Troubles respiratoires

Soumises à des injections, des inhalations sous anesthésie et une trachéotomie en fin de protocole, 6 480 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée, toutes tuées à l'issue. Selon le modèle d'allergie, elles subissent un choc anaphylactique provoqué, avec chute de température corporelle et diarrhées, un gonflement des oreilles ou une dermatite induite par patch. Ces vaccins à ARN visent à prévenir ou réduire des symptômes allergiques que le RNT présente comme sans traitement efficace à long terme aujourd'hui. Le bénéfice reste une perspective, quand les chocs et inflammations infligés aux souris sont, eux, programmés.

Objectifs

La prévalence mondiale des pathologies allergiques est en perpétuelle augmentation à la fois dans les pays développés et en voie de développement. Par exemple, il est maintenant estimé qu’un tiers des français souffrent d’une ou plusieurs formes de pathologies allergiques, dont certaines peuvent s’avérer fatales (p.ex., certaines formes d’asthmes réfractaires aux corticoïdes ou encore des anaphylaxies induites par l’ingestion de fruits à coques). Il n’existe pas à l’heure actuelle de traitement permettant de prévenir les allergies ou de réduire les symptômes allergiques de manière efficace et sur le long terme. La pandémie de Covid-19 a permis de mettre en lumière l’efficacité, la modularité selon la cible thérapeutique, et la production rapide de vaccins à ARN. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de vaccins à ARN dans différents modèles d’allergies majeurs pour permettre de prévenir et de réduire les symptômes allergiques. Nous utiliserons des modèles d’asthme allergique, d’allergie alimentaire, d’anaphylaxie systémique et cutanée et de dermatite atopique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer de nouveaux traitements à visée anti-allergique permettant de réduire les limitations des traitements actuels qui sont principalement symptomatiques, avec moins d’effets secondaires, de prévenir le risque de complications graves comme l’anaphylaxie. Ces traitements possèdent des modes de production facilités et permettraient une réduction des coûts de santé.

Procédures

Chaque injection se fera sur animal vigile et sous contention (20 sec), alors que les inhalations et injections à l'oreille se feront sous anesthésie gazeuse (induction/perte de conscience : 2min ; inhalation ou injection : 30 sec). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal sous anesthésie gazeuse au minimum 1 fois par semaine avec alternance des sites de prélèvement (joue droite puis joue gauche ; induction/perte de conscience : 2min ; prélèvement : 30 sec).. Une trachéotomie sera réalisée sous anesthésie générale après vérification de la profondeur de la narcose et suppression de tout réflexe (10-15min), par du personnel diplomé en « chirurgie de l’animal de laboratoire », en fin de procédure expérimentale.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont en premiers liés à la douleur des aiguilles et à l’inconfort induits par les injections des traitements qui sont de courte durée (5 secondes). Des nuisances supplémentaires peuvent-être associées selon les modèles d’allergies. Le modèle d’allergie alimentaire peut induire un stress lors du gavage des animaux (20 secondes). Il peut aussi provoquer des diarrhées, des douleurs abdominales, la baisse rapide de température corporelle lors de l’induction du choc anaphylactique. Le gonflement des oreilles lié à l’allergie cutanée (anaphylaxie cutanée) peut provoquer une douleur (non quantifiable en l’absence de réactions observables de l’animal). L’application de patch pour induire une dermatite atopique peut géner l’animal et provoquer des démangeaisons.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser des prélèvements de sang et d’organes pour analyser les cellules et les tissus, notamment grâce à des techniques permettant d’identifier les différents types de cellules et d’observer leur organisation au sein des tissus (comme la cytométrie en flux ou l’histologie).

