Maladies infectieuses

50 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont vaccinés puis anesthésiés pour des prises de sang, avant d'être infectés par voie nasale avec un variant du SARS-CoV-2, pour comparer l'efficacité d'un vaccin candidat. Le porteur indique une perte de poids progressive attendue pendant les six jours suivant l'infection, sans autre symptôme ni décès non désiré selon lui. Tous les hamsters sont tués pour autopsie et collecte d'organes.

Objectifs

Les vaccins récemment développés contre le SARS-CoV-2 sont majoritairement destinés à générer une réponse anticorps vis-à-vis des protéines situées à la surface du virus. Avec un risque de mutation de ces protéines au cours du temps, l'efficacité des vaccins actuels pourrait s'en trouver diminuée. Par ailleurs la réponse anticorps contre cette protéine de surface, s'estompe dans le temps et pourrait ne plus être suffisante pour une protection à long terme nécessitant des rappels vaccinaux réguliers. Le présent projet se propose de poursuivre l'évaluation de l'efficacité d'un vaccin candidat produit à partir d’une protéine conservée au sein de la famille des coronavirus (protéine N), qui oriente la réponse immunitaire vers une réponse cellulaire (en plus de la production d'anticorps) en stimulant certaines catégories de cellules (les lymphocytes T) responsables de la destruction des cellules infectées. Ce projet constitue la quatrième phase d'une étude d'efficacité d'un vaccin candidat (3 études menées en 2021). Ici, l'antigène vaccinal a été obtenu par un nouveau procédé de haute purification afin d'être compatible avec des essais cliniques sur l'Homme prévus ultérieurement. Les objectifs de l'étude sont: 1/ Comparer les 2 formes d'antigène résultant de deux procédés de purification différents: DSP1 (ancien procédé ayant abouti au vaccin candidat évalué lors des 3 précédentes études) et DSP3 (nouveau procédé adapté aux Bonnes Pratiques de Fabrication). 2/ Evaluer l'efficacité du nouveau vaccin candidat combiné à un autre vaccin favorisant la réponse anticorps contre la protéine Spike du virus.

Bénéfices attendus

Une confirmation de l'efficacité du vaccin candidat obtenu grâce au nouveau procédé de haute purification de l'antigène permettra d'entrevoir la phase d'essais cliniques chez l'Homme.

Procédures

Tous les animaux seront : 1/ anesthésiés à J0 pour prise de sang par voie rétro-orbitale et vaccinés par voie intramusculaire avec l'une des formulations vaccinales choisies (durée totale= quelques minutes). 2/ vaccinés à J28 par voie intramusculaire avec l'une des formulations vaccinales choisies (quelques secondes). 3/ anesthésiés à J42 pour prise de sang par voie rétro-orbitale (durée = quelques minutes). 4/ anesthésiés à J56 pour infection par voie intranasale avec un variant du SARS-CoV2 (quelques minutes) 4/ anesthésiés à J60 (50% de l'effectif) ou J63 (50% de l'effectif) pour subir une prise de sang totale par voie intra-cardiaque, et une autopsie pour collecte d'organes (durée totale = environ 10/15 minutes)

Impact sur les animaux

Une perte de poids, progressive et s’étalant sur une période de 6 jours post-infection, est attendue chez les hamsters infectés avec du SARS-CoV2. Hormis cette perte de poids, il n’y a pas de symptômes cliniques attendus durant la période d’infection. L’infection n’aboutit jamais à des décès non désirés. A partir du 7ème jour post-infection, les animaux commencent à reprendre du poids.

Devenir

Les animaux de chaque procédure seront tous mis à mort pour autopsie puis collecte d'organes/sang.

Remplacement

Les évaluations de la réponse immunitaire post-vaccination et de l'efficacité vaccinale ne peuvent être conduites que sur modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été défini de sorte à avoir 5 animaux à chaque temps de mise à mort qui est le minimum généralement requis pour obtenir des résultats d'infection virale statistiquement significatifs.

Raffinement

Les hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.

Choix des espèces

Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc le modèle de choix pour l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapeutiques ou de nouveaux vaccins. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 à 10 semaines à réception.

88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont d'abord rendues immunodéprimées par deux injections, puis infectées par une bactérie hospitalière résistante, Acinetobacter baumannii, par voie intranasale sous anesthésie, avant une mise à mort 24 heures après l'infection pour compter les bactéries dans les poumons et la rate. Le porteur cherche la plus petite dose efficace de rifampicine. Il affirme que le recours aux animaux est une étape obligatoire et réglementaire du développement de médicaments.

