux sont systématiquement réalisés. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales.

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font de la souris un modèle pertinent. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (arrivée des animaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).

Toutes tuées à l'issue parce qu'infectées, 828 souris reçoivent deux plaies dorsales pratiquées au punch de biopsie puis une inoculation de bactéries formant un biofilm, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur suit la croissance de l'infection par imagerie quotidienne sous anesthésie gazeuse et par des prises de sang à la veine rétro-mandibulaire. Il annonce qu'aucune souris ne peut être réutilisée, placée ni adoptée, du fait de l'infection qu'il a provoquée. L'enjeu du projet reste de mettre au point ce modèle de plaie infectée pour y tester ensuite des produits anti-biofilm.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer des modèles précliniques de BIOFILM mimant les conditions d’infection chez l’homme. Ils permettront ainsi d’étudier la virulence/ pathologie de bactéries cliniquement pertinentes et d’évaluer ensuite l’activité des nouveaux composés prophylactiques ou thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont : (1) Mise au point/caractérisation de modèles murins de BIOFILM dans une plaie translatant une infection cliniquement pertinente induite par des agents bactériens Gram (+) ou Gram (-) (2) Mise en place d’un suivi longitudinal de la croissance d’un biofilm dans une plaie par le biais de l’utilisation de bactéries bioluminescences et de systèmes d’imagerie du petit animal. Les résultats de cette étude pourraient être ainsi prédictifs de l’approche thérapeutique à déployer chez les patients.

Procédures

Pour mimer les plaies aiguës chez l’homme, une plaie sera induite dans le cadre d’une procédure chirurgicale. Elle est induite au niveau dorsal de la souris (souris sous anesthésie générale et locale, injection d’analgésiques.) (Ensemble de la procédure 7-10min/souris). Au préalable de l’inoculation bactérienne (bactéries bioluminescentes), les souris seront traitées au niveau de la plaie par des approches différentes (dépôt direct au niveau plaie du produit candidat (20-30 secondes/souris), utilisation de pansement pré-imbibés ou pulvérisation du produit) (20-30 secondes/souris). Les souris seront suivies quotidiennement : suivi clinique (apparence, poids et taille de la plaie) + imagerie (croissance/dissémination du biofilm). Le suivi en imagerie est réalisé sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris). Pour suivre la réponse immunitaire, des prises de sang précoces seront réalisées par la veine rétro-mandibulaire (3h et +1j) (1-2min/souris).

Impact sur les animaux

Mise au point d’un modèle de plaies aiguës • La mise en place de 2 plaies cutanées par souris à l’aide d’un punch de biopsie stérile entraine un stress et une douleur. o Les plaies seront induites chez des souris sous anesthésie gazeuse et ayant été préalablement traitées pour la prise en charge de la douleur. Le traitement sera renouvelé 2 fois/jours, pour une durée de 3 jours post opération • La formation de biofilm dans une plaie (induite par lésion cutanée) peut induire chez les animaux non traités une infection modérée. • Les plaies induites seront suivies quotidiennement : • Suivi clinique : état de la souris, poids • Croissance du biofilm et dissémination : ceci sera réalisée par imagerie à des temps différents) • Evaluation de l’activité prophylactique Pas d’effets indésirables prévus. Les solutions prophylactiques préalablement produites ont été évalués in vitro pour des effets indésirables éventuels.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils ont été préalablement infectés (plaies).

Remplacement

L’absence de modèles in vitro pertinent permettant de reproduire la majorité des interactions entre agent pathogène et/ou agent antimicrobien et système immunitaire (réponse inflammatoire) nous oriente vers l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

L’évaluation du nombre minimal d’animaux à inclure pour pouvoir observer l’effet escompté a été déterminé avec des tests statistiques pour petits échantillons. Ceci a été réalisé en collaboration avec des biostatisticiens. Par ailleurs, L’utilisation des systèmes d’imagerie du petit animal permettra une réduction du nombre de souris en limitant le ainsi le recours au sacrifice des souris pour déterminer la charge bactérienne. En effet, elle permet un suivi longitudinal non invasif de l’infection.

Raffinement

Les animaux seront élevés en communauté dans des cages ventilées enrichies avec du sopalin. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée quotidiennement par les expérimentateurs afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Pari ailleurs, Afin de prendre en compte la souffrance des animaux, un suivi par imagerie ainsi qu’un suivi clinique seront mis en place, basé sur des observations quotidiennes des souris. En fonction des observations (apparence générale, posture, activité, poids…) et du score clinique associé, des décisions graduelles seront enclenchées : couverture chauffante, injection d’analgésique, réhydratation sous-cutanée. Le score clinique permettra également de définir un point limite précoce et, en conséquence, de réduire la souffrance de l'animal ; dès le point limite atteint, il sera procédé à une mise à mort.

Choix des espèces

Les infections liées à des biofilms touchent majoritairement les personnes légèrement ou fortement immunodéprimées et impliquent souvent des bactéries commensales comme Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa. Ainsi, les personnes âgées, atteintes d’une maladie sévère, immunodéprimées, opérées ou exposées à un dispositif invasif (sonde urinaire, cathéter vasculaire ou intubation/trachéotomie) ont un risque particulièrement élevé. Les infections liées à des biofilms représentent un sérieux problème de santé publique. Dans la recherche préclinique, les modèles murins permettent d’intégrer un grand nombre des caractéristiques de la pathologie humaine. En plus, l’ensemble des technologies d’imagerie pré-clinique est conçu pour des rongeurs de petite taille, principalement la souris. Adultes, 7 à 12 semaines, ayant ainsi un système immunitaire immunocompétent.