Maladies infectieuses

2 000 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Rendus obèses puis diabétiques par injections, ils sont infectés par le SARS-CoV-2 dans les narines et suivis jusqu'à vingt-cinq jours, pour tester des thérapies contre les formes graves de COVID-19. Le porteur indique que l'infection provoque léthargie et perte de poids pouvant atteindre 15 %, la mise à mort étant déclenchée au-delà de 20 %, puis que les animaux sont tués pour analyser leurs organes. Il présente les bénéfices attendus comme une réponse à une urgence de santé publique, les vaccins ne suffisant pas selon lui à contrôler la pandémie.

Objectifs

Le but des études chez le hamster Golden Syrian obèse est d'évaluer l'efficacité des molécules avec des potentiels thérapeutiques dans ce modèle animal infecté par le SARS-CoV-2 pour reproduire la problématique de santé publique liée à la pandémie de COVID-19 dont la maladie est aggravée chez les personnes obèses. Les protocoles d'infection au SARS-CoV-2 qui seront utilisés ont été publiés dans des revues scientifiques internationales évaluées par des pairs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices issus de ce projet sont les suivants : -à court terme, ce projet va permettre de valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement des formes sévères de COVID-19, qui sont le plus problématiques pour la Santé Publique puisque les patients souffrant de ces formes sévères embolisent les services de réanimation et impacte le traitement des autres patients hors COVID-19. Les vaccins ne permettant pas de contrôler complètement la pandémie, il est urgent de disposer de ces thérapies. -à long terme ce projet permettra également de mieux comprendre les mécanismes par lesquels l’obésité, le diabète et les comorbidités qui y sont associées favorisent les formes sévères de COVID-19. La compréhension de ces mécanismes permettra de développer là aussi de nouvelles thérapies, mais aussi de se préparer pour d’éventuels nouveaux variants, coronavirus, ou autres pathologies respiratoires d’origine virale dans le futur.

Procédures

Les hamsters obèses seront utilisés pour pouvoir évaluer des thérapies ciblant la COVID-19 pour leurs propriétés anti-virales ou anti-inflammatoires, à différentes doses (une à 2 fois par jour) et différentes durées d’administration (de 4 à 25 jours) par voie orale, sous cutanée ou intrapéritonéale. Les hamsters obèses seront rendus diabétiques par 2 injections intrapéritonéales espacées de 24h. Les animaux seront endormis par injection d'anesthésique puis infectés avec le SARS-CoV-2 avec une goutte dans les narines d'une solution contenant le coronavirus. Les animaux infectés seront hébergés au maximum jusqu’à 25 jours post-infection. Le poids et l’état de santé des animaux seront contrôlés quotidiennement. A 4 jours ou 25 jours post-infection, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie gazeuse pour collecter du sang et différents organes (poumons, cœur, foie, tissu adipeux, etc.) afin d'analyser les effets de l’infection.

Impact sur les animaux

Les hamsters infectés par le coronavirus sont dans un état léthargique après infection et ont donc une activité réduite, associée à une perte de poids (jusqu’à 15% en moyenne) sur 7 jours. Après ces 7 jours post-infection, les hamsters récupèrent et voient leur poids corporel de nouveau augmenter. Les points limites adaptés pour l'étude de l’infection au SARS-CoV-2 seront la perte de poids importante (> 20% du poids corporel mesuré avant infection), l'immobilité, l'isolement et la position allongée.

Devenir

Les animaux doivent être euthanasiés pour pouvoir faire des analyses biochimiques et histologiques des organes, plus particulièrement des poumons, pour évaluer l’efficacité des thérapies.

Remplacement

Les seules alternatives non animales disponibles sont les modèles cellulaires exposés au SARS-CoV-2 (ex : VEroE6) qui permettent de mesurer l’activité anti-virale d’une thérapie in vitro. Cependant, ces mesures in vitro ne permettent pas de conclure définitivement sur les bénéfices d’une thérapie tant qu’elle n’a pas été testée in vivo : il faut en effet confirmer la pharmacocinétique du composé in vivo chez l’animal puis son efficacité anti-virale lors d’une infection au SARS-CoV-2. En outre certaines thérapies ne sont pas anti-virales mais anti-inflammatoires ou ciblent des mécanismes impliqués dans les lésions pulmonaires (ex : molécules ciblant l’apoptose ou la fibrose pulomanire) et ne peuvent donc être évaluées qu’in vivo.

