Troubles immunitaires
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- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Investigation du mécanisme d’action d’une approche de thérapie cellulaire chez la souris âgée _ MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
912 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 480 irradiées et 64 soumises à une chimiothérapie pour préparer la greffe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cent soixante souris nouveau-nées reçoivent une transplantation de cellules, et 128 d'entre elles une seconde neuf à douze mois plus tard. Le conditionnement peut provoquer un amaigrissement et une anémie, le traitement par voie orale une irritation de l'œsophage, et la chirurgie d'injection ajoutée par modification une douleur postopératoire et un défaut de cicatrisation. Les bénéfices annoncés vont de nouveaux essais cliniques à des économies pour les systèmes de santé, tous au conditionnel, quand la mise à mort sert dès maintenant à prélever moelle osseuse, rate et thymus.
Objectifs
La greffe de cellules souches du sang, appelées aussi cellules souches hématopoïétiques (CSH), est le traitement de référence pour de nombreuses maladies du sang, malignes (comme les leucémies ou les lymphomes) et non malignes (incluant les déficits immunitaires, en particulier chez les enfants). Cependant, la maladie du greffon contre l'hôte, les infections et les rechutes sont des obstacles majeurs au succès de cette thérapie. Certains de ces obstacles sont liés à une lente reconstitution du système immunitaire après la greffe de CSH. Dans ce contexte, une nouvelle stratégie thérapeutique a été développé pour améliorer la régénération immunitaire lors des greffes de CSH et augmenter la chance de survie des patients greffés. Cette stratégie repose sur la production in vitro de progéniteurs lymphoïdes et leur greffe, pour favoriser une production rapide de cellules immunitaires. Par rapport à la transplantation de CSH, la transplantation des progéniteurs lymphoïdes à des souris immunodéficientes nouveau-nées conduit à une régénération plus rapide des cellules du système immunitaire qui jouent un rôle clé dans la défense contre les pathogènes et les cellules cancéreuses. Les progéniteurs lymphoïdes transplantés sont immatures, une caractéristique qui confère une grande sécurité à ce produit en termes de risque de maladie du greffon contre l’hôte. Nos objectifs de recherche du projet proposé sont de tester ces progéniteurs T produits in vitro pour leur capacité à régénérer les lymphocytes T de patients âgés. En effet, avec l’âge, le thymus, organe jouant un rôle central dans la production des lymphocytes T, fonctionne moins bien ce qui complique la reconstruction du système immunitaire. De précédentes études expérimentales ont suggéré que l’ajout de progéniteurs lymphoïdes lors de la transplantation de CSH améliorerait le fonctionnement du thymus. Ce processus encore mal compris nécessite une investigation approfondie pour en optimiser les effets dans le cadre de futures applications thérapeutiques de ces progéniteurs chez les personnes âgées. Cela passe par une meilleure compréhension des mécanismes de vieillissement et par l'amélioration du système immunitaire après la greffe, dans le but d'augmenter les chances de survie des patients. MODIFICATION/Le projet a été modifié afin de prendre en compte des ajustements méthodologiques issus des premières observations expérimentales.
Bénéfices attendus
Le projet actuel présente des bénéfices potentiels significatifs, tant à court qu'à long terme. Tout d'abord, les résultats attendus permettront d’approfondir la connaissance du produit de thérapie cellulaire à base de progéniteurs lymphoïdes T. Ce projet permettra d'éclaircir son mode d'action chez les individus âgés, d'affiner ses caractéristiques de qualité et d'évaluer son efficacité au-delà de la simple reconstitution des lymphocytes T. Ces découvertes pourraient déboucher sur de nouveaux essais cliniques ou sur l'optimisation des essais en cours, favorisant ainsi des avancées thérapeutiques. En outre, ce projet ouvre la voie à l'élargissement des applications thérapeutiques du produit, initialement conçu pour traiter l'immunodéficience combinée sévère chez les enfants. Les progéniteurs lymphoïdes pourraient également bénéficier à d'autres groupes de patients, notamment ceux dont la fonction thymique est diminuée, que ce soit en raison du vieillissement, du VIH/SIDA ou de l'exposition aux radiations ionisantes. Cela pourrait aboutir à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces populations vulnérables. Enfin, d'un point de vue sociétal et économique, les progéniteurs lymphoïdes pourraient réduire les hospitalisations post-greffe de cellules souches hématopoïétiques et diminuer les risques de rechutes, entraînant ainsi des économies substantielles pour les patients et les systèmes de santé. Ces bénéfices contribueront non seulement à l'amélioration des traitements actuels, mais aussi à la réduction des coûts de santé à l'échelle globale. Ce projet vise également à approfondir notre compréhension des processus de vieillissement, de dégénérescence et de régénération du thymus, organe essentiel pour la production de cellules du système immunitaire. Il propose notamment d'identifier des molécules capables d'influencer le vieillissement immunitaire et les altérations du thymus. Une connaissance fine des mécanismes permettrait une régénération de l'architecture thymique dégradée avec l’âge et faciliter une greffe plus efficace des progéniteurs lymphoïdes et une meilleure reconstitution des cellules immunitaires.
Procédures
480 animaux vigiles seront conditionnés à la greffe par une irradiation d'une durée inférieure à 5 minutes. Ce procédé est rapide et non douloureux. 64 animaux vigiles recevront une chimiothérapie de conditionnement pour la greffe, chaque traitement durant environ 1 minute/animal. 96 animaux, sous anesthésie gazeuse, recevront des molécules de régénération du thymus d’une durée de 1 minute/traitement et un seul traitement/animal. 96 animaux vigiles recevront en vigile différentes molécules de conditionnement/régénération du thymus chaque jour pendant 15 jours, chaque traitement durant 1 minute/animal. 704 animaux sous anesthésie gazeuse seront transplantés avec des cellules souches/progénitrices, durée de l’action 1 minute/animal. 160 animaux nouveau-nés vigiles recevront une transplantation de cellules (1 minute/animal). 128 d’entre eux recevront sous anesthésie une seconde transplantation, 9 à 12 mois plus tard, chaque action durant 1 minute, une seule action/animal. 160 animaux sous anesthésie gazeuse subiront un prélèvement sanguin juste avant leur euthanasie. 160 animaux sous anesthésie gazeuse subiront deux prélèvements sanguins au cours de leur suivi, à au moins 5 mois d’intervalle. Chaque prélèvement sanguin dure environ 1 minute. MODIFICATION/48 animaux recevront une transplantation de cellules par méthode chirurgicale sous anesthésie, durée de l’action 10 minutes/animal.
Impact sur les animaux
Les conditionnements à la greffe (chimiothérapie ou irradiation), nécessaires pour préparer l’organisme à recevoir une greffe de CSH et mimer ainsi les conditions des patients humains, peuvent occasionner chez la souris des symptômes cliniques de type amaigrissement et anémie. Les injections peuvent provoquer une légère douleur localisée et un stress transitoire. Le traitement par voie orale peut provoquer un stress, une douleur, et une légère irritation au niveau de l’œsophage chez l’animal surtout lors des traitements en continu. L’anesthésie gazeuse générale peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. MODIFICATION/ La chirurgie d’injection ciblée peut provoquer une douleur post-opératoire transitoire, un stress lié à la procédure, ainsi qu’un risque de complications chirurgicales (mauvaise cicatrisation).
Devenir
Afin de mesurer la production des cellules lymphoïdes T humaines après injection, nous devons euthanasier les souris. Des organes hématopoïétiques (Moelle osseuse, rate et thymus) sont prélevés et les cellules qui y sont contenues sont soumises à une caractérisation cellulaire. Ces protocoles sont importants pour pouvoir juger de la réussite ou non de l’injection effectuée.
Remplacement
Ce projet n'a pas d'alternative non animale. L’utilisation d’un modèle préclinique in vivo capable de mimer la réponse thérapeutique chez l’Homme est indispensable pour évaluer et comprendre les effets de la greffe de progéniteurs lymphoïdes sur la reconstitution du système immunitaire. Nous utiliserons des souris sans système immunitaire qui représentent les outils de référence internationaux pour l’analyse fonctionnelle du développement sanguin humain d'après la littérature scientifique Ces souris immunodéficientes sont appelées souris NSG; elles combinent une série de mutations génétiques qui altèrent leur système immunitaire dans sa globalité, les rendant aptes à ne pas rejeter les xénogreffes de cellules humaines d'origine sanguine
Réduction
Le nombre total de souris impliquées dans les expériences a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable des résultats pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. Afin de réduire le nombre d’animaux, les scores d’évaluation clinique les plus objectifs, prédictifs et robustes seront privilégiés. Ces études permettront de choisir une condition de greffe optimale et de diminuer les échecs de greffe. Le modèle animal choisi et le plan expérimental sont inspirés de plusieurs études similaires très bien documentées dans la littérature. Cela confirme la pertinence du modèle expérimental et renforce la validité de nos hypothèses évitant des étapes intermédiaires de mise au point chez l’animal. Les expérimentations seront regroupées au maximum et dans la mesure de la faisabilité technique, afin de réduire le nombre d'animaux contrôles.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton de nidification et de rouleaux en carton pour favoriser les cachettes et le jeu. Le nombre de souris sera limiter à 5 animaux par cage. Toutes les souris sont hébergées en portoir à cages ventilées dans une pièce avec un cycle jour/nuit de 12h/12h. Chaque cage est indépendante des autres, l’air entrant est filtré et l’eau utilisé est filtrée, et donc constitue une entité séparée. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable ou souffrance à l’issue de la greffe des cellules immunitaires chez les animaux greffés. Toute irradiation sera suivie rapidement par une greffe de cellules et toute manifestation de signes de douleur sera scrutée selon les critères de définition des points limites de la présente étude. Les greffes seront précédées par une anesthésie générale. Lors des greffes chez le nouveau-né, l’expérimentateur transfère l’odeur de la cage sur ses gants en le frottant sur la litière pour ne pas risquer une réaction négative de la mère par rapport à ses petits. En outre, les mères sont isolées durant les greffes afin de diminuer leur stress durant la manipulation des petits. En cas de signe de souffrance et selon les résultats de la grille préétablie, le personnel qualifié et le responsable scientifique de l’étude pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l’euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunodéficientes qui reproduisent de nombreux mécanismes fondamentaux existant chez l’Homme. Le déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules hématopoïétiques humaines normales et offre la possibilité d'évaluer les immunothérapies avec des cellules humaines in vivo. Nous utiliserons les souris âgées entre 9 et 12 mois. Le thymus des souris immunodéficientes âgées ressemble à celui des patients humains atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une transplantation de moelle osseuse. De nombreuses données sur l’étude de la différenciation des lymphocytes T humains chez ces souris sont disponibles, ce qui nous permettra d’évaluer l’efficacité des progéniteurs lymphoïdes produits par nos équipes dans un environnement similaire à celui des patients. Nous utiliserons aussi les animaux nouveau-nés pour humaniser leur système hématopoïétique sans passer par l’irradiation.
