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Etude de la transmission de Bordetella pertussis et de l’efficacité de protection de la souche vaccinale BPZE1P contre les Bordetellae chez le hamster.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
1 386 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par voie nasale par la bactérie de la coqueluche, hébergés avec des animaux sains pour étudier la transmission, puis tués pour prélever nez et poumons. Le porteur indique une surveillance quotidienne du poids et du comportement, une perte de plus de 20 % du poids pouvant déclencher la mise à mort. Il présente le hamster comme un modèle permettant, contrairement à la souris, d'étudier la transmission par aérosol, et revendique le recours à l'animal pour valider son vaccin vivant.
Objectifs
Ce projet a pour but d'étudier une phase critique de la coqueluche qui est la phase de transmission et la potentialité de notre vaccin vivant à protéger contre l’infection bactérienne par aérosolisation naturelle.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d’étudier et comprendre la phase de transmission de Bordetella pertussis dans un modele Hamster et de potentialiser notre vaccin vivant pour définir la protection médiée contre une infection par transmission naturelle par infection nasale.
Procédures
1) administration intranasal de Bordetella chez le hamster (5 min par animaux). Les animaux seront euthanasiés 0, 3, 7, 14,21, 28 et 56 jours post administration pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons 2)exposition des animaux sains à l'infection par co-hebergement avec les animaux infectés. Le temps de co-hebergements est de 0, 7, 14, 28 et 56 jours, ensuite les animaux sains et infectés initialement seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons 3) les hamsters seront vaccinés par instilation intranasal de Bordetella pertussis (5 min) ou injection sous cutanée de vaccin commercial (5 min). Un mois plus tard, le groupe ayant recu le vaccin commercial sera boosté par la même dose. 28 jours plus tard, les hamsters immunisés ou naifs seront infectés par une souche virulente de Bordetella (5min). 3h et 7j après ce challenge, les hamsters seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons. 4) les hamsters seront vaccinés par instilation intranasal de Bordetella pertussis (5 min) ou injection sous cutanée de vaccin commercial (5 min). Un mois plus tard, le groupe ayant recu le vaccin commercial sera boosté par la même dose. 28 jours plus tard, les hamsters immunisés ou naifs seront mis en contact avec des hamsters préaleblement infectés par une souche virulente de Bordetella (5min). 3 heures, 14 jours, 28 jours et 56 jours après la mise en contact les hamsters seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons.
Impact sur les animaux
Nous avons déjà démontré que l’infection nasale par BPZE1 dans un modèle hamster ne provoque aucun symptôme bien que les bactéries puissent coloniser le nez pendant 56 jours. En revanche bien que la littérature montre une résistance naturelle des hamsters à Bordetella bronchiseptica, nous ne connaissons pas la virulence des souches cliniques de Bordetella pertussis ni des souches de Bordetella parapertussis dans le modèle hamster.
Devenir
Les hamsters seront mis à mort à la fin de chaque expérience pour la récupération des nez et poumons ou à l'atteinte des points limites
Remplacement
Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. Les modèles in vitro ou in silico ne suffisent pas pour comprendre les phénomènes de colonisation et d’induction de l’immunité induits par l’infection. En outre, dans l’optique de positionner le vaccin BPZE1P comme protecteur contre une infection naturelle, son efficacité doit être validée par une expérimentation animale in vivo. D'autre part l'etude de la phase de transmission necessite de mettre en contact (cocconing) les animaux infectés avec des animaux sains pour tenter de mimer une infection naturelle, cette etape ne peut etre reproduite in vitro.
Réduction
Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. le nombre d’animaux est basé sur un calcul de puissance statistique en fonction de la variabilité attendue concernant la significativité des différences observées entre les groupes expérimentaux. Si la variabilité inter-individus et inter-expérimentation est faible le nombre d’animaux par groupe sera revu à la baisse.
Raffinement
Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. nous serons extrêmement vigilants sur le respect de la notion de points limites. Chaque jour, les critères de souffrance seront évalués (changement comportemental, prostration, etc.) à l’aide d’une grille de cotation. Dans le cas où le score atteint le seuil limite fixé, l'animal sera mis à mort. Les résultats de la procedure 2 nous permettra d'affiner les points de prelevement d'organe pour la procedure 5 ce qui limitera le nombre d'animaux utilisés. Le bien-être animal sera vérifié quotidiennement au travers de : - Contrôle du poids de l’animal (si une perte de poids de plus de 20% était observée, nous procéderions à l’euthanasie des animaux concernés) - Comportement général de l'animal (prostration, isolement dans la cage ou au contraire hyperactivité) - Aspect physique, en particulier si le poil est hérissé ou si la respiration est rapide ou saccadée (puisque Bordetella pertussis responsable de la coqueluche est une maladie respiratoire).
Choix des espèces
Le modele animal utilisé pour étudier Bordetella pertussis, l’agent responsable de la coqueluche chez l'humain, est depuis plus de 30 ans le modèle murin. En effet cette bactérie colonise transitoirement le nez et le poumon de la souris. Cependant, la pathologie humaine de la coqueluche met en évidence une infection des voies aériennes supérieures (nez, trachée, bronche) mais très rarement l’entièreté du poumon. Le mode d’infection utilisé pour le modèle murin semble être trop intrusif pour mimer complètement l’infection naturelle humaine. D’autre part, malgré de nombreux essais, le modèle murin ne permet pas d’étudier la phase de transmission car les souris ne toussent pas et n’aérosolisent pas la bactérie. En revanche, le modèle hamster a été mis en évidence comme permettant l’aérosolisation de particule virale du SARS-COV2 et permet l’infection d’animaux naïfs présents dans la même cage avec une séparation physique. l'age de 3 semaines et le sexe sont liés au fait que des hamsters males de 3 semaines ont deja ete utilisés dans un autre protocol APAFIS#27475-2020100514546435 v3 et nous voulons puvoir comparer les resultats experimentaux avec ces deux projets l'age de 3 semaines est aussi liée au fait que les animaux qui seront vaccinés a deux reprises par le vaccin acellulaire auront alors 11 semaines lors du challenge avec les souches de Bordetella
Evaluation in vivo de l’efficacité de bactériophages dans le traitement d’une infection à Klebsiella pneumoniae
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
3 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères. Elles reçoivent par gavage sans anesthésie des antibiotiques, une bactérie multirésistante puis des bactériophages, ce geste étant répété jusqu'à dix-neuf fois sur quinze jours, avec prélèvement quotidien de selles. Toutes sont tuées pour prélever leur tube digestif et mesurer l'effet du traitement. Le porteur affirme que la colonisation et le traitement n'induisent pas de symptôme et revendique un modèle vivant "indispensable", le microbiote intestinal ne pouvant selon lui être reproduit in vitro.
Objectifs
La résistance aux antibiotiques des entérobactéries est telle que nombre d’infections sont devenues intraitables et la diffusion des bactéries multirésistantes expose à un risque de prescriptions d’antibiotiques inadaptés. La colonisation digestive à bactéries multi-résistantes est le principal facteur de risque d’infection qui augmente avec le niveau de colonisation. La décolonisation du portage digestif est une priorité pour lutter contre la dissémination et les conséquences de l’antibiorésistance. Klebsiella pneumoniae (Kp), impliquée dans les infections humaines joue un rôle majeur dans le maintien et la dissémination de cette multirésistance. La décolonisation du portage digestif par antibiotiques n’a pas montré son efficacité, il est donc essentiel de développer de nouvelles armes antibactériennes. Les bactériophages pourraient être une de ces armes puisque leur efficacité a été prouvée dans d’autres infections. Les phages sont des virus qui infectent les bactéries et il existe au moins un phage identifié pour chaque bactérie. Notre projet consiste à évaluer l’efficacité d’un traitement par phages dans un modèle murin dont le tractus digestif est colonisé par une souche de Kp. Ce modèle va permettre de modéliser ce qui se produit chez des patients sous antibiothérapie et des porteurs colonisés par des bactéries multi-résistantes. Nous testerons les conditions d’établissement de la colonisation par différentes Kp (n=10) et testerons l’efficacité de la décolonisation par le traitement par 1 jusqu’à 5 phages. Nous utiliserons donc 3 000 souris au total. Règle des 3R : - Remplacement: notre projet s'inscrit en amont d’étude de décolonisation sélective chez l'homme et le modèle animal ne peut être remplacé ; - Réduction : le nombre d'animaux a été réduit au minimum afin de nous permettre d'obtenir une puissance statistique suffisante pour des résultats interprétables ; - Raffinement: La surveillance quotidienne des animaux permettra de détecter un changement de comportement pouvant indiquer une éventuelle souffrance. Les traitements antibiotiques, la colonisation par les Kp et l’injection de bactériophages n’induisent pas de symptômes chez les animaux. Un enrichissement sous forme de copeaux de cellulose, maison en carton et/ou boule de papier kraft type carfil nesting permettant de faire des nids et mis à disposition des animaux.
Bénéfices attendus
La diffusion des bactéries multi-résistantes représente un problème majeur de santé publique. Dans un contexte de faible développement d’antibiotiques réellement innovants et face à des infections qui deviennent non traitables, des alternatives sont nécessaires. Le développement de cocktails de phages pour décoloniser des patients du portage intestinal de Klebsiella pneumoniae multi-résistantes ou diminuer la charge bactérienne, ouvre une perspective intéressante et innovante: diminution du risque de transmissions croisées donc réduction des infections liées aux bactéries multi-résistantes et diminution de la morbidité-mortalité associées. Ce type de modèle est pertinent cliniquement : il permet de modéliser ce qui se produit chez des patients sous antibiothérapie et des personnes porteuses colonisées par des bactéries multi-résistantes. En effet, l’utilisation d’un modèle in vivo est ici indispensable et ne peut être remplacé car tout le microbiote intestinal est susceptible d’interagir avec les phages et il est nécessaire d’en apprécier les effets avant une possible extrapolation du traitement chez l’homme.
