Troubles musculosquelettiques

15 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'anomalies squelettiques qui se dégradent avec l'âge au point de gêner leur alimentation, elles reçoivent des injections et jusqu'à six prélèvements sanguins avant l'analyse de leurs organes, pour évaluer une biothérapie contre un groupe de maladies rares des os. Le porteur qualifie lui-même le bénéfice pour les patients d'"éventuel à long terme". Il conclut que le recours au modèle murin est "inévitable".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer un nouveau traitement pour une famille de maladie des os. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour ce groupe de maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour certains symptômes de la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre d'évaluer un traitement pour cette famille de maladie. Il s’agit d’un groupe de maladies rares sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice éventuel à long terme pour ces patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à des injections de traitement (30 secondes), ainsi que des prélevements de sangs (5 minutes). Les prélèvements de sang sont sur animal anesthésié et un animal aura maximum de 6 prélèvements dans sa vie. Les animaux auront également une biopsie d'oreille pour déterminer s'ils sont porteurs de la maladie (20 secondes).

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé dans ce projet présente des anomalies squelettiques qui se dégradent avec le temps et les empêchent de s’alimenter normalement lorsque les animaux sont âgés (environ 12 mois). Ces altérations sont caractéristiques de la maladie.

Devenir

​Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, le projet nécessite d'étudier la structure des organes afin de vérifier l'efficacité du traitement testé et cela ne peut se faire que sur animal euthanasiés.

Remplacement

​Globalement, la construction des traitements et l’optimisation de ces derniers se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Les différents vecteurs viraux produits sont précédemment testés in vitro afin de valider leur efficacité. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible. Cependant l’utilisation du modèle murin de la maladie est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.

Réduction

​Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement. Ce modèle étant un nouveau modèle de souris, il est possible que ce nombre soit amené à changer au cours des études et des différents résultats obtenus.

Raffinement

​Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage. Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire.

Choix des espèces

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant d’Aggrecanopathies, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il est connu pour mimer les principales caractéristiques de la pathologie. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 52 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.

42 rats mâles vont être utilisés, tués à l'issue par inhalation de dioxyde de carbone, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une mutation reproduisant la dystrophie musculaire de Duchenne, ils subissent une série de tests fonctionnels, dont champ ouvert, labyrinthe en Y, test d'agrippement, échocardiographie, exercice forcé sur tapis roulant et électromyographie, ainsi que des prélèvements sanguins. Le porteur indique une perte de poids légère et un niveau de stress plus élevé chez ces rats, sans souffrance liée au phénotype selon lui. Il affirme que la thérapie génique ne peut être évaluée que dans un organisme vivant, ce modèle reproduisant selon lui la maladie plus fidèlement que la souris mdx.

Objectifs

Ce projet correspond à des recherches translationnelles qui rentrent dans le domaine « prévention, prophylaxie, diagnostic, traitement de maladies chez l’homme, l’animal ou la plante ». En effet, les dystrophies musculaires sont des pathologies invalidantes, dont une faiblesse musculaire, et sans traitement curatif à ce jour. Le modèle en question est un modèle rat de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), portant la grande délétion la plus commune dans le génome des patients DMD. Ce modèle sert à mieux comprendre la pathologie, en suivant sa mise en place et son évolution, ainsi que pour l'évaluation des thérapies pour la DMD.

Bénéfices attendus

La création et la caractérisation d’un modèle de rat portant la grande délétion la plus fréquente chez la population de patients DMD permettra d’avoir une meilleure compréhension du déroulement de la pathologie et des méchanismes impliqués dans la maladie. Une compréhension des mécanismes d’évolution de la maladie est nécessaire pour différentes voies de suivi clinique et traitement de la maladie. Une étude approfondie du modèle peut servir à la détermination de biomarqueurs efficaces pour un diagnostic rapide et un suivi convenable de la maladie. Le modèle joue un rôle important dans la découverte et compréhension de plusieurs voies impliquées dans la mise en place et la progression de la maladie, ce qui est nécessaire pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Enfin, le modèle servira pour tester des approches thérapeutiques développées par le laboratoire Généthon pour modifier le génome autour de l’exon délété ou dans le hotspot 45-55 afin de traiter de façon permanente la maladie de Duchenne.

Procédures

Nous allons réalisé les tests d'exploration fonctionnelle suivants à 3-4 et 9-10 mois d'age environ, sur 2 cohortes indépendantes, chacun des tests étant réalisés une seule fois: test du champ ouvert pour évaluer l'activité locomotrice et la réaction dans un nouvel environnement (30 minutes); test du labyrinthe en Y pour évaluer la fonction cognitive (8 minutes); test d'agrippement pour évaluer la force musculaire (2 minutes); échocardiographie/ECG pour évaluer la morphologie et la fonction cardiaque, ainsi que l'activité électrique (10-15 minutes); exercice sur tapis roulant pour évaluer la performance à l'effort (20-45 minutes); électromyographie permettant la mesure neurophysiologique de la fonction motrice et sensorielle (20 minutes); deux prélèvements sanguins pour analyser les biomarqueurs (2 minutes en cas de prélèvement à la veine temporale superficielle sans anesthésie; 4 minutes en cas de prélèvement par voie rétro-orbitale sous anesthésie); le suivi du poids des animaux (1X/semaine)

