Troubles musculosquelettiques

2 090 rongeurs, 1 640 souris et 450 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées par de nombreuses voies, jusque dans le duodénum ou la trachée sous anesthésie, pendant jusqu'à 24 semaines, pour tester des molécules de thérapie génique contre des maladies génétiques. Le porteur mentionne des modèles génétiquement modifiés au phénotype "dommageable", les animaux étant tués avant l'apparition des symptômes. Il justifie le recours à deux espèces par les exigences des études réglementaires et qualifie le modèle animal d'"indispensable" pour un développement préclinique.

Objectifs

Notre équipe développe des outils moléculaires de transfert de gène et d’approches antisens dont l’objectif principal est l’identification d’un ou plusieurs candidats susceptibles d’être utilisés dans de futurs essais cliniques. Nos efforts se focalisent sur des pathologies génétiques essentiellement neuromusculaires. Le challenge est d’autant plus grand qu’il s’agit de maladies qui nécessitent un traitement sur corps entier. Ainsi, face à ces contraintes physiopathologiques nous focalisons nos efforts sur des stratégies, des technologies et des outils moléculaires capables de répondre efficacement à ce défi. Dans ce contexte, nous développons une approche innovante de modulation de l’épissage en interférerant avec la machinerie d’épissage des ARN pré-messagers. Il s’agit plus précisément de forcer la machinerie d’épissage à former et « libérer » des ARN messagers exempts de mutations et capables d’être traduits en protéines fonctionnelles. Pour cela nous développons de courtes séquences d’oligonucléotides antisens (AON) chimiquement modifiés qui gardent la capacité de se lier aux ARN par complémentarité de bases. Le deuxième outil est matérialisé sous la forme d’un petit ARN nucléaire, l’U7snRNA, modifié au niveau de sa séquence d’origine pour participer, au même titre que les AONs, à la modulation de l’épissage des ARN mutés. Les outils dérivés de l’U7snRNA sont délivrés par deux types de vecteurs. Les premiers sont des vecteurs dérivés des virus adéno-associés (AAV). Le deuxième type de vecteur que nous développons est matérialisé sous forme de molécule d’ADN nu dérivée du génome des AAV. Le recours aux AAV comme vecteurs de gènes est largement utilisé à travers le monde et des essais cliniques de thérapie génique sont autorisés par les instances règlementaires depuis de nombreuses années.Dans le cadre de cette approche envisagée, il s’agit de trouver la meilleure molécule et la meilleure voie d’administration pour la délivrance de nos outils thérapeutiques dans l’environnement in vivo.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de maladie génétiques. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus fort potentiel thérapeutique ainsi que la voie d'administration la plus appropriée, permettant une amélioration significative chez les modèles animaux etudiés, et à plus long terme chez les patients traités.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de molécules actives selon différentes voies (intramusculaire, intraveineuse, intra-péritonéale ou sous cutanée) afin d’évaluer les meilleures voies pour la biodistribution. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil, les injections intra péritonéale ou sous cutanée pourront être plus brèves de l’ordre de 1 à 2 minutes si elles sont réalisées sur animaux vigiles. Aucun animal ne recevra plus d’une injection par jour. En revanche, afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les injections systémiques pourront être répétées chaque semaine, sur une durée maximum de 24 semaines. Si nos molécules se révèlent efficace après analyse de la procédure 1, nous testerons des voies d’administration moins invasives chez le patient en vue d’un essai clinique, à savoir une administration orale (intra-stomachal ou intra dudodenum) et une administration pulmonaire (intra- nasale ou intra-tracheal). L’administration intra-duodenum sera réalisée uniquement sur un petit nombre d’animaux pour voir si la molécule passe le duodenum. Cette intervention durera 1h entre l’anesthesie et le réveil de l’animal et ne sera pas répétée. En revanche, pour l’administration intra stomachal, intra nasal et intra tracheal ; afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les administrations pourront être répétées 1 à 4 fois par semaine, sur une durée maximum de 12 semaines. Les administrations intra-stomachal et intra-nasale sont brèves, de lors de 1 à 2 minutes par animaux. Pour les administrations intra tracheal elles se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil. Les animaux pourront également de façon optionnel être soumis à des prélèvements sanguins. Pour cela, les animaux recevront une anesthésie générale et le sang sera prélevé sur une veine superficielle (veine de la queue, sinus retro-orbital ou sous maxilaire). Un volume sanguin maximum de 10% du volume total sera recueilli et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours selon les normes en vigueur. Les animaux pourront de même de facon optionnelle être placés en cage métabolique pendant 24h afin de récolter l’urine.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales de ce projet (anesthésies, administration de molécules, euthanasie) sont simples et peu ou pas douloureuses. Cependant les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la présence de plaies seront évalués post-adminsitration jusqu’au sacrifice. Les animaux montrant un signe quelconque de détérioration de santé dûe à une potentielle toxicité de nos molécules seront sacrifiés immédiatement. Les autres nuisances qui pourraient être observées concernent surtout les animaux subissant la procédure d’administration intra-duodenum qui pourraient présenter des difficultés d’alimentation du fait du déplacement possible du duodenum lors de l’administation. Leurs états seront donc particulièrement surveillés avec ajout de nourriture en gelée si besoins. Concernant les modèles utilisés, il peut s’agir d’animaux altérés génétiquement classé « dommageable », car les gènes responsables des maladies génétiques étudiées sont invalidés. Ces modèles développent des phénotypes dommageables très légers et tardifs, et les animaux dans ce projet seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant en cas de protocole long allant jusqu’à 6 mois dans nos procédures, les animaux seront particulièrement surveillés afin d’être euthanasiés si les symptômes devaient apparaitre prématurément.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de toutes les procédures afin de collecter l’ensemble des tissus d’interet et de valider l’impact du traitement au niveau moléculaire (Analyse ARN, protéine, etc.)