Procédures
Prélèvement de selles : la totalité des souris (3 000). Les selles sont récupérées dès émission chez les animaux tenus en contention manuelle. La procédure dure 20 secondes par animal, est effectuée 1 fois par jour pour un maximum de 14 jours. Gavage : (N=3 000 souris). Les animaux recevront des antibiotiques (clindamycine (8,6 mg/kg/jour), les bactéries K. pneumoniae, les bactériophages) dans un volume de 200 µl à l’aide d’une canule de gavage. L’animal est tenu en contention manuelle, sans anesthésie et la suspension lui est administrée à l’aide d’une canule de gavage. Aucune anesthésie n’est mise en place car la procédure consiste en une seule administration par voie orale et la mise en place d’une anesthésie serait plus traumatisante pour l’animal. Le geste de gavage dure en moyenne 15 secondes par animal. Selon les groupes, ce geste sera réalisé un minimum de 1 fois et un maximum de 19 fois sur 15 jours. Euthanasie : la totalité des souris (3000). L’animal est euthanasié par injection létale de pentobarbital à 150 mg/kg (100 μl d’Euthasol ou autre spécialité autorisée à base de pentobarbital dilué à 30 mg/mlpar souris de 20 gr) par voie intra-péritonéale (souris tenue en contention verticale ou légèrement inclinée sur le dos, injection avec une aiguille 25G). L’injection dure 5 secondes par animal. Contention manuelle : la totalité des souris (3 000)
Impact sur les animaux
Deux concentrations différentes de Kp seront inoculées aux animaux afin d’établir un modèle de colonisation stable du tractus digestif. De notre expérience et étude de la litérrature la colonisation par une souche de Kp, même hypervirulente, ne présente pas d’effet indésirable jusqu’à 28 jours post-colonisation (données isssues de la litérrature) voire 50 jours (communication personnelle d’un collaborateur). La deuxième étape de traitement par phages n’engendrera pas de préjudices aux animaux puisque le traitement est à visée décolonisante. Chaque animal de chaque groupe sera identifié par marquage au feutre au niveau de la queue.
Devenir
A l’issue de la période de colonisation par Kp ainsi qu’à l’issue du traitement par les phages, tous les animaux sont euthanasiés afin de procéder au prélèvement de leurs tubes digestifs pour une mise en culture et visualisation de la localisation des bactéries le long du tube digestif. Ces méthodes vont permettre de voir l’efficacité de la colonisation par Kp ainsi que l’efficacité du traitement par les phages, comparativement au groupe témoins non traités et nécessite l’euthanasie des animaux
Remplacement
L’utilisation d’un modèle in vivo est indispensable dans l’étude de l’efficacité du traitement par phages et ne peut être remplacé. En effet, tout le microbiote intestinal est susceptible d’interagir avec les phages et il est nécessaire d’en apprécier les effets avant une possible extrapolation du traitement chez l’homme.
Réduction
Les groupes d’animaux ont été réduits au minimum tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, conduisant à un nombre total d’animaux de 3 000 pour ce projet. La taille des groupes a été estimée à partir de logiciel d’analyse statistique. L’utilisation de chaque animal sera optimisée en effectuant sur un même animal au cours du temps différents types d’analyses après prélèvement non invasifs des selles, suivi de coupes histologiques et microscopie en fin d’expérience.
Raffinement
Le projet a été construit en intégrant les mesures permettant de réduire le stress et si possible, la souffrance des animaux (raffinement). Il sera assuré par l'enrichissement mis à disposition des animaux (litière en copeaux de cellulose, maison en carton et/ou boule de papier kraft type carfil nesting permettant de faire des nids). Les animaux sont hébergés par groupe de 6 souris maximum (qui constituent les groupes expérimentaux) dans des cages de type IIL dont la surface répond aux normes de l’annexe II section B paragraphe 2.1 tableau 1.1 de l’arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d’agrément, d’aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs éleveurs ou fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques et leurs contrôles dans le cas de l’utilisation de souris. Une période d’acclimatation d’une semaine est observée à l’arrivée des animaux avant le début des expériences. Les traitements antibiotiques, la colonisation par les Kp et l’injection de bactériophages n’induisent pas de symptômes chez les animaux. Les gavages seront effectués par des personnes formées et compétentes. Lors du gavage, une surveillance accrue des animaux pendant 10 minutes permettra de détecter d’éventuels signes de souffrance. Si une difficulté respiratoire est observée, l’animal sera euthanasié par disclocation cervicale. La surveillance quotidienne des animaux permettra de détecter un changement de comportement pouvant indiquer une éventuelle souffrance (animal prostré, ne se nourrissant plus, poil piqué, ne se servant plus de l’enrichissement mis à sa disposition). Si un des paramètres cité précédemment est observé, l’animal est euthanasié par injection létale de pentobarbital à 150 mg/kg (100 μl d’Euthasol ou autre spécialité autorisée à base de pentobarbital dilué à 30 mg/ml par souris de 20 gr) par voie intra-péritonéale (souris tenue en contention verticale ou légèrement inclinée sur le dos, injection avec une aiguille 25G). La mort des animaux est confirmée par une vérification de l'arrêt respiratoire et de l'arrêt cardiaque. La vérification de ces paramètres est réalisée pendant une minute.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle murin (souris SWISS) car celui-ci a prouvé son efficacité dans la mise en place de colonisation par des bactéries mais aussi dans la décolonisation par des phages. Nous avons choisi des souris femelles (afin d’éviter les conflits entre mâles) SWISS (souris immunocompétentes non consanguines). Les animaux seront utilisés à un âge de 7 -12 semaines ce qui permettra d’avoir une flore digestive mature. Chaque animal de chaque groupe sera identifié par marquage au feutre au niveau de la queue.
Etude de l’immunogénicité de pseudo-particules virales de SARS-COV2 chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
16 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, réparties entre un niveau de souffrance léger et modéré. Elles reçoivent un candidat vaccin à pseudo-particules virales de SARS-CoV-2 par voie sous-cutanée ou nasale à trois reprises, avec quatre prélèvements sanguins à la veine sub-mandibulaire, avant mise à mort pour prélever les organes lymphoïdes. Le porteur indique n'avoir jamais observé de signe clinique avec des protocoles similaires. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne mime la complexité de la réponse immunitaire des mammifères.
Objectifs
La disponibilité d'un vaccin efficace et permettant une cross-protection contre les variants de SARS-CoV-2 reste une urgence. Les pseudo-particules virales (virus-like particles ou VLPs)ont montré dans de nombreux modèles d'infection leur grande qualité d'antigène vaccinal. Le vaccin candidat composé de ces VLPs doit permettre de générer une réponse immunitaire humorale et cellulaire contre l'ensemble des protéines de structure du coronavirus (protéines S, E, M, N) contrairement aux vaccins actuellement disponibles ne contenant que l'antigène ou des séquences codant la protéine SPIKE à l'exception des vaccins basés sur des virus inactivés. Pour cela, notre équipe a développé des pseudo-particules virales de SARS-COV2 contenant la protéine S du variant delta ainsi que les protéines M, N et E de la souche originelle de Wuhan. En effet, ces trois dernières protéines structurales sont beaucoup moins sujettes à l'apparition de mutations et peuvent donc induire des protections croisées. Notre objectif est d'évaluer l'immunogénicité humorale et cellulaire de ce candidat vaccin de seconde génération en évaluant deux voies d'administration : sous-cutanée et nasale.
Bénéfices attendus
En cette période de pandémie de COVID-19 , la disponibilité d'un vaccin efficace et permettant une cross-protection contre les variants de SARS-CoV-2 reste une urgence. Ce projet va permettre de valider l'immunogénicité de notre candidat vaccin basé sur des pseudo-particules virales (virus-like particles ou VLPs) selon deux voies d'administration, l'une classique, la voie sous cutannée et l'autre plus adaptée à des pathogènes respiratoire, la voie nasale.
Procédures
Les animaux seront soumis à des : 1/ Prélèvements sanguins à J0 , J14, J28 et J45 à la veine sub-mandibulaire avec un volume cible de 200 μL 2/ Injections sous-cutanées du candidat vaccin sous un volume de 200 μl à J0, J7 et J28 3/ Instillations nasales du candidat vaccin sous un volume de 20 μl (10 μl par naseau) à J0, J7 et J28
Impact sur les animaux
Des protocoles similaires que ce soit d'immunisation sous-cutanée ou nasale ont été mis en oeuvre au sein de notre laboratoire et n’ont jamais montré de signes cliniques ou de changement de comportement suite à la vaccination. Les animaux seront tout de même surveillés de manière quotidienne pour détecter toute nécrose au point d'injection (groupe recevant les immunogènes par voie sous cutanée), tout inconfort respiratoire (groupe recevant les immunogènes par voie nasale). Tout animal présentant un de ces signes cliniques sera euthanasié. Toutes les procédures sont effectuées sous le controle d'un expérimentateur/concepteur expérimenté qui saura limiter ou le cas échéant évaluer le stress et/ou la douleur engendrée par la procédure.