Objectifs

L’objectif du projet est de définir la plus petite dose et fréquence d’administration d’un antibiotique (ici la rifampicine) capable d’induire une diminution bactérienne dans les poumons des souris infectées par une souche d’Acinetobacter baumannii résistante aux carbapénèmes (CRAb). En effet les carbapénèmes constituaient la dernière ligne de traitement antibiotique efficace contre ce pathogène fréquemment associé aux infections nosocomiales (acquises en milieu hospitalier), telles que les pneumonies sévères acquises sous ventilation chez les patients de réanimation ou immunodéprimés. Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude réalisée par le laboratoire ayant donnée de bons résultats avec la rifampicine dans ce modèle d’infection.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude déjà réalisée par notre équipe ou les souris infectées et traitées par de la rifampicine à 25 mg/kg administrée 4 fois par jour a montré une réduction bactérienne pulmonaire de plus de 4 Log 24h après l’infection par une souche d’Acinetobacter baumannii résistante aux carbapénèmes. Après plus d’investigations, il s’est avéré que la rifampicine administrée était surdosée par rapport à la clinique. Le but de cette étude est d’évaluer la plus petite dose et fréquence de rifampicine seule ou en association avec un carbapénème permettant une diminution de la charge bactérienne dans le poumon qui se rapproche au maximum de la clinique. Cette combinaison pourrait représenter une nouvelle ligne thérapeutique contre les infections à A. baumannii résistant aux carbapénèmes.

Procédures

L’infection se fera par voie intranasale par l’injection de 50µL à l’aide d’une pipette et sous une petite anesthésie volatile (isoflurane 2%). L’administration des antibiotiques et d’un immunosuppresseur (endoxan) se fera par voie intrapéritonéale (ip). Les souris recevront deux injections d’endoxan en ip à J-4 et J-1 avant infection afin d’obtenir une neutropénie significative mais non létale.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle d’infection, aucune atteinte systémique liée à l’infection n’est attendue (vérifié dans d’autres études réalisées par le laboratoire). Les injections intra-nasales seront réalisées par du personnel compétent et expérimenté. En effet, l’appréhension et l’entrainement liés au geste technique d’injection intra-nasales ont déjà été réalisés sur d’autres expériences et sont maintenant bien maitrisés. Avant l’infection, les souris seront immunodéprimées avec un protocole bien défini (150 mg/kg de endoxan à J-4 et 100 mg/kg à J-1). Ce protocole a déjà été utilisé dans plusieurs études et n’a montré aucun effet indésirable sur les animaux. Les concentrations d’antibiotiques utilisées seront en accord avec les données de la littérature sur ce sujet. Aucune toxicité n’est rapportée. Du fait des temps d’administration des antibiotiques (toutes les 8h pour la rifampicine et toutes les 2h pour le méropénème), la surveillance sera accrue sur la totalité de l’étude (24h). Si l’animal présente des souffrances extrêmes (convulsions, détresse respiratoire, animal amorphe et non réactif aux stimuli), alors une mise à mort prématurée sera mise en place.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort 24h post infection afin de dénombrer la charge bactérienne présente dans les poumons et dans la rate.

Remplacement

La rifampicine est un antibiotique antibactérien de la famille des rifamycines, antituberculeux, antilépreux, dont le mode d'action est la formation d'un complexe stable avec la RNA polymérase des bactéries. Utilisé en clinique, son spectre antibactérien est large et comprend les staphylocoques, les streptocoques et les bactéries à croissance intracellulaire telles que les mycobactéries. Dernièrement, des études in vitro et in vivo ont démontré une activité intéressante chez Acinetobacter baumannii multi résistants (en fonction des résistances). La mesure de l’efficacité de la rifampicine ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement. Pour l’heure, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude a été réduit au maximum (8 souris par groupe) qui permettront de répondre aux hypothèses énoncées et permettre une analyse statistique fiable (estimation de la diminution de la charge bactérienne dans les poumons par une analyse Anova (test post hoc Bonferroni)).

Raffinement

4. D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée du fait de l’interaction reconnue avec les modulateurs de l’inflammation, et risquerait même de faire flamber l’infection. Les injections intra-nasales seront réalisées par du personnel compétent et expérimenté et sous anesthésie volatile (isoflurane 2%). Un programme d’enrichissement de l’environnement sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal. Les animaux seront hébergés à 8 par cage. De plus, une surveillance accrue (toutes les 8h pour la phase 1 et toutes les 2h pour la phase 2) sera réalisée tout au long de l’étude. 5.

Choix des espèces

Les souris Balb/c représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la charge bactérienne. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée pour la mise au point du modèle d’infection pulmonaire à Acinetobacter baumannii dans d’autres projets. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédentes études).

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'un aérosol, puis reçoivent des composés par gavage cinq jours par semaine pendant quatre à huit semaines, avec une perte de poids pouvant conduire à la mort et une mise à mort à 20 % du poids perdu, avant le prélèvement des poumons et de la rate. Le porteur situe le projet dans un consortium européen et revendique un "besoin" de générer un maximum de données. Il affirme que les essais précliniques reposent sur le recours à l'"organisme entier".

Objectifs

Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la sélection in vivo de molécules comme traitement ou encore vaccins avant leur passage en essais cliniques. Le projet européen, dans lequel nous sommes partenaires, est engagé dans le développement de nouvelles molécules anti-tuberculeuses. Ce projet, qui ne compte pas moins de 30 partenaires de 13 pays différents, a pour ambition d’accélérer les processus qui conduiront à la sélection de nouveaux composés et nouvelles combinaisons efficaces comme traitement contre la tuberculose avant leur entrée en phase clinique. Les nouvelles molécules sont synthétisées par des groupes pharmaceutiques partenaires, sont testées par une partie du consortium en charge des expériences in vitro et les plus prometteuses (seule ou en combinaison) passent ensuite à l’étape in vivo pour évaluer leur véritable potentiel sur un organisme vivant. Nous intervenons, avec d’autres groupes, d’autres modèles, à ce niveau-là. Notre participation à ce projet permettra de générer in vivo des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques chez le modèle murin pour un nombre limité de molécules savamment sélectionnées ; données qui, analysées et intégrées à l’ensemble de celles générées par le consortium, participeront donc à l’optimisation et au développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux, à valider ou non leur passage en phase clinique.