Impact sur les animaux

A l’âge de l’étude (3-4 mois et 9-10 mois environ) aucune observation indiquant la souffrance de l’animal à cause de son phénotype n’a été indiquée. Une légère perte de poids par rapport aux rats non atteints a été observée aux âges de l’étude, sans affecter leur activité. Les rats DMD présentent un niveau de stress plus élevé que les rats non atteints. Les animaux subiront des tests fonctionnels qui induiront une souffrance minimale, sans induire des blessures ou autres formes d’atteinte physique. Lors du test d'effort qui peut entrainer une fatigue de l'animal (musculaire et/ou cardiaque), les animaux seront surveillés toutes les 30 minutes durant les 2 heures suivant l'interruption du test. L'échographie se déroule quant à elle sous anesthésie pendant toute la durée du test. Les rats seront rasés et une crème dépilatoire hypoallergénique sera appliquée. Le rythme cardiaque et la respiration seront surveillés en continu tout au long de l'échographie. Si la fréquence cardiaque diminue ou si l'animal commence à mal respirer, le test sera arrêté et le rat sera mis dans une cage de réveil chauffée pour récupérer. Lors de l'EMG, si un animal commence à se réveiller au cours du test, l'expérience sera immédiatement stoppée. Si un animal présente des difficultés respiratoires, l'expérience sera également stoppée. Il y aura deux prises de sang prévues, l'une après l'échographie et l'autre après le test d'effort sur tapis roulant. Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole.

Devenir

A l'issue des procédures, les animaux seront euthanasiés par inhalation de dose croissante de CO2.

Remplacement

Ce projet a recours au modèle animal et au modèle rat en particulier pour les raisons principales suivantes : on ne sait pas modéliser aujourd’hui la distribution d’un traitement de thérapie génique ou d’édition du génome dans un organisme sans le tester dans un organisme vivant. Deuxièmement, l’effet bénéfique d’un traitement sur un phénotype dystrophique au niveau histologique et au niveau fonctionnel va nécessiter une évaluation au niveau de l’organe atteint, en l’occurrence le muscle squelettique différencié et le cœur. Troisièmement, une caractérisation fonctionnelle au niveau des muscles squelettiques, cœur et cerveau du rat sont nécessaires pour la compréhension de mécanismes de la pathologie, à cause de l’implication de plusieurs voies et interactions de systèmes exploitables uniquement in vivo.

Réduction

Les protocoles d’études seront réalisés en incorporant le juste nombre d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions. A cet effet, les 1ères études sont réalisées in vitro pour valider les hypothèses scientifiques et une étude-pilote sera réalisé avec 10 rats afin de valider les protocoles d'exercice sur tapis roulant et d'EMG selon les conditions expérimentales discutées avec le laboratoire porteur du projet. Par ailleurs, une étude préalable de caractérisation a été réalisée permettant de définir le niveau d’atteinte et les caractéristiques des animaux et de définir le nombre d'animaux minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats robustes. En particulier, nous utiliserons 7-9 rats de chaque génotype et 2 ages (3-4 et 9-10 mois environ) pour réaliser les analyses fonctionnelles. Cet effectif est réduit au maximum, mais suffisant pour assurer une analyse statistique fiable et reproductible. D'autre part, les échantillons sanguins ou prélèvement de tissus en cas de mortalité seront partagés avec le laboratoire partenaire afin d'éviter l'utilisation d'un deuxième lot d'animaux pour effectuer ces analyses complémentaires. Enfin, nous n'utiliserons que des males dans cette étude, la pathologie étant liée au chromosome X. Les males porteurs de la mutation sur le chromosome X seront ainsi porteurs de la pathologie et comparés à des males sains.

Raffinement

Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes. Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance. En cas d’observation de la moindre douleur, les rats recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seront euthanasiés pour éviter toute souffrance. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Des anesthésies seront appliquées lors des procédures d'échocardiographie/ECG et d'électromyographie.

Choix des espèces

Ce projet est réalisé dans le cadre de la recherche de traitements pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Les modèles utilisés dans ce projet sont des rats, modèles représentatifs de la pathologie étudiée au niveau histologique, fonctionnel et génétique. Le rat est une espèce facile à manipuler, se reproduisant facilement et rapidement, et facile à héberger. Afin de pouvoir obtenir une évaluation de l’effet thérapeutique, nous utilisons des rats déficients en dystrophine, modèle portant une modification correspondant aux mutations les plus fréquentes dans DMD. Ce modèle rat reproduit notamment plus fidèlement la pathologie humaine, en comparaison au modèle de souris mdx. Il présente en particulier une atteinte cardiaque, ce qui nous permettra d’obtenir une évaluation thérapeutique sur le muscle cardiaque. Les rats seront adultes, agés de 3 et 9 mois environ au début des tests d'exploration fonctionnels (4 et 10 mois environ lors du dernier test, l'ensemble des tests étant réalisés sur une période de 4-5 semaines)

120 rats mâles de quatre souches vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une craniotomie créant deux trous dans la voûte crânienne, l'un laissé vide et l'autre comblé par une céramique, des séances d'imagerie répétées, puis une thoracotomie que le porteur décrit lui-même comme douloureuse, réalisée en condition péri-mortem. À la fin, les rats sont mis à mort pour analyser la réparation osseuse. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité de la cicatrisation osseuse, rendant selon lui le recours à l'animal "nécessaire".