Devenir
A J42, fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes lymphoïdes secondaires.
Remplacement
Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution pour mimer la complexité de la réponse immunitaire chez les mammifères.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et de notre expérience.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives en vigueur et bénéficient d'un enrichissement social (3 animaux /cage) et physique (maisonnette en plexiglas, papier absorbant, boîte à oeuf en carton) dans la zone d'hébergement définie par la SBEA de l’établissement. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites (prostration des animaux, poils hérissés). Tout traitement pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt en lien avec les points limites sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus.
Choix des espèces
La souris Balb/c est la souris la plus utilisée pour valider l'immunogénicité d'un candidat vaccin. De plus, tous les outils immunologiques sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire humorale et cellulaire chez la souris. Ce modèle murin permettra de faire la preuve concept de l’induction d’une réponse immunitaire avant de passer sur un modèle d’infection comme la souris K18-hACE2 et le hamster. 7 semaines incluant une semaine d’acclimatation. Stade physiologique : croissance
Evaluation de l’efficacité antibactérienne des Eligobiotiques® (EB) contre Escherichia coli entérohémorragique (EHEC) productrice de Shiga-toxine (STEC) chez le lapereau.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
36 lapereaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Infectés à deux jours par une E. coli entérohémorragique par gavage pour mimer de jeunes enfants, ils subissent une ponction intracardiaque sous anesthésie avant mise à mort pour prélever sang et côlon, et les lapines mères sont également tuées. Le porteur indique que la sous-nutrition des lapereaux délaissés par leur mère est la principale cause de souffrance. Il affirme que la complexité d'un être vivant ne peut être reproduite in vitro.
Objectifs
Le présent projet vise à tester l’efficacité d’un composé antibactérien (EB) dans un modèle d’infection du tube digestif à E. coli chez le lapereau. Deux concentrations du composé seront testées, une correspondant à la dose pharmacologiquement active (PAD) et cette même dose divisée par 10 (EB/10).
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal de ce projet est de mettre en évidence l’efficacité d’une thérapie ciblée offrant une alternative à l’utilisation des antibiotiques et permettant un contrôle précis des écosystèmes microbiens complexes. Dans cette optique, le projet vise à utiliser une nouvelle technologie antimicrobienne basée sur l’utilisation d’un dérivé des bactériophages (ciblant exclusivement certaines espèces bactériennes) transportant des « ciseaux moléculaires » qui, une fois à l’intérieur des bactéries, vont scanner leur matériel génétique et trouver la séquence à couper pour laquelle ils ont été « programmés ». Ainsi seules les bactéries possédant la séquence d’ADN ciblée seront tuées, sans affecter le reste du microbiote. Les bactéries d’intérêt dans ce projet sont des Escherichia coli (E. coli) entérohémorragiques (peuplant le système digestif et responsable d’hémorragies) productrices de Shiga-toxine (EH-STEC). Ces bactéries sont à l’origine de maladies rares mais graves en particulier chez les jeunes enfants chez qui elles induisent des diarrhées hémorragiques et une atteinte rénale sévère. Une précédente étude a déjà permis de mettre au point le modèle d’infection du tube digestif chez le jeune lapereau et d’appréhender le potentiel bénéfice d’un traitement aux Eligobiotiques® (EB). Cette étude a pour but d’évaluer l’efficacité de la dose pharmacologiquement active déterminée ultérieurement sur cette bactérie.
Procédures
Les méthodes d’infection et de traitement par gavage (quelques secondes par lapereaux) ont été choisies pour leur qualité non invasive et indolore pour les animaux. Les lapereaux seront infectés une seule fois à J0 et les traitements auront lieu deux fois par jour, J3 après infection pendant 4 jours. L’expérience durera 7 jours. Dans ce modèle, l’infection, même symptomatique (diarrhée), n’empêche pas la prise de poids des lapereaux et n’entraine pas de souffrance particulière s’ils sont bien nourris par leur mère. En revanche, il est possible que l’infection favorise le délaissement de la lapine pour ses lapereaux les plus fragiles. Dans ce cas, le poids des lapereaux et leur score clinique enregistrés quotidiennement nous permettrons d’évaluer leur état et de les mettre à mort en accord avec les points limites évoqués plus haut. En fin d’étude, les lapereaux seront soumis à une ponction intracardiaque sous anesthésie volatile (vetflurane 5%) avant leurs mises à mort.
Impact sur les animaux
Les précédentes études nous ont permis de déterminer que la principale cause de souffrance dans ce modèle était la sous nutrition des lapereaux (résultant ou non de l’infection). Le nombre d’animaux par portée est assez variable. Les lapines donnant naissance à plus de 9 lapereaux ont souvent tendance à en délaisser certains au profit des autres. Pour pallier ce problème, des lapereaux issus de grandes portées pourront être transférés à des portées plus petites au cours de leur premier jour de vie. Une observation quotidienne durant les 5 jours suivant la naissance des lapereaux puis bi-quotidienne jusqu’à la fin de l’expérience nous permettra de déterminer lesquels ont le plus de mal à se nourrir et ainsi de favoriser leur alimentation en les plaçant en priorité dans le nid avec leur mère. Ce suivi nous permettra également de déceler le plus rapidement possible des signes de douleur et pouvoir anticiper l’atteinte des points limite.
Devenir
Tous les animaux (lapereaux + lapines) seront mis à mort à la fin de l’étude afin de récupérer chez les lapereaux, le sang pour analyses biologiques et le colon pour dénombrement des CFU. Les lapines seront également mises à mort car elles auront été en contact avec des animaux infectés.
Remplacement
Une partie des résultats préliminaires a été obtenue in vitro mais la complexité d’un être vivant ne peut pas être mimée en laboratoire nécessitant l’utilisation de modèles animaux. Également, une étude similaire a déjà été réalisée et a permis de mettre en évidence des résultats très encourageants. Toutefois, la validation de l’efficacité est requise sur un lot clinique par les autorités et le conseil scientifique du commanditaire de l’étude.
Réduction
Le modèle étant déjà maitrisé, aucune phase de mise au point n’est prévue. Afin d’obtenir une étude statistique solide, 12 effectifs par groupe de traitements seront nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Les lapereaux et leur mère ne seront pas séparés durant l’étude pour limiter leur stress et permettre une alimentation naturelle par la tétée. L’infection bactérienne du tube digestif et l’administration du traitement seront réalisées par voie orale et seront donc indolore. Des critères d’arrêts de l’étude, supportés par une grille de score clinique, ont été définis afin d’assurer le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le lapin développe des symptômes très semblables à l’homme dans un contexte d’infection à E. coli, notamment au niveau de la diarrhée, contrairement au modèle murin. Des lapereaux de 2 jours seront utilisés de façon à correspondre à une population de jeunes enfants particulièrement sensibles aux infections à EH-STEC.
Evaluation de l’efficacité de probiotiques dans l’infection au SARS-CoV2 chez le hamster
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
160 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SARS-CoV-2 par voie nasale ou orale, gavés chaque jour avec des probiotiques, et subissent une perte de poids progressive avant un prélèvement sanguin intracardiaque terminal sous anesthésie et une autopsie. Le porteur teste l'efficacité de bifidobactéries contre l'infection et présente le hamster doré comme un "modèle de choix" par sa sensibilité au virus. La perte de poids attendue reste sous le seuil de 15 % fixé comme point limite.
Objectifs
L’intestin héberge naturellement des milliards de microorganismes, constituant le microbiote intestinal. Outre sa fonction dans la digestion, le microbiote exerce un rôle important dans la protection de l’organisme contre les pathogènes. Lorsque le microbiote intestinal est perturbé dans sa composition et/ou son fonctionnement, on parle de dysbiose. La dysbiose peut être due à un traitement antibiotique par exemple mais aussi liée à une pathologie. Chez certains patients atteints de la Covid-19, outre les symptômes classiquement observés, on peut constater parfois un tel déséquilibre de la biodiversité de la flore intestinale, associé à des symptômes gastro-intestinaux incluant des diarrhées. Par ailleurs, les analyses des selles de ces patients démontrent que le virus SARS-CoV2 peut survivre dans le tractus gastro-intestinal suggérant ainsi que ce dernier peut constituer un site extra-pulmonaire pour la multiplication et l’activité virale. De plus, le récepteur utilisé par le SARS-CoV2 pour infecter les cellules de l’hôte (fortement exprimé dans les cellules pulmonaires) est aussi présent dans les cellules épithéliales du tractus GI et joue un rôle essentiel dans le contrôle de l’inflammation intestinale et l'équilibre microbien. L’apport de probiotiques pourrait constituer une approche de traitement à 2 niveaux : 1/En exerçant un blocage du processus de fusion du virus aux cellules de l’hôte 2/en exerçant une activité de modulation des molécules de l'immunité. Le présent projet se propose d’évaluer l’efficacité de bifidobactéries sur l’infection à SARS-CoV2 chez le hamster doré. Deux probiotiques candidats (bifidobactéries) ont été retenus pour l'essai d'efficacité in-vivo.
Bénéfices attendus
Une activité immunomodulatrice des bifidobactéries associée à une activité de perturbation de la mutiplication du SARS-CoV2 permettraient de limiter l'infection par le SARS-CoV2 chez le hamster. Le bénéfice attendu est donc l'apport de la preuve que les bifidobactéries peuvent constituer un potentiel traitement contre l'infection au SARS-CoV2.