Remplacement

Dans notre respect de la règle des 3R, nos molécules actives font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats thérapeutiques et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Cependant, dans le cas d’un développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux s’avère indispensable pour sélectionner les molécules les plus prometteuses d’un point de vue efficacité mais également présentant un profil toxicologique favorable. L’efficacité thérapeutique de nos molécules, seules ou en combinaison, est évaluée grâce à des modèles rongeurs appropriés.

Réduction

Toutes nos molécules sont préalablement testées in vitro afin de déterminer leurs potentiels thérapeutiques et leurs toxicités. Si ces molécules sont efficaces in vitro, et qu’elles ne sont pas toxiques sur cellules nous vérifions tout d’abord chez un petit nombre de rongeurs qu’elles présentent le même potentiel en injection locale (intra-musculaire). Les molécules ayant démontré une efficacité après injection locale en intramusculaire, seront évaluées par injection systémique pour évaluation moléculaire et tissulaire. Si et seulement si nos molécules sont efficaces par injection systémique, nous testerons les autres voies d’administrations (moins invasives pour le patient en vue d’un essai clinique) à savoir l’administration par voie orale ou pulmonaire. Les tests type student, fisher, ANOVA ou Bonferroni/Dunn seront effectués pour chaque lot afin d’obtenir une analyse statistique correcte en utilisant le moins d’animaux possibles suite au plan d’expérience préalablement défini.

Raffinement

LLors de leur arrivée, les rongeurs auront 5 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement. Ils seront stabulés sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement et de la nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (jour entre 6h et 18h). Le milieu est enrichi avec du coton compacté pour la nidification et des igloos en polypropylène sont disposés dans leur cage permettant les jeux et le repos des animaux. Une alimentation adaptée et enrichie est donnée à volonté et de l’alimentation en gelée pourra être disposés dans la cage pour des animaux jeunes ou ayant subi une procédure afin de faciliter l’accès. Concernant le phénotype de certains modèles pouvant être utilisés, il est classé « dommageable » car les gènes responsables des maladies génétiques sont invalidés. Cependant, ces modèles développent des phénotypes dommageables légers et tardifs, et les animaux seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant ces animaux au phénotype dommageable font tout de même l’objet d’une autorisation à part au sein de notre animalerie pour la procédure d’élevage.Tout au long du protocole, l’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de réduire tout inconfort ou douleur qui pourraient se développer. Nous avons plusieurs années de pratique de ces procédures et n’avons jamais observé de souffrance liée à sa pratique. Néanmoins, les rongeurs seront surveillés après la procédure pour vérifier leur réveil et le retour à un comportement normal.