Validation préclinique in vivo d’une nouvelle méthode de thérapie cellulaire destinée à réduire la réponse auto-immune dans un modèle murin de diabète de type 1.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Jusqu'à quinze ponctions de la veine de la queue, quinze injections d'anesthésiant, quinze injections de son antagoniste et treize prélèvements sanguins par souris : 2 688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Deux injections de streptozotocine leur provoquent un diabète, avec perte de poids rapide, diarrhée et une hyperglycémie que le porteur qualifie de potentiellement létale, avant une chirurgie de trente minutes pour greffer des îlots pancréatiques et l'injection intraveineuse de lymphocytes dirigés contre ces cellules. Le porteur décrit une mise à mort indolore, réalisée selon des méthodes "garantissant que les animaux ne souffrent pas", dans des procédures qu'il déclare par ailleurs de gravité sévère. La justification de l'effectif tient en une phrase, un calcul par logiciel statistique, sans qu'aucun nombre par groupe ne soit donné pour ces 2 688 souris.
Objectifs
Dans la pratique clinique, la production et la transplantation de structures pancréatiques sécrétrices d’insuline (îlots pancréatiques) dérivées de cellules souches constituent une option thérapeutique prometteuse pour les patients atteints de diabète de type 1. Cette approche permet de restaurer la production physiologique d’insuline et d’améliorer le contrôle de la glycémie. Cependant, la récidive de la maladie après la greffe demeure un obstacle majeur et nécessite le recours à un traitement immunosuppresseur important, associé à de nombreux effets secondaires. En effet, certaines cellules du système immunitaire continuent, en l’absence de blocage pharmacologique efficace, à attaquer les cellules productrices d’insuline après la transplantation. Cette réaction entraîne progressivement la destruction des cellules transplantées, provoquant une perte de fonction du greffon et le retour de l’hyperglycémie. Ces limitations soulignent la nécessité de développer de nouvelles stratégies visant à protéger les cellules greffées contre l’attaque immunitaire. Dans ce contexte, notre laboratoire a mis au point une approche innovante consistant à modifier certaines protéines impliquées dans la reconnaissance cellulaire par le système immunitaire. L’objectif est de rendre les cellules greffées moins visibles aux lymphocytes responsables de leur destruction, sans recourir à un traitement immunosuppresseur pharmacologique. Nos résultats préliminaires obtenus in vitro montrent que ces cellules génétiquement modifiées échappent à la reconnaissance et à la destruction par les systeme immunitaire du receveur, sans traitement pharmacologique. Ces résultats prometteurs ont conduit au dépôt d’un brevet et nécessitent désormais une validation dans un modèle murin pertinent. Cette étude permettra d’évaluer la capacité de nos îlots dérivés de cellules pluripotentes génétiquement modifiées à résister à l’attaque immunitaire tout en conservant leur capacité à sécréter l’insuline.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude permettront de confirmer l’efficacité de notre technique de modification génétique dans la production d’ilots pancréatiques fonctionnels et protégés de l’agression auto-immune du diabète de type I, ouvrant ainsi la possibilité de greffer les patients sans besoin de thérapies immunodépressive qui sont souvent accompagnées d’effets secondaires lourds, mais aussi d’améliorer le rendement de la greffe elle-même en limitant le rejet.
Procédures
Pendant la procédure, les souris recevront au total : - deux injections de streptozotocine afin d’induire le diabète (1 minute chacune) ; - une procédure chirurgicale (30 minutes) ; - une injection intraveineuse de lymphocytes réactifs contre les cellules pancréatiques (2 minutes) ; - un maximum de 15 injections sous-cutanées d’anesthésiant avant les analyses intravitales (1 minute chacune) ; - un maximum de 15 ponctionnes de la veine caudale sur souris vigiles pour suivi de la glycémie lors de l’induction du diabètes (10 secondes chacune); - un maximum de 15 injections intrapéritonéales d’antagoniste de l’anesthésiant après les analyses (1 minute chacune) ; - un maximum 13 prélèvements sanguins de 100 µL au niveau de la veine submandibulaire sur souris vigiles (une fois par semaine, 10 secondes chacun).
Impact sur les animaux
Les nuisances et complications éventuelles de la procédure incluent : (1) Stress et angoisse, voire des douleurs, liées aux contentions multiples auxquelles s’additionnent les actions d’injections, les prélèvement de sang et la période de jeun avant injection de la Streptozotocine; (2) Les souris pourront développer des effets indésirables aigües lié au traitement STZ (perte de pois rapide, diarrhée) et des effets indésirables chroniques typique du diabète (hyperglycémie potentiellement létale, perte de poids progressive) , qui seront monitorés régulièrement; (3) Des complications peuvent survenir au cours et après la procédure chirurgicale, notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement ou une infection du site de la greffe ou du site de l'injection des cellules et des médicaments. Ces complications sont rares (
Devenir
La mise à mort des animaux à la fin de l’expérience est nécessaire pour pouvoir analyser précisément les cellules injectées dans les tissus. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur des animaux vivants sans leur causer de souffrance importante ou sans compromettre la qualité des résultats scientifiques. Les animaux sont euthanasiés de manière indolore : ils reçoiveront d’abord un traitement pour limiter toute gêne, puis une anesthésie profonde avant le prélèvement des échantillons. Cette procédure sera réalisée selon des méthodesreconnues, garantissant que les animaux ne souffrent pas.
Remplacement
Les expériences réalisées en laboratoire ont permis de démontrer l’efficacité de notre approche, mais elles ne reproduisent qu’une partie du fonctionnement réel du système immunitaire, qui reste beaucoup plus complexe dans un organisme vivant. Seule l’utilisation d’un modèle in vivo permet de prendre en compte l’ensemble des phénomènes physiologiques liés à la greffe et au diabète, comme le manque temporaire d’oxygène des tissus, la reformation des vaisseaux sanguins autour du greffon ou encore les déséquilibres métaboliques. Tous ces éléments peuvent influencer l’efficacité réelle de notre stratégie de protection des cellules transplantées.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans l'étude est strictement calculé avec le logiciel statistique reconnu pour obtenir des résultats statistiquement concluants, tout en réduisant au maximum le nombre de souris nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes de 5 à 6, dans des cages enrichies afin de favoriser leur bien-être. Ils feront l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel animalier et les expérimentateurs, avec une attention portée à leur comportement, leur apparence et à l’apparition d’éventuels signes cliniques. Les souris immunodéficientes seront maintenues dans des conditions sanitaires renforcées afin de les protéger des infections. Elles seront hébergées dans des cages ventilées et manipulées dans un environnement stérile, selon des procédures spécifiques distinctes de celles des autres animaux. Les interventions chirurgicales seront réalisées dans des conditions limitant au maximum les risques d’infection et d’inconfort, avec désinfection du site opératoire, matériel stérile et maintien des animaux sur tapis chauffant pendant l’anesthésie. Une attention particulière sera portée au suivi des souris diabétiques, notamment au contrôle du poids, de la glycémie et à la surveillance de la cicatrisation, grâce à une grille d’évaluation adaptée permettant une prise en charge rapide en cas de besoin.
Choix des espèces
À l’heure actuelle, aucune méthode alternative ni expérience réalisée uniquement en laboratoire ne permet de reproduire toute la complexité du système immunitaire et ses interactions dans un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle chez la souris est donc indispensable pour étudier la réaction du système immunitaire face aux cellules transplantés dans un contexte proche du diabète de type 1, notamment l’attaque des cellules produisant l’insuline par des cellules immunitaires issus de patients diabétiques. Cette étape est essentielle avant d’envisager une application chez l’être humain. Les souris seront utilisées à l’âge adulte. Le choix d’animaux adultes permet de travailler avec un organisme physiologiquement stable, ce qui améliore la fiabilité et la reproductibilité des résultats en limitant les variations liées à la croissance et au développement.
Immunotherapie intranasale pour le traitement de l’allergie alimentaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Deux injections à une semaine d'intervalle sur souris vigiles pour installer une allergie à l'ovalbumine, puis jusqu'à cinq administrations orales, jusqu'à six administrations intranasales sous anesthésie générale et jusqu'à trois prises de sang. 930 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les réactions allergiques provoquées comprennent des diarrhées, une baisse de la température corporelle et une perte de poids, plus rarement des difficultés respiratoires et des signes de choc anaphylactique, et que la température et les diarrhées servent de points limites déclenchant la mise à mort. Toutes sont tuées pour récupérer la rate, les ganglions, le tissu nasal et l'intestin.