Bénéfices attendus

Les données générées par nos expériences combinées à celles des divers partenaires rendront compte de l’efficacité de nouveaux composés contre l’agent pathogène de la tuberculose, dont certains, telle est l’ambition de ce projet, pourront passer en phase clinique. A cela, l’apport de nouvelles technologies, l’apport de nombreuses données inédites pour caractériser la tuberculose et son évolution in vivo (imagerie, biomarqueurs…) seront un support essentiel pour le développent de meilleures armes pour lutter contre cette maladie qui demeure un enjeu majeur de santé publique au niveau mondial.

Procédures

1. L'infection des souris par des souches virulentes de bacilles tuberculeux est effectuée par une exposition à un aérosol. Une seule exposition d’une vingtaine de minutes en début d’expérience. 2. Lors du traitement, les composés sont administrés par gavage 5 jours par semaine pendant 4 à 8 semaines. Il y a 1 gavage par jour par souris. Le nombre de gavages total par souris au cours de l’expérience variera selon qu’une souris soit un contrôle du niveau d’infection ou bien reçoive un traitement de 8 semaines, ou encore permette d’obtenir des données pharmacodynamiques à des stades intermédiaires, par conséquent de 0 à 40 gavages. Le geste technique en lui-même ne prend que quelques secondes. 3. Des prélèvements sanguins de faible volume seront effectués au niveau de la queue pour l'étude de la biodisponibilité́ des composés. Un faible volume de sang (~ 30 µl) sera prélevé au niveau d’une incision faite sur la veine caudale. L’animal, vigile, est pour cela placé dans un dispositif l’immobilisant et ne laissant dépasser que la queue. Une pression est ensuite effectuée au niveau de l’incision avec une compresse imbibée d’alcool pour stopper le saignement. Il y aura au maximum 2 prélèvements – à plusieurs heures d’intervalle – pour chaque souris sélectionnée pour l’étude pharmacologique. Il s’agit d’un acte rapide qui doit prendre 1 à 2 min. 4. Pour l’analyse de biomarqueurs, des prélèvements de sang seront effectués par ponction cardiaque sur animaux anesthésiés avant leur mise à mort prévue pour le prélèvement des organes. Sont concernés l’ensemble des animaux de l’expérience (maximum 120). Une fois les animaux anesthésiés, le geste technique ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Sur la base de nos expériences, l’apparition de signes cliniques (déambulation perturbée due à un début de parésie et piloérection) plusieurs semaines après une infection avec des bacilles tuberculeux est précurseur d’une perte de poids qui a terme peut conduite à la mort des animaux. Habituellement à partir de leur apparition, un suivi strict du poids d’abord 2 fois par semaine puis à fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué. Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considérée comme point limite et les animaux concernés seront mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Dans le cas présent, et du fait d’un besoin de générer un maximum de données relatives aux expérimentations, les animaux identifiés par un marquage aux oreilles seront pesés une fois par semaine avec pour premier point celui correspondant au jour de l’infection. A noter que la probabilité de voir l’apparition de signes cliniques sera fortement diminuée pour les groupes d’animaux traités avec une molécule anti-tuberculeuse. Une attention particulière sera portée sur le groupe témoin non-traité avec toujours pour point limite la perte de 20 % du poids.

Devenir

Tous les animaux au cours de la procédure doivent être mis à mort pour prélever les organes cibles (poumons et rate) pour déterminer les charges bactériennes.

Remplacement

Cet important projet comprend de nombreuses études in vitro pour évaluer, entre autres, l’efficacité́ bactéricide des composés (exemple : via l’infection de lignée cellulaire). Néanmoins elles permettront de ne répondre qu’à une partie de la problématique. Ces modèles ne permettent pas d’identifier et donc de caractériser, de façon biologiquement pertinente, tout ce qui concourt, par exemple, à la colonisation du poumon et à l’établissement plus ou moins durable des bactéries. En d’autres termes le recours aux souris, chez qui le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons plus ou moins importants selon la virulence de la souche, permet de reproduire les processus rendant compte de ce qui sous-tend les premières phases du parasitisme – colonisation, persistance ...- des différentes populations des bacilles tuberculeux et rend compte de manière plus approfondie des phénotypes complexes d’une interaction hôte-pathogène. Les essais pré-cliniques de nouveaux médicaments antituberculeux reposent entièrement sur la combinaison des méthodologies in vitro avec ces approches in vivo (comprendre la réponse d’un organisme vivant « entier » à un traitement) avant un éventuel passage en phase clinique.