Réduction

Le modèle de hamster obèse a été initialement développé avec des références médicamenteuses qui a permis de valider le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence leur efficacité, soit n=10 par groupe. Quand plusieurs groupes de traitement sont étudiés, on utilise un test statistique pour comparer les résultats. Avec 10 animaux par groupe, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable.

Raffinement

Sur la base de données disponibles sur ce modèle, les doses de SARS-CoV-2 administrées aux hamsters sont sub-léthales, elles permettent d’étudier les formes sévères de COVID-19 sans induire de mortalité. Ces doses pourront être ré-évaluées si les effets de la dose sont plus marqués sur les hamsters injectés à la streptozotocine.

Choix des espèces

Le hamster « Golden Syrian » (Mesocricetus auratus) a récemment été caractérisé pour l’étude du Covid-19. En effet, l’ACE2 (Angiotensin-converting Enzime 2) du hamster se lie avec une forte affinité au récepteur du SARS-Cov-2, ce qui permet d’infecter avec ce dernier le hamster Golden Syrian et d’étudier la transmission, la cinétique virale, la réponse immunitaire et la pathogenèse de la Covid-19. Des signes cliniques similaires à l’homme ont ainsi été rapportés, même si les symptômes les plus sévères ne peuvent pas être observés, du fait de l’absence de comorbidités sur le hamster naïf. Les animaux seront utilisés à un âge de 25 semaines, car c'est le temps nécessaire pour qu'ils deviennent obèses.

12 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont infectés par le virus Marburg, proche d'Ebola, et devraient développer fièvre, perte de poids, chutes de tonus et symptômes hémorragiques avant leur mise à mort, avec prélèvements de liquide céphalo-rachidien et de moelle osseuse. Le porteur prévoit une mise à mort dès l'atteinte d'un score clinique qu'il qualifie de "limite éthique" et décrit l'étude comme une étape pilote sans test statistique. Il affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas une maladie dans un organisme "entier" et que le primate est le seul modèle reproduisant l'infection humaine.