Choix des espèces

Nous évaluerons l’efficacité et le profil toxicologique de nos molécules administrées sur modèle rongeurs, celui-ci étant le plus adapté (taille, disponibilité, lignée appropriée aux maladies génétiques étudiées) pour une évaluation thérapeutique pré-clinique. Nous travaillerons sur 2 espèces, à savoir sur les souris et les rats, cette condition de 2 espèces étant exigés dans les études réglementaires (notamment de toxicité chronique) de produits destinés à un traitement pharmaceutique La majorité des animaux utilisés seront des rongeurs d’âges adultes afin d’évaluer l’efficacité, ainsi que le profil toxicologique des molécules sur animaux adultes Cependant, afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement précoce ayant pour objectif d’empêcher ou de retarder l’apparition d’un phénotype pathologique, nous évaluerons également les molécules thérapeutiques sur des rongeurs plus jeunes (allant du stade nouveaux-nés à 4 semaines). Enfin, un de nos objectifs consistera à vérifier la possibilité du passage de la barrière placentaire des médicaments, et nous traiterons pour cela des adultes gestantes.

54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles courent sur un tapis roulant trois fois par semaine pendant six semaines, subissent un test d'endurance final et deux prélèvements de sang, pour évaluer l'effet d'un extrait de microalgue sur la performance sportive. Le porteur reconnaît que la course peut stresser les animaux et prévoit des séances d'habituation. L'objet du projet relève de la nutrition sportive, et les animaux sont tués pour recueillir du matériel biologique.

Objectifs

L'effort d'endurance mobilise de nombreuses ressources, notamment les nutriments issus de l'alimentation. Ces nutriments sont majoritairement utilisés au niveau musculaire afin de produire une contraction et une relaxation optimales, mais également afin que les muscles puissent récupérer correctement après l'effort. Toutefois, les sportifs qui s'entrainent avec une grande fréquence ont besoin d'une plus grande quantité de substrats afin de pouvoir soutenir un effort intense sur une base régulière, nécessaire pour progresser. Ce protocole est destiné à évaluer l'effet d'un extrait de microalgue dans ce contexte de nutrition sportive.

Bénéfices attendus

Les effets potentiels de la supplementation en microalgue seront évalués sur la performance des animaux suite au test d'endurance final. De plus, les modifications métaboliques seront identifiées par des dosages des marqeurs des voies du métabolisme énergétique et musculaire. Des marqueurs inflammatoires et du stress oxydant seront également recherchés.

Procédures

Les souris seront nourries ad libitum pendant 6 semaines avec un régime contrôle ou avec un régime supplémenté avec un extrait de microalgue (1 extrait, 4 doses). Les animaux courront sur un tapis de course adapté pendant ces 6 semaines tous les lundis, mercredis et vendredi pendant 1h. Lors de la dernière course, les souris seront soumises à un test d'endurance afin de mesurer leur performance. 2 prélévements de sang de 100µL sur animal vigile seront réalisés à 6 semaines d'intervalle.

Impact sur les animaux

La course sur tapis roulant peut engendrer un stress chez l'animal. Afin de limiter ce stress, les animaux suivront des séances d'habituation lors des premières séances de course. Lors de ces séances, les souris seront tout d’abord laissées libres d’exploration sur le tapis d’exercice éteint. L’appareil sera ensuite allumé pour que les animaux s’habituent au bruit du moteur puis le tapis roulant sera mis en marche pendant 5 min à la vitesse de 9 m/min, avec une pente de +5 degré.

Devenir

A l'issu de la procédure, tous les animaux mis à mort pour recueil du materiel biologique nécessaire aux analyses.

Remplacement

L'étude des relations entre alimentation et activité physique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Aucun modèle in vitro n’a la capacité d’intégrer cette complexité ni de mesurer les niveaux d'endurance à l'effort physique.

Réduction

Le nombre d'animaux est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. Des études du même type portent sur 8 à 10 animaux, du fait de la forte variabilité entre animaux au niveau de la performance sportive. Nous avons choisi de travailler avec 9 animaux afin que le nombre d'animaux par cage soit homogène (3 souris par cage). Nous chercherons à mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes à l'aide de tests statistiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés par cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. La course sur tapis roulant peut engendrer un stress chez l'animal. Afin de limiter ce stress, les animaux suivront des séances d'habituation lors des premières séances de course. Lors de ces séances, les souris seront tout d’abord laissées libres d’exploration sur le tapis d’exercice éteint. L’appareil sera ensuite allumé pour que les animaux s’habituent au bruit du moteur puis le tapis roulant sera mis en marche pendant 5 min à la vitesse de 9 m/min, avec une pente de +5 degré. Les animaux seront observés hebdomadairement afin de détecter des comportements agressifs de certains animaux, si tel est le cas l'animal agressif sera isolé de ses congénères dans une cage individuelle. Si un animal est blessé, il sera soigné par badigeonnage de bétadine sur la zone lésée, il sera également isolé le temps de la cicatrisation de ses blessures. Dans tous les cas, les animaux isolés resteront en contact visuel, olfactifs et auditifs avec leurs congénères. Pour chaque procédure, des points limites spécifiques et des points d'arrêt ont été prévus.