Remplacement

Bien que des expériences in vitro avec des cellules humaines ou d’animaux sont réalisées au laboratoire, celles-ci ne permettent pas de reproduire toutes les intéractions d’un organisme complet. Les maladies allergiques sont des maladies multifactorielles complexes dans lesquelles plusieurs organes du corps jouent un rôle important (épithélium, organes lymphoïdes secondaires, système vasculaire…). Ce projet est multidisciplinaire et vise à démontrer l’efficacité de différents vaccins à ARN dans le développement de différentes maladies allergiques, dans des modèles murins mimant les pathologies humaines. C’est pourquoi, l’utilisation d’animaux est primordiale afin d’étudier les mécanismes mis en jeu dans les différents modèles allergiques.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons 4 animaux contrôle versus 4 animaux allergiques de même âge et sexe pour chaque expérience. Pour une procédure, chaque souris sera son propre contrôle permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés (une oreille traité vs. une oreille contrôle). Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs, le test statistique le plus approprié sera utilisé.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE. Un enrichissement (frisures de papier (sizzlenest), igloos, ou bâtonnets en bois destinés au rongement...) sera introduit dans l’hébergement des animaux. Les animaux seront suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, pilo-érection et/ou grimace, présence de blessure, … . Si un animal présentait un point limite, il serait immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier les maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponible chez la souris. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles mimant les maladies humaines observées chez les patients. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés entre 7 et 12 semaines, car leur système immunitaire est suffisamment développé pour fonctionner de manière comparable à celui d’un adulte, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et pertinents.

Pour suivre où se répartissent deux candidats médicaments contre la mucoviscidose, 1 562 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une ou plusieurs administrations sous anesthésie, par voie intraveineuse, nasale, trachéale ou sous la peau, avant d'être tuée entre un et sept jours plus tard pour prélever ses organes. Le projet vise à choisir la dose et la voie d'administration avant d'éventuels essais chez l'humain. Le résumé ne détaille pas comment l'effectif de 1 562 a été fixé.

Objectifs

La mucoviscidose est une maladie génétique rare. Elle apparaît lorsqu’un gène chargé de garder le mucus fluide ne fonctionne pas correctement. Le mucus devient alors épais et collant, surtout dans les poumons et le système digestif, ce qui favorise les infections et abîme progressivement les organes. Aujourd’hui, les personnes atteintes vivent en moyenne 40 à 50 ans. Un traitement existe et aide beaucoup de patients, mais il n’est pas parfait : il peut provoquer des effets secondaires et il est très coûteux. C’est pourquoi il est important de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques. Dans ce projet, nous cherchons à développer de nouvelles approches thérapeutiques. Dans cette optique, nous cherchons à comprendre comment administrer au mieux deux nouveaux candidats médicaments afin d’étudier leurs répartitions dans le corps de la souris. En même temps, nous pourrions également montrer que les doses administrées ne provoquent pas d’effets indésirables. Cela nous permettra de choisir la bonne dose, la meilleure manière de les administrer et de préparer les étapes suivantes, comme les tests de sécurité, avant de pouvoir envisager des essais chez l’humain.

Bénéfices attendus

Cette étude va aider les chercheurs à mieux comprendre comment les nouvelles molécules thérapeutiques se répartissent dans les organes chez la souris, selon la manière dont elles sont administrées, la dose utilisée ou leur composition. L’objectif est de trouver la meilleure combinaison pour que ces molécules restent actives pendant une semaine dans les poumons et le système digestif. Si cela fonctionne, cela permettra de réduire la fréquence des traitements : les patients pourraient recevoir ces médicaments une à deux fois par semaine, au lieu de tous les jours comme c’est le cas avec le traitement actuel.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour recevoir une dose unique ou des doses multiples (tous les 2 jours) administrées par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée, intranasale ou intratrachéale. Puis, à la fin du protocole, les animaux seront mis à mort à J+1, J+2, J+3, J+4 ou J+7.

Impact sur les animaux

Les injections peuvent provoquer une douleur légère et passagère, un stress transitoire, une gêne locale ou respiratoire selon la voie d’administration, sans effet durable.

Devenir

Afin de caractériser l’effet de nos traitements, notamment leur devenir dans l’organisme, nous devons récupérer en fin d’expérience les organes des animaux traités et non traités. Cela nécessite l’euthanasie de l’ensemble des animaux du projet. L’étude du devenir des traitements dans les organes est indispensable pour évaluer leur accumulation et pour définir les doses et le nombre d’administrations. La collecte du sang total sera également effectuée afin d’obtenir plus d’informations sur le traitement utilisé (selon les 3R) et d’analyser en parallèle si le traitement active les cytokines (réponse inflammatoire).