Objectifs

L’étude des maladies infectieuses émergentes (MIE) ou ré émergentes occupe un intérêt majeur en santé publique et dans la recherche scientifique ; et cet intérêt a augmenté depuis l’apparition du SARS-CoV-2. Ainsi, l’état français a décidé de renforcer les capacités de la France à répondre aux épidémies, en mettant l’accent sur le développement d’outils de diagnostic/détection des MIE, mais également en appuyant la recherche, le développement et l’innovation dans la mise au point de traitements contre ces maladies. Notre étude cible le virus Marburg (MARV), de la même famille que le virus Ebola (Filoviridae). Identifié en 1967, il provoque chez l’homme une fièvre hémorragique, dont les symptômes s’apparentent à ceux de la grippe, puis dégénère en une forme plus sévère provoquant saignements, forte fièvre, troubles vasculaires, neurologiques, pulmonaires, douleurs musculaires, et dont l’issue est fatale dans 80% de cas. Ce projet expérimental s'articule autour de deux volets : 1) la caractérisation de la physiopathologie induite par deux souches différentes de MARV (Popp et Musoke), à travers une étude préliminaire réalisée chez le macaque cynomolgus. La description de l'infection de ce modèle animal, par ces deux souches de virus, est une première étape clé pour la mise au point et la validation de nouveaux vaccins ou molécules antivirales. Les souches Musoke et Popp étant disponibles au laboratoire, ce projet portera donc sur la caractérisation de la pathogénicité de la souche Popp en comparaison à la souche Musoke, cette dernière étant déjà décrite. Les animaux seront suivi périodiquement afin de pouvoir étudier l’apparition des symptômes au regard de modifications des constantes biologiques de l’animal. La physiopathologie induite par les deux souches sera également confrontée à l’apparition de la virémie infectieuse et moléculaire mise en évidence à partir de prélèvements sanguins. Pour pouvoir détecter rapidement et efficacement la présence du virus dans le sang d’animaux, il est nécessaire de développer des systèmes de détection moléculaires sensibles et sécurisés. 2) la validation d'un outil de diagnostic dit "au lit du patient". Cette technologie, repose sur l’utilisation d’un système clos de cartouche dans laquelle l’échantillon biologique sera aussitôt traité pour en détecter la présence du virus MARV par PCR en temps réel.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra la mise en place d’un outil de diagnostic robuste, offrant un avantage considérable en termes de sécurité biologique. De plus, la caractérisation de l’infection chez le primate non-humain, ici le macaque cynomolgus, par voie intramusculaire par MARV (en particulier la souche Popp), posera les bases d’un nouveau système pour l’évaluation in vivo de nouvelles cibles thérapeutiques ou de vaccins ciblant ces pathogènes. 1) Avantages de la caractérisation l’infection de MARV chez le macaque cynomolgus : à court terme, cela permettra de poser les bases d’un modèle détaillé pour l’infection par la souche Popp encore très peu décrite. La comparaison avec la souche Musoke permettra de confirmer et compléter les données de la littérature. Cette étude, première expérimentation du virus MARV chez le primate non-humain (PNH) dans notre laboratoire, nous permettra de développer une table de scoring plus adaptée qui sera appliquée lors de nouvelles expérimentations. Les données obtenues seront partagées au sein de la communauté scientifique. A moyen/long terme, il s'agit de proposer un modèle bien établi ciblant la famille des filovirus (modèle décrit pour Ebola) pour la validation et l’évaluation d’outils thérapeutiques et prophylactiques, étant un enjeu de majeur depuis l’apparition de la Covid-19. 2) Les objectifs de la détection du virus MARV par les cartouches sont de permettre une mise sur le marché d’un outil de diagnostic rapide et sécurisé et à plus long terme, un déploiement en zone épidémique pour détecter suffisamment tôt une infection et en limiter ainsi sa propagation. Cet outil a déjà été mis à disposition en Afrique de l’ouest (détection du virus Ebola, épidémie 2014-2016). De nombreux automates ont été envoyés afin d’augmenter la capacité locale de diagnostic. La mise sur le marché de ces cartouches (détection MARV), viendra renforcer cette capacité à l’aide d’un système rapide (durée réduite du prélèvement au résultat), simple (peu de gestes techniques, limités au dépôt d’échantillon en cartouche), sécurisé (inactivation de l’échantillon en système fermé), et en une seule étape (lyse, extraction d’acides nucléiques et réaction PCR). Le développement de nouvelles cartouches ciblant d’autres agents responsables de fièvres hémorragiques virales, de groupe de risque 4, se poursuivra dans les prochaines années.

Procédures

La procédure expérimentale soumettra les animaux à des anesthésies (au nombre de 12 prévues dans la procédure expérimentale et d'une durée de 1h à 2h selon les individus) et à des prélèvements lacrymaux, salivaires, vaginaux et sanguins sur animaux anesthésiés (11 sessions de prélèvements prévues dans cette procédure expérimentale). Lors de l'atteinte de point limite ou de la fin du protocole, les animaux seront anesthésiés, puis les prélèvements de LCR (liquide céphalo-rachidien) et de moelle osseuse seront réalisés avant de procéder à la mise à mort.

Impact sur les animaux

La procédure concernée dans ce projet sera de classe sévère et concernera 12 animaux. Les animaux, suite à l'infection par l'une ou l'autre des souches de MARV, devraient présenter des signes cliniques caractéristiques d'une infection par un filovirus et plus particulièrement par MARV, tels qu'une dérégulation de la température corporelle, une perte de poids, une diminution de l'alimentation et de l'hydratation, une perte de tonus et des symptômes hémorragiques. Les animaux présentant des points limite ou un score clinique de 15 (selon notre matrice de score), représentant la limite précoce d'un état de la maladie devenant une limite éthique en termes de douleur/détresse de l'animal, seront anesthésiés puis mis à mort. Une autopsie avec collecte d'échantillons sera alors réalisée.