Objectifs

La réparation / régénération osseuse est une composante importante de la pratique clinique et vise à combler les défauts de tissu osseux résultant de traumatismes, de défauts congénitaux ou d’excision de tumeurs. La réparation des grands défauts osseux (en particulier les défauts dits de taille critique, c’est-à-dire ceux ne réparant pas) reste en particulier un défi clinique. Dans le domaine de la régénération osseuse, en particulier en site maxillo-facial, le modèle de défaut au niveau du crâne est couramment utilisé pour évaluer la performance de nouveaux biomatériaux de comblement ou nouveaux protocoles de régénération osseuse. Quant au modèle animal, le rat est très largement utilisé en recherche orthopédique en raison de sa taille supérieure à la souris tout en gardant les avantages du rongeur, que sont la standardisation biologique des souches de rats, sa facilité d’élevage et la disponibilité d’outils d’évaluation en biologie et imagerie. Néanmoins, l'utilisation de différentes souches de rat dans les nombreuses études publiées chaque année (utilisant le même modèle chirurgical) est une cause de non-productibilité et d’impossibilité de comparaison des données. Dans ce cadre, l’objectif de cette étude est d’évaluer le potentiel de réparation de défauts crâniaux chez 4 souches de rats couramment utilisées par la communauté scientifique dans le domaine de la régénération osseuse et d’en mieux comprendre les mécanismes sous-jacents. Deux souches non-syngéniques (ayant une diversité génétique ; Wistar et Sprague-Dawley) et deux souches syngéniques (ayant une homogénéité génétique, Fisher et Lewis) seront utilisées et comparées. Nous utiliserons un modèle de défaut crânial 5mm de diamètre (dit sub-critique car large mais pouvant réparer) afin de pouvoir observer des différences entre les 4 souches. Deux défauts seront réalisés par rat (de part de d’autre de la suture dans l’axe fronto-dorsal) ; l’un des défauts sera laissé vide et l’autre comblé par un matériau en céramique macrostructuré pour évaluer le potentiel de régénération en absence et présence de biomatériau de comblement ostéoconducteur.

Bénéfices attendus

La comparaison de la réparation osseuse selon la souche de l’animal et la détermination de paramètres critiques responsables des différences observées devraient être d’une grande utilité pour la communauté scientifique, en particulier dans son choix de modèle pour les études à venir dans le domaine. Par ailleurs les résultats nous aideront à mieux comprendre les mécanismes de réparation et de non-réparation osseuse, en particulier dans des contextes cliniques peu favorables chez certains patients

Procédures

1-Craniotomies latérales et dépôt d’un implant ( 1X ; durée ~40 min) 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (Max 7X; durée 15 min) 3- Prélèvement sanguin au niveau de la Veine saphène latérale ( Max 4X; durée 10 min) ; 4- Injection de fluorochromes (2X, durée 5 min) 5- Infiltration du réseau vasculaire par un agent radio-opaque (1X; durée 30 min)

Impact sur les animaux

Les craniotomies réalisées sont généralement bien tolérées chez le rat. Un effet indésirable potentiel est le glissement de l’implant sous la voute crânienne au moment de la pose. Cela nous est arrivé une fois ; les animaux sont scannés en post-op (encore sous anesthésie générale) et cet événement est donc tout de suite détecté. En telle situation, il est impossible de récupérer l’implant ; l’animal est donc euthanasié avant son réveil par injection massive d'anesthésique. Si cela arrive pendant les 12 semaines, et observé soit par un comportement inhabituel de l’animal dû à la compression du cerveau soit après imagerie par scanner, l’animal sera euthanasié. Ce projet comprend aussi une thoracotomie (ouverture de la cage thoracque pour accéder au coeur) . La thoracotomie est une procédure douloureuse, aussi nous utiliserons des doses élevées d’analgésie et d’anesthésie afin que l’animal soit en condition péri-mortem.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de projet permettant des analyses post-mortem (analyse au μCT à une résolution de 9 μm + histologie des cranes réparés)

Remplacement

Aucun modèle de néoformation osseuse in vitro n’est disponible aujourd’hui. La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel orchestré complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire; à cela s'ajoute l'impact d'un système hormonal complexe . Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénués de système vasculaire qui joue un rôle clé dans la réparation osseuse. Pour toutes ces raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Le suivi de la formation osseuse par imagerie in vivo et l'analyse du réseau vasculaire au temps final seront réalisées sur les mêmes animaux. Elles nécessiteront 8 animaux compte tenu des variations de résultats pouvant être observées dans les études in vivo et de l’étape de perfusion vasculaire qui, parfois faillit en ne remplissant pas parfaitement le réseau vasculaire, notamment les capillaires. L'évaluation de l’inflammation dans les défauts osseux nécessitera 6 animaux par groupe pour obtenir un pouvoir statistique suffisant. Le modèle de défaut osseux sub-critique (5 mm) permet de réaliser 2 défauts par animal de part et d’autre de la suture sagittale (jointure longitudinale qui relie les deux os pariétaux symétriques), et ainsi d’évaluer sur le même animal la réparation d’un défaut laissé vide et comblé par un matériau ostéoconducteur.

Raffinement

La souffrance sera limitée par analgésie pré-opératoire puis post-opératoire pendant les 3 premiers jours. Pour chaque analyse (micro-scanner), les rats seront anesthésiés par anesthésie gazeuse. Un environnement enrichi sera fourni avec briques de bois (usure des dents), et papier afin de contribuer au fouissement des animaux. Les rats initialement hébergés ensemble (3 rats/cage) le resteront du début à la fin du protocole. La température sera maintenue et contrôlée entre 20 et 22°C et le rythme veille/sommeil sera de 12h/12h. Eau et nourriture seront fournies ad libitum. L'analyse du réseau vasculaire nécessite une thoracotomie et perfusion intracardiaque ; la thoracotomie est une procédure douloureuse, aussi nous utiliserons des doses élevées d’analgésie et d’anesthésie afin que l’animal soit en condition péri-mortem avant ouverte de la cage thoracique.