Choix des espèces

La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant la mobilisation des ressources énergétiques, notamment au cours d’un exercice imposé. Le modèle C57Bl/6J est une souche reconnue pour ce type d'expérimentation. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.

1890 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de dystrophies musculaires, elles reçoivent des injections répétées et des gavages plusieurs fois par semaine, ainsi que des vecteurs de thérapie génique, avant une évaluation de la force musculaire sous anesthésie terminale. Le porteur soutient que les traitements, "tous de nature bénéfique", ne justifient pas de points limites, tout en décrivant des modèles sévères au phénotype avancé. Il affirme que l'effet ne peut être obtenu que dans un organisme "entier" et qualifie ces expériences d'"absolument indispensables".

Objectifs

L'objectif de ce projet s’inscrit dans l’évaluation d’approches de thérapie génique médiées par des vecteurs viraux pour les dystrophies musculaires, pour lesquelles il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement. Ces maladies sont caractérisées par des cycles de dégénérescence/régénération du muscle entrainant une perte des fibres musculaires au profit de tissu fibrotique ou adipeux. Ce processus dégénératif provient de défauts génétiques et conduit à des conséquences délétères sur la fonction motrice, la qualité et la durée de vie des patients. Il peut impacter les capacités de réversion du phénotype myopathologique. En raison de la progressivité du processus dégénératif, le diagnostic et le traitement se réalisent alors que la dégénération est engagée déjà depuis des années chez les patients. Il semble que ceci soit à l’origine de la faible efficacité des approches de thérapie génique observée dans les essais cliniques dans les dystrophies musculaires où la restauration fonctionnelle dépasse rarement 15%. De plus, les essais cliniques soulignent la possibilité d’apparition d’effets adverses liés aux doses utilisées. Il apparait donc nécessaire d’adjoindre au transfert de gène des traitements agissant sur le mécanisme physiopathologique dystrophique afin d’obtenir un effet thérapeutique probant et une meilleure sécurité. Le but est d’évaluer l’effet de traitements thérapeutiques agissant sur les différentes composantes du processus dystrophique en combinaison avec un produit de thérapie génique pour évaluer leur synergie sur les modèles murins des pathologies incluses dans le projet à un stade précoce et avancé de la maladie. Les résultats obtenus devraient permettre une meilleure efficacité de la thérapie génique et une réduction des possibilités de toxicité par une diminution des doses à administrer chez les patients. Les animaux utilisés sont des souris modèles et leurs contrôles normaux. Le nombre nécessaire est de 1890 animaux. Les traitements associés peuvent être de petites molécules qui seront administrées soit par gavage, soit par administration intrapéritonéale, sur une durée variable. Ils peuvent également être réalisés par transfert de gène. Dans ce cas, ils seront co-administrés avec le traitement de thérapie génique. Un suivi de biomarqueurs sériques permettra de suivre l’effet au cours du temps. L’évaluation de l’effet thérapeutique sera réalisée par des études de la fonction du muscle, et après sacrifice par des études moléculaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Ils visent à valider l’effet thérapeutique de combinaisons associant soit une petite molécule, soit une modulation génique, à un traitement de thérapie génique d’intérêt pour un groupe de maladie humaine sur un modèle murin de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de dystrophie et donc de valider une thérapie pour des maladies qui n’en n’ont pas à ce jour. La combinaison de traitement permettra d’augmenter la correction chez les patients et d’améliorer la sécurité de produits de thérapie génique par la réduction des doses requises.