Devenir

L'étude comparative de la physiopathologie induite par les deux souches virales d'intérêt implique que les organes et les tissus puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux de l'étude (n=12), ceux-ci étant répartis en deux groupes infectés différemment (n=6) et composés chacun d'un égal nombre de mâles et de femelles (n=3 et n=3, respectivement). Par conséquent, seule la mise à mort des 12 animaux de l'étude permettra d'obtenir des données statistiquement robustes.

Remplacement

Il existe désormais plusieurs méthodes alternatives in vitro, dérivées de la culture cellulaire classiquement utilisée depuis des décennies. Ces nouvelles technologies tendent à recréer artificiellement les interactions inter cellulaires que nous pouvons retrouver dans l'organisme. Citons par exemple le développement de la culture cellulaire en trois dimensions, ou encore la culture d'organoïdes, sphéroïdes ou d'organes sur puce. Dans tous les cas, il s'agit de reconstituer la structure organisationnelle de systèmes cellulaires complexes ex vivo, afin de mimer les conditions observées in vivo. Ces avancées récentes ont déjà permis d'étudier des questions complexes et multidimensionnelles telles que l'apparition de la maladie, la régénération tissulaire ou bien les interactions entre organes. Bien que très prometteuses, ces techniques restent très localisées et répondent à des problématiques assez ciblées, tout en étant multi factorielles. Dans le cadre de notre étude, elles ne permettent pas, pour l'instant, de répondre à des questions globales telles que l'apparition d'une maladie dans un système vivant "entier", le développement symptomatologique ou la mise en place des réactions immunitaires dans leur ensemble. Lors du développement d'un outil de diagnostic (PCR par exemple), les preuves d'efficacité incluent, généralement en première intention, des tests réalisés sur des échantillons mimant les conditions retrouvées sur le terrain. Ainsi, du virus mélangé dans des matrices complexes telles que le plasma, le sang total, la salive, etc. permettent de récréer des prélèvements "naturels" et ainsi valident le test. Cependant, l'outil n'est définitivement validé qu’après avoir été éprouvé à partir de "vrais" prélèvements issus de patients. La complexité de la matrice et les variabilités inhérentes aux individus peuvent induire des résultats imprévisibles et bien différents de ceux observés artificiellement in vitro (présence d'inhibiteurs, changement de composition de la matrice ...). Afin de répondre à nos questions et pour toutes les raisons citées précédemment, il est impossible de remplacer l'utilisation d'un organisme vivant complexe. Le modèle primate non-humain (PNH) est, pour l'étude de l'infection du virus MARV, le seul organisme pouvant reproduire ce qui se passe chez l'homme.

Réduction

Il s’agit dans ce projet de réaliser une étude pilote portant sur la description de la physiopathologie induite par deux souches d’un même virus, MARV. Pour permettre cette caractérisation tout en intégrant la variabilité inter-individuelle, les groupes seront constitués de 3 animaux de chaque genre. Ce nombre de 12 animaux a été réduit au maximum afin d’obtenir des résultats interprétables et robustes tout en restant en accord avec les capacités d’hébergement de l’animalerie : 6 animaux seront challengés avec la souche Musoke, 6 animaux seront challengés avec la souche Popp. S’agissant d’une étude pilote, aucun test statistique n’a été réalisé. Cette étude nous permettra à terme, de pouvoir réaliser des tests statistiques (et de puissance) afin d’établir les groupes d’animaux adéquats lors d’une future étude, portant sur ce modèle animal, infecté dans les mêmes conditions.

