Troubles musculosquelettiques

17 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte de la collagénase dans le tendon rotulien pour provoquer une tendinopathie, avant des séances d'imagerie répétées sous anesthésie sur 35 jours et, pour dix d'entre eux, une embolisation des vaisseaux. Les deux tendons sont prélevés après la mise à mort, geste que le porteur juge "indispensable" pour confirmer les données d'imagerie. Il affirme qu'aucune méthode sans animal ne permet d'étudier la néovascularisation dans un "organisme vivant" et retient le porc pour son accès endovasculaire proche de l'humain.

Objectifs

La tendinopathie est une pathologie fréquente. Celle-ci touche essentiellement les populations jeunes et adultes, elle est responsable d’une altération importante de la qualité de vie que ce soit sur le plan professionnel ou personnel. Le principal symptôme étant la douleur chronique. Le traitement initial de la tendinopathie est principalement conservateur avec une reprise physique douce, glaçage, l’administration d’anti inflammatoires non stéréoidiens, l’injection péri tendineuse de corticostéroïdes ou l’injection intra-tendineuse de plasma riche en plaquettes. De nouveaux traitements sont également apparus, ceux-ci ciblant la néoangiogénèse dans les tendinopathies, correspondant la création de nouveaux vaisseaux : électrocoagulation des vaisseaux, sclérose des vaisseaux sous guidage échographique… Plus récemment, de nombreuses études sont apparues dans le traitement des pathologies ostéoarticulaires et notamment l’embolisation intra vasculaire des néo vaisseaux avec un succès clinique important (jusqu’à 80% de succès clinique persistant à 3 ans). Cependant, de nombreux agents emboliques sont utilisés et dans de nombreuses indications différentes les unes des autres. Certaines études ont montré une efficacité précoce mais avec une récurrence rapide de la douleur. Il est donc essentiel de mieux comprendre l’ensemble de ces mécanismes. L’objectif de notre projet est de mieux comprendre le mécanisme de néovascularisation (création de nouveaux vaisseaux) dans les tendinopathies et leur corrélation. De plus nous évaluerons l’effet de l’embolisation sur cette néoangiogenèse.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra une meilleure compréhension de la formation et de l'évolution des néovaisseaux dans un modèle de tendinopathie. De plus, l'analyse comparative de modèles de tendinopatie avec et sans traitement par embolisation ostéoarticulaire permettra d'étudier ses effets sur les néovaisseaux. Si nous montrons que l'embolisation provoque la destruction des néovaisseaux au début mais stimule la néoangiogenèse en même temps, nous pourrions expliquer l'effet transitoire (bon effet à 3 mois mais modéré à 1 an) et nous pourrions proposer une meilleure sélection des patients pouvant bénéficier d’une embolisation musculo-squelettique tels que les patients souffrant de douleurs aiguës provoquant une immobilisation douloureuse d’une articulation.

Procédures

Le protocole se déroule sur 35 jours: 1) acclimatation des animaux 2) sessions d'imagerie (scanner et TEP-CT) sous anesthésie générale, répétées à J0, 72h, J7, J9, J14, J21 et J28, chaque session durera environ 2h (30 minutes de préparation de l’animal, 10 minutes de scanner et 20 minutes d’acquisition TEP réalisée 1h post-injection du radiotraceur). 3) induction du modèle de tendinopathie par injection intra tendineuse au niveau du tendon patellaire de collagénase de type 1. Cette injection est réalisée suite à la 1ère session d'imagerie basale, sur un animal toujours sous anesthésie générale. L'induction du modèle dure environ une quinzaine de minutes. Dix animaux recevront le traitement par embolisation, cette procédure durera 30minutes. La mise à mort est réalisée à la fin de la procédure expérimentale n°1, sous anesthésie générale, par injection intra veineuse de pentobarbital (140mg/kg) . Les tendons patellaires sont prélevés après la mise à mort.

Impact sur les animaux

Le modèle de tendinopathie peut provoquer des douleurs au niveau de l'articulation. Afin de limiter celles-ci nous avons constitué des groupes hétérogènes afin de disperser les tendons recevant le modèle pour que chaque cochons puisse avoir un tendon sain ou un tendon traité. De plus, lors des phases d'observation de l’étude précédente ayant permis la validation de la dose de collagénase, aucun signe d’apparition d’inconfort ou de douleur, ni de changement de comportement chez les animaux n'ont été relevés. Enfin, pour réduire la douleur et d'éviter le stress chez les animaux, tous les gestes interventionnels seront réalisés sous anesthésie générale.

Devenir

Tous les animaux (n=17) du projet seront mis à mort à la fin de la procédure n°1. Le prélèvement des 2 tendons patellaires est indispensable afin de pouvoir confirmer les données d'imagerie par les analyses histologiques.