Procédures

Toutes les molécules pharmacologiques seront injectées entre 2 et 5 fois par semaine en fonction de leur demi-vie. Elles seront administrées soit par voie orale, soit par injection intra péritonéale (durée injection moins de 1 minute), sur animaux vigiles. L’administration par voie orale se fait par gavage à l’aide d’une canule souple en plastique à bout arrondi afin de ne pas blesser l’animal (durée : entre 30 secondes et 1 minute). Les traitements adjoints administrés par AAV et le traitement de thérapie génique se font par injection intraveineuse en une seule fois, soit sur animaux vigile avec injection dans la veine caudale (durée : moins de 1 minute en injection rapide et entre 3 à 10 minutes pour les injections lentes), soit sur animaux anesthésiés au sinus (durée : moins de 1 minute). Dans ce cas l’anesthésie est une anesthésie gazeuse de courte durée. Les prélèvements de sang se font au maximum une fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse de courte durée. (Durée de l’intervention : moins de 10 minutes entre l’anesthésie et le réveil de l’animal. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire. En fin de protocole, les animaux sont soumis à une évaluation fonctionnelle sur muscle semi-isolé sur animaux analgésiés et anesthésiés. L’analgésique est injecté 30 minutes avant l’anesthésie qui est une anesthésie par voie intra-péritonéale profonde sans réveil de l’animal. L’évaluation fonctionnelle dure en moyenne 30-45 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : - Piqûres intrapéritonéales d’un volume maximum de 100µl pour l’administration de molécules (5 fois par semaine sur animaux vigiles) ou d’anesthésique une seule fois en fin de protocole. Pour réduire les nuisances, les animaux seront traités 30 minutes avant la procédure avec un analgésique. - Gavage pour administration de molécules (maximum 200µl, 5 fois par semaine) - Intraveineuse caudale ou au sinus pour injection AAV (soit en bolus de 100µl/20g, soit en IV lente 500µl/20g, une fois au cours du protocole) * Possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies (utilisation de gel pour réduire cette nuisance). En ce qui concerne les modèles utilisés, même s’ils sont porteurs d’une anomalie génétique correspondant à une dystrophie musculaire progressive chez l’homme, ils présentent un phénotype moins important que les patients. Ils ne présentent donc pas de phénotype délétère à l’exception des modèles les plus sévères (SGCA et SGCG) au stade avancé de la pathologie. Cependant, même dans ce cas, les nuisances possibles n’ont pas d’impact sur la survie et ne sont pas de nature à nécessiter la mise en place de points limites. Il n’y a pas de nuisances attendues dans ce projet par rapport à l’effet des traitements qui sont tous de nature bénéfique et sont utilisés à des doses correspondant à la fenêtre thérapeutique.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés par dislocation cervicale.

Remplacement

Afin de valider l’effet thérapeutique in vivo au préalable à une application chez l’homme, nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris), car aucun modèle in vitro ou de culture cellulaire ne nous permet d’étudier les symptômes de perte de la locomotion typiques des dystrophies musculaires. De plus, afin d’estimer l’efficacité de nos approches expérimentales, il est nécessaire d’administrer les vecteurs dans un organisme entier capable de répondre physiologiquement aux traitements administrés. Ceci ne peut être obtenu in vitro et justifie notre recours à des animaux.

Réduction

Un effort de réduction a été réalisé en amont de ce projet. En effet, les molécules pharmacologiques utilisées dans ce projet ont toutes déjà démontré leur efficacité sur la souris mdx, modèle de la myopathie de Duchenne. Nous savons donc qu’elles ont un effet bénéfique, reste à savoir maintenant si, combinées à la thérapie génique, elles pourront augmenter la correction et permettre une réduction des doses de vecteurs. La dose administrée a déjà été validée chez la souris. Au cours des 5 années du projet, nous avons prévu d’utiliser un total de 1890 souris pour faire l'ensemble des expériences in vivo. Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes. Tous les modèles sont sur le même fond génétique., nous pouvons donc utiliser les mêmes souris contrôles pour tous les modèles. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les différentes conditions seront testées en premier lieu sur les modèles les plus sévères. Pour les conditions ne montrant pas d’effet positif, les traitements ne seront pas testés sur les modèles les moins sévères, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Le raffinement du projet inclus la sélection des modèles : la souris est un modèle déjà utilisé et bien étudié pour les maladies musculaires. Le souci de raffinement est une préoccupation permanente tout au long de la vie des animaux et pendant les différentes étapes des protocoles expérimentaux. Les souris étant des animaux sociaux, elles sont hébergées par groupes. Une phase d’adaptation de 7 jours est mise en place avant l’entrée en protocole. En cas d’observation de la moindre douleur, les souris reçoivent un traitement analgésique, et si cette douleur persiste, les animaux sont sacrifiés pour éviter toute souffrance. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi, ils sont observés quotidiennement pendant les jours ouvrés. Les souris sont anesthésiées lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux reçoivent au préalable un traitement analgésique. Les prélèvements de sang seront effectués sous anesthésie de courte durée (moins de 5 minutes). Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures de sacrifice appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées, telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir la température corporelle stable lors de la phase de réveil et l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.