Réduction

Au sein de ce projet, une équipe de statisticiens spécialisés dans les études pré-cliniques a pour rôle de concevoir avec les expérimentateurs les designs expérimentaux en trouvant le meilleur équilibre entre les capacités (techniques et d’hébergement) des différentes équipes et la pertinence des données à générer pour répondre au mieux aux problématiques posées. Et ce, avec toujours en tête, la réduction au minimum du nombre d’animaux nécessaire. Exemples : .pour le groupe témoin traité avec une molécule dont l’efficacité est connue et très bien documentée, seul un nombre limité d’animaux seront mis à mort et uniquement en un seul point de cinétique. La charge bactérienne alors estimée en UFC par rapport à celle avant traitement donneront une tendance sur l’efficacité de la réponse qui sera comparée aux multitudes de données pour ce composé déjà existantes et qui permettront d’établir la cinétique sans avoir eu à utiliser des animaux pour des points de cinétique intermédiaires. .pour une étude avec un nouveau composé et donc avec peu voire pas de donnée de disponible, plus d’animaux seront nécessaires pour décrire la réponse au traitement au cours du temps. Néanmoins, nous ne cesserons d’optimiser au minimum le nombre d’animaux requis. Il peut être envisagé d’avoir 5 animaux pour seulement 1 ou 2 points clefs de la cinétique, comme 4 semaines et 8 semaines – dans le cas d’un traitement de 8 semaines – et ainsi obtenir des données statistiquement robustes sur ces points charnières. Ensuite sur des points intermédiaires comme à 1 semaine, 3 semaines ou 5 semaines après le début de traitement, ne mettre à mort « que » 2 animaux serait suffisant pour estimer la cinétique de la réponse. A nouveau, tout ceci repose sur l’étroite collaboration mise en place avec ces spécialistes de la modélisation informatique d’essais pré-cliniques qui analyseront l’ensemble des résultats du consortium. La procédure expérimentale ne cessera d’être optimisée, notamment en termes de nombre de points d’observation / nombre d’animaux par points au cours du traitement ou encore sur la durée entre l’ingestion des composés et le prélèvement de sang périphérique, avec toujours cette considération à minimiser les contraintes de manipulations et réduire au minimum le nombre d’animaux pour l’obtention de données utiles. A noter qu’il a été délibérément choisi que ce soient les mêmes animaux qui serviront à l’obtention des données pharmacocinétiques et des données pharmacodynamiques.

Raffinement

Des observations régulières des animaux sont effectuées tout au long de l’expérience : d’une part lors de la pesée hebdomadaire depuis l’infection jusqu’au début du traitement puis au cours des administrations quotidiennes des composés. De manière plus précise, nous serons sensibles à l’apparition du moindre signe clinique telles la parésie et la piloérection qui sont précurseurs, sur la base de nos expériences, d’une perte de poids. Dès apparition de ces signes cliniques, un suivi strict du poids à une fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué (de 2 fois par semaine à tous les jours jusqu’à 2 fois par jour, l’animal étant mis à mort en fin de journée s’il est estimé que le point limite sera atteint avant la pesée du lendemain matin). Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considéré comme point limite et l’animal concerné sera mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Il est à noter également que les animaux ne sont jamais privés de nourriture et de boisson. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel.

Choix des espèces

Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la recherche in vivo de nouveaux traitements anti-tuberculeux. Le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection tuberculeuse ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons. Pour ce projet nous utiliserons des souris commerciales immunocompétentes C57BL/6 et BALB/c pour lesquelles de nombreuses données bibliographiques d’études pré-cliniques existent. Nous serons également amenés à utiliser un modèle de souris dont l’intérêt est grandissant depuis quelques années : la souris C3HeB/FeJ dite « Kramnik ». Il s’agit d’un modèle plus susceptible à l’agent pathogène Mycobacterium tuberculosis pouvant induire des lésions nécrotiques et reflétant au final plus fidèlement la stratification et la pathogénèse de la tuberculose chez l’homme. Nos travaux sont effectués sur des animaux adultes car nous avons besoin d’organisme mature en particulier sur le plan immunitaire.

1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont anesthésiées trois fois par semaine pendant quatre semaines et leur cavité buccale est colonisée par la levure Candida albicans, pour mettre au point un modèle d'infection oropharyngée. Le porteur, une société de biotechnologie, présente ce modèle comme un service destiné à ses clients pour tester des composés. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la réponse immunitaire de l'hôte.

Objectifs

La forme la plus fréquente de candidose est une infection superficielle de la bouche, du vagin ou de la peau, qui provoque l’apparition de plaques blanches ou rouges, et un prurit (démangeaisons), une irritation, ou les deux. Les patients immunodéprimés peuvent présenter de très graves atteintes au niveau de l’œsophage ou d’autres organes. Le projet consiste à développer un modèle pré-clinique prédictif afin de tester de nouvelles drogues en développement contre les infections oropharyngées à Candida albicans.

Bénéfices attendus

Notre société de biotechnologie possède une plateforme scientifique dédiée à la validation de nouveaux composés et thérapies pour ses programmes de R&D et ses clients. Le développement de ce nouveau modèle pré-clinique permettra de répondre aux attentes de différents clients et contribuera au développement de thérapies anti-infectieuses innovantes.

Procédures

S'il est prévu d'analyser les animaux après nécropsie uniquement, des prélèvements uniques de sang pourront être réalisés sous anesthésie

Impact sur les animaux

-anesthésie 3 fois par semaine pendant 4 semaines. -écouvillonnage de la cavité buccale et de la langue avec un écouvillon enduit de levure C. albicans -établissement d'une colonisation de la cavité buccale par la levure -traitements par différentes voies d'administration (per os, ip, iv, in).