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant de reproduire de façon fiable la complexité d’un organisme entier pour étudier la distribution d’un médicament dans les organes. Les modèles cellulaires, les organoïdes ou les simulations informatiques ne permettent ni d’évaluer la circulation systémique, ni de mesurer la répartition précise d’une molécule dans les tissus, ni d’anticiper son élimination. L’utilisation de l’animal est donc indispensable pour obtenir des données biologiquement pertinentes. Avant d’en arriver à cette étape, toutes les alternatives non animales ont été exploitées, notamment des études in vitro et des analyses prédictives, afin de réduire au maximum le recours aux animaux.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, chaque souris sera exploitée au maximum en réalisant plusieurs mesures sur les mêmes individus (analyses de sang, imagerie, prélèvements d’organes). Les groupes expérimentaux sont volontairement restreints au strict minimum permettant d’obtenir des résultats fiables grâce à un calcul préalable de puissance statistique. L’utilisation d’un seul groupe contrôle par procédure, rendu possible par la stabilité de la fluorescence basale quel que soit le mode d’administration ou le temps post‑traitement, évite la création de contrôles supplémentaires. Enfin, l’ensemble du protocole a été conçu pour réduire toute redondance expérimentale, en regroupant les analyses et en évitant tout doublon inutile.

Raffinement

Toutes les procédures sont conçues pour limiter au maximum le stress, la douleur et l’inconfort des animaux. Les souris sont hébergées dans un environnement contrôlé et enrichi (matériaux à ronger, abris, papier), favorisant l’expression de comportements naturels. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé, en douceur et avec le moins de contention possible. Lors des procédures, une anesthésie adaptée est systématiquement utilisée, et un analgésique est administré si un signe de douleur apparaît. Les animaux sont surveillés quotidiennement à l’aide de grilles d’évaluation permettant de repérer rapidement tout signe de détresse. Si un seuil critique est atteint, des critères d’arrêt humanitaires sont appliqués pour éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

La souris a été choisie car il s’agit de l’espèce la plus couramment utilisée et la mieux adaptée pour étudier la répartition d’un médicament dans l’organisme. Son métabolisme, la structure de ses organes et sa réponse aux traitements sont bien connus, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et comparables à d’autres études précliniques. Les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes (environ 8 semaines), un stade auquel leurs organes et systèmes physiologiques sont pleinement développés et fonctionnels. Ce choix garantit que la distribution du médicament reflète correctement celle observée dans un organisme mature, tout en évitant les variations importantes liées à la croissance ou au vieillissement. Les souris seront utilisées après une semaine d’acclimatation pour réduire le stress et assurer des conditions expérimentales stables.

Une injection dans la trachée après incision et suture de la peau, puis sept à huit administrations d'auto-anticorps par voie endotrachéale sur onze jours: 1008 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à J7 ou J14. L'induction de la fibrose peut provoquer des difficultés respiratoires, une perte de poids et une mortalité entre le septième et le quatorzième jour. Les auto-anticorps proviennent de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, injectés pour voir s'ils aggravent la fibrose pulmonaire. Le porteur décrit des cultures de cellules humaines en trois dimensions déjà utilisées en amont, mais affirme qu'elles ne reproduisent pas la fibrose dans un "organe entier".

Objectifs

Chez certaines personnes ayant des prédispositions génétiques et sous l’influence de facteurs environnementaux (exposition à la fumée de tabac), le système immunitaire produit des anticorps anormaux qui vont attaquer leur propre organisme, et provoquer une maladie auto-immune. On parle alors d’auto-anticorps. C’est le cas de la polyarthrite rhumatoïde, une maladie auto-immune se traduisant par une inflammation articulaire au premier plan. Le projet vise à déterminer si ces auto-anticorps favorisent la formation de cicatrices dans les poumons (fibrose). La fibrose rend les poumons moins souples, gêne la respiration et peut conduire à une insuffisance respiratoire possiblement mortelle. Les traitements disponibles aujourd’hui peuvent ralentir l’évolution de la maladie mais ne la guérissent pas. Pour répondre à cette question, nous utiliserons un modèle chez la souris qui reproduit la fibrose pulmonaire et nous étudierons si des auto-anticorps isolés à partir de patients atteints de cette maladie auto-immune aggravent cette fibrose. Les résultats pourraient améliorer la compréhension de la fibrose associée aux maladies auto-immunes et ouvrir des pistes pour de futurs traitements.

Bénéfices attendus

Les mécanismes à l’origine de la fibrose pulmonaire au cours de maladies auto-immunes demeurent encore mal compris à l’heure actuelle. Nous pensons que certains auto- anticorps favorisent la fibrose pulmonaire dans une maladie auto-immune appelée polyarthrite rhumatoïde. Comprendre leur rôle pourrait ouvrir la voie à des prises en charge plus ciblées. La prise en charge des patients présentant cette atteinte potentiellement mortelle constitue un enjeu majeur compte-tenu de sa sévérité.