Objectifs
Les allergies alimentaires touchent 6 à 8 % des enfants et 2 à 4 % des adultes. Elles se caractérisent par des symptômes gastro-intestinaux, cutanés, respiratoires et cardiovasculaires, pouvant conduire à un choc anaphylactique. Si l’absence stricte et contraignante de l'aliment incriminé est la première approche utilisée, l'immunothérapie spécifique de l'allergène gagne en intérêt, mais se heurte toujours à un manque de protection durable et à des effets secondaires sévères. Utilisant le modèle de l’allergie alimentaire à l’ovalbumine, la principale protéine du blanc d'œuf, le projet vise à évaluer l’effet thérapeutique d’un traitement intranasal par une ovalbumine modifiée pour désensibiliser l'organisme et réduire les réactions allergiques. Pour ce projet, une allergie alimentaire à l’ovalbumine sera induite chez la souris selon un protocole défini mimant ce qui se passe chez l’homme. Puis, l’effet d’un traitement avec de l’ovalbumine modifiée administrée par voie intranasale sera analysé.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de démontrer l'efficacité thérapeutique de l'administration intranasale de notre protéine de fusion dans le traitement de l'allergie alimentaire à l'ovalbumine, composante du blanc d’oeuf. Si cette approche s'avère efficace, elle pourrait représenter une avancée majeure dans la prise en charge des allergies alimentaires en général, qui, à l'heure actuelle, offrent peu d'options thérapeutiques durables et souvent insatisfaisantes pour les patients. L’administration intranasale se distingue par son caractère non invasif, ce qui en ferait une alternative potentiellement plus sûre et plus confortable que les traitements actuels. Les résultats attendus pourraient poser les bases d'essais cliniques pour valider cette approche chez l’homme, ouvrant la voie à de nouvelles thérapies pour les patients allergiques.
Procédures
- Injections pendant 10 secondes, effectuées 2 fois à 1 semaines d’intervalle sur souris vigile. - Administration intranasale sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée 6 fois maximum (1/jour). - Administration orale sur souris vigile pendant 2 minutes, effectuée 5 fois maximum (1/jour tous les 2 jours). - Prélèvement de sang effectué 3 fois maximum sur souris vigile pendant 30 secondes, ou effectué 1 seule fois sous anesthésie générale pendant 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les interventions prévues dans le cadre de ce projet peuvent entraîner un stress et quelques effets indésirables. Les injections et administrations orales et intranasales peuvent causer des douleurs légères ou des inconforts localisés et de courte durée (quelques secondes à quelques minutes). Les réactions allergiques incluent des diarrhées, la diminution de température corporelle, la perte de poids, et plus rarement des difficultés respiratoires et des signes de choc anaphylactique dans les cas les plus graves.
Devenir
Les souris sont mises à mort pour récupération de différents organes nécessaires pour répondre à la question scientifique
Remplacement
Des tests cellulaires appropriés seront utilisés pour analyser le mécanisme d'action et l'impact de notre protéine sur les réponses immunitaires. Cependant, ces approches ne peuvent remplacer les expérimentations sur animal vigile, car elles ne reproduisent pas fidèlement la dynamique et la complexité des réactions allergiques. L'expérimentation animale est indispensable pour évaluer sur le vivant l'efficacité thérapeutique des stratégies proposées sur le traitement de l'allergie alimentaire et comprendre les mécanismes immunitaires de la maladie et de l’effet thérapeutique observé dans leur globalité.
Réduction
Le nombre de souris utilisées sera minimisé tout en assurant une analyse statistique fiable des résultats. Pour chaque souris, plusieurs organes seront collectés, notamment la rate, les ganglions, le tissu nasal et l'intestin, afin de maximiser les données recueillies. Aussi, afin de diminuer le nombre de souris utilisé, le protocole donnant le meilleur effet thérapeutique sera déterminé avant de lancer de nouvelles expériences pour comprendre les mécanismes responsables de l’effet thérapeutique.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus (groupes sociaux) dans un environnement enrichi. Pour minimiser le stress, la douleur et l'inconfort des animaux, toutes les manipulations seront effectuées rapidement (quelques minutes) et par des opérateurs expérimentés. Des points limites adaptés ont été établis (notamment la mesure de température, l'observation de diarrhées) permettant de mettre à mort l'animal en cas de signes de souffrance ou de développement d'une réaction allergique trop sévère. Une anesthésie générale de courte durée (quelques minutes) est réalisée pour réduire la douleur de certains gestes.
Choix des espèces
La souris est un modèle largement utilisé pour l’étude des allergies alimentaires en raison de sa pertinence biologique, de la disponibilité d’outils expérimentaux adaptés et de l’abondante littérature existante. Les mécanismes immunitaires impliqués dans les réponses allergiques sont largement conservés entre la souris et l’homme, ce qui rend ce modèle particulièrement approprié pour étudier l’allergie alimentaire et évaluer l’efficacité nouvelles thérapies. Les expériences seront réalisées chez des souris adultes, à partir de 10 semaines d’âge afin que les souris aient un système immunitaire mature.
Évaluation de cellules thérapeutiques génétiquement modifiées pour limiter la rejet immunitaire.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Les souris de ce projet ont un système immunitaire affaibli puis reconstitué avec des cellules immunitaires humaines, ce qui les rend plus sensibles aux infections opportunistes. 648 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit quatre injections, dont deux de cellules, et une prise de sang de 100 microlitres, avant une analyse par imagerie sous anesthésie. Cinq à six semaines après l'injection, le porteur annonce une réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids, baisse d'activité, diarrhées, déshydratation et parfois atteintes de la peau, tout en classant l'ensemble du projet en souffrance légère.
Objectifs
Ce projet vise à tester une nouvelle technique de modification génétique permettant de réduire le risque de rejet de greffe. Lors d’une greffe, le système immunitaire du receveur peut reconnaître les cellules greffées comme étrangères et les attaquer, entraînant la perte du greffon. Pour limiter ce phénomène, notre laboratoire a développé une méthode qui modifie certaines protéines impliquées dans la reconnaissance immunitaire afin que les cellules greffées soient moins détectées par le système immunitaire, tout en conservant sa capacité à lutter contre les infections et les cellules anormales. Des tests réalisés en laboratoire ont déjà montré que ces modifications permettent de diminuer les réactions de certaines cellules immunitaires responsables du rejet. L’objectif de cette étude est maintenant de vérifier l’efficacité et la sécurité de cette approche dans des modèles animaux possédant un système immunitaire humain.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra la validation préclinique des nouvelles modifications géniques visant à prévenir le rejet cellulaire de cellules étrangères et fournir une plateforme prometteuse pour de futures thérapies cellulaires universelles.
Procédures
Pendant la procédure, les souris recevront au total 4 injections : - deux injections avec des cellules (2 minutes par injection). - une injection d'anesthésiant, avant analyse intravitale (10 secondes). - une injection de l' antagoniste de l’anesthésiant, après analyse (10 secondes). Une seule fois au cours de la procédure, elles feront l’objet d’un prélèvement sanguin de 100 μL (30 secondes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus chez les souris sont principalement liés à la manipulation, aux injections et aux prélèvements sanguins. Cela peut entraîner un stress passager, de brèves douleurs, de petits hématomes ou encore une légère inflammation au niveau des zones d’injection. Dans ce modèle particulier, où les souris reçoivent des cellules immunitaires humaines, un effet indésirable spécifique peut survenir : une réaction appelée “réaction du greffon contre l’hôte” (GVHD). Elle apparaît généralement 5 à 6 semaines après l’injection et se traduit par une perte de poids, une baisse d’activité, des diarrhées, une déshydratation et parfois des atteintes de la peau. Enfin, comme ces souris ont un système immunitaire affaibli, elles sont plus sensibles aux infections opportuniste
Devenir
La mise à mort des animaux à la fin de l’expérience est nécessaire pour pouvoir analyser précisément les cellules injectées et la réponse immunitaire dans le sang et les tissus. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur des animaux vivants sans leur causer de souffrance importante ou sans compromettre la qualité des résultats scientifiques. Les animaux sont euthanasiés de manière indolore : ils recevront d’abord un traitement pour limiter toute gêne, puis une anesthésie profonde avant le prélèvement des échantillons. Cette procédure sera réalisée selon des méthodes reconnues, garantissant que les animaux ne souffrent pas.
Remplacement
Les données in vitro produites précédemment par notre laboratoire montrent des résultats préliminaires encourageants. Pour avancer vers l’application clinique de notre procédure, nous avons besoin de les tester dans un contexte complexe le plus proche possible des patients humains et nous ne pouvons pas nous affranchir d’un model murin pour aller plus loin dans notre étude pré-clinique.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans l'étude est strictement calculé avec un logiciel statistique adapté pour obtenir des résultats statistiquement concluants.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, des mesures de raffinement seront mises en oeuvre afin de limiter les contraintes et les risques sanitaires liés à l’immunodépression des animaux. Les souris seront hébergées en portoirs ventilés, en conditions confinées. L’ensemble des manipulations, incluant les changements de cages, sera réalisé sous poste de sécurité microbiologique de niveau 2, dans le respect de procédures strictes d’asepsie. Une grille de suivi clinique spécifique sera mise en place afin d’assurer une évaluation régulière, standardisée et objective de l’état de santé et du bien-être des animaux. Des points limites prédéfinis, adaptés au modèle NOG humanisé, permettront de détecter précocement tout signe de souffrance ou d’altération de l’état général. L’atteinte de ces critères entraînera la mise en oeuvre immédiate de mesures appropriées.
Choix des espèces
Le modèle de souris avec un système immunitaire humanisé permet de se rapprocher du fonctionnement du corps humain. C’est une étape essentielle avant d’envisager une application chez les patients. De plus, les souris offrent la possibilité d’utiliser des modèles génétiquement modifiés, ce qui nous aide à répondre à des questions précises sur notre stratégie. En particulier, cela permet de vérifier si notre approche peut réduire, voire empêcher, le rejet allogénique, c’est-à-dire la réaction du système immunitaire contre des cellules pourtant issues de la même espèce mais différentes sur le plan génétique. Enfin, l’utilisation de souris adultes est justifiée par une meilleure efficacité et reproductibilité de la procédure de reconstitution du système immunitaire, notamment en raison d’une physiologie plus stable et d’une tolérance accrue aux manipulations expérimentales. Les souris seront importées dans l’animalerie à l’âge de 7-8 semaines selon disponibilité du fournisseur et entreront dans la procédure aprés la période règlementaire d’acclimatation de 5 jours.