Devenir

A la fin de la procédure tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever et analyser les organes d'intérêt.

Remplacement

Le recours à l’animal de laboratoire se justifie dans le sens où l’efficacité in vivo d’un composé sur une infection résulte non seulement de l’effet de ce dernier sur les micro-organismes mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur ces agents pathogènes. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes.

Réduction

Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Nous travaillons avec une compagnie spécialisée dans les biostatistiques. Cette collaboration nous permet d’utiliser le nombre strictement nécessaire pour chaque expérience et de l’optimiser durant toute la durée du projet.

Raffinement

L'accent sera mis sur les conditions d’hébergement (soins, enrichissement du milieu) des animaux dans le but d’augmenter autant que possible leur bien-être. Planification du protocole de façon à éviter les perturbations susceptibles d'affecter le bien etre des animaux. Recourir à l’anesthésie. Utilisation de procédures d’euthanasie appropriées.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le traitement des maladies infectieuses: Souris agées de 49-55 jours, afin de reproduire un modèle déjà décrit dans la littérature.

780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections dans le muscle de la patte et des prélèvements de sang au niveau de l'oeil, avant la mise à mort et le prélèvement d'organes, pour comparer des candidats vaccins contre le SARS-CoV-2 et la grippe. Le porteur affirme n'attendre aucune souffrance, tout en prévoyant l'exclusion et la mise à mort immédiate des souris montrant prostration ou perte de poids. Sur le remplacement, il indique que le modèle souris est adapté mais aussi "imposé par son utilisation dans les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques".

Objectifs

Les épidémies de coronavirus et de grippe posent un problème majeur de santé publique. Ces 2 virus sont soumis à de nombreuses modifications génétiques limitant l’efficacité des vaccins actuels. Le virus SARS-Cov2 possède, entre autres, une protéine permettant l’entrée du virus dans les cellules. C’est la cible des vaccins actuels qui génèrent une réponse immunitaire générant de nombreux anticorps de courte durée de vie. Le virus possède également la nucléocapside (N) contenue à l’intérieur du virus, qui est la protéine qui mute le moins entre les différentes souches de coronavirus. Pour le virus de la grippe, il existe également une protéine très conservée, la nucléoprotéine (NP), faisant d’elles des cibles pertinentes pour l’efficacité des vaccins sur le long terme. La technologie mise au point permet aux candidats vaccins d’être très accessible aux cellules du système immunitaire pour protéger des infections. Un partenariat avec une entreprise de biotechnologie permet l’obtention de nouveaux candidats contre la Grippe ou le SARS Cov2 contenant cette technologie. Il est intéressant d’étudier si ces nouvelles formulations vaccinales sont capables de produire des anticorps permettant de lutter contre les virus, mais également de stimuler le système immunitaire afin d’obtenir une protection longue dans le temps. Plus précisément, pour le projet SARS Cov2 les réponses immunitaires sont étudiées suite à l'injection de différents candidats vaccins contenant la protéine permettant l’entrée du virus et/ou la nucléocapside. Pour le projet grippe, des formulations vaccinales avec NP sont caractérisées dans la lutte contre les épidémies saisonnières. Ces études seront réalisées chez le modèle souris. Techniquement, les formulations vaccinales à tester sont injectées dans le muscle de la patte qui est une voie utilisée pour étudier de nombreux phénomènes immunologiques. Des prélèvements de sang réalisés permettront de quantifier les anticorps générés chez les animaux, et des prélèvements d’organes, post mortem, seront étudiés pour valider si les candidats vaccins sont efficaces.

Bénéfices attendus

Les nouveaux condidats vaccins sont très prometteurs pour la santé humaine. Les vaccins récemment développés contre le SARS-CoV-2 ou produits chaque année contre la grippe saisonnière, sont majoritairement destinés à générer une réponse anticorps vis-à-vis de protéines du virus présent à sa surface. Avec l’apparition de nombreuses mutations et donc l’apparition de nouveaux variants, des formulations vaccinales, visant à développer une réponse immunitaire à long terme, pourrait permettre de pallier les problèmes des vaccins actuels. Cela permettrait de mieux traiter les patients avec un vaccin capable d’induire une protection contre différentes souches de SARS-CoV-2 et de la grippe. Selon les résultats obtenus, il pourra être envisagé de porter ce projet à plus grande échelle avec la possibilité de phases cliniques.

Procédures

Tous les animaux du projet vont recevoir 2 injections dans le muscle de la patte sans anesthésie préalable. Ces injections sont espacées de 21 ou 28 jours selon la procédure utilisée et dureront environ 5 à 10 secondes par souris. Pour 30% des animaux, 2 prélèvements de sang seront réalisés, le premier durant les phases d'immunisations, et le second au jour de sa mise à mort. 100ul de sang seront prélevés au niveau de l'oeil sur animaux vigiles. Pour 70% des animaux, seul un prélèvement de sang sera réalisé au jour de la mise à mort de l'animal. Avant chaque prélèvement de sang, une goutte d'un collyre anesthésique local (Tétracaïne) sera appliqué. Chaque prélevement durera 5 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Pour l'ensemble du projet aucune souffrance des animaux n'est attendue. Toutefois, si une souris présente des signes de souffrance tel que la prostration, l'absence de réponse aux stimuli extérieurs ou la perte de poids, elle sera exclue de la procédure et immédiatement mise à mort.