Choix des espèces

Le modèle choisi est le rat male. Le rat est un bon compromis entre la souris (trop petite pour obtenir un défaut de taille suffisante pour l’évaluation d’implants massifs) et le lapin (couteux et trop gros pour permettre un suivi en imagerie micro-scanner in vivo). De plus le modèle de défaut au niveau de la calvaria est bien décrit dans la littérature et autorise la réalisation de défauts reproductibles et contrôlés. Les souches Wistar, Sprague-Dawley, Fisher et Lewis seront utilisées car l’objectif de l’étude est d’évaluer l’impact de la souche de rat sur la réparation de défauts crâniaux. Jeunes adultes (3 mois) car de taille suffisamment importante pour permettre l’implantation en site osseux et leur phase de croissance est terminée.

15 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le modèle leur impose de sévères atteintes du squelette, cyphose, scoliose et déformation de la cage thoracique, et une espérance de vie réduite par le risque de rupture de l'aorte, entre 27 et 240 jours. Elles reçoivent des injections, jusqu'à six prélèvements de sang et une biopsie de l'oreille, puis sont tuées pour analyse des organes. Le porteur annonce un bénéfice "éventuel à long terme" pour les patients atteints de cette maladie rare et affirme que le projet "ne peut pas se faire sans modèle animal".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer une nouvelle approche thérapeutique pour une maladie des os avec des troubles cardiovasculaires. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour cette maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour les symptômes cardiovasculaires de la maladie.

Bénéfices attendus

Le projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d'un traitement pour cette maladie. Il s’agit d’une maladie rare sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucun traitement. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice éventuel à long terme pour ces patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à des injections traitements (30 secondes), ainsi que des prélevements de sangs (5 minutes). Les prélèvements de sang sont sur animal anesthésié et un animal aura maximum de 6 prélèvements dans sa vie. Les animaux auront également une biopsie d'oreille pour déterminer s'ils sont porteurs de la maladie (20 secondes).

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé dans ce projet a d’importantes atteintes squelettiques comprenant une sévère cyphose, une scoliose et une surcroissance de la cage thoracique ainsi qu’une espérance de vie réduite due à une importante probabilité de rupture aortique. Il est connu que l’espérance de vie de ces animaux est de 27 à 240 jours notamment à cause des problèmes vasculaires intervenant à des âges différents selon les animaux et ne pouvant donc pas être prédits. Cependant ces animaux arrivent à se déplacer et manger. Toutes ces altérations sont caractéristiques de la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, le projet nécessite d'étudier la structure des organes afin de vérifier l'efficacité du traitement testé et cela ne peut se faire que sur animal euthanasiés.

Remplacement

Globalement, la construction des traitements et l’optimisation de ces derniers se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Les différents traitements produits sont précédemment testés in vitro afin de valider leur efficacité. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement.

Raffinement

​Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage . Chaque cage contient des enrichissements de type tige en papier, igloo et buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire.

Choix des espèces

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant du Syndrome de Marfan, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il a été construit pour mimer la pathologie et plusieurs études démontrent que les principales caractéristiques de la pathologie sont retrouvées dans ce modèle. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 24 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.

7 812 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiés, ils subissent prélèvement de nageoire pour génotypage, bains chimiques, chocs thermiques et imageries répétées sous anesthésie, pour étudier une malformation du crâne liée au gène Fgfr3. Le porteur indique que des malformations craniofaciales, microcéphalie et scoliose, sont attendues et que les poissons dépassant les points limites seront mis à mort, l'atteinte n'étant pas présentée comme systématique. Il qualifie d'"indispensable" le développement de nouvelles thérapies et conclut au recours au poisson zèbre pour reproduire ces mécanismes.

Objectifs

Les craniosynostoses sont des maladies génétiques qui résultent d’un défaut du processus d'ossification et entrainent une fusion prématurée d’une ou plusieurs sutures crâniennes associées à des malformations crâniofaciales. Outre les problèmes esthétiques ces malformations sont responsables de troubles fonctionnels majeurs dus aux conflits de croissance entre crâne et encéphale qui provoque une hypertension intracrânienne. Aujourd’hui les traitements des craniosynostoses consistent en des interventions chirurgicales lourdes et répétées. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est indispensable et nécessite une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeux au cours de l’ossification dans des conditions normales et pathologiques. Les objectifs du projet seront de comprendre les mécanismes mis en jeu dans la formation de la voûte crânienne en utilisant des poissons zèbres génétiquement modifiés. Les modèles de poisson zèbres utilisés et développés au cours de ce projet présenteront des malformations crâniofaciales mimant la pathologie humaine (microcéphalie, défaut des sutures) dont le caractère dommageable ne sera présent que tardivement au cours du développement environs 2 mois après la naissance. Les modèles de poissons zèbre développés permettront également de tester l'efficacité de différents composés pharmacologiques qui sont susceptibles de corriger ces malformations au cours de la formation de la voûte crânienne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’un point de vue fonctionnel de mieux définir le rôle de Fgfr3 dans l’ossification membranaire. L’utilisation du poisson zèbre permet de développer une approche novatrice pour comprendre les mécanismes impliqués dans les osteochondrodysplasies liées à des mutations de fgfr3. La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour l’étude des craniosynostoses et la mise en place de stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients. L’établissement de ces modèles de poissons zèbres permettra d’effectuer le criblage de molécules.