Cartographie fonctionnelle du système immunitaire du Nothobranchius furzeri avec l’âge
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Filmés trente minutes dans un bac pour classer leurs performances de nage, traités par un antalgique, endormis, puis injectés dans la cavité abdominale avec un vaccin, 270 killis turquoise d'Afrique sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces poissons vieillissent vite, six mois de vie en captivité, et le porteur attend chez eux une perte de pigmentation, une émaciation, une baisse de la prise alimentaire et des changements de comportement qu'il qualifie d'anxiété ou de résignation. Les individus sont observés entre 2 et 6 mois, par groupes de 6 à 10, pour relier des populations immunitaires à la perte de mobilité au cours du vieillissement. Tous sont tués et disséqués à l'issue, afin d'extraire les cellules immunitaires de leurs organes.
Objectifs
Aujourd’hui, les personnes âgées de plus de 60 ans représentent 1/4 de la population française et pourraient en représenter 1/3 en 2050. Si l’espérance de vie en France après 50 ans s’avère élevée, le nombre d’années vécues en bonne santé reste inférieur à celui de plusieurs pays de l’UE. Il est donc urgent d’intervenir pour ralentir cette progression défavorable et améliorer la qualité de vie au cours de l’avancée en âge. Dans ce contexte, l'OMS a identifié 5 domaines, la mobilité, la vitalité, les capacités neurosensorielles, le psycho-social et la cognition, qui doivent être préservées ou restaurées chez la personne âgée pour promouvoir son "bien vieillir". L’objectif de ce projet est de caractériser les modifications du système immunitaire associées à la perte de mobilité spontanée, une des grandes fonctions à préserver pour vieillir en bonne santé, en utilisant un modèle animal présentant un vieillissement accéléré, l'African Turquoise Killifish.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu au cours du vieillissement. Nous pourrons évaluer quelles populations immunitaires sont associées à la diminution de la locomotion. Les outils développés dans ce projet pour cartographier les réponses immunitaires avec l’âge seront mis à disposition de la communauté scientifique. A plus long terme, les résultats permettront d'identifier de nouveaux gènes candidats et/ou de proposer de nouvelles approches d'immunomodulation afin de préserver la mobilité et favoriser le "bien vieillir".
Procédures
Nous utiliserons des poissons mâles pour caractériser les populations immunitaires modifiées avec la perte de mobilité associée au vieillissement. Les principales populations identifiées chez le mâle seront testées chez les femelles. Puis, nous évaluerons la réponse à une vaccination chez les poissons en comparant les réponses immunitaires induites par l'injection intrapéritonéale de vaccin contenant ou non un composé pro-inflammatoire. Les poissons seront traités par un antalgique avant d’être endormis pour prévenir la douleur liée à l'injection et réduire l’angoisse associées à cette intervention. Les poissons injectés seront également traités par un antalgique après l’injection. Les poissons seront filmés au préalable (trois jours à une semaine avant la vaccination) pendant 30 min dans un bac pour enregistrer les mouvements de nage spontanés et permettre de classer les individus âgés en fonction de leur performance physique.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables chez le poisson concernent principalement les conséquences du vieillissement naturellement rapide chez l'African Turquoise Killifish. Les autres effets à évaluer concernent l’injection du vaccin et les conséquences de la vaccination. Les individus peuvent présenter une réduction de la pigmentation de la peau, une perte de poids, ou émaciation, accompagnées de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium).
Devenir
Au terme des procédures, tous les animaux (n=270) seront mis à mort et disséqués afin de récupérer différents organes pour extraire les cellules immunitaires ou pour procéder à des analyses histo-pathologique et transcriptomique.
Remplacement
Le processus de vieillissement est très variable d'un individu à l'autre. Pour mieux comprendre ces différentes trajectoires de vieillissement à l'échelle individuelle, il est nécessaire d'étudier l'évolution des fonctions, comme la mobilité, chez des organismes vivants. Les individus âgés nous permettront d’étudier les réponses immunitaires dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement in vivo. Le Turquoise Killifish est un modèle unique et indispensable pour étudier, de manière intégrée, à l'échelle de l'organisme entier, les réponses immunitaires en fonction de la qualité du vieillissement des individus.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’individus, en tenant compte des expériences déjà réalisées au laboratoire. Les poissons sont observés aux âges extrêmes de la vie (2 mois à 6 mois) et leur capacité de locomotion est évaluée. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques et fonctionnels généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 6 à 10 individus au total seront constitués pour mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction). Des analyses post mortem sur différents organes seront réalisées afin d'obtenir le plus d'informations possibles pour un même individu.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire) ou l'amaigrissement (creusement de la partie ventrale du poisson). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à un suivi du poids sur 1 semaine. Si la perte de poids est trop importante, le protocole expérimental sera interrompu. La surveillance du poids se poursuivra jusqu'à stabilisation ou atteinte d'un point limite nécessitant la mise à mort de l'individu.
Choix des espèces
Pour étudier les mécanismes en lien avec le vieillissement, l'African Turquoise killifish est l'espèce de choix, puisqu'il est le vertébré dont la durée de vie est la plus courte en captivité avec 6 mois. En tant que vertébré, il possède une anatomie comparable à celle du rongeur en terme de tissus et de cellules présents. Une abondante littérature montre comment chez le mâle et la femelle, ce poisson présente un vieillissement systémique, là aussi comparable à celui des rongeurs et à l'Homme (sarcopénie, déclin cognitif ou maladies métaboliques). Pour toutes ces raisons, l'African Turquoise Killifish est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans des laboratoires académiques, de plus en plus nombreux, pour modéliser un large spectre de pathologies liées à l'âge, avec la possibilité d’une exploration fonctionnelle in vivo couplée à des études biologiques intégrées et à la caractérisation de sous-populations cellulaires ex vivo. Toutes les explorations et expérimentations seront réalisées sur poissons adultes puisque l'ensemble de la physiopathologie que nous étudions se développe à l'âge adulte.
Etude de l’effet de la clusterine sur la progression et la gravité de l’atteinte rénale dans un modèle murin de vascularite à ANCA
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Deux injections intraveineuses sous anesthésie à cinq jours d'intervalle, une injection intrapéritonéale sur animal vigile, trois prises de sang, 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs reins. Le modèle induit une dégradation progressive de la fonction rénale sur quinze jours, pour tester si une protéine, la clusterine, freine l'atteinte rénale dans une vascularite auto-immune. Le porteur présente le traitement visé comme moins invasif et plus spécifique que les immunosuppresseurs actuels, dont il rappelle les effets indésirables chez les patients. Sur les atteintes subies par les souris, il écrit qu'"aucune modification significative du bien-être animal n'a été décrite dans la littérature scientifique", alors que le protocole consiste à dégrader leurs reins.
Objectifs
Les vascularites sont un groupe de maladies auto-immunes touchant les petits vaisseaux. La prise en charge thérapeutique de ces pathologies est complexe. Elle repose sur des traitements immunosuppresseurs « lourds » , qui doivent être mis en place le plus rapidement possible pour éviter des séquelles rénales et pulmonaires,notamment ; elles-mêmes pouvant grandement impacter les chances de survie. En effet, le pronostic est relativement mauvais, puisque jusqu’à 30% des patients présenteront une insuffisance rénale chronique terminale, nécessitant une dialyse à vie, ou seront décédés à 5 ans du diagnostic. D’autre part, les traitements immunosuppresseurs, bien qu’efficaces, peuvent provoquer des effets indésirables sur le système cardio-vasculaire et considérablement accroître les infections et le développement de cancers chez le patient. Il est donc nécessaire de développer de nouveaux protocoles pour enrichir l’arsenal thérapeutique disponible et permettre une meilleure prise en charge des patients en diminuant les effets indésirables à long terme. L’objectif de ce travail est d’évaluer le potentiel de nouvelles thérapeuties ciblant des mécanismes cellulaires récemment décrits comme étant impliqués dans la physiopathologie des vascularites
Bénéfices attendus
Les vascularites sont des pathologies difficiles à prendre en charge. Cette étude permettra d’enrichir la compréhension de la maladie et d’améliorer l’arsenal thérapeutique grâce à un traitement moins invasif, plus spécifique et pouvant être débuté plus rapidement pour diminuer les séquelles. L'objectif est d'améliorer la condition de vie des patients, de diminuer le risque des effets secondaires et donc d’augmenter la survie des patients
Procédures
Pour chaque animal du projet, l'induction de la pathologie sera réalisée par une injection intraveineuse (< 1 minute) sous anesthésie générale (< 5 minutes) , suivie, cinq jours plus tard, d'une deuxième injection intraveineuse sous anesthésie générale, et d'une injection intrapéritonéale sur l'animal vigile. Une prise de sang sera réalisée sur chaque animal pour des analyses biochimiques, une semaine avant le début de la procédure, puis deux fois au cours des deux semaines suivantes, pendant l'induction de la pathologie. Afin de minimiser le stress lié à ces prélèvements (< 1 minute), les animaux seront anesthésiés (< 5 minutes). Des échantillons d'urine seront également collectés sur animaux vigiles au même moment, en les laissant uriner à leur convenance.
Impact sur les animaux
Le modèle induira une altération progressive de la fonction rénale sur les 15 jours d'induction de la pathologie. Aucune modification significative du bien-être animal n'a été décrite dans la littérature scientifique. Cependant, les souris seront au minimum trois fois par semaine par le personnel en charge des procédures, et le bien-être animal sera évalué selon une grille décrite dans chacune des procédures.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car les reins seront prélevés pour des analyses histologiques.
Remplacement
Les études in vitro ont permis de démontrer dans des systèmes cellulaires simples, l’efficacité de la molécule testée dans ce projet. Cependant, ces modèles ne permettent pas de restituer la complexité des interactions cellulaires au sein d’un organe et d’un organisme complet pour étudier l’efficacité thérapeutique de notre molécule dans un contexte aussi complexe que celui de la vascularite.