Procédures
Les hamsters vigiles seront traités par gavage oral quotidien (sonde) avec un volume de 200µL, soit 11 ou 13 gavages (durée = 2/3 secondes/gavage) selon les groupes Les hamsters de la procédure 1 seront infectés une seule fois par voie intra-nasale (40µl - animaux anesthésiés - durée = 15 secondes environ) Les hamsters de la procédure 2 seront infectés une seule fois par voie orale (200µl - animaux vigiles - 2/3 secondes environ) Les hamsters seront manipulés quotidiennement pour une pesée (11 à 14 pesées selon les groupes - durée = 10 secondes) Les hamsters seront anesthésiés (J+4 ou J+7) à l'isoflurane puis par injection de kétamine/xylazine afin de réaliser une prise de sang intracardiaque terminale avant autopsie (prooédure terminale de 15 minutes au total)
Impact sur les animaux
Une perte de poids, progressive et s’étalant sur une période allant de J+1 à J+6 post-infection, est attendue chez les hamsters infectés avec du SARS-CoV2. Hormis cette perte de poids, il n’y a pas de symptômes cliniques attendus durant la période d’infection. L’infection n’aboutit jamais à des décès non désirés. La perte de poids prend généralement fin à J+6 et n'excède pas 15% du poids constaté le jour de l'infection.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort afin de réaliser une autopsie et une collecte d'organes/sang pour étudier différents paramètres de l'infection.
Remplacement
Des experimentations préliminaires in-vitro ont été réalisées en amont du projet afin de sélectionner les souches candidates et de valider leur activité anti-protéase et immunomodulatrice. Néanmoins, l'évaluation de l'efficacité des traitements par probiotique (évalution de multiplication virale, la distribution, lésions associées) ne peut se faire in-vitro et nécessite de passer par le modèle animal.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été fixé à 16 afin d'avoir 8 animaux par point de mise à mort (J+4 et J+7) afin d'obtenir des résultats d'infection virale statistiquement significatifs.
Raffinement
Ces hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.
Choix des espèces
Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc le modèle de choix pour l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapeutiques ou de nouveaux vaccins. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV2 utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 à 10 semaines à réception.
Atteintes microcirculatoires et modification de la cinétique des anti-infectieux aux cours des états de choc par péritonite chez le porcelet anesthésié et ventilé.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
100 porcelets vont être utilisés dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque porcelet subit pendant treize heures l'induction d'un choc septique par péritonite, une ouverture chirurgicale de l'abdomen et la pose de cathéters, pour mesurer la diffusion des anti-infectieux dans les tissus. Le porteur précise qu'un réveil est impossible car le choc et les souffrances d'organes seraient douloureux. Il indique aussi que ces animaux servent à former des médecins réanimateurs, formation qu'il présente comme "indispensable" à leur pratique.
Objectifs
Les états de choc sont la principale cause de décès des patients de réanimation. Ils sont à l'origine d'atteintes vasculaires responsables d'un mauvais fonctionnement des organes. Mieux comprendre les facteurs influençant ce mauvais fonctionnement des organes pourrait modifier le pronostic des patients. Deux types de traitements sont couramment utilisés. Le premier est le remplissage vasculaire (RV). Il consiste à perfuser au malade des produits pour augmenter son volume de sang. C'était l'objet de travaux précédents qui portaient sur l'évaluation de l'efficacité de différents liquides de RV pour traiter les états de choc infectieux chez le porcelet endormi (anesthésié) et sous respirateur. L'autre principal traitement des chocs infectieux est la prescription de médicaments pour tuer les bactéries ou les champignons (antibiotiques et antifungiques) responsables de l'infection. L'efficacité de ces médicaments dépend de leur quantité dans le sang et de leur capacité à aller dans les organes. L'objectif de ce projet consiste à étudier la concentration des anti-infectieux dans un modèle de choc infectieux pour mieux comprendre leur répartition lors de l'infection et pouvoir adapter les doses et les temps d'injection. Il s'agit de la deuxième étape d'étude sur cette thématique, faisant suite à un premier modèle de choc créé par injection intraveineuse de toxine de la bactérie Eschérichia Coli. Dans cette nouvelle étude nous avons décidé de tester un modèle de choc plus physiologique en induisant une péritonite (infection abdominale). Les animaux ne seront soumis qu'à une seule procédure sans réveil qui consistera dans un premier temps à induire un choc infectieux, puis ensuite à traiter les animaux avec le médicament à tester. Tout au long de de la procédure les animaux resteront anesthésiés et ventilés mécaniquement, leur évitant ainsi stress et douleur liée au choc. Nous étudierons la concentration des antibiotiques non seulement dans le sang, mais également dans les tissus par une technique de microdialyse qui permet de collecter des échantillons en temps réel et de réaliser des mesures sans avoir à prélever les tissus. L'atteinte des vaisseaux quant à elle sera étudiée par microcope laser. Cette technique avait déjà été utilisée dans nos projets précédents.
Bénéfices attendus
L'augmentation de la perméabilité vasculaire observée lors du choc septique et l'oedème tissulaire qui en découle influence la diffusion et la concentration des anti-infectieux dans l'organisme. Connaître cette atteinte microvasculaire et la modification de la pharmacocinétique des anti-infectieux lors du choc septique est fondamentale pour la prise en charge optimale des patients. L'étude pharmacologique nécessite un modèle reproductible stable, permettant une modélisation fiable. Le modèle porcin remplit toutes les conditions pour permettre de répondre à cette problématique. De plus, les groupes étudiés vont permettre de continuer l'étude de la micro-circulation par microscopie confocale lors du choc septique.
Procédures
La procédure complète se déroulera sur 13 heures : 1 heure environ pour la préparation de l'animal, 4 heures pour l'induction du choc septique, et 8 heures pour la collecte des données. En raison du choc septique et des souffrances d'organes, un réveil est impossible car responsable de douleur. La phase la plus douloureuse est la réalisation d'une microlaparotomie au niveau abdominal pour la mise en place d'une sonde urinaire. Elle sera réalisée après l'injection intraveineuse de sufentanil afin de prévenir la douleur. Cette ouverture chirurgicale permet également d'avoir accès au mésentère de l'intestion grêle afin de réaliser des images par Cellvizio (endomicroscope confocal laser) pour l'évaluation de la porosité des vaisseaux (ces images sont réalisées après injection intraveineuse de dextran 70 kda couplé à la fluorescéine).
Impact sur les animaux
Les animaux ne seront soumis qu'à une seule procédure sans réveil qui consistera dans un premier temps à induire un choc infectieux, puis ensuite à traiter les animaux avec le médicament à tester. Tout au long de de la procédure les animaux resteront anesthésiés et ventilés mécaniquement, leur évitant ainsi stress et douleur liée au choc induit. Nous étudierons la concentration des antibiotiques non seulement dans le sang, mais également dans les tissus par une technique de microdialyse qui permet de collecter des échantillons en temps réel et de réaliser des mesures sans avoir à prélever les tissus. L'atteinte des vaisseaux quant à elle sera étudiée par microcopie confocale. Cette technique avait déjà été utilisée dans nos projets précédents.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
Il s'agit d'une étude descriptive qui a pour objectif de démontrer une théorie pharmacocinétique. Il n'existe pas de méthode alternative permettant d'atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques.
Réduction
L'étude de la pharmacocinétique (devenir du médicament dans l'organisme) des anti-infectieux se fait par modélisation mathématique qui nécessite 8 données pour chaque temps de prélèvement. Afin d'anticiper des pertes dues à l'état de choc mais qu'il est difficile de prévoir, il a été décidé de relever ce nombre à 10. Ainsi pour chaque anti-infectieux, nous utiliserons un groupe de 10 porcelets et chaque animal sera son propre témoin. En considérant l'étude de 2 anti-infectieux par an, nous envisageons d'utiliser 20 animaux par an, soit 100 animaux sur 5 ans. L'ensemble des analyses statistiques sera effectuée par une équipe de médecins statisticiens agréés qui a validé ce modèle de cinétique dans des publications internationales. De plus, les animaux de ce projet permettront en parallèle de former les médecins réanimateurs à la réalisation de gestes sous échographie et à la prise en charge du choc infectieux, indispensable à leur pratique professionnelle et requise pour la validation de leur formation.
Raffinement
Nous attacherons une importance majeure au raffinement des conditions d’hébergement et d'enrichissement pendant la période d'acclimatation d'une semaine. - Contact et observations quotidiennes par les soigneurs (apparence physique externe, comportement , réponses comportementales aux stimuli externes...). Toute anomalie est remontée au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondi, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent. - Environnement adapté et enrichi : les animaux sont hébergés en groupe. L'enrichissement est réalisé en créant une zone de repos couverte de litière, leur permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement. Ils disposent également de jouets suspendus à mordiller. - Procédure expérimentale réalisée par du personnel qualifié et expérimenté. L’animal reste sous anesthésie générale jusqu'au décès. Au cours des expérimentations, les animaux seront anesthésiés profondément Lors des quelques gestes invasifs et possiblement douloureux, un morphinique sera utilisé (SUFENTANIL 10 μg/h). La mise en place des cathéters sera réalisée sous échographie, évitant l'ouverture cutanée à l'exception de la ponction à l'aiguille. En raison du choc septique et des souffrances d'organes, un réveil est impossible car responsable de douleur. C'est la raison pour laquelle tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.