Procédures

Procedure 1 à 8: Les animaux génétiquement modifiés subiront une fois dans leur vie des prélèvements sous anesthésie d'un bout de nageoire, pour génotypage. La procédure consiste à anesthésier le poisson adulte par bain rapide de benzocaïne (1min), puis un segment de 2-3mm de la nageoire caudale est coupé. Les poissons régénèrent spontanément leurs nageoires en quelques jours et il n’y a pas d’effets nocifs à long terme. Procédure 3: Les animaux seront baignés une fois dans du rouge alizarine et une fois dans de la de la calcéine pendant une nuit chacun. Procédure 4: Les poissons seront baignés 1 fois dans du tamoxifène pendant 7 heures Les poissons subiront un choc thermique à 37°C 3 fois pendant 1 heure. Les poissons seront imagés 2 fois en 30 jours pour cela ils seront maintenus sous anesthésies générales dans de l'hydrogel pendant 5 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L). Procédure 5: Les poissons seront baignés 1 fois dans de l'actiflash pendant 7 heures. Ils seront irradiés avec un laser UV 1 fois pendant 200fs sous anesthésie générale et maintenues dans de l'hydrogel durée 5 min. Les poissons subiront un choc thermique à 37°C 3 fois pendant 1 heure. Les poissons seront imagés 2 fois en 10 jours pour cela ils seront maintenus sous anesthésie générale dans de l'hydrogel pendant 5 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L) Procédure 6: Les poissons seront imagés 4 fois en 4 semaines pour cela ils seront maintenues sous anesthésies générales dans de l'hydrogel pendant 3 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L). Procédure 7: les poissons subiront une seule fois dans leur vie une injection intrapéritonéale sous anesthésie générale (benzocaïne 75mg/L) , l'anesthésie durera 5 min maximum. Procédure 8: les poissons seront soumis à un traitement pharmacologique par balnéation pendant 15 jours.

Impact sur les animaux

Des malformations squelettiques sont attendues pour les poissons fgfr3lof/lof et pour l’ensemble des poissons exprimant une mutation Fgfr3 pPro262Arg, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial (microcéphalie, aplatissement de la face) et axial (scoliose, retard de croissance) ne sera pas un critère éliminatoire. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lesion…) ou comportementaux (poisson amaigri, immobilité…) sera suivis et scorés tout au long de la croissance du poisson. Les poissons dépassant les points limites définis dans le projet seront euthanasiés. D'autre part les poissons au cours des différentes procédures subiront des stress relatifs aux anesthésies répétées, aux chocs thermiques à 37°C, aux isolements nécessaires pour les acquisitions et pour le génotypage des poissons.

Devenir

l'ensemble des poissons de ce projet seront mis à morten fin de procédure

Remplacement

Pour la procédure 8, la sélection des molécules les plus spécifiques et efficaces permettant potentiellement d'améliorer le phénotype pathologique des poissons fgfr3P262R se fera au préalable in vitro afin de ne pas utiliser de poissons lors de cette étape de sélection.

Réduction

Selon l'expérience, les tests d'ANOVA, de Mann Whitney et de Student seront réalisés. Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Les procédures d'imagerie in vivo se feront de maniere longitudinale (Un même individu est analysé à différents temps) ceci permettant d'augmenter la puissance statistique et de réduire le nombre d'individus analysés.

Raffinement

Les poissons seront élevés à 28°C dans une eau ayant un pH de 7 avec des cycles jour/ nuit de 14/10h et nous veillerons à fournir un enrichissement aux poissons grâce à l'apport de nourriture vivante et à maintenir un enrichissement social. Afin d’effectuer le suivi des poissons ceux-ci seront regroupés par génotype et un dénombrement des poissons affectés par symptôme sera effectué quotidiennement. Des malformations squelettiques sont attendues pour les poissons fgfr3lof/lof et pour l’ensemble des poissons exprimant une mutation fgfr3 pPro262Arg ; l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial (microcéphalie, aplatissement de la face) et axial (scoliose, retard de croissance) ne sera pas un critère éliminatoire. La majorité des procédures seront pratiquées à des stades précoces (environs 6 à 10 semaines post fécondation du développement de la voûte crânienne), stade où les malformations crâniofaciales dommageables sont nulles ou très légères et ne sont pas susceptible d'induire de la souffrance. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lésion…) ou comportementaux (poisson amaigri, immobilité…) sera suivie et les poissons seront scorés quotidiennement tout au long de leur croissance. Les poissons dont le score dépasse les points limites définis dans le projet seront euthanasiés par surdosage de benzocaïne à une concentration dans l'eau de nage de 375mg/L pour une durée de 15 min. La mort des poissons est visualisable par la perte de flottaison qui suit une période d'anesthésie qui est observée en moins de 2 minutes. L’acquisition d'image nécessaire au cours des procédures d'imagerie in vivo sera réalisée avec un confocal de type spinning disk permettant de réduire au maximum le temps d'acquisition (environ 1min) et par conséquent la durée de l'anesthésie qui sera réalisée dans une solution de benzocaïne tamponnée à 75mg/L. Lors de l'acquisition d'images ou de l'irradiation des poissons avec un laser UV, les poissons seront maintenus dans de l’hydrogel. Ce milieu aqueux permet de garder la peau humide, alimente les branchies en eau et oxygène, et limite l’impact sur la peau et les écailles évitant ainsi les suffocations. Enfin des tests préalables seront réalisés pour réduire au maximum la dose et la durée d’exposition des poissons à des composés pharmacologiques.