Choix des espèces

Les modèles murins utilisés dans ce projet sont des souris modèles de la pathologie étudiée. Dans cette étude, les animaux seront utilisés à partir de leur sevrage jusqu’à un stade tardif de la pathologie (variable selon les modèles mais entre 6 mois et 1 an) afin de refléter au mieux la maladie humaine puisqu’il s’agit de pathologies progressives. Les signes cliniques peuvent apparaitre dès l’enfance, mais également à l’âge adulte pour certaines dystrophies. Après le sevrage, les animaux présentent une taille de muscle et des conditions physiques suffisantes pour évaluer la fonction musculaire et présentent déjà des signes histologiques pour les modèles les plus sévères. Des animaux plus âgés (entre 6 mois et 12 mois) seront également utilisés, afin d’évaluer l’effet thérapeutique sur des animaux où le phénotype dystrophique est installé, ce qui permettra d’évaluer la réversion du phénotype au stade tardif. En effet, il est indispensable de savoir si le traitement est efficace lorsque la maladie est installée afin de pouvoir proposer un traitement à des patients qui sont à un stade avancé de la maladie.

190 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent l'implantation sous la peau de pompes délivrant de l'angiotensine II pour accélérer une atteinte cardiaque, puis des prélèvements de sang, des épreuves de course sur tapis roulant et des échographies sous anesthésie, pour tester une thérapie génique de la glycogénose de type III. Le porteur indique attendre un possible dommage rénal lié à l'angiotensine, jugé limité par la durée courte d'administration. Il affirme que le mécanisme de défense contre les virus est "impossible à recréer en laboratoire" et que le recours à l'animal est "indispensable".

Objectifs

-Etudier l’efficacité d’une approche de thérapie génique pour la glycogénose de type III (GSD III) dans un nouveau modèle rat de la pathologie présentant une hypertrophie du ventricule gauche à 9 mois. -Administration de l'Angiotensine II pour accélérer le développement du phénotype cardiaque afin d’évaluer l’effcicacité des produits de therapie génique sur le traitement ou la prévention de l’apparition de la pathologie cardiaque.

Bénéfices attendus

Développement d’un traitement de thérapie génique pour la glycogénose de type III

Procédures

-Implantation de les pompes d’Ang II. Procédure chirurgicale légère car l’implantation se fait sous le peau. La procédure d'implantation durera 10 minutes maximum. Les pompes resteront sous le peau un maximum de 14 jours. -Prélèvements du sang sont réalisés sur animal anesthésié lors d’un prélèvement au sinus rétro-orbitaire ou sur animal vigile à la veine sous-maxilliare. La procédure de prélèvement de sang est rapide, 5 minutes maximum de l’endormissement de l'animal à son réveil après le prélèvement. Pour le prélèvement dans la veine sous-mandibulaire, le prélèvement durera entre 30 sec et 1min maximum. -Evaluation fonctionnelle: tapis roulant (course maximum 10 minutes) et wirehang (moins d'un minute). -Echocardiographie et ECG sur animaux anesthésiés : la durée maximale sera de 15 minutes pour chaque procédure de l’endormissement au réveil de l’animal après les examens.

Impact sur les animaux

Le dommage collatéral que pourrait causer l’administration d’Ang II pourrait être le développement d’un dommage rénal, car l’effet direct est l’augmentation de la tension artérielle. Par contre on n'éspère pas avoir un dommange rénal car le temps de dosage sera que de 15 jours.

Devenir

Ils seront éuthanasiés par surdosage d’anesthésique (0,35 ml/kg d'EUTHASOL en tant que 140mg de pentobarbital sodique par kilo) à la fin du protocole afin de prélever les tissues: coeur, foie et muscles squelettiques pour analyser en premier lieu l'accelaration de la cardiomyophatie avec l'infusion de la AngII (fibrose et hypertrophie des cardiomyocites), asin que la correction par nos produits de therapie genique de la cardiomyopathie et de la pathologie musculaire et du foie présent chez les patients GSDIII et que le modèle de rat reproduit.