Choix des espèces
Le porc est un bon modèle d'étude cardio-vasculaire proche de la physiologie humaine. Le comportement hémodynamique et la vascularisation sont également proches de l'Homme, ce qui permet de se former sur l'animal avant l'usage chez l'Homme. De plus, notre équipe de recherche a acquis une expérience de plusieurs années sur ce modéle de grand animal permettant d'optimiser au mieux le modèle. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 2-3 mois, pour des raisons techniques d'une part (poids entre 25 et 35 kg, permettant des groupes homogènes) et pour des raisons de coût d'autre part.
Infestation expérimentale de souris par la forme larvaire d’Echinococcus multilocularis
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection intrapéritonéale de la forme larvaire d'Echinococcus multilocularis, puis développe dans l'abdomen une masse parasitaire qui entraîne une prise de poids et des difficultés de locomotion, avec un risque d'ulcération de la peau par frottement contre la cage. Toutes sont tuées pour récolter cette masse parasitaire, l'objectif étant de maintenir la souche au laboratoire et de produire du matériel pour des outils de diagnostic. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'existe et conclut qu'il est "nécessaire" d'utiliser la souris.
Objectifs
L’objectif du projet est de maintenir au laboratoire un isolat d’Echinococcus multilocularis sur hôtes intermédiaires. E. multilocularis est l’agent causal chez l’Homme de l’échinococcose alvéolaire, maladie rare mais mortelle si non traitée. La transmission à l’Homme se fait exclusivement par voie orale, suite à l’ingestion d’œufs de parasites présents dans l’environnement sur des végétaux souillés, au contact du sol contaminé mais aussi de manière indirecte par ingestion d’œufs manuportés après contact avec le pelage souillé de carnivores porteurs du parasite. Le nombre de cas humains diagnostiqués chaque année en France reste faible, cependant on note une augmentation au cours des dix dernières années de ce nombre qui est passé de 15 à 30 cas en moyenne par an. Le maintien en laboratoire d’isolats d’Echinococcus multilocularis sur hôtes intermédiaires nous permettra de disposer facilement d’un matériel parasitaire de bonne qualité. La maîtrise de l’infection des hôtes intermédiaires en captivité permettra : 1/ De fournir du matériel larvaire de référence pour la mise au point de nouveaux outils diagnostiques. 2/ De produire au niveau de la masse larvaire des protoscolex (forme initiale du futur ver qui se développera dans l’intestin des hôtes principaux).
Bénéfices attendus
L’ensemble des prélèvements récoltés permettra de produire du matériel de référence pour le développement d’outils de diagnostic qui contribueront à une meilleure connaissance de la répartition/ circulation des pathogènes étudiés et à une meilleure compréhension des mécanismes qui aboutissent à l’exposition de l’homme à ce parasite. Les protoscolex produits permettront de reproduire sur des renards en captivité le cycle parasitaire d’ Echinococcus multilocularis pour obtenir des vers adultes et des œufs de parasite.
Procédures
Les souris vigiles ne recevront qu'une seule injection intrapéritonéale (intervention ne prenant que quelques secondes) de la forme larvaire du parasite (0,5 ml) sans anesthésie préalable.
Impact sur les animaux
L'infestation par le parasite, entraine une prise de poids progressive des souris, en raison du développement de la masse parasitaire dans l’abdomen, qui à terme entraine des difficultés de mobilité/locomotion. Exceptionnellement, des cas d’ulcération cutanée liés aux frottements de l’abdomen sur les parois de la cage peuvent être constatés lors de la surveillance journalière. Dans ce cas, les animaux seront immédiatement mis a mort.
Devenir
L'ensemble des animaux sont mis à mort afin de récolter la massse paraistaire.
Remplacement
Il n'existe actuellement pas de méthode alternative in vitro pour produire des protoscolex en dehors de l’infection des hôtes intermédiaires.
Réduction
Le projet utilisera environ 60 souris par an, soit 300 sur 5 ans. Cela se justifie par un temps de developpement de la forme larvaire qui est de 5 mois minimum et par un succès du maintien de la forme productrice de protoscolex qui est de 66%. Ces paramètres nous obligent pour assurer le maintien des souches de répéter l’infestation tous les deux/trois mois sur des lots d’environ 10 souris. Les souris sont issues pour une part importante d'animaux commandés dans le cadre d'un projet concernant la détection d’agents de la menace dans des échantillons d’eau potable contaminée accidentellement ou intentionnellement. Ce type de projet n'étant mis en oeuvre que lors d'évènements de contamination, les souris commandées pour ce projet ne sont donc pas systématiquement utilisées.
Raffinement
Les souris seront surveillées tous les jours et bénéficieront d’un enrichissement (carton, abris plastique et cellulose, bâton de bois,..) dans les cages. Les animaux seront pesés mensuellement jusqu’à 4 mois puis à partir du 5eme mois les pesées seront hebdomadaires afin de contrôler si les animaux atteignent le poids limite de 80 gr. De la nourriture sera diposée au sein même de la cage en cas de problème d’accès à la mangeoire située sur la grille. Si toutefois, les souris montrent des signes de mal-être, des problèmes locomoteurs trop importants, alors les animaux seront mis à mort. L'observation d'une pathologie intercurrente qui ne peut être soignée (ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée) entraîne la mise à mort compassionnelle de l'animal. De même, un point limite de temps a été fixé à 6 mois, point au-delà du quel les animaux sont mis à mort même si le poids limite n'a pas été atteint.
Choix des espèces
Les hôtes intermédiaires d'Echinococcus multilocularis sont les rongeurs sauvages et plus particulièrement Arvicola terrestris, communément appelé Campagnol terrestre ou encore Rat taupier. Comme il n'existe pas de méthode alternative in-vitro pour produire des protoscolex, il est nécessaire d'utiliser le modèle souris, pour obtenir du matériel parasitaire larvaire facilement utilisable pour le développement des outils diagnostiques et pour l’infestation des hôtes définitifs en captivité. Notre expérience a montré que le stade de développement n'avait pas d'influence sur la sensibilité du parasite et le developement de la forme larvaire. Les souris sont issues pour une part importante d'animaux commandés dans le cadre d'autres projets concernant la détection d’agents de la menace dans des échantillons d’eau potable contaminée accidentellement ou intentionnellement. Ce type de projet n'étant mis en oeuvre que lors d'évènements de contamination, les souris commandées pour ce projet ne sont donc pas systématiquement utilisées et ne sont donc entrées dans aucune procédure. Les animaux utilisés peuvent donc avoir des poids compris entre 20 et 30 grammes.
Identification des mécanismes impliqués dans la fonction pro-tumorale des cellules tuft dans le cancer gastrique causé par Hélicobacter
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont une partie sous anesthésie sans réveil et le reste de gravité légère à modérée. Elles sont infectées par la bactérie Helicobacter felis, qui provoque des lésions gastriques et un cancer de l'estomac avec perte de poids, et reçoivent des gavages et des injections répétés. Le porteur indique suivre l'apparition des lésions sur des durées d'au moins six mois et mettre à mort les animaux dès l'atteinte de scores de souffrance définis. Il qualifie le modèle animal d'"indispensable" faute de méthode reproduisant ce processus, l'objectif restant de comprendre le rôle de certaines cellules dans la tumeur.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de découvrir les mécanismes impliqués dans les propriétés inflammatoires et pro-tumorales des cellules tuft en utilisant des modèles murins innovants suite à une infection à Helicobacter.
Bénéfices attendus
Elucider les mécanismes moléculaires impliqués dans les propriétés pro-oncogeniques des cellules intestinales suite à une infection à H. felis. Les analyses moléculaires pourraient permettre l'identification de substances biologiques potentiellement médicamenteuses. Cela mettrait en lumière de nouveaux mécanismes d’interaction entre H. felis, les cellules tuft et la muqueuse gastrique, ouvrant ainsi la voie à des approches thérapeutiques inexplorées.
Procédures
Gavage sur animal vigile : 1100 souris, 1 fois par jour sur 3 jours Injection intrapéritonéale sur animal vigile : 150 souris, 1 fois par jour pendant 5 jours Prélèvement sanguin rétro-orbitaire sous anesthésie générale : 1980 souris, 1 fois en phase terminale
Impact sur les animaux
Perte de poids liée à l’infection à H. felis et au développement de lésions gastriques dans les expériences d’infection d’une durée supérieure ou égale à 6 mois. Souffrance observée.
Devenir
Nous souhaitons faire des analyses sur les prélèvements issus des animaux. Pour cela les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure pour que leurs organes soient prélevés.
Remplacement
Nous souhaitons étudier les propriétés inflammatoires et pro-tumorales des cellules tuft gastriques suite à une infection à H. felis. A ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour mimer ce processus ce qui rend le modèle animal indispensable.
Réduction
Le modèle d’infection à H. felis est connu et maitrisé par notre équipe. En souris contrôle (dit WT) nous utiliserons les souris non transgéniques issues des accouplements des lignées dans un but de réduire le nombre d’animaux. Nous prévoyons également d’utiliser des mâles et des femelles pour l’objectif 5 dans les expériences de lineage tracing, toujours dans un but de réduction. Pour les autres objectifs, des mâles seront utilisés car la réponse inflammatoire et la carcinogenèse sont maximales chez les mâles d’après les études antérieures du laboratoire et d’après la littérature scientifique. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de réaliser des études statistiques ; pour cela, d’après les publications précédentes de l’équipe et d’après la littérature scientifique sur ces modèles murins d’infection par H. felis qui présentent une certaine hétérogénéité de réponse entre animaux, des groupes de 10 animaux par condition expérimentale sont requis.