Choix des espèces

Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette crâniofacial et de la voûte crânienne. La voûte crânienne présente de nombreuses similitudes entre le poisson zèbre et l’homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires (ossification membranaire) et moléculaires (conservation des principales voies de signalisation régulant l'ostéogénèse) impliqués au cours de son développement. De plus l’accessibilité du crâne chez le poisson zèbre et l'existence de nombreuses lignées transgéniques permettent d'observer par simple microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires impliquées dans la formation osseuse. Enfin chez le poisson zèbre, Fgfr3 est conservé et exprimé fortement au cours de la formation de la voûte crânienne, contrairement à la souris. L’analyse du phénotype squelettique se fera du stade larvaire (5jpf ; formation du squelette pharyngé) jusqu’au stade adulte. Le poisson zèbre ayant une croissance continue tout au long de sa vie il est important d’observer l’evolution du phénotype squelettique à des stades tardifs ( 2 semaines, 6 semaines, 3 mois et 6 mois). Une grande partie des procédures seront réalisées entre 4 semaines et 8 semaines pendant la formation de la voûte crânienne.

16 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de vecteurs viraux puis des injections quotidiennes d'immunosuppresseurs pouvant s'étaler sur seize semaines, avec des prélèvements de sang répétés, l'immunosuppression pouvant provoquer des infections opportunistes et une perte de poids. Ce criblage sert à préparer une thérapie génique destinée à des enfants atteints d'une maladie osseuse rare. Le porteur décrit la souris comme une "espèce inférieure" servant à trier vecteurs et traitements avant des essais sur primates, qu'il présente comme le "modèle de prédilection".

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme plus large qui inclut un projet déjà en cours dans le même établissement utilisateur. L’objectif du programme est de développer des traitements pour différents types de dysplasies du squelette, notamment la dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (SEDc), la collagénopathie de type 2 la plus fréquente. La SEDc est une dysplasie osseuse génétique qui cause une forme rare de nanisme chez l'être humain (1 naissance sur 100 000). Elle est caractérisée phénotypiquement par une petite taille avec un raccourcissement du tronc et du cou, induisant un risque important d'instabilité au niveau des vertèbres cervicales pouvant provoquer une paralysie. Les patients souffrent également d'anomalies au niveau de la rétine et d’une perte d'audition. Cette pathologie est due à des mutations perte de fonction dans le gène du collagène de type 2. L’objectif de ce projet est d’identifier un traitement immunosuppresseur pouvant être utilisé en combinaison avec un traitement de thérapie génique pour différents types de dysplasies squelettiques. Les traitements de thérapie génique basés sur l’utilisation de vecteurs viraux peuvent induire des réponses immunitaires pouvant réduire l’efficacité du traitement (diminution du niveau d’expression du gène d’intérêt ou élimination des cellules transduites) et empêcher la ré-administration efficace de ce dernier (réponse mémoire dirigée contre le vecteur viral). Il est donc nécessaire d’inhiber de façon transitoire les mécanismes impliqués dans les réponses immunitaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à la fois d’identifier la ou les constructions de vecteurs viraux les moins immunogènes, et la stratégie d’immunosuppression la plus efficace entrainant le moins de complications. Ces résultats, combinés à ceux d’un autre projet en cours permettront d’identifier, chez la souris, la combinaison vecteur viral / immunosuppression la plus efficace et la moins toxique. Ces étapes de pré-sélection chez la souris permettront de diminuer le nombre de sujets dans les futures études sur animaux supérieurs (type primates) aux caractéristiques plus proches de celles de l’Homme. Le bénéfice final du projet est de développer des traitements (combinaison thérapie génique / Immunosuppression) pour différents types de dysplasies du squelette, notamment la dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (SEDc), la collagénopathie de type 2 la plus fréquente.

Procédures

Les animaux seront soumis à une ou deux injections de vecteurs viraux par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, et de multiples injections d’immunosuppresseurs par voie intrapéritonéale. Ces dernières se feront sur une durée maximum de 16 semaines (injections IP quotidiennes sur un maximum de 21 jours consécutifs ou injections hebdomadaires sur un maximum de 16 semaines). Les animaux seront également soumis à des prélèvements répétés de sang (toutes les semaines, ou toutes les deux semaines sur une durée maximale de 16 semaines) dans la mesure du possible (effectués sur des animaux d’un mois minimum). Ces prélèvements s’effectueront sous anesthésie au niveau de la veine mandibullaire en alternant chaque côté. Des prélèvements de sang terminaux seront également effectués sous anesthésie sur tous les animaux par la voie rétro-orbitale.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’injection de vecteurs viraux (résultats obtenus dans le cadre d’un précédent projet). Les souris sous immunosuppresseurs présenteront un système immunitaire éteint. Elles seront ainsi plus sujettes à des infections opportunistes et aux complications qui pourraient en découler. En cas d’infection, les souris pourraient être sujettes à des pertes de poids ou des signes d’inactivité.

Devenir

Toutes les souris utilisées au sein de ce projet seront mises à mort par dislocation cervicale, asphyxie au CO2 ou injection intrapéritonéale d’une dose létale de pentobarbital sodique (de type Euthasol 140 mg/kg ou Euthoxin 500 mg/kg). La mise à mort est nécessaire afin de récupérer un ensemble d’organes (rate, foie, moelle osseuse, plaques de croissance…) pour évaluer à la fois la biodistribution des vecteurs viraux testés, mais aussi l’effet du traitement (vecteur viral et immunosuppresseur) sur la réponse immunitaire cellulaire.