Devenir

L'ensemble des animaux du projet sont mise à mort lors de chaque procédure.

Remplacement

La vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire faisant appel à l’ensemble des organes lymphoïdes et des différents tissus ciblés. Le choix du modèle souris est donc adapté, et également imposé par son utilisation dans les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit à minima sans compromettre les objectifs du projet. Pour obtenir des résultats statistiquement interprétables, des groupes de 6 souris sont nécessaires. L'analyse de puissance et l'estimation de la taille de l’échantillon se font en amont de l’expérimentation. Test d’hypothèse: est-ce que la moyenne de la population traitée avec une constructions X est différente de la moyenne de la population contrôle et de la moyenne des autres groupes immunisés. Pour les analyses des résultats et les comparaisons de plusieurs échantillons nous utilisons les Analyses de variance ou ANOVA (one-way analyses of variance) qui va consister à chercher le rapport entre la variance entre les groupes et la variance à l'intérieur des groupes. Également les tests statistiques comme des tests de comparaison de moyennes de Student, ou non paramétrique (Mann Whitney) avec un seuil minimal du risque alpha fixé à 5% peuvent être utilisés selon les comparaisons souhaitées.

Raffinement

Les souris seront acclimatées durant une semaine. L'immunisation est réalisée dans le muscle. C'est une voie permettant l'obtention d'une bonne réponse immunitaire et étant le peu invasif pour l’animal. Enfin, avant chaque prélèvement de sang, un collyre anesthésique local (Tétracaïne, une goutte) sera appliqué.

Choix des espèces

La réponse immunitaire est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale particulière qui rend impossible son étude dans des tests in vitro

2 000 souris et hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SRAS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie puis reçoivent des traitements ou des vaccins, l'infection étant létale chez la souris transgénique hACE2 avec atteinte du système nerveux central. Le porteur indique que la mise à mort est imposée par la gestion du risque lié à l'agent pathogène. Il présente cette recherche sur modèles animaux comme "essentielle" à la gestion de la crise sanitaire.

Objectifs

Depuis fin 2020, la COVID-19 évolue par vagues épidémiques et l’émergence de variants préoccupants de SRAS- CoV-2 requiert dans l’urgence de nouvelles données scientifiques. Dans ce contexte, l’apport de la recherche utilisant des espèces animales modèles est essentiel à la gestion de la crise sanitaire. De nouveaux besoins urgents de recherche sont apparus en lien avec l’apparition de formes symptomatiques longues de la maladie et l’émergence des variants préoccupants du SRAS-CoV-2. Le présent projet a pour objectifs (i) l’étude de la physiopathologie des infections à SRAS-CoV-2 et ses variants et ce, principalement, au niveau de l’épithélium respiratoire des rongeurs modèles de la COVID-19, (ii) une meilleure compréhension de la diffusion et de la multiplication du SRAS-CoV-2 et ses variants dans les tissus (immunité croisée, transmissibilité, réinfection) et (iii) l’évaluation de vaccins, en particulier muqueux, et d’approches thérapeutiques adaptés à l’évolution épidémiologique des infections à SRAS-CoV-2.

Bénéfices attendus

L’étude chez le rongeur des infections à SRAS-CoV-2 et des stratégies de prévention et/ou de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la pandémie de COVID-19. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche.

Procédures

L’inoculation de la souche virale est réalisée en 8 minutes, par voie nasale sous anesthésie à l’isoflurane, en prise unique. Les traitements (thérapeutiques ou vaccinaux) sont administrés en 2 minutes, par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire à l’animal vigile. Le traitement par voie nasale est administré en 8 minutes sous anesthésie à l’isoflurane. Des analyses sérologiques seront réalisées au cours des essais vaccinaux. Tous les animaux seront prélevés au plus 3 fois lors de la phase d’immunisation : avant chaque vaccination (au maximum 2) et avant l’administration de la souche virale d’épreuve. Les prélèvements seront réalisés en 10 minutes, au sinus rétro-orbital sur animal anesthésié. Le volume de sang prélevé est de 100 à 300 μl selon l’espèce.

Impact sur les animaux

Dans les conditions expérimentales les plus défavorables, l’infection du hamster doré par le SRAS-CoV-2 se traduit par une perte de poids transitoire d’environ 10%. L’animal infecté contrôle l’expression pulmonaire de la maladie au bout du septième jour de l’infection. En revanche, dans les mêmes conditions, l’infection est létale chez la souris transgénique hACE2 à 7 jours post-infection avec une perte de poids et une infection du système nerveux central conduisant à une chute de l’activité motrice et des capacités respiratoires. Cette lignée de souris est la seule à ce jour qui présente une létalité. L’impact physiopathologique de l’infection des autres lignées de souris utilisées dans ce projet sera systématiquement évalué. Il a été observé que l’infection de souris non transgéniques pour hACE2 par la souche murinisée MACo3 entraîne des symptômes légers ou modérés.

Devenir

La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure.