Réduction
Le nombre total d’animaux utilisés pour l’étude a été défini en fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables et fiables. Ce nombre constitue toutefois une estimation haute et pourra être ajusté à la baisse en fonction des résultats obtenus.
Raffinement
Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, afin d’éliminer ou de réduire au maximum toute angoisse, souffrance ou douleur selon des critères couramment utilisés en expérimentation animale et une grille de score décrite pour chaque procédure. Les animaux, 5 par cage de type 2L, seront hébergés dans une animalerie aux paramètres environnementaux contrôlés (portoirs ventilés). Un enrichissement de leur milieu par des tunnels, abris et objets à ronger, permettra de rétablir le répertoire comportemental des souris. L’entretien des animaux, et les gestes techniques effectués seront pris en charge par du personnel habilité et compétent. De plus, les sites d’injection et les prélèvements de sang seront alternés, permettant une cicatrisation des tissus Les plasmas, et organes prélevés post-mortem constituerons une tissuthèque pour des marquages tissulaires et des dosages biochimiques ultérieurs.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les espèces les plus couramment utilisées en recherche préclinique. Ceci est dû à la facilité d'introduire une modification génétique chez ces espèces, à la grande taille des portées, au temps de génération court et à la relative facilité d'hébergement et de soins. Les modèles de vascularites induits sont décrits dans la littérature chez le rat ou la souris. Un modèle murin a été privilégié car notre équipe a une expertise de travail chez cette espèce et le modèle de vascularite est déjà connu par l’un des chercheurs en charge des procédures, qui l’a déjà expérimenté chez notre équipe partenaire. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines afin d'avoir atteint un stade de développement adulte et d'avoir un poids adéquat (~20-25 g) pour être mises en expérimentation. Nous laissons une marge d’âge allant jusqu’à 10 semaines (pas plus) pour maintenir une homogénéité des poids. L’induction de la pathologie ainsi que le traitement des souris se dérouleront sur 4 semaines. L'induction de la pathologie a été démontrée chez des souris de cet âge.
Rôle des plaquettes dans les lésions rénales associées au diabète après arrêt de la circulation sanguine
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune passant cinq semaines entre l'induction d'un diabète et une opération qui prive ses deux reins de sang pendant vingt-deux à vingt-cinq minutes. Le diabète est provoqué par des injections répétées d'un composé qui détruit le pancréas, avec hyperglycémie, soif et urines abondantes, perte de poids et risque d'hypoglycémie. L'ouverture de l'abdomen et le clampage des vaisseaux rénaux entraînent une prostration, une fatigue importante et des douleurs post-opératoires que le porteur reconnaît malgré l'analgésie. Toutes seront tuées sous anesthésie après un prélèvement sanguin terminal, pour comprendre pourquoi les patients diabétiques opérés du cœur développent quatre fois plus souvent une insuffisance rénale grave.
Objectifs
Le diabète est une maladie très fréquente qui fragilise les vaisseaux sanguins de nombreux organes, en particulier les reins. Nous avons observé, à partir d’une cohorte de 11 000 patients opérés de chirurgie cardiaque, que les patients diabétiques ont quatre fois plus de risque de développer une maladie rénale sévère nécessitant une dialyse après l’intervention, à cause de l'arrêt de la circulation sanguine associée à cette chirurgie. Beaucoup d’entre eux évoluent ensuite vers une maladie rénale chronique, ce qui affecte profondément la qualité et l’espérance de vie des patients, et représente un lourd fardeau pour le système de santé. Actuellement, aucun traitement ne permet de prévenir la survenue d'une maladie rénale post-chirurgie cardiaque chez ces patients. Notre projet vise à comprendre pourquoi le diabète augmente autant ce risque. Nous nous intéressons particulièrement aux plaquettes, dont le rôle est de stopper les saignements. Ces cellules jouent aussi un rôle très important dans l’inflammation. Nous étudierons comment le diabète modifie leur fonctionnement et quels mécanismes pourraient jouer un rôle dans l’aggravation des lésions rénales lorsqu’un rein subit un épisode d’ischémie/reperfusion. Pour répondre à cette question, nous mènerons deux approches complémentaires : Une étude chez l’humain, basée sur nos observations cliniques, pour analyser les caractéristiques des patients diabétiques et mieux comprendre les mécanismes en jeu. Une étude expérimentale chez la souris, dans laquelle nous induirons un diabète puis une lésion rénale d’ischémie-reperfusion. Nous évaluerons la fonction rénale, l’activation des plaquettes, ainsi que l’inflammation et la fibrose (cicatrisation anormale) du rein. Nous utiliserons également des souris génétiquement modifiées afin d’altérer spécifiquement certaines fonctions des plaquettes. Cela nous permettra de déterminer précisément leur rôle dans l’aggravation des lésions rénales en contexte de diabète. À terme, ce projet permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour protéger les reins des patients diabétiques, réduire le recours à la dialyse et améliorer leur qualité et leur espérance de vie.
Bénéfices attendus
Les complications rénales aiguës après chirurgie cardiaque sont fréquentes et particulièrement sévères chez les patients diabétiques. À ce jour, il n’existe pas de stratégie spécifique permettant de réduire ce risque accru. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’aggravation des lésions rénales en contexte de diabète, en particulier le rôle des plaquettes. L’identification des voies plaquettaires impliquées pourrait ouvrir la voie au développement de stratégies thérapeutiques ciblées. À terme, ces travaux pourraient contribuer à réduire la sévérité des complications rénales chez les patients diabétiques exposés à une chirurgie cardiaque.
Procédures
(1) Une partie des animaux sera soumise à une induction de diabète par injections répétées d'un composé chimique qui détruit le pancréas. (2) Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 22–25 minutes sous analgésie et anesthésie. Ce protocole a une durée de 40 minutes. (3) Prélèvement de sang sur souris vigile, au niveau de la joue (30 secondes environ). (4) Prélèvement de sang terminal, < 1 min, sous anesthésie générale, sur un plateau chauffant ; suivi de l’euthanasie par une méthode réglementaire en vue des différents prélèvements et analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
L’induction du diabète par injections répétées d’une substance chimique détruisant le pancréas entraîne une augmentation du taux de sucre dans le sang associée à une augmentation de la soif et des urines, une perte de poids ainsi qu’une altération modérée de l’état général. Les injections répétées peuvent provoquer un stress transitoire lié à la contention et à la manipulation. Une hypoglycémie transitoire peut survenir dans les heures suivant les injections ; afin de prévenir une hypoglycémie sévère, une solution de sucre sera mise à disposition dans les cages pendant la période d’induction. Des variations individuelles de la réponse au traitement peuvent être observées. L’induction d’une maladie rénale par chirurgie entraîne une altération transitoire de l’état général et une prostration liée à une fatigue importante. La procédure chirurgicale repose sur une ouverture chirurgicale de l’abdomen permettant d’accéder aux reins, suivie de la pose de pinces temporaires sur les vaisseaux sanguins apportant du sang aux reins afin de suspendre temporairement la circulation sanguine. Malgré une prise en charge optimale de l’analgésie, des douleurs post-opératoires peuvent survenir : (1) douleur liée à la chirurgie (anesthésie, analgésie, incision cutanée médiane, ouverture des plans musculaires, pose des clamps, sutures) ; (2) complications potentielles liées à l’anesthésie (difficultés respiratoires, modifications du rythme cardiaque, baisse de la température corporelle) ; (3) altération de l’état général avec perte de poids et déshydratation ; (4) stress lié aux manipulations répétées (surveillance clinique, pesées). Ces nuisances ne peuvent pas être totalement évitées, car l’induction du diabète et la chirurgie sont indispensables pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Un suivi clinique rapproché et des mesures adaptées seront mis en œuvre afin de limiter au maximum la douleur et la souffrance des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée. Les différents prélèvements nécessaires pour les analyses sont réalisés après constatation de la mort par une personne expérimentée. Durée de la procédure 5 semaines.
Remplacement
En raison notamment de la complexité du tissu rénal et de sa circulation (dizaines de types cellulaires), ainsi que de la fragilité des plaquettes, et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organes en culture (organoïdes), l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative basée sur des cultures cellulaires (in vitro) pour analyser l’évolution de la défaillance chronique progressive d’organes.
Réduction
Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer la variabilité entre individus de la maladie rénale avec ce protocole. Afin d’obtenir des résultats robustes pour détecter des différences entre groupes et garantir la reproductibilité des résultats, des effectifs de 10 animaux par groupe sont nécessaires. Le calcul des effectifs a été réalisé à l’aide du module statistique du site EDA (Experimental Design Assistant), en prenant comme paramètre principal le débit de filtration glomérulaire (capacité du rein a filtré dle sang). Chaque procédure sera répétée deux fois sur des cohortes indépendantes. Le nombre total d’animaux utilisés est de 400 souris. Les analyses statistiques seront réalisées avec des tests adaptés.
Raffinement
Les nuisances seront réduites au maximum grâce à des mesures de raffinement adaptées. Les conditions d’hébergement respectent la réglementation en vigueur pour la souris. Les animaux sont surveillés quotidiennement par du personnel qualifié. Leur bien-être est assuré par un environnement enrichi comprenant une litière adaptés, des objets (morceaux de bois) à ronger et un abri dans chaque cage. Les actes chirurgicaux sont réalisés sous anesthésie et avec une prise en charge de la douleur avant et après l’intervention. Les souris sont placées en couveuse pendant le réveil puis replacées dans leur cage d’origine. De la nourriture gelifiée est également mise à disposition pour faciliter l’alimentation. En dehors d’une courte période d’isolement de deux heures en couveuse (nécessaire pour préserver des dispositifs de mesure de la fonction rénale), les animaux restent dans leur cage d’origine, dans leurs groupes habituels. Une surveillance quotidienne de l’état général et de la motricité est réalisée, avec une pesée régulière tout au long du protocole. Des points limites ont été définis (perte de poids, paralysie, saignements, prostration, altération du pelage, infection post-chirurgicale). Les injections sont réalisées avec des aiguilles fines afin de limiter la douleur et le risque de saignement. Les complications liées à l’anesthésie (troubles respiratoires, arrêt cardiaque, baisse de température) sont limitées par une surveillance adaptée et l’utilisation d’un plateau chauffant.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car : - modèles d’ischémie/reperfusion bilatérale et de diabète bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire ; - nombreuses données relatives au projet déjà disponibles dans la littérature scientifique, plus que dans d’autres espèces ; - possibilité de tester l’implication des plaquettes et des protéines d’intérêt dans cette étude grâce à des modèles de souris génétiquement modifiées. À l’âge de 8 semaines, ces souris sont adultes et leurs reins fonctionnent bien. Des animaux jeunes sont utilisés pour éviter l’accumulation de graisse autour des vaisseaux du rein, afin de faciliter la procédure chirurgicale.