Raffinement
Les souris seront suivies en suivant les critères de la feuille de scoring fournie en annexe. Pour un score compris entre 6 et 12 les souris recevront de la nourriture humidifiée dans la cage. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas en 48 h il sera immédiatement sacrifié. Si le score est supérieur ou égal à 12, l’animal sera sacrifié sans attendre. Les souris seront pesées (de façon hebdomadaire), si la perte de poids est de 10% par rapport à la semaine précédente l’animal sera sacrifié sans attendre.
Choix des espèces
Le modèle d’infection à H. felis a été mis au point chez la souris. De plus nous disposons de plusieurs lignées de souris transgéniques pour ce projet qui nous permettront de répondre aux objectifs fixés. Les souris seront utilisées à un âge de 6-7 semaines car c’est l'âge optimal pour permettre une infection à H. felis. Après ce stade l’infection ne se met pas en place.
Potentiel vaccinal de souches de virus du Nil Occidental atténuées
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit deux injections de virus, une souche atténuée candidate au vaccin puis la souche pathogène, et subit jusqu'à sept prises de sang. Le porteur indique que l'infection par le virus du Nil occidental peut provoquer paralysie, prostration, dos voûté et perte de poids d'au moins 20 %, l'animal étant tué dès l'apparition d'un signe sévère. Il affirme que l'étude d'une réponse protectrice "ne peut être effectuée qu'in vivo".
Objectifs
Le virus du Nil Occidental (West Nile Virus) est un flavivirus pouvant conduire à des cas sévères d’encéphalite virale (dans 1 infection sur 150 environ chez l’homme). Cela pouvant conduire à la mort de la personne infectée. Il n’existe à ce jour que des traitements symptomatiques et il n’existe aucun vaccin efficace chez l’homme. La mise en place d’un vaccin atténué contre le WNV est donc d’intérêt clinique. Nous avons décrit dans les dernières années différentes mutations permettant d’atténuer le virus WNV. Ainsi des mutations dans la protéine de membrane réduisent significativement la production virale par rétention réticulaire. De plus une mutation dans la protéine d’enveloppe abrogeant la glycosylation de la protéine E conduit également à une souche atténuée. Cependant ces virus ne sont pas complètement atténués, et la probabilité de réversion est théoriquement importante. Notre objectif est de générer un virus vivant atténué comportant simultanément plusieurs des mutations décrites, et tester la capacité de ce virus à répliquer, et à éliciter une réponse immunitaire protectrice contre une infection d’épreuve. En un premier temps, nous testerons l’atténuation du virus in-vivo, i.e. l’absence de symptômes sévères et l’absence de mortalité. Nous confirmerons que chez l’animal aucun virus révertant n’émerge (i.e. les mutations sont maintenues). Enfin nous testerons l’efficacité de ce virus à induire une protection contre une infection secondaire par le virus WNV sauvage (challenge).
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’étudier un triple mutant du virus WNV (1 mutations dans la protéine E, deux mutations dans la protéine M) qui pourrait constituer un virus atténué, sûr et au potentiel vaccinal. Les 3 mutations étudiées dans ce projet ont déjà été décrites indépendamment dans la littérature mais mis en évidence une atténuation partielle ou pourraient muter et redevenir pathogène.
Procédures
Chaque animal sera soumis à deux injections de virus (souche vaccinale puis souche pathogène ; quelques minutes par injections), et à 7 prises de sang au maximum (alternance veine caudale et rétro-mandibulaire ; quelques minutes par prise de sans).
Impact sur les animaux
Les souris seront suivies et mises à mort dans le cas de souffrance selon les critères définis. Suite à l’infection par le virus West Nile, les souris sont susceptibles de développer les symptômes suivants : Symptômes sévères : paralysie, prostration, dos fortement voûté, perte de poids supérieure ou égale à 20%, facies douloureux. Symptômes légers : réduction de la motricité, isolement, dos légèrement voûté, perte de poids inférieure à 20%, poils ébouriffés. Dans le cas de l’apparition d’un symptôme sévère, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas de l’apparition de deux symptômes légers, l’animal sera immédiatement mis à mort.
Devenir
Les souris ont reçu du virus et un traitement potentiellement vaccinal, elles ne peuvent donc ni être réutilisées ni replacées ni adoptées, et sont donc mises à mort.
Remplacement
L’étude de la capacité d’un virus atténué à induire une réponse protectrice ne peut être effectuée qu’in vivo. Nous aurons au préalable confirmé que le virus est capable de réplication efficace et incapable de réverter in vitro. Le modèle souris (Balb/c) est un modèle précédemment utilisé pour les essais vaccinaux précliniques contre les infections à WNV.
Réduction
Nous commencerons par une expérience préliminaire sur 18 souris femelles, qui permettra de valider le nombre d’animaux à utiliser dans les expériences suivantes pour atteindre la significativité. Les groupes contrôles pour lesquels on connait bien la mortalité en réponse au virus WT, est nécessaire pour tester l’inoculum viral ; nous aurons dans ce groupe 3 animaux. Les expériences ne seront réalisées sur les mâles que si les résultats sont concluants chez les femelles. Nous commencerons par travailler chez les femelles car elles sont plus faciles à gérer. Bien que des différentes immunologiques entre mâles et femelles peuvent être décrits dans certains, cas, il n’y a eu aucune différence observée au cours les études antérieures.
Raffinement
Les souris seront suivies 3 fois par semaine (quotidiennement à partir de J7 post challenge). Pour réduire les risques de souffrance inutile, les animaux seront mis à mort selon les critères de suivi. Les souris seront suivies et mises à mort dans le cas de souffrance selon les critères définis. Suite à l’infection par le virus West Nile, les souris sont susceptibles de développer les symptômes suivants : Symptômes sévères : paralysie, prostration, dos fortement voûté, perte de poids supérieure ou égale à 20%, facies douloureux. Symptômes légers : réduction de la motricité, isolement, dos légèrement voûté, perte de poids inférieure à 20%, poils ébouriffés. Dans le cas de l’apparition d’un symptôme sévère, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas de l’apparition de deux symptômes légers, l’animal sera immédiatement mis à mort. En cas de problèmes de motricité, la nourriture et du gel d’hydratation seront déposés directement dans cage. En cas de symptômes légers, davantage de coton dentaire sera ajouté.
Choix des espèces
La souris Balb/c est un modèle à la fois simple et bien décrit de mammifère pour évaluer la capacité vaccinale de virus atténués WNV. S’ils sont positifs, les résultats chez la souris constitueront une première preuve de l‘efficacité vaccinale de ce virus atténué, permettant alors d’envisager la conduite d'autres essais précliniques. En règle générale, les jeunes animaux sont plus sensibles aux Flavivirus neurotropes et sont donc préférentiellement utilisés. Nous utiliserons dans cette étude des animaux âgés de 3 à 4 semaines, afin que les souris soient âgées de 8 à 9 semaines au moment de l’épreuve.
Etude de l’activité anti-biofilm à Candida sur cathéter vasculaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
57 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Livrés déjà porteurs d'un cathéter vasculaire, ils reçoivent dans ce cathéter un composé d'origine lichénique contre la formation de biofilm à Candida, et sont hébergés seuls avant d'être tués pour récupérer les cathéters. Le porteur indique que l'isolement, lié à la fragilité du point de sortie du cathéter, est source de stress géré par de l'enrichissement. Il affirme qu'il est difficile de reproduire in vitro les conditions du flux et du système immunitaire, et conserve donc le modèle animal.
Objectifs
L'objectif du projet est de pouvoir montrer l'intérêt de l'utilisation de composés d'origine lichenique comme antifongique dans le cas de la formation de biofilm sur cathéter vasculaire.
Bénéfices attendus
L'objectif est de selectionner de futurs candidats médicaments permettant d'inhiber la formation de biofilm à Candida dans les cathéters des patients.
Procédures
les animaux sont cathétérisés par le fournisseur. Un changement de lock solution doit être effectué toutes les 72h, au minimum, selon les recommandation du fournisseur. Celle-ci est utilisée pour remplir le cathéter afin que le sang ne remonte pas dedans entre 2 utilisations. Cela évite la formation de caillots présentant un risque d'obstruction du cathéter et/ou de diffusion de celui-ci ensuite dans l'organisme. Ces caillots pourraient ainsi entrainer des dégats au niveau des viscères de l'animal en obstruant les voies de circulation sanguine.
Impact sur les animaux
Les animaux cathétérisés sont achetés chez l'éleveur après chirugie. Le traitement par les composés évalués sera administré seulement dans le cathéter pour un effet local (lock solution). Nous n'envisageons donc pas d'effet sytémqie chez le rat. Les animaux seront hébergés individuellement en raison de la fragilité du point de sortie du cathéter. Ce stress sera géré par l'ajout d'enrichissement.
Devenir
Les cathéters devant être récupérés en fin d'expérience pour être analysés, les animaux sont euthanasiés au préalable.