Remplacement

Il s’agit d’une étude ayant pour objectif de mieux comprendre le mécanisme de néovascularisation dans les tendinopathies ainsi que l’effet de l’embolisation sur cette néoangiogenèse. Cette meilleure compréhension permettra d’expliquer l'efficacité et la précision d'une technique de radiologie interventionnelle (l’embolisation). Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques. En effet, le mécanisme de néovascularisation ne peut etre étudié que dans un organisme vivant. Le modèle animal choisi est le Porc qui présente l’avantage d’être accessible à une exploration endovasculaire pour embolisation par rapport au petit animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois de travailler sur un nombre suffisant pour obtenir une différence significative entre les différents groupes pour les comparaisons. La plupart des analyses dépendront de données qualitatives, par expérience, un nombre de 10 tendons par groupe permettra d'obtenir des résultats interprétables, en tenant compte de la variabilité interindividuelle. En prenant en compte le risque que la création du modèle de tendinopathie puisse ne pas aboutir dans 10% des cas, le nombre maximum d'animaux necéssaires pour avoir le nombre de tendons voulu sera donc de 17 cochons. Le projet sera arrêté dès l'obtention du nombre de tendons souhaité (soit 10 tendons par groupe).

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisées. Les gestes interventionnels seront toujours réalisés sous anesthésie générale, par du personnel formé, permettant un temps interventionnel réduit au maximun, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Le bien-être de l'animal sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux. L'acclimatation des animaux sera d'une semaine avant d'entrer dans le protocole. Des observations quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (peu enclins aux manipulations, tentative de fuite). Ces contrôles sont enregistrés et permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Des controles biquotidiens en postopératoire sur une durée de 5 jours seront réalisés par une personne compétente avec évaluation du bien-être et de la douleur (Annexe 2). L'évolution du score permet de noter l'amélioration ou l'aggravation de l'état de l'animal et de prendre des mesures appropriées (points limites). Chaque paramètre est ainsi quantifiable, les scores sont additionnés et l'atteinte d'un score supérieur ou égal à 6 définit un point limite et engendre la sortie de l'animal du programme et sa mise à mort après consultation du vétérinaire référent si nécessaire. Tout constat d'un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondis, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent.

Choix des espèces

Il s’agit d’une étude ayant pour objectifs de mieux comprendre le mécanisme de néovascularisation dans les tendinopathies et leur corrélation, d’expliquer l'efficacité et la précision d'une technique de radiologie interventionnelle en étudiant l’effet de l’embolisation sur la néoangiogenèse. Le recours à un modèle in vivo est incontournable pour créer un modèle de pathologie et étudier les conséquences vasculaires d'un traitement par embolisation. Le modèle animal choisi est le Porc qui présente l’avantage d’être accessible à une exploration endovasculaire pour embolisation par rapport au petit animal. De manière générale, le Porc est un bon modèle d'étude, proche de la physiologie humaine, notamment au niveau de la vascularisation, ce qui permet de reproduire les therapeutiques utilisées chez l'Homme. De plus, le modèle de tendinopathie sur le Porc est bien décrit dans la littérature. Les animaux seront des porcs adultes. Les tendinopathies touchent en très grande majorité les populations d'adultes.

819 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une cryolésion, une brûlure par le froid de degré 4 détruisant le muscle, réalisée sous anesthésie et provoquant une boiterie transitoire, pour étudier le rôle d'une chimiokine dans la réparation musculaire. Le porteur soutient, références à l'appui, que la destruction des terminaisons nerveuses rend la zone insensible, et prévoit un antalgique péri-opératoire. Il affirme qu'aucun système de culture ne pourrait reproduire la complexité des interactions cellulaires impliquées.

Objectifs

L’objectif du projet est de détailler le rôle des isoformes de CXCL12 dans la stabilité de la microvasculature musculaire à l’homéostasie et dans la réparation musculaire après lésion. La microvasculature à l’homéostasie et les étapes de réparation tissulaire seront étudiées dans des souris de phénotype sauvage, dans des souris dont CXCL12 est dépourvu de tous ses sites de fixation à la matrice extracellulaire (souris CXCL12gatm) et dans des souris n’exprimant pas CXCL12γ qui est l’isoforme ayant de loin la plus forte affinité à la matrice extracellulaire (souris CXCL12gamma). Nous avons des souris portant également la mutation Flk1-GFP qui permet de visualiser directement les vaisseaux sanguins en microscopie confocale. Les lésions musculaires seront créées en suivant le protocole de cryolésion décrit dans le projet dont celui-ci prend la suite. A différents temps post-lésions, les muscles seront prélevés après mise à mort des animaux et étudiés par des méthodes standard d’histologie impliquant des colorations de coupes et des immunomarquages des populations cellulaires impliquées. Ces analyses seront complétées par des quantification d’expression, par qPCR, des isoformes de CXCL12.