Remplacement

L’étude de la physiopathologie de l’infection ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. En revanche, les stratégies vaccinales et thérapeutiques sont validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées (cellules VeroE6 ou Calu3). L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SRAS-CoV-2 ainsi que le choix de l’antigène vaccinal sont ainsi entérinés par des analyses in vitro. Les essais vaccinaux et thérapeutiques sont ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l'innocuité et l’efficacité du traitement.

Réduction

Les modèles d’infection à SRAS-CoV-2 chez les rongeurs sont validés et totalement maîtrisés. L’utilisation de la souche historique française dénommée D614G définit les conditions standard des protocoles expérimentaux auxquelles se réfèrent l’étude des variants préoccupants ou VoC. Nous disposons d’un protocole d’administration de souches virales présentant des conditions de Répétabilité et Reproductibilité satisfaisantes. La comparaison des traitements s’établit à l’aide de tests non paramétriques (Mann-Whitney).

Raffinement

Nous nous sommes employés à définir les conditions optimales d’hébergement des hamsters dorés. L’observation du comportement du hamster, d’une part, et l’adaptation des méthodes d’anesthésie, de contention et des gestes techniques à l’animal, d’autre part, garantissent une bonne prise en compte du principe de raffinement. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les hamsters sont hébergés individuellement et les souris par 5 dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger.

Choix des espèces

Le hamster doré est naturellement sensible aux infections à SRAS-CoV-2 et représente un modèle de choix pour étudier la COVID-19. Ce modèle restitue naturellement la physiopathologie humaine de la COVID-19. Les signes cliniques sont transitoires, l’animal contrôlant naturellement l’infection. La souris transgénique K18 ou KI exprime le récepteur humain ACE2 au SRAS-CoV-2 et permet le développement clinique et virologique des infections à SRAS-CoV-2. La souris non transgénique pour hACE2 est sensible à l’infection par la souche murinisée MACo3 et présente l’avantage de pouvoir envisager l’emploi de souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt (surexpression ou suppression) nécessaire à l’exploration des mécanismes biologiques impliqués dans la susceptibilité ou la défense de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale. Les animaux utilisés dans ce projet seront des hamsters ou des souris de 6 à 8 semaines d’âge. Mais des hamsters plus âgés (> 6 mois) pourraient être enrôlés dans des études spécifiques selon l’évolution des connaissances.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime enrichi en graisses pendant cinq semaines, reçoivent des injections quotidiennes pendant onze jours, un antibiotique dans l'eau puis un gavage de bactéries isolées de patients atteints de la maladie de Crohn, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélèvement du tube digestif. Le porteur indique attendre une perte de poids et une inflammation intestinale légère à modérée, suivies au moyen d'une grille de souffrance notée sur quinze points. Il juge le recours à la souris "nécessaire" pour étudier l'infection dans un "organisme entier", à partir de résultats obtenus jusque-là in vitro.

Objectifs

La maladie de Crohn est une maladie inflammatoire chronique de l’intestin qui touche plus de 2,5 millions de personnes en Europe. Cette maladie digestive, pour laquelle aucun traitement curatif n’existe à ce jour, altère considérablement la qualité de vie des malades. Des facteurs génétiques, environnementaux et bactériens sont impliqués dans le développement de cette maladie. Notamment, des bactéries particulières sont anormalement retrouvées dans le tube digestif des patients. Les mécanismes menant à l’implantation des bactéries dans l’intestin des patients sont encore méconnus. Cependant, il semblerait que d’autres facteurs soient impliqués dans le développement de cette maladie tels que des facteurs épigénétiques. Aux vues de dérégulations épigénétiques observées chez les patients, nous avons émis l’hypothèse que certains acteurs épigénétiques (HDAC), dérégulées par un régime alimentaire enrichi en graisses, joueraient un rôle dans cette susceptibilité accrue des patients à être colonisés par les bactéries. Ainsi, ce projet a pour but de valider des résultats obtenus dans des modèles de cellules en culture dans un modèle in vivo de souris. Dans ce projet, des souris seront nourries avec un régime enrichi en graisses et infectées avec des bactéries provenant de patients afin de déterminer si ce type de régime dérégule les HDAC et de valider le rôle des HDAC lors de l’infection intestinale par les bactéries. Cette étude permettra également de tester des molécules potentiellement d’intérêt thérapeutique pour traiter les patients atteints de maladie de Crohn.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de confirmer les résultats obtenus in vitro dans des modèles de cellules en culture où il a été observé que les HDAC régulaient l’entrée des bactéries dans les cellules de l’hôte. Il est attendu que les résultats confirment le rôle majeur joué par ces HDAC au cours de l’infection et qu’ils permettent de déterminer si un facteur environnemental tel qu’un régime alimentaire enrichi en graisses peut déréguler ces HDAC. Ce protocole expérimental permettrait également de démontrer un potentiel bénéfice des molécules testées. À plus long terme, l’analyse des différents échantillons recueillis au cours du protocole permettrait de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de l’infection dans un contexte de régime alimentaire enrichi en graisses ce qui pourrait mener à la découverte des nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique pour les patients.