Remplacement

Globalement, la construction des vecteurs viraux et l’optimisation de ces derniers se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Les différents vecteurs viraux produits sont précédemment testés in vitro afin de valider leur capacité à transduire efficacement des cellules modèle (HEK293). Si la transduction n’est pas efficace, le vecteur ne sera pas sélectionné pour les études in vivo. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier des traitements immunosuppresseurs d’intérêt, d’autant plus sachant que la patientèle sera constituée en totalité d’enfants. Il est très difficile de valider une stratégie d’immunosuppression par des tests in vitro sachant que cela nécessite la présence d’un système immunitaire complet et fonctionnel. Certains immunosuppresseurs seront tout de même évalués à l’aide des tests in vitro mentionnés précédemment afin de confirmer qu’ils n’impactent pas la capacité des vecteurs à transduire efficacement les cellules modèles.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 8 animaux par groupe sera suffisant pour comparer de manière significative les niveaux d’anticorps et les réponses cellulaire induites. En effet, l’utilisation d’outils statistiques (calcul de puissance de test et de taille d’échantillons, https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#) permet de définir un nombre minimal d’animaux de 8 par groupe, en considérant un seuil de significativité (p

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage et par sexe dans une pièce à température et hygrométrie contrôlées avec un cycle jour/nuit de 12h. Chaque cage sera soumise à un enrichissement du milieu de type tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Les souris sous immunosuppresseurs présenteront un système immunitaire éteint. Elles seront ainsi plus sujettes à des infections opportunistes et aux complications qui pourraient en découler. L’hébergement des animaux en zone SPF (Specific Pathogen Free) dans des cages ventilées, l’utilisation de hottes de change, ou de hotte à flux laminaire pour les expérimentations, et l’apport d’aliments irradiés, permettront de réduire ces risques au minimum. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima deux fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée (observation et pesée quotidienne) et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire

Choix des espèces

Afin d’identifier une combinaison vecteur / immunosuppression applicable en clinique chez l’homme, il est important de la valider au préalable au sein d’un modèle animal. En effet le système immunitaire fonctionne au travers de mécanismes complexes qu’il est impossible de reproduire fidèlement en dehors d’un organisme vivant. Les primates non humains représentent le modèle de prédilection de par son anatomie proche de celle de l’Homme. Il est cependant impossible de cribler autant de paramètres différents (vecteur, dose, immunosuppresseur, dose, fréquence) chez cette espèce. Nous allons avoir besoin d’une espèce inférieure, i.e. la souris, pour cribler les vecteurs mais aussi les traitements immunosuppresseurs pertinents. Étant donné que les destinataires finaux du traitement seront des enfants, l’efficacité du traitement combinatoire thérapie génique + Immunosuppresseur devra être confirmé chez un modèle de souris d’âge similaire, soit des souris juvéniles (1 à 22 jours). Les études qui consistent à évaluer la cinétique de la réponse immunitaire (Procédure n°1), cribler les différents traitements immunosuppresseurs (Procédure n°2) et évaluer l’efficacité d’une seconde injection de vecteur viral (Procédure 3) seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 5 à 8 semaines. Étant donné que les destinataires finaux du traitement seront des enfants, l’efficacité du traitement combinatoire thérapie génique + Immunosuppresseur devra être confirmé chez un modèle de souris d’âge similaire, soit des souris juvéniles avec des traitements allant de la naissance jusqu’à un âge de 4 mois maximum (procédures n°4 et 5).

16 270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent un modèle d'une maladie osseuse rare avec atteinte rénale, reçoivent des injections de vecteurs lentiviraux, des prélèvements de sang et d'urine et une biopsie d'oreille, puis sont toutes tuées pour analyse des organes, pour une preuve de concept thérapeutique. Le porteur annonce un bénéfice "certain à long terme" pour les patients, formulé au conditionnel, face à ce nombre très élevé d'animaux mobilisés d'emblée. Il affirme le recours au modèle animal "inévitable" malgré des tests menés in vitro et une recherche bibliographique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer une nouvelle approche thérapeutique pour une maladie osseuse avec troubles renaux associés. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour cette maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour certains symptômes de la maladie notamment les problèmes rénaux associés.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d’une approche thérapeutique pour cette maladie. Il s’agit d’une maladie rare sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice certains à long terme pour ces patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à des injections de vecteurs lentiviraux (30 secondes), ainsi que des prélevements de sangs (5 minutes) et d'urine (30 minutes). Les prélèvements de sang sont sur animal anesthésié et un animal aura maximum de 3 prélèvements dans sa vie. Les prélèvements d'urine se font sur animal non anesthésié et un maximum de 6 prélèvements sera fait Les animaux auront également une biopsie d'oreille pour savoir s'ils sont porteur de la maladie (20 secondes).

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé dans ce projet présente les signes cliniques caractéristiques de la maladie. En effet, ces animaux sont de plus petite taille et présentent un poids inférieur par rapport aux souris non malades de même âge. Cependant les chercheurs ayant générés ce modèle ne rapportent aucun problème pour ces animaux à se mouvoir ou à s’alimenter. Les souris ont également une altération de la fonction rénale et une ostéoporose associée à une destruction partielle des os des pattes chez la souris malade. Toutes ces altérations sont caractéristiques de la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, le projet nécessite d'étudier la structure des organes afin de vérifier l'efficacité du traitement testé et cela ne peut se faire que sur animal euthanasiés.