Raffinement

Afin d’assurer au mieux le bien-être des animaux, ils seront hébergés en volière par groupes de 3, dans un environnement enrichi avec des dispositifs favorisant l’adoption d’un comportement naturel (perchoir, hamac, jeu, diversification alimentaire…). Les animaux seront implantés par télémétrie, nous permettant de surveiller et d’enregistrer en temps réel, l’activité et la température corporelle des animaux. Un système de vidéosurveillance permettra également de visualiser le comportement des animaux pendant les périodes où ils ne seront pas stimulés par la présence des techniciens. La surveillance via ce système est réalisée quotidiennement en fin de journée, et plus régulièrement pendant la période critique. L'accès aux enregistrements est également possible. En cas de doute sur l’état d’un ou plusieurs animaux, une entrée en laboratoire sera programmée immédiatement pour procéder à une observation en zone et à une possible décision. Une matrice de score, établie pour l’étude de la physiopathologie induite par les filovirus, nous permettra de réaliser un scoring quotidien (éprouvé sur d’autres protocoles utilisant des primates non-humains) qui sera mis en place dès le jour du challenge et des points limites seront définis à l’avance (hypothermie, pyrexie, perte de poids, durée des symptômes, coma post anesthésie, durée de symptômes persistants, …). L’observation d’un point limite ou l’atteinte d’un score supérieur ou égal à 15 points (représentant la limite précoce d'un état de la maladie devenant une limite éthique en termes de douleur/détresse de l'animal) permettra de mettre fin à la procédure expérimentale pour l’animal concerné.

Choix des espèces

Le modèle PNH, étant phylogénétiquement et physiologiquement proche de l'Homme, est un modèle sensible à l'infection par les filovirus. Comme le révèlent les observations de terrain, les PNH développent des syndromes hémorragiques comparables à ceux décrits chez l'Homme, ce qui en fait un modèle de choix pour l'évaluation de stratégies vaccinales, diagnostiques et thérapeutiques. Certains modèles rongeurs (souris, cobaye, hamster), modèles expérimentaux présentant souvent un système immunitaire déficient, sont sensibles à l'infection par le MARV mais présentent des symptômes et pathologies peu comparables à ceux chez l'humain. La littérature décrit quelques études portant sur l'infection par MARV (selon les souches étudiées) chez le macaque, le marmoset et le babouin. Les animaux concernés par ce protocole seront âgés de 2,5 à 3 ans afin de pouvoir caractériser l'infection par le virus Marburg chez des individus bénéficiant d'un système immunitaire mature. Le système d'hébergement PNH du laboratoire ne permet pas l'hébergement et donc l'étude, d'animaux de plus de 3 ans.

102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la bactérie Pseudomonas aeruginosa par instillation intra-nasale sous anesthésie, puis mises à mort 24 heures après pour analyser leurs poumons, afin d'étudier une protéine bactérienne comme cible thérapeutique. Le porteur indique des signes d'infection respiratoire, dyspnée et poil hérissé, et une surmortalité possible de 20 % lors de l'instillation. Il affirme qu'un modèle in vitro d'épithélium humain reste "très limité" et ne rend pas compte de la réponse immunitaire globale.

Objectifs

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie de l’environnement induisant des infections respiratoires chez les sujets fragilisés comme ceux se trouvant en réanimation, ceux atteints de broncho-pneumopathie chronique obstructive ou encore ceux atteints de mucoviscidose. L’émergence de souches de P. aeruginosa de plus en plus résistantes aux antibiotiques est observée partout dans le monde. La resistance aux antibiotiques est un problème car cela risque d’entrainer des impasses thérapeutiques pour les patients. L’objectif est d’étudier si une proteine protégeant P. aeruginosa contre la défense de l’hôte peut servir de cible thérapeutique alternative ou adjuvante aux antibiotiques pour traiter les infections à P. aeruginosa résistant aux antibiotiques : ce projet scientifique a pour objectif (i) de déterminant les charges bactériennes dans les poumons infectés par les bactéries hyperexprimant ou non la proteine, (ii) d’étudier l’impact de l’infection sur la destruction de l’architecture du poumon et sur la réaction inflammatoire et immunitaire.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra de caractériser plus précisement la virulence accrue au niveau pulmonaire induite par la proteine d’intérêt chez la bactérie P. aeruginosa résistante aux antibiotiques utilisés couramment en médecine humaine. Cette caractérisation histologique et bactérienne est indispensable pour affirmer l’implication de cette protéine dans la différence de survie observée chez les souris dans nos travaux précédents et elle est nécessaire pour expliquer le mécanisme global de la virulence augmentée de ces souches. Cette protéine participe à la virulence à la bactérie. Elle constitue donc une cible potentielle pour le développement à plus long terme de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les infections pulmonaires à P. aeruginosa résistants à de nombreux antibiotiques. Le développement d’inhibiteurs de cette proteine peut être envisagé pour constituer une thérapeutique alternative et adjuvante aux antibiotiques en médecine humaine. Son inhibition pendant l’infection respiratoire permettrait de limiter la prolifération de P. aeruginosa en le rendant sensible à la réponse de l’hôte.