Remplacement
Il a été démontré que les espèces particulières de Candida, la nature de la surface de l’appareil, la présence d’un film de conditionnement dérivé de l’hôte et le débit de liquide affectent le développement du biofilm (Chandra, J. J. Bacteriol, 2001). En raison de la complexité du milieu entourant les dispositifs médicaux prothétiques implantés, comme les cathéters intravasculaires, il est difficile de reproduire avec précision les conditions in vivo dans les modèles in vitro. Bien que des progrès aient été faits pour reproduire le flux dans un modèle in vitro, pour imiter le conditionnement des dispositifs intravasculaires par une exposition préinfectieuse à divers composants sériques comme le fibrinogène, ces deux paramètres n'ont pour le moment pas encore été corcectement simulés en raison de la complexité du flux intavasculaire et intracathéter et/ou de la diversité de la composition protéique sérique . Il n’est pas possible d’inclure dans ces modèles chacune des protéines hôtes qui sont probablement importantes in vivo (Chandra, J. J. Bacteriol, 2001) . Plus important encore, le système immunitaire de l’hôte et le site d’infection n’ont pas été pris en compte dans ces systèmes in vitro. Il est donc souhaitable de tester des modèles de biofilms in vivo et le straitements permetatnt de les éliminer (Andes D., Infect Immun, 2004).
Réduction
Le nombre d'animaux a été déterminé en utilisant le logiciel G*Power avec les paramètres suivants (test = anova, risque alpha = 0.05, puissance = 0.80, 4 groupes). Cette expérience sera réalisée en double pour valider les résultats obtenus lors de la première expérience. Afin d'améliorer le raffinement, une première expérience sera réalisée pour déterminer le meilleur paramètre de développement du biofilm reposant sur la détermination de la concentration de l'inoculum de levures à injecter dans le cathéter. Le nombre d'animaux a donc été réduit au strict nécessaire pour conduire à des résultats interprétables.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement dès leur arrivée et seront traités conformément aux indications du fournisseur, en particulier pour l'entretien du cathéter. Le choix de l'espèce Rattus norgegicus est issu de la littérature, ce modèle est décrit comme robuste et moins susceptible d'obturation du cathéter (information du fournisseur et expérience personnelle chez la souris). Le nombre d'animaux a été déterminé de façon rationnelle pour obtenir des résultats interprétables et analysables statistiquement. L'expérience a été conçue pour éviter toute souffrance inutile des animaux. Cependant tout animal montrant des signes de gravité sera euthanasié conformément aux critères indiqués dans les procédures.
Choix des espèces
Les modèles de biofilm sur cathéter sont décrits chez plusieurs espèces animales : la souris, le rat et le lapin. Les cathéters chez la souris sont difficles à manipuler et s'obstruent plus facilement en raison d'un diamètre interne faible. Chez le rat et le lapin, cet inconvénient est très fortement diminué. Le modèle de cathéter vaculaire chez le lapin est peu utilisé par les équipes de recherche, selon la littérature scientifique. De plus, l'expérimentateur n'a pas d'expérience dans la manipulation des lapins. Le rat a donc été choisi comme espèce dans les modèles décrits dans les procédures. Cette étude visant à évaluer le traitement de cathéters vaculaire chez des animaux en pleine possession de leur capacité de défense immunitaire, des animaux trop jeunes ou trop vieux ne réponderont pas à cette condition. De plus, le diamètre des cathéter utilisables chez des animaux jeunes sera plus restreint rendant le risque d'obstruction plus élevé.
Modèles d’étude pour les pathologies infectieuses humaines : souris humanisées pour le système immunitaire et/ou le foie
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
5 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Greffées avec des cellules humaines, elles subissent une irradiation sublétale, des prélèvements de sang, des chirurgies puis une infection par des virus comme le VIH ou les hépatites B et C, pour étudier ces infections et tester des traitements. Le porteur indique que certaines souris présentent un poids réduit lié à une déficience hépatique et peuvent développer une dermatite, avec mise à mort si le score de souffrance atteint le point limite. Il présente ce modèle comme le "seul" permettant ces infections et comme une alternative au recours aux primates non-humains.
Objectifs
Ce projet utilise le seul modèle murin expérimental qui permet de suivre la progression in vivo des infections par des virus à tropisme restreint aux humains et aux primates non-humains. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la physiopathologie induite par l’infection des virus de l’immunodéficience humaine (VIH), d’Epstein-Barr (EBV), de l’hépatite B (VHB), et de l’hépatite C (VHC) en suivant les réponses immunitaires, et évaluer l’impact des nouvelles approches antivirales ou vaccinales. Ce type d’expérimentation ne peut pas être mené chez l’hôte naturel de ces virus pathogènes (l’homme) et s’avère de plus en plus difficile à mettre en place chez des primates non-humains. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces virus, des modèles de souris humanisés pour le système immunitaire (souris HIS), ou pour le foie avec l'ajout d'hépatocytes humains (souris HUHEP), ont été développés au cours des deux dernières décennies. Comme premier modèle, nous avons généré des souris immunodéficientes (BRGS), par l’invalidation fonctionnelle des gènes codant pour certaines protéines. Les principaux mécanismes de rejet de greffe sont absents chez ces souris ce qui permet l’établissement d’une xénogreffe hématopoïétique humaine après injection de cellules souches hématopoïétiques humaines (HSC). Des études précédentes ont montré que les souris HIS étaient susceptibles aux infections par les virus HIV ou EBV, et modélisaient les réponses immunitaires humaines. Un second modèle murin immunodéficient porte en plus un gène urokinase plasminogen activateur (uPA) qui est toxique pour les hépatocytes dans le foie, ce qui induit une déficience hépatique. Ces souris sont greffées avec des hépatocytes humains adultes sains qui participent à la régénération du foie et constituent le modèle HUHEP. Des études précédentes ont montré que les hépatocytes humains pouvaient être infectées par les virus VHB et VHC ainsi que par le parasite de la malaria (Plasmodium falciparum) chez ces souris HUHEP. La combinaison des deux modèles ci-dessus, dite HIS-HUHEP permet une étude approfondie des interactions entre le système immunitaire et le foie dans le cadre d’infections hépatiques (VHB, VHC, P. falciparum). Celui-ci permet de décortiquer les mécanismes d’infection et de mieux comprendre la pathogénèse complexe induite par ces microbes invasifs.
Bénéfices attendus
Ces modèles animaux permettront de mieux caractériser les mécanismes d'infection et de réplication des virus (VIH, EBV, VHB, VHC), le rôle du système immunitaire dans l'évolution des pathologies, ainsi que de tester des nouvelles stratégies thérapeutiques et vaccinales. Bien que des traitements thérapeutiques existent pour les patients atteints de VIH, un vaccin thérapeutique permettrait de contrôler les infections de manière pérenne. Il n’existe pas de vaccin préventif pour le VIH et le VHC, ainsi des millions de nouvelles infections surviennent par an, ne permettant pas d’éliminer ces virus de la population globale. Bien qu’un vaccin sûr et efficace existe pour le VHB, plus de 260 millions de personnes sont actuellement infectées et seul 1% de ces patients ont accès aux traitement thérapeutiques, le VHB induit des hépatocarcinomes à mauvais pronostique. Ces traitements, comme celui pour le VIH, doivent être pris à vie, induisant un coût élevé pour la société et un risque de survenu d’échappement virologique. Ainsi, les recherches se poursuivent pour développer des vaccins, ou des traitements curatifs, pour ces pathologies. L’interaction entre la réponse immunitaire et le virus est essentiel dans la progression de la pathologie, comprendre ces mécanismes d’action est une clé de voute pour développer des nouveaux concepts de traitements à visé thérapeutiques, ou des vaccins. Or, les modèles animaux qui permettent d’étudier ces interactions sont rares étant donné que ces virus n’infectent que des cellules humaines ou de chimpanzés. Afin de modéliser ces questions, nous avons développé des modèles de souris greffées avec des cellules humaines qui sont susceptibles à ces virus, permettant d’étudier les réponses immunitaires antivirales humaines. L’ensemble de ces études participe à comprendre la physiopathologie induite par ces virus chez l’humain, et à développer des nouveaux traitements thérapeutiques et des stratégies vaccinales afin d’éliminer ces maladies.
Procédures
Les procédures expérimentales décrites prévoient les interventions suivantes : irradiation avec des doses sous-létales (une fois par vie, 1-3 minutes), prélèvements sanguins en retro-mandibulaire (chaque prélèvement dure quelques secondes et est réalisé tous les 15 jours au maximum), anesthésie et procédures chirurgicales (une fois par vie, environ une heure et demi par animal), infection par des virus (une fois par vie, chaque infection dure quelques secondes).
Impact sur les animaux
Le degré de gravité des procédures est considéré comme léger (injections et prélèvements) ou modéré (conséquences potentielles à long terme de l’irradiation sous létale ou chirurgie). Les animaux portant le transgène uPA ont un poids réduit (autour de 10% en dessous du poids normal) du à leur déficience hépatique qui entraîne des défauts métaboliques. Ce poids diminué n’affecte pas le comportement des animaux, n’entraîne pas de souffrances, ni de stress, d’après nos observations sur plusieurs années d’expérimentation. Les animaux humanisés pour le système immunitaire et exprimant le transgène TSLP peuvent développer une dermatite. Afin de soulager la dermatite, les animaux seront traités avec une solution antiseptique (bétadine) avec un anesthésiant locale (lidocaine) et ils pourront être hébergés sur une litière de cellulose plus adaptée aux peaux sensibles. Leur phénotype est suivi toutes les semaines selon les critères et les points limites suivants : 1. Apparence global de l’animal score 0 : normal score 1: poils ébouriffés, rougeur de peau ou perte de poils sur moins de 50% du corps, expression faciale modérée, animal en mouvement score 2: dos voûté, perte de poils sur plus de 50% du corps, expression faciale sévère, absence de mouvement, prostration. 2. Conditions corporelles (cachexie) score 0: BCS (Body Condition Scoring) 3: L’animal est bien conditionné. La colonne vertébrale est continue. Vertèbres palpables seulement avec une pression ferme. score 1: BCS 2: L’animal est sous-conditionné. Segmentation de la colonne vertébrale évidente. Les os du bassin dorsal sont facilement palpables. score 2: BCS 1 : L’animal est amaigri. Structure squelettique extrêmement visible et peu ou pas couverte par la chair. Vertèbres distinctement segmentées 3. Poids score 1: perte de plus de 10% du poids score 2: perte de plus de 20% du poids Le point limite est défini par la détection d’un score =2 Si un score > 0 est observé, les animaux auront une surveillance renforcée. Si un score = 2 est observé, les animaux seront mis à mort.