Procédures

Les animaux suivront un régime alimentaire enrichi en graisses tout au long du protocole soit 5 semaines. Ils seront également traités par injection intra-péritonéale avec les molécules à tester tous les jours durant 11 jours. Les souris recevront un antibiotique à faible dose via l’eau de boisson durant 2 jours et l ’infection des animaux avec les bactéries isolées de patients se fera par voie orale, via un unique gavage intragastrique (durée contention + gavage estimée < 1 min). Un prélèvement de sang au niveau du sinus rétro-orbital sera également réalisé, une seule fois, sur animaux anesthésiés (durée contention + prélèvement estimée < 2 min).

Impact sur les animaux

À partir des travaux antérieurs menés sur souris infectées par ces bactéries les effets indésirables attendus sont une perte de poids légère dans les jours suivant l’infection (environ 5%) et le développement d’une inflammation intestinale légère à modérée. Les symptômes liés à l’inflammation intestinale sont relativement légers mais une surveillance quotidienne (y compris dimanches et jours fériés) des animaux par un personnel formé sera réalisée dans le but de détecter tout comportement douloureux. La souffrance des animaux sera évaluée à partir d’une grille tenant compte de plusieurs critères comme l’apparence générale, l’expression faciale, le poids, les signes d’inflammation digestive et le comportement (score sur 15 points). En fonction du score individuel et de son évolution, un arbre décisionnel permettra d’adapter la surveillance ou le traitement de l’animal par des antalgiques. Si un animal dépasse le score limite, il sera immédiatement sorti du protocole et euthanasié.

Devenir

À l’issue de la procédure, tous les animaux seront anesthésiés par inhalation à l’isoflurane puis euthanasiés par dislocation cervicale car différentes sections du tube digestif seront prélevées et les bactéries associées aux muqueuses seront dénombrées. De cette manière, les bactéries adhérentes aux muqueuses seront quantifiées précisément et spécifiquement.

Remplacement

Les modèles de cellules en culture in vitro ne permettent de travailler que sur une ou deux lignées cellulaires à la fois. À l’inverse, un modèle de souris in vivo va permettre d’étudier l’interaction entre les bactéries et l’intestin dans un organisme entier, complexe composé du microbiote intestinal et du système immunitaire de l’hôte. Le recours à un modèle murin est donc nécessaire pour notre projet pour étudier l’impact d’un régime alimentaire enrichi en graisses associé à différentes molécules sur la colonisation intestinale par les bactéries et sur l’inflammation intestinale afin de pouvoir conclure pleinement sur le bénéfice des molécules testées pour une potentielle utilisation chez les patients atteints de maladie de Crohn.

Réduction

Le nombre de 7 animaux par lot a été déterminé lors de précédentes études d’infection avec les bactéries. Ce nombre d’animaux devrait permettre d’obtenir des résultats fiables, reproductibles et statistiquement significatifs. Les expériences ont été conçues de manière à ne pas démultiplier les lots témoins. Le nombre d’animaux pour ce projet a été réduit au minimum (140 animaux) sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre de bactéries présentes dans les fèces des souris reflètent le nombre de bactéries associées à la paroi intestinale. Ainsi, la quantification des bactéries au cours du temps dans les fèces des animaux réduit le nombre d’animaux à euthanasier à différents temps post-infection pour comptabiliser les bactéries présentes dans l’intestin. Aussi, un maximum de prélèvement sera réalisé sur les animaux lors de l’euthanasie ce qui permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin d’éviter le surpeuplement qui est une source de stress, les souris de chaque lot seront séparées dans des cages de 530 cm² (3-4 animaux/cage), soit > 80 cm² pour des souris de 25-30 g. Elles auront un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les conditions d’hébergement seront : température 20-24°C, hygrométrie 50 ± 10%, cycle 12h/12h, éclairage 350/450 lux. Un enrichissement leur sera proposé sous la forme de maison et tube en polycarbonate teinté rouge afin de diminuer le stress en stimulant l‘activité et en procurant un sentiment de sécurité à l‘animal. Les injections par voie intra-péritonéale, l’infection par voie orale ainsi que le prélèvement de sang seront réalisés par des personnels témoignant de la qualification nécessaire. Lors du prélèvement sanguin via le sinus rétro-orbital, les souris seront anesthésiées afin de réduire stress et douleur potentiellement générés par cet ace. Les animaux peuvent développer une inflammation intestinale légère à modérée lors de ce projet. Les animaux seront donc surveillés quotidiennement (y compris dimanches et jours fériés) par un personnel formé pour évaluer leur souffrance à partir d’une grille tenant compte de plusieurs critères comme l’apparence générale, l’expression faciale, le poids, les signes d’inflammation intestinale ou le comportement (sur 15 points). En fonction du score individuel et de son évolution, un arbre décisionnel permettra d’adapter la surveillance ou le traitement de l’animal par des antalgiques. Si un animal dépasse le score limite, il sera immédiatement sorti du protocole et euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle d’étude choisi est la souris. Il s’agit d’un des modèles le plus utilisé et les expériences antérieures pour étudier l’infection intestinale par les AIEC ont été réalisées sur des modèles murins également. Cela permettra ainsi de comparer les résultats obtenus avec de précédentes études. L’étude sera réalisée sur des animaux de 8 à 10 semaines, âge auquel les études antérieures de colonisation par les AIEC sur modèle murin ont été réalisées.