Procédures

Pour chaque animal, il sera réalisé : - Une infection respiratoire par instillation intra-nasale : geste réalisé sous anesthésie générale. - Une administration d’un antalgique de palier III par injection intrapéritonéale à 6h post infection. - L’euthanasie à 24h post infection pour prélévement et analyse des poumons (études bactérienne, histologique et cytologique)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont ceux résultants de l’infection pulmonaire bactérienne. Il pourra être observé des signes d’infections respiratoires : dyspnée, mobilité réduite, dos vouté et poil hirissé. Une sur-mortalité possible de 20% lors de l’instillation intranasale est également attendue.

Devenir

Les animaux de la procédure seront mis à mort 24h après l’infection afin de réaliser le dénombrement de la charge bactérienne pulmonaire, les analyses d’histologie/immunomarquage sur poumons et les analyses cytologiques sur LBA

Remplacement

Ce projet requérant un modèle murin a été considéré après une étude in vitro préalable. En effet, la première partie de notre projet, qui a permis la mise en évidence de la virulence augmentée de la souche résistante aux antibiotique et le rôle d’une protéine d’intérêt, a été réalisée sur un modèle in vitro d’épithélium respiratoire humain. Cependant, malgré son utilité, ce modèle reste très limité car il ne permet pas d’étudier la virulence bactérienne à l’échelle du poumon dans son ensemble et il ne prend pas en compte la réponse immunitaire globale de l’hôte vis-à-vis de P. aeruginosa. Seule une partie de la réponse immunitaire innée est assurée mais la réponse immunitaire innée médiée par les phagocytes (polynucléaires, macrophages, …) ainsi que la réponse immunitaire adaptative (humorale et cellulaire) est absente dans ce modèle. Au contraire, dans le modèle murin de pneumonie aiguë, la réponse globale de l’hôte au niveau pulmonaire est assurée et cette étape in vivo est essentielle à la validation du rôle la protéine d’intérêt dans l’infection à P. aeruginosa résistant aux antibiotiques

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé pour répondre à l’objectif scientifique selon le nombre d’expériences prévues, les besoins en données selon les analyses statistiques envisagées et les données de la litterature. Pour comparer les résultats de charges bactériennes, des tests non paramétriques de Mann-Whitney seront appliqués, ces tests non paramétriques étant adaptés à notre étude comprenant un faible nombre d’individu. Une réflexion biostastistique (utilisant le logiciel G-Power) a été réalisée afin d’éviter qu’une réduction trop drastique ne nuise à la fiabilité des résultats du projet. Nous avons également pris en compte le risque de surmortalités, c’est-à-dire la sortie précoce d’animaux avant la fin de la procédure (mortalité lors de l’instillation nasale, atteinte des points limites avant 24h, …), selon les données de la littérature et notre expérience acquise lors de précédentes manipulations. Les groupes ont donc été réduits à la taille minimum nécessaire à l’interprétation des résultats. Pour essayer de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous allons exploiter le plus possible les organes prélèvés, en essayant par exemple de mettre au point l’immunomarquage de P. aeruginosa sur les coupes en paraffine utilisées pour l’étude histologique classique. Si le marquage fonctionne, l’expérimentation (infection 4) prévue pour la cryoconservation/immunomarquage ne sera finalement pas utilisée, permettant de diminuer le nombre d’animaux (16 animaux en moins).