Procédures

Entre 5 et 10 jours de vie, un prélèvement de tissu sera effectué sur animaux vigiles de certaines lignées génétiquement modifiées, afin de réaliser le génotypage (APAFIS #51323). A J0 de la procédure aura lieu l’induction de la fibrose (ou contrôle) sous anesthésie générale, par injection unique intratrachéale d’un produit déclenchant une fibrose pulmonaire ou d’une solution saline (contrôle). L’injection se fait au niveau de la face antérieure de la trachée après une mini- incision cutanée puis suture. La durée prévisible de cette procédure de l’incision à la suture est de 5–7 min. Une analgésie pré- et post-opératoire sera effectuée. De J-1 à J10 seront administrés les auto-anticorps, sur des animaux sédatés par un gaz anesthésiant par voie endotrachéale toutes les 48 h (7–8 séances sur 11 jours). Cette procédure ne nécessite pas de dissection et consiste en l'injection du produit après introduction d'un cathéter, par la bouche, dans la trachée de l'animal. Ces interventions seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse. A J7, un prélèvement sanguin unique sera réalisé au niveau de la joue sur des sur animaux non sédatés. La durée de cette procédure est de 25 secondes. A J7, J10 et J13, environ la moitié des animaux recevront une injection intra-péritonéale (réalisée dans la cavité abdominale au niveau du quadrant inférieur droit ou gauche) d’une substance activant ou inhibant certaines cellules immunitaires. Ces injections dureront moins de 10 secondes. L’étude prendra fin à J7 ou à J14 : les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale et les tissus seront recueillis.

Impact sur les animaux

Les nuisances liées au génotypage sont décrites dans le projet APAFIS # 51323. Au cours de la procédure, la manipulation répétée des souris pour les différentes administrations de substances peut être source de stress. Les nuisances attendues lors des différentes administrations de substances dépendront du type et de la voie d’administration employés. Les injections intra-péritonéales peuvent provoquer une douleur transitoire ou une petite irritation au point de ponction. L’injection de substances dans la trachée par voie chirurgicale comporte un risque de douleur et d'irritation au niveau de la cicatrice durant 48 heures suivant l’incision et constitue un point de surveillance en post-opératoire. Les injections dans la trachée par voie chirurgicale ou par voie buccale peuvent induire une baisse transitoire de l’oxygénation et nécessite une surveillance du rythme respiratoire et de la couleur des muqueuses. L'induction de la fibrose pulmonaire chez les souris peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Il existe un risque de mortalité liée au développement de la fibrose, à partir du 7ème jour, et jusqu'au 14ème jour après l’induction. La mortalité ne survient en règle générale pas au décours immédiat de l'injection ni entre J0 et J7 après celle-ci, ce qui suggère qu'elle est la conséquence du développement de la fibrose et non du geste en lui-même. Cette mortalité est en général inférieure à 20% des effectifs.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à J7 ou à J14 de l’injection de la substance induisant la fibrose sous anesthésie générale, selon une méthode réglementaire. Les prélèvements pulmonaires et sanguins seront réalisés pour quantifier la fibrose et analyser les cellules immunitaires.

Remplacement

Avant toute expérimentation animale, nous utilisons des méthodes alternatives : cultures de cellules pulmonaires humaines et modèles 3D de sphéroïdes (structures en forme de sphère constituées de cellules pulmonaires humaines cultivées en trois dimensions). Ces approches permettent de tester nos hypothèses et d’optimiser en amont le protocole expérimental appliqué aux souris, limitant ainsi le recours aux animaux. Toutefois, elles ne reproduisent pas : (1) la complexité du développement de la fibrose dans un organe entier, (2) l’intégration du système immunitaire dans sa globalité, (3) le recrutement progressif et la migration de cellules vers le poumon via la circulation sanguine. À ce jour, il n’existe pas d’alternative par expérimentation en laboratoire ou par modélisation virtuelle capable de modéliser fidèlement ces aspects ; l’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

D’une part, nous utiliserons l'effectif minimal qui permet de tester nos hypothèses en s’affranchissant de résultats biaisés par le hasard ou un échantillon de taille insuffisante. De plus, des stratégies d’optimisation de l’utilisation de chaque animal seront appliquées afin de respecter le principe de réduction : collecter le maximum d’organes de toutes les souris expérimentales, partage des tissus/organes au sein de notre unité de recherche, tri et utilisation des cellules et tissus d’intérêt maintenus viables en dehors de l’organisme.