Remplacement

Dans le cas particulier des maladies génétiques, le principe de la thérapie génique repose sur l’utilisation de corps étrangers à l’organisme pour véhiculer le gène « médicament » jusqu’aux cellules à traiter. Pour apporter le cDNA de l’enzyme GDE (enzyme de débranchement du glycogène) jusqu’aux cellules du foie, nous utilisons des virus modifiés. L’organisme est entrainé à lutter naturellement contre les virus et ce mécanisme de défense est à ce jour impossible à recréer en laboratoire. Le recours à l'animal est donc indispensable pour vérifier le pouvoir thérapeutique des virus modifiés que nous utilisons. Nous testerons les virus que nous avons sélectionnés après nos premières expériences réalisées sur des cellules: tous les virus qui ne produisaient pas suffisamment d’enzyme GDE fonctionnelle ont ainsi été éliminés.

Réduction

Lors de la procédure 1, nous identifirons la dose, l’âge et le temps d’administration optimals de l’Ang II, cela nous permettra d’utiliser ces paramètres dans les procédures suivantes. Nous réaliserons une analyse statistique afin d'avoir le nombre d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée. Nous avons utilisé un test unilatéral standard de comparaison des moyennes afin d’avoir 90% de chance (Z1-β=-1.282) de détecter une baisse de la force chez le rat GSDIII avec un risque d’erreur de 5% (Z1-α =-1.645). Formule : n=2*((σ²/Δ²)*(Z1-α+Z1-β)²) - σ :déviation standard attendue (σ=0,261) - Δ : différence entre les moyennes (Δ=0,4998) D’où n=5 rats GSDIII par groupe.

Raffinement

Prélèvement de sang dans la veine sous-maxillaire sur rat vigile ou à la queue sur rat anesthésié pour mésurer la glycemie. L'échocardiographie est non invasive et sans douleur, mais pour réaliser cet examen dans les meilleures conditions pour les animaux, les rats seront anesthésiés par voie gazeuse, ça sera aussi le cas pour l'ECG. La minipompe d’Ang II est placée sous la peau des rats anesthésiés par voie gazeuse.

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle rat car dans un autre modèle rat de glycogénose de type II (maladie de Pompe), une atteinte cardiaque majeure a été identifiée. Le rat GDS III est le modèle de la glycogénose de type III, voilà pourquoi nous utiliserons ce rat et non le rat GDS II qui est le modèle pour la glycogénose de type II. De plus, le modèle rat a une taille qui permet de mieux étudier la morphologie du coeur par échocardiographie. Les procédures 1-2 nous permettront de définir la dose et le temps d'administration de l'Ang II ainsi comme la durabilite du phenotype apres l'enlevement des pompes. L'expérience que nous avons chez la souris et les rats nous a montré que les animaux accumulent du glycogène à partir de la naissance et qu'ils montrent un phénotype d'hypoglycemie à partir de 6 semaines. Donc nous utiliserons des rats de 6 semaines minimun.

125 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du fémur pour y greffer un biomatériau, puis quatre séances d'imagerie sur trois mois avant d'être tué pour analyse des tissus. Le porteur indique une douleur modérée traitée par analgésique et précise que les rats dont le fémur n'a pas été correctement stabilisé sont tués et remplacés. Il présente cette étape animale comme un préalable "impératif" avant des essais sur de plus gros animaux puis en clinique.

Objectifs

La reconstruction des pertes de substances osseuses importantes, telles qu'elles se produisent dans les cas d'accidents graves, de cancers ou de métastases osseuses, reste un challenge. Les greffes d'os autologue (lambeaux osseux, prélevés chez le patient) sont le traitement de référence mais ils présentent de nombreux inconvénients, en raison de la quantité limitée d'os que l'on peut prélever sur un site sain, et des conséquences de ce prélèvement sur son état général et sur sa qualité de vie. En outre, ces procédés chirurgicaux complexes ne sont pas toujours réalisables en raison de contre-indications d'ordre anatomique, vasculaire ou médicale. Le but des recherches qui seront menées durant les 5 prochaines années, est de développer un procédé de reconstruction osseuse avec greffe d'un biomatériau capable de se substituer à l'os manquant dans un premier temps, puis idéalement de permettre la régénération d'un os nouveau.