Bénéfices attendus

Ces expériences devraient permettre de comprendre de façon plus fine l’implication de CXCL12 dans les processus de réparation musculaire et devraient à plus long terme ouvrir à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation de cette chimiokine multifonctionnelle, exprimée dans de nombreux organes et tissus depuis les premières étapes du développement et tout au long de la vie. La très grande similarité entre CXCL12 de souris et CXCL12 humaine (CXCL12 est extrêmement conservée dans l’évolution) est évidemment un atout important dans une perspective translationnelle. Des interventions thérapeutiques ciblées sur un isoforme, dans le cas de processus pathologiques impliquant CXCL12, pourraient permettre de moduler l’action de cette cytokine qu’il est difficile de cibler dans sa totalité du fait de son caractère essentiel.

Procédures

Cryolésion une fois dans leur vie (une intervention réalisée sous anesthésie). L’intervention dure quelques minutes.

Impact sur les animaux

Les mutations sur CXCL12 ou sur flk1 n’entraînent aucun phénotype particulier, en particulier aucune altération visible du comportement ou de la fertilité. Chez l’humain les brûlures par le froid (gelures) de degré 3 (atteinte de toute l’épaisseur du derme) et 4 (destruction musculaire) détruisent les terminaisons nerveuses et s’accompagnent d’une perte de sensibilité. Cf les deux sites web ci-dessous : https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/frostbite/symptoms-causes/syc-20372656 (“Deep (severe) frostbite … [that] affects all layers of the skin as well as the tissues that lie below [makes] the skin turns white or blue-gray and you lose all sensation of cold, pain or discomfort in the area.”) http://www.brulures.be/index.php/degres-de-gravite/fr/ (« les atteintes du 3e degré sont indolores du fait de la destruction des terminaisons nerveuses ») La brûlure que nous appliquons aux souris est de degré 4 et donc après cryolésion les terminaisons nerveuses du tissu sont détruites. Nous pouvons en déduire que, par les mêmes mécanismes que chez l’Homme, il y a une perte de sensibilité au niveau de la cryolésion. Les souris seront protégées de la douleur de l’incision cutanée par une anesthésie générale à l’isoflurane, complétée d’un traitement antalgique péri-opératoire. Il est possible que des douleurs apparaissent à la ré-innervation ou du fait de la réaction inflammatoire. Le risque d’infection secondaire qui accompagne les brûlures graves chez l’Homme est ici très faible parce que la brûlure sera protégée par la peau qui, elle, sera intacte (quoique suturée). Du côté lésé, les souris auront une perte transitoire de la fonction musculaire engendrant une boiterie, qui n’empêchera pas les animaux d’accéder à la nourriture dans la grille.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le projet seront euthanasiés.

Remplacement

Nous nous intéressons à la régulation complexe par CXCL12 et ses isoformes d’interactions entre des populations cellulaires différentes (résidentes du tissu et recrutées à partir du sang) permettant la régénération d’un tissu lésé. CXCL12 lui-même peut avoir différentes cibles cellulaires. Aucun système de culture ne pourrait reproduire fidèlement la complexité de l’environnement cellulaire impliqué.

Réduction

Le nombre de souris a été déterminé en comptant 7 animaux par groupe, et en multipliant par le nombre de points d’observation prévus. Le nombre de souris pour chaque groupe a été déterminé sur la base de précédentes expériences. Un effectif de 7 animaux par groupe a été retenu pour permettre de détecter les différences de moyenne attendues entre les deux lignées mutantes, avec une puissance statistique suffisante. Chaque animal fournit un muscle lésé et son contrôle controlatéral, non lésé, et un groupe contrôle présentant le phénotype sauvage est également inclus.

Raffinement

La cryolésion sera réalisée dans le cadre d’une anesthésie gazeuse et d’un traitement antalgique complémentaire. Les animaux seront sur plaque chauffante le temps de l’intervention et des chaufferettes seront utilisées jusqu’au réveil complet. De l’aliment appétent facilement absorbable sera rajouté dans les cages qui seront également enrichies d’un igloo. Les souris seront surveillées quotidiennement par le responsable du protocole à la recherche de signes de complications locales, de douleur ou d’altération de l’état général. Si certains de ces signes apparaissent, des actions adaptées seront mises en oeuvre.

Choix des espèces

Nous travaillons chez la souris car il s’agit d’un petit Mammifère, étudié par de nombreuses unités de recherche (important pour les confrontations avec les résultats antérieurs), pour lequel de nombreux outils existent (anticorps, biologie moléculaire, etc…), génétiquement manipulable, aux temps de génération courts et aux portées nombreuses, permettant d’obtenir rapidement le nombre d’animaux nécessaire pour nos expérimentations. De plus, le CXCL12 murin est homologue à 99% au CXCL12 humain. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes âgés de 6 et 10 semaines. Le choix de cette tranche d’âge résulte des éléments suivants : 1) L’importance de garder les mêmes conditions expérimentales que celles qui ont été utilisées dans une étude antérieure dont celle-ci prendra la suite ; 2) Pour ces deux études, le but est d’étudier des processus de réparation tissulaire et vasculaire à l’âge adulte, sans interférence avec la croissance et la maturation du système immunitaire des premières semaines de vie, ni avec les processus de vieillissement qui surviennent au-delà de quelques mois.