Raffinement

Nous appliquons le raffinement afin de limiter au maximum les contraintes et les possibles douleurs générées. Les méthodes de raffinement liées à la procédure de génotypage sont prises en charge dans le projet APAFIS # 51323. Toutes les procédures sont réalisées par du personnel qualifié et expérimenté. Les souris sont maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales ; aucun animal ne sera isolé. Les instillations intratrachéales de la molécule induisant la fibrose ou de solution saline sont effectuées sous anesthésie générale, avec antalgie pré- et post-opératoire. Un enrichissement est fourni (coton de nidification, petit tunnel) ainsi qu’une alimentation gélifiée facile à ingérer en cas de difficulté de prise alimentaire ; l’eau et la nourriture sont disponibles à volonté. En plus de la surveillance quotidienne par le personnel animalier, une surveillance clinique est assurée par l’expérimentateur après le réveil puis au moins trois fois par semaine jusqu’à l’euthanasie selon une grille de points limites évaluant l’apparence, le comportement, la perte de poids et l’état de la suture. La fréquence de suivi sera augmentée si nécessaire. Tout animal atteignant un point limite sera euthanasié sans délai.

Choix des espèces

D’une part, les modèles de fibrose pulmonaire chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose humaine. D’autre part, l’étude du système immunitaire murin a conduit à de nombreuses découvertes dans le domaine des traitements modulant le système immunitaire et a permis de tester la sécurité et l’efficacité des thérapies ciblant les processus immunitaires avant les essais cliniques humains. Les souris offrent aussi la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon. Ainsi la souris est un animal incontournable pour répondre à des enjeux de santé humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 8 et 24 semaines. La fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.

Immunodéprimées pour accepter des cellules pulmonaires humaines, 169 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un emphysème est d'abord provoqué par instillation d'élastase dans la trachée, avant la greffe de cellules alvéolaires humaines par inhalation sous anesthésie. L'atteinte pulmonaire peut entraîner des difficultés respiratoires et une perte de poids. Les poumons sont prélevés après la mise à mort pour évaluer si les cellules greffées réparent les alvéoles détruites, une preuve de concept en vue d'une éventuelle thérapie cellulaire humaine.

Objectifs

L’emphysème pulmonaire est une maladie fréquente et potentiellement grave pouvant évoluer vers une insuffisance respiratoire. Il est principalement lié à l’exposition à la fumée de cigarette et se caractérise par la destruction progressive des alvéoles pulmonaires. Cette altération résulte d’un défaut de régénération alvéolaire dont les mécanismes restent encore mal connus. À ce jour, aucun traitement ne permet de former de nouvelles alvéoles ni d’améliorer durablement la fonction alvéolaire chez les patients atteints de formes sévères. Des avancées récentes suggèrent que les cellules épithéliales alvéolaires (CEA) peuvent se greffer dans le poumon de souris endommagées par une autre pathologie, la fibrose pulmonaire, et contribuer à une amélioration de leur état de santé. Il a également été montré que le vieillissement cellulaire, appelé sénescence, peut limiter l’efficacité de ces greffes. L’hypothèse de ce projet est que la transplantation de CEA, en particulier de cellules non sénescentes, dans un modèle murin d’emphysème induit par instillation d’élastase, permettrait de réparer les alvéoles lésées. Il sera également étudié si l’association avec des fibroblastes peut renforcer l’efficacité de la greffe. Le premier objectif de ce projet est de mettre en place un modèle d’emphysème chez des souris immunodéprimées en déterminant la concentration d’élastase nécessaire pour induire l’atteinte pulmonaire. Le second objectif va consister à greffer des CEA humaines obtenues à partir de poumons humains transplantés dans les poumons emphysémateux murins (xénogreffe) afin d’évaluer leur capacité de réparation. Les CEA humaines seront greffées seules, avec ou sans élimination des cellules sénescentes et avec ou sans des cellules de support (fibroblastes) et les fibroblastes primaires humains obtenus de poumons de patients emphysémateux et non emphysémateux ayant subi une chirurgie thoracique carcinologique ou une transplantation. Les cellules sénescentes et non sénescentes seront isolées grâce à des sondes fluorescentes puis transplantées dans le modèle murin. Le recours au modèle animal est justifié par sa pertinence pour l’étude des thérapies cellulaires, contrairement aux cultures in vitro.