Bénéfices attendus

Les résultats des expériences conduites sur ce modèle animal sont un préalable à la poursuite de travaux impliquant d'autres modèles, notamment chez le gros animal. Des résultats médiocres obtenus avec un biomatériau conduisent à l'arrêt de l'étude de celui-ci. A l'inverse, des résultats positifs (régénération osseuse au moins partielle, supérieure à celle observée avec le matériau de référence) permettent d'envisager le dépôt de demandes de financement pour la poursuite des études : tests chez le gros animal, puis essais cliniques.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une chirurgie orthopédique (il s'agit d'un acte chirurgical unique d'une durée de 20 minutes), puis à 4 séances d'imagerie de rayons X (durée de l'examen: 15 minutes) et d'IRM (durée de l'examen: 30 minutes) à J2, J28, J56, J72, éventuellement J90.

Impact sur les animaux

Les opérations réalisées pourront entraîner une douleur modérée. Celle-ci sera traitée par l'injection intra-péritonéale de buprénorphine. Dans certains cas, une réduction de la mobilité des animaux pourra être constatée, si les fixateurs externes destinés à stabiliser le fémur n'ont pas été parfaitement posés. Dans ce cas, les animaux concernés seront sacrifiés et remplacés par d'autres.

Devenir

Les animaux sont maintenus en vie jusqu'à 3 mois après l'opération. Ils sont tous sacrifiés à J90 pour procéder à une analyse histologique des tissus dans la région opérée.

Remplacement

L'utilisation en clinique d'un nouveau procédé chirurgical avec un biomatériau nécessite impérativement une phase d'expérimentation pré-clinique. Des études in vitro ont été réalisées pour éliminer une éventuelle toxicité cellulaire du biomatériau (nHA +/- Sr) et pour évaluer le potentiel de différenciation ostéoblastique de ce complexe. Le modèle de défait osseux critique sur la diaphyse fémorale de rat a été décrit dans plusieurs études antérieures.

Réduction

L'utilisation de systèmes d'imagerie non invasie (IRM et microtomographie de rayons X) permet de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés. En effet, le suivi de chaque animal permet d'obtenir des informations sur le processus de régénération et sur divers autres paramètres biologiques à différents temps, sans avoir besoin de sacrifier les animaux. Sans ces procédures, il faudrait envisager des groupes de rats pour chaque temps expérimental où une analyse est requise.

Raffinement

L'utilisation de l'imagerie non invasive par microtomographie de rayons X constitue en soi un raffinement dans la mesure où il limite le nombre d'animaux et permet d'obytenir un grand nombre d'informations sur le même animal tout au long de l'expérience. Pendant la chirurgie, une cage après l'autre sera amenée dans la salle d'opération afin d'éviter toute source de stress par contact visuel, olfactif et sonore des animaux opérés et des animaux à opérer. Après la chirurgie, chaque rat se réveillera dans une cage à part pour éviter le contact avec des conégnères non anesthésiés. L'anesthésie se fera par inhalation d'isoflurane, et la profondeur de l'anesthésie sera vérifiée par immobilité, réflexe de retrait et fréquence respiratoire. La prise en charge de la douleur sera prise en charge par l'injection sous-cutanée d'un analgésique: 0.3 mg par kg de buprénorphine juste avant l'intervention et 24 heures après comme recommandé. Si nécessaire, une troisième dose peut être appliquée après 48 heures. Pour réduire le risque d'infection au niveau du site opératoire, un antibiotique prophylactique (céfazoline, 100 mg/kg) sera injecté par voie sous-cutanée le jour de l'opération et le lendemain (protocole calqué sur celui utilisé en clinique). Après le réveil, le rat reviendra dans sa cage d'origine. Les rats seront hébergés par 3 dans des cages comportant des tunnels, avec accès illimité à l'eau et à la nourriture, placées dans une salle dont les paramètres d'ambiance (température, hygrométrie) sont parfaitement contrôlés.

Choix des espèces

le rat wistar a été choisi à la suite de travaux réalisés dans notre laboratoire et par d'autres équipes portant sur l'analyse des propriétés hostologiques et biologiques des membranes induites en site osseux fémoral chez le rat. Il est d'autre part décrit dans de nombreuses études dans le monde. Autres critères retenus: animaux adultes , poids 225-250 grammes la croissance du squelette doit être arrivée à son terme il faut des animaux de poids suffisant pour supporter la procédure