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien être de l’animal, plusieurs mesures seront réalisées : - l’anesthésie par injection intrapéritonéale de Kétamine (50 mg/Kg) / Xylazine (5 mg/Kg) lors de l’instillation intra-nasale de l’inoculum bacterien, avec l’utilisation d’un dispositif chauffant lors de l’anesthésie des souris pour éviter l’hypothermie. - une surveillance rapprochée pendant la procédure (toutes les 2 à 4 heures en journée (8h à 18h) et une visite nocturne). Cette surveillance permet le suivi des animaux et la vérification des points limites, requérant l’euthanasie. - l’administration d’un antalgique de palier III (Buprénorphine, 50µg/kg) en intra péritonéal à 6h post-infection pour limiter la douleur et la dyspnée chez l’animal. - un enrichissement des cages et le regroupement des souris dans les cages pour préserver les interactions sociales

Choix des espèces

La souris est une espèce pour laquelle de nombreux protocoles de pneumonie aiguë d’étiologie bactérienne ont été optimisés et validés. Le modèle murin utilise des souris âgées de 6 à 8 semaines et permet d’étudier la pathogénicité bactérienne lors de l’infection pulmonaire aiguë (i) en établissant les courbes de survie (se basant sur l’atteinte des points limites), (ii) en réalisant des coupes histologiques pulmonaires et (iii) en déterminant la charge bactérienne infectante dans les poumons.

48 lapins, lapereaux âgés de deux jours et leurs mères, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Les lapereaux sont infectés par une Escherichia coli entérohémorragique responsable de diarrhées hémorragiques, puis traités par gavage avec trois doses d'un produit antibactérien commercial, les mères étant tuées car exposées aux animaux infectés. Le porteur indique que la principale cause de souffrance est la sous-nutrition des lapereaux délaissés par la mère et prévoit un suivi du poids. Il affirme que la complexité d'un être vivant ne peut pas être reproduite en laboratoire.

Objectifs

Le présent projet vise à tester l’efficacité d’un composé antibactérien (EB) dans un modèle d’infection du tube digestif à E. coli chez le lapereau. Trois concentrations du composé seront testées, une correspondant à la dose pharmacologiquement active (EB) et cette même dose divisée par 10 (EB/10) et 100 (EB/100). Cette étude sera réalisée avant le passage de ce composé EB en phase d’évaluation clinique.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal de ce projet est de mettre en évidence l’efficacité d’une thérapie ciblée offrant une alternative à l’utilisation des antibiotiques et permettant un contrôle précis des écosystèmes microbiens complexes. Dans cette optique, le projet vise à utiliser une nouvelle technologie antimicrobienne basée sur l’utilisation d’un dérivé des bactériophages (ciblant exclusivement certaines espèces bactériennes) transportant des « ciseaux moléculaires » qui, une fois à l’intérieur des bactéries, vont scanner leur matériel génétique et trouver la séquence à couper pour laquelle ils ont été « programmés ». Ainsi seules les bactéries possédant la séquence d’ADN ciblée seront tuées, sans affecter le reste du microbiote. Les bactéries d’intérêt dans ce projet sont des Escherichia coli (E. coli) entérohémorragiques (peuplant le système digestif et responsable d’hémorragies) productrices de Shiga-toxine (EH-STEC). Ces bactéries sont à l’origine de maladies rares mais graves en particulier chez les jeunes enfants chez qui elles induisent des diarrhées hémorragiques et une atteinte rénale sévère. Une précédente étude a déjà permis de mettre au point le modèle d’infection du tube digestif chez le jeune lapereau et d’appréhender le potentiel bénéfice d’un traitement aux Eligobiotiques® (EB). Les précédents résultats ont également entrainé un réajustement de la composition du traitement (proportion composé actif/ tampon). Cette étude a pour but d’évaluer l’efficacité de 3 doses issues d’un lot clinique, sur cette bactérie.