Immunophénotypage et étude des mécanismes physiopathologiques de la myocardite aiguë auto-immune.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
280 souris de six à huit semaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une myocardite auto-immune est déclenchée chez 224 d'entre elles par injection d'une protéine du muscle cardiaque, puis viennent des injections répétées dans l'abdomen, un prélèvement de sang à la mandibule et trois échographies du cœur sous anesthésie, avec épilation à la crème. Le porteur cherche à préciser le rôle d'une protéine sanguine dans la fibrose et la dilatation du cœur qui suivent l'inflammation. Il rappelle qu'aucun traitement spécifique n'existe et que les dernières études menées chez l'humain n'ont rien donné, et renvoie l'intérêt thérapeutique de sa cible à de futures études spécifiques.
Objectifs
Ce projet de recherche vise à mieux comprendre une maladie inflammatoire du cœur appelée myocardite. La myocardite correspond à une inflammation du muscle cardiaque qui peut, dans certains cas, entraîner une dilatation du cœur et une diminution de sa capacité à pomper le sang. Elle représente une cause majeure de mort subite du sujet jeune. L’impact sur la qualité de vie est important, avec un quart des patients qui développent une dilatation du cœur (on parle de cardiomyopathie dilatée) avec une insuffisance cardiaque. Cette dilatation est souvent le fait de la cicatrisation après l’inflammation, appelée fibrose. Il n’existe pas de marqueur permettant de cibler cette fibrose ou de prévenir cette dilatation du cœur après cette inflammation aiguë. Une étude préliminaire a permis d’identifier un rôle potentiel d’une protéine du sang qui intéragit avec le cœur. L’objectif de ce travail est de préciser le rôle de cette protéine sur la survenue des processus cicatriciels (fibrose), la survenue d’une dilatation du cœur et d’une insuffisance cardiaque associée. Pour étudier cette pathologie, des souris adultes de laboratoire seront utilisées. Chez une partie des animaux, une myocardite sera provoquée en stimulant leur système immunitaire avec une protéine provenant du muscle cardiaque. D’autres souris serviront de groupe de comparaison et ne développeront pas cette maladie. Certains animaux recevront également un traitement expérimental par un anticorps. L’objectif est de déterminer si ce traitement peut modifier l’évolution de la maladie. Chaque semaine, les animaux seront suivis attentivement afin de détecter tout signe d’inconfort. Des echographies cardiaques seront réalisées sous anesthésie pour observer le fonctionnement cardiaque. À la fin de l’étude, des analyses biologiques permettront de mieux comprendre les effets de la maladie et du traitement sur le cœur.
Bénéfices attendus
Il n’existe à ce jour pas de traitement spécifique de la myocardite aiguë, pathologie inflammatoire du muscle cardiaque. Les dernières études réalisées chez l’hommes se sont avérées négatives. Les bénéfices attendus de cette étude sont les suivants : 1. A court terme • identifier des cibles cellulaires impliquées dans la dilatation du cœur, l’insuffisance cardiaque, la fibrose • Préciser le rôle d'une protéine d'intérêt dans le processus de dilatation du cœur, d’insuffisance cardiaque et de fibrose après une myocardite aiguë 2. A long terme, cette étude conduira à une évaluation de l’intérêt thérapeutique potentiel de cibler les cellules et notre proteine d'intérêt dans la myocardite aiguë afin de prévenir la dilatation du cœur, l’insuffisance cardiaque et/ou la fibrose par le biais d’études spécifiques.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Injections intrapéritonéales : Ce sont des interventions sur animaux vigiles qui n'excèdent pas plus de 30 sec qui sont répétées avec plusieurs jours d'intervalle au long de la procédure. Elles permettent d'administrer les molécules et les anesthésiques. 2) Prélèvement unique de sang à la mandibule sous anesthésie : C'est un geste qui n'excède pas plus de 5 min. 3) Echographies cardiaques sous anesthésie : les animaux sont endormis durant la durée de l'échographie. Le temps de mesure est de maximum 10min. Pour cet examen, les animaux sont épilés avec une crème épilatoire. 3 échographies sont prévues pour ce projet.
Impact sur les animaux
Au cours du projet, les animaux seront soumis à une contention, des injections intrapéritonéales et intraveineuses pouvant toutes entraîner un stress. Un prélèvement de sang sub-mandibulaire est également prévu et peut générer une douleur légère ainsi qu’un stress. Des échographies hebdomadaires (nécessitant une anesthésie faible) provoqueront un stress chez l’animal de fait de la contention au moment de l’anesthésie.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin de prelever les différents organes à analyser
Remplacement
La myocardite est une maladie inflammatoire du muscle du cœur pouvant aboutir à un défaut de fonction du cœur (insuffisance cardiaque), une dilatation du cœur. C’est une maladie qui peut également aboutir au décès. Il est difficile de prélever le muscle du cœur chez l’homme à cause du risque de complications liés à la procédure qui peut entraîner des complications sévères. Dans le cas où le muscle du cœur est prélevé, il s’agit de petits échantillons qui ne permettent pas toujours de mesurer correctement l’étendue de l’inflammation. Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n’existe pour l’heure aucune autre technique que l’expérimentation in vivo pour réaliser les procédures expérimentales prévues dans ce projet. Il n’existe pas d’autre modèle permettant de reproduire les organes complexes, leur interaction et leur effet sur le corps entier. Le modèle de souris a été retenu pour sa ressemblance avec la présentation clinique humaine. Il a régulièrement été étudié et publié lors d’études sur la myocardite, et il s’agit d’un modèle maîtrisé par le laboratoire.
Réduction
Le protocole comprend 4 groupes expérimentaux organisés selon un plan factoriel 2×2 : myocardite auto-immune avec ou sans traitement par anticorps, et groupes contrôles avec ou sans traitement par anticorps. Les groupes sont les suivants : 1. Myocardite auto-immune avec injection d’anticorps 2. Myocardite auto-immune sans injection d’anticorps 3. Contrôles sans myocardite avec injection d’anticorps. 4. Contrôles sans myocardite sans injection d’anticorps Aussi, la répartition finale sera la suivante : Groupe 1 : 112 animaux, Groupe 2 : 112 animaux, Groupe 3 : 28 animaux, Groupe 4 : 28 animaux. Au total, 280 animaux seront nécessaires au projet.
Raffinement
Les mesures prévues ont pour objectif de réduire autant que possible la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout au long de l’étude. Les échographies seront réalisées sous anesthésie légère afin que les animaux ne ressentent pas de gêne. Avant cet examen, ils seront installés dans la salle concernée pendant deux heures pour leur laisser le temps de s’habituer à l’environnement et ainsi diminuer leur stress. Les prises de sang seront effectuées par du personnel formé et expérimenté, avec du matériel adapté, en respectant des volumes limités pour préserver le bien-être des animaux. Leur nombre sera réduit au strict nécessaire.Des critères de surveillance précis seront appliqués afin de repérer rapidement tout signe de souffrance ou de dégradation de l’état de santé. Si l’un de ces critères est atteint, des mesures immédiates seront prises pour éviter toute souffrance prolongée.À la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale, de manière à éviter toute douleur ou détresse.
Choix des espèces
Les souris sont le modèle le plus adapté pour cette étude sur la myocardite auto-immune, car cette espèce est largement utilisée et bien connue pour comprendre les réactions du système immunitaire et leurs effets sur le cœur. Les objectifs de l’étude ne peuvent pas être atteints par des méthodes alternatives, comme des cultures cellulaires ou des simulations informatiques, car il est nécessaire d’observer l’ensemble des interactions entre le système immunitaire, le cœur et l’évolution de la maladie dans un organisme vivant. La souris est également l’espèce la plus appropriée car elle permet d’obtenir des résultats robustes tout en limitant les contraintes d’élevage et l’impact sur le bien-être animal par rapport à des animaux de plus grande taille. Les expériences seront menées sur des souris jeunes adultes âgées de 6 à 8 semaines. À cet âge, leur système immunitaire est pleinement développé, tout en restant stable, ce qui permet d’obtenir des résultats comparables et reproductibles. Utiliser des animaux plus jeunes ou plus âgés pourrait modifier la réponse immunitaire et introduire davantage de variabilité dans les résultats.
Dynamique des protéomes des cellules B au cours de l’auto-immunité et des traitements immunothérapeutiques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
Les souris de ce projet développent spontanément un lupus vers six mois, avec des auto-anticorps qui se déposent dans leurs reins et une évolution vers la défaillance rénale sur un an. 1 544 d'entre elles vont être utilisées, 1 124 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 420 dans des procédures d'un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Elles reçoivent des injections à jours fixes pendant six mois, subissent des prélèvements de sang et des séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse, et près d'un tiers développe une inflammation de la peau aux points d'injection ou de prélèvement. Le porteur qualifie ces procédures d'"indolores" et parle d'un "léger inconfort", alors que la maladie qu'il laisse s'installer conduit ces souris à l'insuffisance rénale.