Remplacement

Globalement, la production du traitement et l’optimisation se fait et continue à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés sur cellules. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible. Cependant l’utilisation du modèle animal de la maladie est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement. Ce modèle étant un nouveau modèle de souris, il est possible que ce nombre soit amené à changer au cours des études et des différents résultats obtenus. Ce nombre est basé sur nos expériences passées avec différents modèles animaux de maladies osseuses.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage. Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et euthanasiés dans les 24 heures.

Choix des espèces

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant de la maladie, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il a été construit pour mimer la pathologie et en effet, les auteurs du papier original démontrent bien que les principales caractéristiques de la pathologie sont retrouvées. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 52 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à une course de deux heures sur tapis roulant en pente descendante, destinée à provoquer des microtraumatismes musculaires, avec prélèvements de sang et de fèces, puis tuées pour recueil de matériel biologique, afin de tester un extrait de microalgue censé accélérer la récupération. Le porteur situe l'objectif du côté des stratégies nutritionnelles pour sportifs, tandis que les lésions musculaires sont provoquées volontairement. Il affirme que l'étude des relations entre alimentation et activité physique ne peut s'envisager que chez l'animal.

Objectifs

La principale conséquence de lésions musculaires induites par l'exercice pour l'athlète est la perte de la fonction musculaire squelettique et la douleur. C'est pourquoi de nombreux nutriments et aliments fonctionnels ont été étudiés pour leur capacité à atténuer les effets de ces lésions et à accélérer la récupération, ce qui est l'objectif de nombreuses stratégies nutritionnelles pour les athlètes. Dans cette étude, nous cherchons à évaluer l'effet d'un extrait de microalgue sur la récupération musculaire suite à un test de blessure provoquée par un exercice physique.

Bénéfices attendus

Dans cette étude, nous évaluerons la capacité d'un extrait de microalgue à atténuer les effets de lésions musculaires et à accélérer la récupération suite à un exercice physique. Des modifications métaboliques seront identifiées par des dosages des marqueurs des voies du métabolisme énergétique et musculaire. Des marqueurs inflammatoires et du stress oxydant seront également recherchés.

Procédures

Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude. Deux recueils de fèces seront effectués à 4 semaines d'intervalle (isolement en cage individuelle pendant 1h au maximum). Une course de 2h (+20 min d'habituation/échauffement) sur tapis roulant aura lieu en fin de protocole.

Impact sur les animaux

La course sur tapis roulant peut engendrer un stress chez l'animal. Au lieu d'une période d'acclimatation typique qui dure de quelques jours à plusieurs semaines, une brève période d'acclimatation au début de la séance d'exercice sera réalisée. Les souris seront placées sur un tapis roulant stationnaire pendant quelques minutes pour leur permettre de se familiariser avec l'environnement de course avant une augmentation progressive de la vitesse et de la pente pendant 20 minutes. Cette période a pour but de réduire le stress provoqué par un environnement nouveau tout en prévenant toute adaptation au protocole de course qui est connu pour atténuer de manière significative les effets nocifs sur les muscles . Les blessures causées par ce type de course en pente descendante sont de l'ordre de microtraumatismes musculaires et courbatures.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour recueil du materiel biologique nécessaire aux analyses.

Remplacement

L'étude des relations entre alimentation et activité physique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Aucun modèle in vitro n’a pour l'instant la capacité d’intégrer cette complexité multifactorielle.

Réduction

Le nombre d'animaux est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. Des études du même type portent sur 8 à 10 animaux, du fait de la forte variabilité entre animaux au niveau de la performance sportive. Nous travaillerons avec 9 animaux par groupe afin que le nombre d'animaux par cage soit homogène (3 souris par cage). Nous chercherons à mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre 3 groupes ou plus à l'aide de tests statistiques non paramétriques de Kruskall-Wallis. Dans le cadre de comparaisons entre 2 groupes, un test statistique de Mann-Whitney sera appliqué.

Raffinement

Les animaux sont hébergés par groupe de 3 animaux par cage. L'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Les animaux seront observés hebdomadairement afin de détecter des comportements agressifs de certains animaux, si tel est le cas l'animal agressif sera isolé de ses congénères dans une cage individuelle. Si un animal est blessé, il sera soigné par badigeonnage de bétadine sur la zone lésée, il sera également isolé le temps de la cicatrisation de ses blessures. Dans tous les cas, les animaux isolés resteront en contact visuel, olfactifs et auditifs avec leurs congénères. La course sur tapis roulant pouvant engendrer un stress chez l'animal, afin de limiter ce stress, chaque souris sera placée sur le tapis roulant fixe pendant quelques minutes afin de se familiariser avec l'environnement. Pendant les 20 premières minutes d'exercice, les animaux seront familiarisés avec le tapis roulant à une vitesse lente et régulière, qui sera progressivement augmentée. Au cours des phases d’exercice sur tapis, les animaux bénéficieront d’une surveillance constante. Si un animal venait à se blesser pendant la course (contusion), ils seraient alors immédiatement pris en charge selon les recommandations du vétérinaire référant. Pour chaque procédure, des points limites spécifiques et des points d'arrêt ont été définis.

Choix des espèces

La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant la mobilisation des ressources énergétiques, notamment au cours d’un exercice imposé. Le modèle C57Bl/6J est une souche reconnue pour ce type d'expérimentation. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.