Devenir
A l’issu de la procédure expérimentale #1 les animaux seront mises en expériences suivant les procédures expérimentales # 2, 3, 4 et 6. A la fin de ces procédures expérimentales les animaux seront mis à mort pour être analysés afin de caractériser la physiopathologie et la réponse immunitaire induite par les virus VIH, VHB, VHC, EBV. A l’issu de la procédure expérimentale #5 les animaux seront mis en accouplement.
Remplacement
Ce projet nécessite un modèle expérimental soutenant l’ensemble des mécanismes de la physiopathologie induite par une/des infection(s) virale(s). Or, de nombreux exemples démontrent que les tests d’efficacité de thérapies antivirales in vitro ne se confirment pas systématiquement in vivo en phase clinique chez l’Homme du fait des dynamiques complexes mises en jeu dans l’organisme (cinétique de l’infection; distributions cellulaires ; bio-distribution des composés; réponse immunitaire). Historiquement, les modèles infectieux de choix restent le macaque pour le VIH (avec le virus simien apparenté VIS ou l’hybride SHIV) et le chimpanzé pour le VHC et le VHB. En proposant comme modèle alternatif la souris humanisée pour le système immunitaire et/ou le foie, nous appliquons de manière relative le principe de remplacement en écartant l’utilisation de primates non-humains, avec l’avantage supplémentaire d’utiliser un modèle expérimental directement adapté au pathogène humain natif. A ce titre, les souris HIS et HIS-HUHEP sont le seul modèle expérimental correspondant à ces critères (mis à part l’Homme lui-même, chez lequel il est éthiquement inacceptable de tester directement de nouvelles stratégies préventives ou thérapeutiques).
Réduction
Le plan d’étude bénéficie de nos connaissances antérieures obtenues avec des souris humanisées sur l’infection par le VIH et le VHB. De plus, nous utilisons un modèle de souris HIS qui est à la pointe du domaine, ce modèle est sans cesse optimisé pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux requis par expérience. Il sera essentiel de compter un minimum de 10 animaux par groupe, du fait de cette variabilité intrinsèque, et d’inclure l’ensemble des groupes contrôles pour valider les conclusions de chaque étude. La planification des expériences en amont et la concertation entre les membres de l’équipe seront des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux.
Raffinement
Les cages d’hébergement sont enrichies avec un coton dentaire permettant une nidification, et avec des refuges en forme de dômes en cellulose dans les cages de croisements. Par ailleurs, le stress des animaux est largement diminué par l’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques lors de la majorité des procédures. L’isoflurane par voie respiratoire présente l’avantage d’être un anesthésiant permettant des séquences d’endormissement courtes et répétées. Les soins post-opératoires tels que des pansements, du gel oculaire, une réhydratation par voie sous-cutanée, et une alimentation hydratante (DietGel) sont inclus dans nos protocoles expérimentaux.
Choix des espèces
La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale soutenant une infection productive par le VIH. La souris HUHEP greffée avec des hépatocytes humains est permissive aux infections hepatotropiques (VHB, VHC, P. falciparum). Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris humanisées pour le système immunitaire (HIS) sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+ dans des souriceaux nouveau-nés (
Evaluation de la survie de souris présentant une pneumonie à Pseudomonas aeruginosa avec ou sans prophylaxie à Porphyromonas
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent par voie nasale, sous anesthésie, une bactérie responsable de pneumonie grave, puis leur survie est suivie pendant sept jours pour tester l'effet protecteur d'un probiotique. Le porteur indique que les souris infectées sans protection peuvent perdre du poids et présenter douleurs, mobilité réduite voire inactivité, une analgésie étant administrée en cas de douleur effective. Il affirme ne pas pouvoir répondre à la question par des cultures cellulaires et conserve donc le modèle animal.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose et chez les patients en réanimation. Cette bactérie, au gré de successives antibiothérapies, devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Lors d’une étude précédente, l’analyse du microbiote respiratoire de patients atteints de mucoviscidose a permis de mettre en évidence un genre bactérien particulier : Porphyromonas. Ce genre bactérien et plus particulièrement Porphyromonas cationae (PC) semble être prédictif de l’infection à PA. Il a été montré chez ces patients, que ceux qui avaient moins de Porphyromonas dans les poumons, avaient plus de risque de se coloniser à PA. Par la suite, il a également été montré que la quantité de PC pulmonaire venait à diminuer, voire disparaître, préalablement à la colonisation à PA alors que PC restait stable chez les patients non colonisés. Précédemment, nous avons testé une souche clinique de Porphyromonas catoniae isolée de patients atteints de mucoviscidose qui semblerait plus efficaces in vivo. Nous avons réalisés 2 expérimentations indépendantes qui ont permis de valider l’effet bénéfique observée ; (réduction significative de la quantité de Pseudomonas aeruginosa à 24h post infection) avec la souche clinique de Porphyromonas catoniae. Nous souhaitons donc poursuivre ces expérimentations afin d’évaluer la survie à l’infection, en complément des diminutions de charge bactérienne, avec un modèle murin d’infection pulmonaire à PA avec ou sans prophylaxie à PC.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentiels bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines dont la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux recevront deux suspensions bactériennes par instillation nasale à 18h d’écart sous anesthésie gazeuse, La durée de chaque instillation dure moins d'une minute. A la suite de quoi, une courbe de survie sera réalisée sur 7 jours.
Impact sur les animaux
L’installation intranasale de bactérie peut induire un stress chez les animaux. L’utilisation d’anesthésie gazeuse lors de l’instillation permet de diminuer significativement le stress chez les animaux, par ailleurs un geste maitrisé par l’expérimentateur, une surveillance accrue (deux fois par jour minimum) des animaux avec un score validé par une publication et l’administration d’un antalgique en cas de dégradation de l’état des animaux permettent également une diminution de ces effets. Lors de la réalisation de la courbe de survie, le groupe témoin recevant seulement PA peut être sujet à une perte de poids, des douleurs, une mobilité réduite voire, une inactivité. Ces derniers seront gérés en accord avec le score choisi, induisant une antalgie en cas de douleur effective. Pour les groupes essais et témoin PC recevant du Porphyromonas, aucun effet indésirable n’est attendu au vu des expérimentations précédentes.
Devenir
A l'issue de la procédure, toutes les souris seront mises à mort afin d'analyser les différents groupes, réaliser les courbes de survie et procéder aux tests statistiques permettant de démontrer le bénéfice thérapeutique d'une proxylaxie par Porphyromonas lors d'une infection à Pseudomonas aeruginosa.
Remplacement
Compte tenu des résultats obtenus in vitro montrant une réduction de la quantité de Pseudomonas aeruginosa souche PAO1 (PAO1) en présence de Porphyromonas cliniques ainsi que les premiers résultats positifs in vivo pour la souche clinique, nous souhaitons poursuivre sur cette voie en confirmant la capacité protectrice de Porphyromonas, ainsi qu’évaluer sa persistance dans le poumon après instillation. Nous ne pouvons pas répondre à cette question scientifique en utilisant des outils de culture cellulaire et tissulaire (culture in vitro et ex vivo), nous choisissons donc de conserver le modèle animal.
Réduction
L’analyse de la survie sera réalisée par comparaison du pourcentage de survie au 7eme jour. Dans l’hypothèse d’une mortalité de 100% dans le groupe des souris infectées par Pseudomonas aeruginosa (souche PA01) et d’une mortalité de 60% dans le groupe des souris ayant reçu une administration prophylactique de Porphyromonas cationae clinique (PC 103) et infectées par PA01 (Groupe PC 103+PA 01) ; le nombre de souris nécessaire par groupe est de 20 souris (risque alpha=0.05, puissance du test 1-béta=90%) Afin de réduire le nombre d’animaux, nous choisissons de limiter le groupe contrôle (Sérum physiologique) à 10 souris car nous n’attendons pas de mortalités Le nombre total de souris sera donc de (3*20) + (1*10) soit 70 souris. Par ailleurs, nous nous limitons à une seule souche de Porphyromonas (P. catoniae ou PC) alors que plusieurs espèces sont décrites dans le poumon. La souche PC103 utilisée lors de ce projet a été préalablement sélectionnée parmi les 7 autres souches cliniques isolées lors d’une précédente étude menée au laboratoire. PC103 a été sélectionnée sur sa capacité à réduire in vitro la croissance de PAO1, sa production d’acides gras à chaines courtes, et son action sur des macrophages, également in vitro.
Raffinement
Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés (isoflurane gazeux), une analgésie est mise en place en cas de dépassement du score M-CASS 11 (de la buprénorphine pour réduire la douleur). Une mise à mort par CO2 sera pratiquée en cas de besoin au cours du suivi ou à la fin du protocole pour les animaux ayant survécus. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux.
Choix des espèces
Les souris C57BL6/J ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats. Les animaux seront utilisés après 1 semaine d’acclimatation à l’animalerie.