Objectifs
Ce projet de recherche a pour but d’étudier en détail les changements et adaptations de certaines cellules issues de différents organes pendant l'évolution d’une maladie auto-immune, le lupus érythémateux systémique (LES), et lors de son traitement par immunothérapie. Le LES est une maladie grave où le système immunitaire, permet pour des raisons encore méconnus le développement des anticorps dirigés contre des protéines de l’organisme par des cellules immunitaires appelées lymphocytes B, des « autoanticorps ». Ceux-ci se déposent principalement dans les reins et la peau et peuvent causer des inflammations de la peau et/ou des atteintes rénales. Malgré les traitements existants, de nombreux patients ne répondent pas bien à ces médicaments, et d’autres développement une résistance au traitement après un certain temps, rendant le traitement inefficace. Aujourd’hui, il est encore impossible de prédire quels patients vont développer des complications graves. Et nous commençons seulement à comprendre pourquoi certains traitements cessent de fonctionner. Notre objectif est de répondre à ces questions et de décrypter les mécanismes de la maladie en observant par des méthodes de pointes les caractéristiques des lymphocytes B évolue au fil du temps, et comment elles réagissent réagit aux traitements. Nous anticipons que ce projet permettra d’identifier des marqueurs précoces de la maladie et des échecs thérapeutiques, permettant une prise en charge plus rapide et mieux adaptée.
Bénéfices attendus
Ce projet va conduire à une meilleure compréhension de l’évolution des différentes populations des cellules immunitaires dans le lupus érythémateux systémique (LES) et des effets des immunothérapies sur ces populations. À terme, cette recherche pourrait permettre de : - développer des traitements plus efficaces notamment pour les patients qui ne répondent pas aux médicaments actuels. - réduire les effets secondaires en ciblant plus précisément les cellules responsables de la maladie. - mieux prédire l’évolution de la maladie grâce à des marqueurs biologiques Ainsi, ce projet devrait sur le long terme contribuer à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes en limitant les poussées inflammatoires et les dommages aux organes.
Procédures
Dans toutes les procédures : L’évaluation de souris implique : - Une observation des animaux sans intervention (2 minutes) - Placement de l’animal (2-3 secondes) dans une boite en plastique jusqu’à la miction. - Transfert de l’animal dans une boite d’anesthésie gazeuse (2-3 secondes) - Pesée de l’animal anesthésié (3 secondes) - Prélèvement de sang sur animal anesthésié (15 secondes). - Dans le cadre de la deuxième procédure, les animaux déjà anesthésiés pour l’évaluation de routine vont en plus recevoir des injections à jours 0,14,28 ensuite tous les 28 jours pendant 6 mois (durée de quelques secondes à chaque fois). Expérience impliquant l’imagerie sur animal vivant : - Transfert de l’animal dans une boite pour l’anesthésie (2-3 secondes) - Injection (quelques secondes) - Installation de l’animal dans l’appareil d’imagerie (5-10 secondes avec maintien de l’anesthésie) - Prise d’image 5-10 minutes
Impact sur les animaux
S’agissant d’un modèle spontané de lupus érythémateux systémique (LES), les souris vont développer progressivement la pathologie autour de l’âge de 6 mois. Dans la suite, la maladie touchera essentiellement les reins. La pathologie se développe sur un an cumulant dans une défaillance rénale. Autre que l’implication rénale, une inflammation spontanée de la peau peut se développer dans une partie (30%) de ces souris, surtout au niveau des sites d’injections ou de prélèvements. Celle-ci va être traitée par des analgésiques locaux selon les conseils des vétérinaires. Les manipulations liées à des procédures sont des très courtes durées et induisent qu’un léger inconfort chez les souris. Plus précisément sont prévues des prélèvements de sang sur animal anesthésié (15 secondes) et dans le cadre de la deuxième procédure, des injections sur des animaux déjà anesthésiés (durée de quelques secondes). L’anesthésie peut provoquer quelques secondes d’angoisse aux moments de l’endormissement et du réveil.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes vitaux et pourront donc être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
La pathologie et les thérapies qui vont être étudiées ici résultent de réactions systémiques et impliquent des conséquences au niveau de différents tissus et organes. Ces processus sont complexes, reposant sur les singularités du système immunitaire et des tissus touchés par des dépôts de complexes immuns, processus qui ne peuvent pas être reproduits in vitro. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinent.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé avec l’objectif de réduire ce nombre autant que possible tout en minimisant le « bruit de fond » inhérent à la recherche biologique in vivo. Ce nombre inclut le nombre nécessaire de contrôles et la nécessité de reproduire les résultats. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental.
Raffinement
Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Cela se traduit par : Un suivi rigoureux tout au long de la vie de l’animal : Les animaux seront évalués régulièrement et avec une fréquence croissante selon leur âge pour des signes évoquant un lupus érythémateux systémique (LES) : Lors de ces évaluations nous observons les souris pour les postures et comportements qui pourraient traduire de la douleur, du stress ou de l’inconfort. Nous utiliserons une grille d’évaluation standardisée pour détecter précocement tout signe de détresse et nous mettrons en place des actions pour minimiser toute forme de souffrance pour l’animal. Nous mesurons leurs poids, et suivons différents paramètres dans le sang et l’urine. Cela nous permet d’établir des points limites précis (nécessitant la mise à mort de l’animal) pour chaque procédure, limitant ainsi au maximum une souffrance inutile des animaux. Des procédures indolores : - Les manipulations sont limitées au strict minimum avec le but de minimiser l’angoisse et le stress ressenti par l’animal. Les animaux seront anesthésiés pour les prélèvements sanguins.
Choix des espèces
L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Même si le système immunitaire des souris n’est pas identique à celui des humains, ces animaux constituent des modèles fiables et largement utilisés pour étudier des maladies complexes comme celle étudiée ici. Leur utilisation permet de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et l’induction de la résistance aux traitements. Dans ce projet, nous utiliserons uniquement des souris adultes, âgées de 4 à 12 mois. Ce choix est motivé par le fait que la maladie étudiée se développe naturellement avec l’âge chez les souris, comme chez les humains. Les premiers signes immunologiques, l’apparition d’auto-anticorps, n’apparaissent qu’à partir de 4-6 mois. Utiliser des animaux plus jeunes ne permettrait pas d’étudier la maladie, car elle n’est pas encore déclarée. Les mécanismes immunitaires que nous voulons observer ne sont pleinement actifs qu’à l’âge adulte. Les organes cibles (reins) ne présentent des lésions qu’à un stade avancé de la maladie, soit vers 8 à 12 mois. Finalement, les résistances aux traitements se développent avec le temps, qui nécessite un suivi de souris sur plusieurs mois.
Étude du dérèglement du système immunitaire dans les maladies du sang
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris de ce projet reçoivent des cellules modifiées en laboratoire qui déclenchent chez elles une maladie de la moelle osseuse, avec anémie, grosse rate, baisse d'activité et perte de poids progressive. 2 190 souris vont être exploitées, 930 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 1 260 dans des procédures d'un niveau modéré. Une irradiation prépare la prise de greffe, un morceau d'oreille est prélevé pour le génotypage, un prélèvement sanguin suit l'évolution de la maladie, et les animaux immunodéprimés sont maintenus en cages individuelles ventilées. Sur le remplacement, le porteur affirme que l'étude de cette maladie du sang exige un "organisme entier", et toutes les souris sont tuées au terme du projet, une partie seulement après avoir servi à ses étapes ultérieures.
Objectifs
La myélofibrose (MF) est une maladie chronique de la moelle osseuse caractérisée par une cicatrisation progressive de la moelle, un dysfonctionnement des cellules souches sanguines et une prolifération anormale de certains types de cellules sanguines. Cette étude utilise un modèle murin de MF afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans la maladie. Nous nous intéressons en particulier à l’influence de certaines protéines liées à l’inflammation sur le développement de la MF. Les résultats de cette recherche pourraient permettre d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ralentir l’évolution de la maladie et améliorer la prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
La myélofibrose (MF) est une maladie grave de la moelle osseuse qui réduit fortement l’espérance de vie des patients. Les traitements actuels ne permettent pas de stopper complètement la progression de la maladie ni de restaurer la production normale de cellules sanguines, et certains patients peuvent développer une leucémie incurable. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes qui participent à la progression de la MF en ciblant plus particulièrement l’inflammation et un déséquilibre dans le métabolisme des protéines, l’objectif étant de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la production de cellules sanguines normales. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de limiter la progression de la MF, améliorer les symptômes des patients, et ouvrir la voie à des traitements plus efficaces, voire potentiellement curatifs.
Procédures
Les souris recevront une irradiation unique de courte durée, d’intensité modérée, afin de permettre la prise de greffe des cellules transplantées. Elles recevront ensuite une injection unique de cellules. Un prélèvement sanguin sera réalisé au cours de l’expérimentation afin d’évaluer l’évolution de la maladie.Prélèvement de sang : 5 s
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent être observés chez les animaux. Les principaux effets attendus sont les suivants : • Stress léger et douleur mineure liés aux manipulations : la contention, les injections et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress transitoire et une gêne modérée et de courte durée. • Gêne locale liée au prélèvement de biopsie pour génotypage : un petit prélèvement de tissu (oreille) réalisé afin de déterminer le profil génétique des animaux peut occasionner une douleur légère et transitoire ainsi qu’un stress bref. • Développement progressif d’une maladie expérimentale du sang: les souris recevant des cellules modifiées en laboratoire peuvent présenter une altération de l’état général, une splénomégalie, une diminution des globules rouges (anémie), une réduction de l’activité ou une perte de poids progressive, caractéristiques de ce modèle expérimental.
Devenir
À l’issue de la première étape du projet, une partie des animaux sera maintenue en vie afin de poursuivre les travaux expérimentaux ultérieurs. Les autres animaux seront mis à mort conformément à la réglementation en vigueur. À la fin des étapes suivantes du projet, les animaux seront mis à mort afin de permettre l’analyse des organes et des cellules nécessaires à l’étude de la maladie sanguine modélisée dans ce projet.
Remplacement
Remplacer: certaines expériences préliminaires ont été réalisées sur des cellules en culture lorsque cela était possible. Cependant, l’étude de cette maladie du sang nécessite un organisme entier afin de comprendre son évolution et ses effets sur différents organes.