Bénéfices attendus

Si les résultats sont positifs, ils constitueront une première preuve de concept concernant : 1) la capacité des CEA à s’implanter avec succès dans le poumon emphysémateux avec l’aide ou non des fibroblastes. Cela permettrait d’envisager la transplantation de cellules dans cette maladie chez l’homme. 2) la sélection de cellules non sénescentes comme outil important pour augmenter la capacité des CEA à s’implanter dans le poumon emphysémateux et d’augmenter leur capacité de réparation Dans l’ensemble, ces résultats ouvriraient un nouvel axe de recherche pour l’équipe, fondé sur l’optimisation de la thérapie cellulaire à base de cellules CEA dans l’emphysème.

Procédures

Injection dans l'abdomen sur animal vigile. Durée de la procédure : 30 sec Instillation dans la trachée. Durée de la procédure : 5 min Xénogreffe par inhalation sous anesthésie générale. Durée de la procédure : 1 à 2 min Prélèvement des poumons sous anesthésie générale profonde. Durée de la procédure : 3 à 4 min. L’instillation d’élastase est une instillation unique, de même que l’instillation des cellules épithéliales alvéolaires humaines (à différents temps en fonction des groupes).

Impact sur les animaux

L’instillation endotrachéale peut générer une douleur légère au moment de l’anesthésie. Elles peuvent potentiellement générer du stress chez l'animal, notamment lors de la manipulation au cours des pesées, de la préhension de l'animal, ou encore lors des déplacements de cage. De plus, ces différentes manipulations sont effectuées durant la journée, moment au cours duquel les souris sont en phase de sommeil. Le développement de l’emphysème dû à l’instillation de l’élastase conduit à des dommages du poumon qui peuvent entraîner des difficultés respiratoires (dyspnée) et potentiellement une perte de poids.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issue de leurs procédures respectives afin de prélever et d’étudier leurs poumons.

Remplacement

Les modèles de culture cellulaire, qu’ils soient en 2D ou en 3D, ne permettent pas de reproduire l’emphysème. Ils ne permettent pas non plus d’appréhender la faisabilité et les effets d’une greffe de CEA dans le poumon ou d’évaluer l’efficacité de traitements visant à atténuer cette pathologie. À l’inverse, le modèle murin d’emphysème induit par l’élastase est un modèle largement utilisé et validé pour l’étude de l’emphysème. Il permet d’évaluer l’effet thérapeutique de la greffe de CEA dans un contexte physiologique de lésion pulmonaire. De plus, si ce modèle permet de réparer le poumon lésé chez la souris grâce aux cellules implantées, cela suggérera que ces cellules d’intérêt jouent un rôle clé dans la régénération pulmonaire. L’identification et la caractérisation des cellules greffées capables de restaurer la fonction pulmonaire permettront ainsi de les définir comme des cibles thérapeutiques potentielles.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est limité à 169. Cela correspond au minimum pour obtenir des résultats pour une expérience pilote. Des expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=8 d’animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses histologiques, moléculaires et fonctionnelles compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle dans nos modèles d’emphysème.

Raffinement

Les animaux importés de fournisseurs agréés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent présent à l’animalerie ainsi que par les porteurs de ce projet. Une surveillance accrue de notre part sera faite durant les 24h suivant l’instillation d’élastase. Les souris seront hébergées en groupe de 5 par cage dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi par des maisons ou tube en carton, du papier craft et du coton. Les zootechniciens et les porteurs du projet seront en communication concernant le bien-être, la santé des animaux et le respect des points limites. Le poids des animaux sera mesuré chaque semaine. Si nous sommes amenés à avoir un mâle isolé, nous réduirons au maximum l’impact de cet isolement par une augmentation de l’enrichissement de son environnement et par le maintien de stimulations sociales indirectes (contacts visuels à travers la cage, contacts olfactifs en ajoutant de la litière provenant de la cage d’où il provient).

Choix des espèces

La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes et la mise au point de modèles génétiquement modifiés est bien développée. Également, le modèle d’emphysème induit par l’élastase permet par une unique instillation d’obtenir un emphysème important chez la souris et ce modèle est très utilisé dans la littérature. Les animaux ne seront pas utilisés avant l’âge de 2 mois, pour attendre la fin du développement total de l’appareil respiratoire chez la souris. Les souris seront utilisées quand elles pèseront au moins 25 g.