Procédures

Les méthodes d’infection et de traitement par gavage (quelques secondes par lapereaux) ont été choisies pour leur qualité non invasive et indolore pour les animaux. Les lapereaux seront infectés une seule fois à J0 et les traitements auront lieu deux fois par jour, dès J3 après infection et pendant 4 jours. L’expérience durera 7 jours. Dans ce modèle, l’infection, même symptomatique (diarrhée), n’empêche pas la prise de poids des lapereaux et n’entraine pas de souffrance particulière s’ils sont bien nourris par leur mère. En revanche, il est possible que l’infection favorise le délaissement de la lapine pour ses lapereaux les plus fragiles. Dans ce cas, le poids des lapereaux et leur score clinique enregistrés quotidiennement nous permettrons d’évaluer leur état et d’interrompre l’étude pour les animaux en état de souffrance. En fin d’étude, les lapereaux seront soumis à une ponction intracardiaque sous anesthésie volatile (vetflurane 5%) avant leurs mises à mort.

Impact sur les animaux

Les précédentes études nous ont permis de déterminer que la principale cause de souffrance dans ce modèle était la sous nutrition des lapereaux (résultant ou non de l’infection). Le nombre d’animaux par portée est assez variable. Les lapines donnant naissance à plus de 9 lapereaux ont souvent tendance à en délaisser certains au profit des autres.

Devenir

Tous les animaux (lapereaux + lapines) seront mis à mort à la fin de l’étude afin de récupérer chez les lapereaux, le sang pour analyses biologiques et le colon pour dénombrement des CFU. Les lapines seront également mises à mort car elles auront été en contact avec des animaux infectés.

Remplacement

Une partie des résultats préliminaires a été obtenue in vitro mais la complexité d’un être vivant ne peut pas être mimée en laboratoire nécessitant l’utilisation de modèles animaux. Également, une étude similaire a déjà été réalisée et a permis de mettre en évidence des résultats très encourageants. Toutefois, la validation de l’efficacité est requise sur un lot clinique par les autorités et le conseil scientifique du commanditaire de l’étude.

Réduction

Le modèle étant déjà maitrisé, aucune phase de mise au point n’est prévue. En tenant compte de possible perte dans les portées et afin d’obtenir une étude statistique solide (Mann-Whitney), 12 animaux par groupe de traitements seront nécessaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Les lapereaux et leur mère ne seront pas séparés durant l’étude pour limiter leur stress et permettre une alimentation naturelle par la tétée. L’infection bactérienne du tube digestif et l’administration du traitement seront réalisées par voie orale et seront donc indolores. Des critères d’arrêts de l’étude, supportés par une grille de score clinique, ont été définis afin d’assurer le bien-être des animaux. Pour pallier au problème de dénutrition observé pour les grandes portées, des lapereaux pourront être transférés à des portées plus petites au cours de leur premier jour de vie. De plus, une vigilance particulière sera appliquée après chaque allaitement, où la présence d’une tâche de lait sera surveillée car elle représente un marqueur spécifique de la bonne prise alimentaire chez le lapereau. Une observation quotidienne durant les 5 jours suivant la naissance des lapereaux (pouvant être modulé en fonction de l’état des lapereaux après leur naissance) puis biquotidienne jusqu’à la fin de l’expérience nous permettra de déterminer lesquels ont le plus de mal à se nourrir et ainsi de favoriser leur alimentation en les plaçant en priorité dans le nid avec leur mère. Ce suivi nous permettra également de déceler le plus rapidement possible des signes de souffrance et pouvoir anticiper l’atteinte des points limites.

Choix des espèces

Le lapin développe des symptômes très semblables à l’homme dans un contexte d’infection à E. coli, notamment au niveau de la diarrhée, contrairement au modèle murin. Des lapereaux de 2 jours seront utilisés de façon à correspondre à une population de jeunes enfants particulièrement sensibles aux infections à EH-STEC.