Réduction
Réduire: le nombre d’animaux a été strictement calculé afin d’obtenir des résultats fiables tout en évitant l’utilisation d’animaux supplémentaires. Lorsque cela est possible, plusieurs analyses seront réalisées à partir des mêmes animaux.
Raffinement
Raffiner: les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien par du personnel qualifié. Des mesures de soutien seront mises en place si nécessaire (hydratation complémentaire, enrichissement alimentaire). Des critères d’arrêt précis permettront d’éviter toute souffrance prolongée, et les animaux seront hébergés dans des conditions adaptées à leurs besoins physiologiques et comportementaux.Les animaux immunodéprimés seront hébergés dans des cages individuelles ventilées, permettant de maintenir un environnement contrôlé et filtré. Ce système limite leur exposition aux agents pathogènes présents dans l’environnement et contribue ainsi à leur protection et à leur bien-être tout au long de l’étude.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car sa similitude génétique et physiologique avec l’Homme permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et d’en tirer des conclusions pertinentes pour la santé humaine. De plus, de nombreux outils expérimentaux, comme les anticorps ou les techniques d’imagerie, sont disponibles pour travailler avec les souris. Le modèle de souris que nous utilisons est bien caractérisé dans la littérature ainsi que dans notre centre de recherche. Il est particulièrement adapté à l’étude de la myélofibrose, car il reproduit de manière fiable les principales caractéristiques de la maladie, comme la fibrose de la moelle osseuse, les anomalies de la production sanguine et l’inflammation. Les souris mâles et femelles seront utilisées à partir de 12 semaines, soit l’âge adulte, lorsque leur système immunitaire est pleinement développé.
Barrière immunitaire aux produits de thérapie génique : mécanismes et nouvelles stratégies d’évitement chez la souris MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
5 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures que le porteur déclare intégralement en gravité légère. Chacune reçoit deux à quatre injections, dont une de cellules immunitaires et une du vecteur de thérapie génique, puis subit jusqu'à neuf prélèvements sanguins étalés sur six mois. Elles sont tuées pour analyser les lymphocytes dans le sang, la rate, les ganglions, le foie et les muscles, et une perte de poids supérieure à 20 % déclenche la mise à mort. Pour justifier de ne pas anesthésier certains gestes, le porteur note que ces injections "sont pratiquées chez l'homme sans anesthésie, ni administration d'analgésique".
Objectifs
Les vecteurs dérivés de virus adéno-associés (AAV) sont les plus utilisés en thérapie génique dans le traitement des maladies génétiques. Ces vecteurs sont bien tolérés chez l’homme, et leur bénéfice thérapeutique est tel que plusieurs d’entre eux ont reçu des autorisations de mise sur le marché. Cependant, quelques barrières subsistent et viennent limiter leur efficacité et leur utilisation. L’une d’entre elles est la barrière de la réponse immunitaire. En effet, notre système immunitaire a pour fonction de préserver l’intégrité de l'organisme en éliminant les éléments qui viendraient perturber trop fortement l’équilibre maintenu avec notre environnement. Il est ainsi logique que l’administration du vecteur de thérapie génique d’origine virale, puisse pâtir d’une réponse immunitaire qui tente de contrôler voire d’éliminer le produit injecté. Fort heureusement, certaines stratégies basées sur la modification des composants du vecteur ainsi que sur l’utilisation de médicaments immunomodulateurs visant à réduire la réponse immunitaire, peuvent atténuer ces effets immuns délétères en induisant une tolérance immune permettant ainsi un bénéfice thérapeutique pour le patient. Toutefois, ces stratégies sont encore mal maîtrisées. Afin d’élargir l’application de ces traitements au plus grand nombre de patients et de maladies génétiques différentes, notre projet vise, chez la souris, à caractériser certains paramètres impliqués dans l’établissement d’une tolérance immune à l’encontre des vecteurs AAV et à développer des co-traitements immunomodulateurs plus efficaces et moins toxiques pour le patient. Plus spécifiquement, nous étudierons à l’aide de différents modèles de souris les cellules de l’immunité que sont les lymphocytes T et B, et le rôle du ciblage par les vecteurs AAV de certains tissus tels le foie ou le muscle dans la balance immunité/tolérance.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de clarifier certains aspects de la tolérance immunitaire vis à vis des vecteurs AAV en disséquant les réponses lymphocytaires qui sont induites de manière différentielle en fonction du tissu et des cellules ciblées par le vecteur. Il permettra aussi de définir les caractéristiques du vecteur AAV qui peuvent diminuer la réponse immunitaire, et idéalement, induire une tolérance robuste. Enfin, il permettra de proposer de nouveaux traitements immunosuppresseurs adaptées à ces traitements AAV innovants. Comme nous l’avons fait depuis 20 ans, les résultats que nous obtiendrons seront rapidement publiés dans des revues internationales afin de renforcer la connaissance de la communauté scientifique sur le sujet et, le cas échéant, d’accélérer le passage en phase préclinique de certains vecteurs AAV développés par notre institution ou par d’autres.
Procédures
__ Partie 1 du projet : Les souris receverons deux injections: 1x injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse, suivie après 24 heures par 1x injection du vecteur médicament AAV (intraveineuse ou intramusculaire). Les souris seront ensuite suivies sur une période allant de 2 semaines (avec 2 prélèvements de sang), à 6 mois (avec 9 prélèvements de sang). __Partie 2 Les souris receverons trois injections: 1x injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse, 1x injection du vecteur médicament AAV après 24 heures (intraveineuse ou intramusculaire), et 1x injection après quelques semaines (voie sous-cutanée ou intradermique). Les prélèvements de sang seront bimensuels pour le 1er mois (2x); ensuite mensuels. Leur nombre total sera défini par le temps de suivi qui sera choisi en fonction des résultats de la partie 1. __Partie 3 Les souris receverons trois injections : 1x Injection de cellules immunitaires au niveau de la veine caudale, 1x injection du vecteur médicament AAV (veine caudale ou voie intramusculaire), 1x Injection de cellules à tolériser au niveau de la veine caudale. Prélèvements de sang hebdomadaires sur 1 mois (4x), puis plus espacées jusqu’à la fin. __Partie 4 Les souris receverons d’abord deux injections : 1x Injection de lymphocytes (intraveineuse), 1x injection du vecteur médicament AAV (intraveineuse ou intramusculaire) Avant ou après l’injection du vecteur, injections répétées par voie intrapéritonéale d’agents immunomodulateurs. Le nombre de ces injections variera en fonction des agents. Par exemple : 3 à 5 fois/ semaine pendant 1 à 3 semaines pour le methotrexate (3 à 15x en tout). Prélèvements de sang mensuels sur 6 mois (6x). __Partie 5 Mêmes interventions que les parties 1 à 4, mais réalisés sur des males.__ Injections intraveineuses (veine caudale), intrapéritonéales et sous-cutanées effectuées sur animal vigile, durée
Impact sur les animaux
Les gestes techniques pratiqués (injections intraveineuse, sous-cutanée, intrapéritonéale, prélèvement de sang) pourraient conduire à de faibles nuisances pour l’animal, tel qu’un stress léger et une douleur aigue de très courte durée. Les administrations intramusculaires et intradermique, sous anesthésie légère, seront sans douleur. Lors de nos études précédentes, aucun effet indésirable ou toxicité n’ont été observés chez les animaux traités par les vecteur-médicaments AAV ou des cellules immunitaires
Devenir
L’étude de la réponse immunitaire passe par l’analyse des populations lymphocytaires dans différents tissus (sang, rate, ganglions, foie…) et l’analyse de l’efficacité du traitement par rAAV (sur les muscles notamment). L’analyse de ces tissus (sauf le sang) ne peut se faire que sur animaux préalablement mis à mort. De ce fait, dans chaque procédure, les animaux seront tous mis à mort.
Remplacement
Les réponses immunes sont la résultante d’interactions complexes impliquant de multiples types cellulaires et se déroulant dans plusieurs organes (rate, ganglions lymphatiques, moelle osseuse, foie, muscle etc…) et avec des cinétiques particulières. Ainsi, seuls les animaux sont capables de mimer la complexité de la réponse immune et il n’existe pour le moment aucune méthode substitutive.
Réduction
(1) Afin d’utiliser un minimum d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée, nous avons utilisé une approche statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir un résultat significatif. Ce nombre est respecté pour chaque procédure. (2) Dès que possible, nous effectuerons un suivi longitudinal de la réponse immune par prélèvement de sang sur les mêmes individus. Sur x point de temps, cela réduit le nombre d’animaux utilisés d’un facteur x. (3) De plus, sur les mêmes individus, nous analysons le maximum de tissus des animaux post-mortem afin de collecter le maximum d’informations sur chaque animal. (4) Dans la plupart des procédures, nous avons évité de répliquer les groupes contrôles en testant les vecteur-médicaments AAV deux par deux. Ceci réduit le nombre total de souris contrôles d’un facteur 2. Il n’est pas possible de tester plus de 2 vecteurs à la fois pour des raisons pratiques de lourdeur expérimentale.
Raffinement
De manière générale, les expérimentateurs qui travailleront sur ce projet ont en plus de leurs formations plusieurs années d’expériences quant à la manipulation des souris. Ils sont donc très sensibilisés au bien-être animal, ce qui permet de facto de limiter stress et angoisse des animaux afférents par exemple aux simples gestes de contentions. Durant les expériences, nous utiliserons des méthodes expérimentales adaptées par exemple lors des prélèvements de sang (anesthésie préalable, application éventuelle d’une compresse pour stopper d’éventuels saignements) ou lors de l’administration des produits (administration d’anesthésiques préalable pour les injections intramusculaires et intradermiques, suivi vigilant de l’état des animaux). Il est à noter que ces types d’injection classiques sont pratiquées chez l’homme sans anesthésie, ni administration d’analgésique. L’endormissement plus ou moins profond de l’animal permet la réalisation du geste expérimental sans que celui-ci ne bouge et puisse se blesser. Après toute intervention, les animaux seront quand même observés avec attention de façon quotidienne. Si des signes d‘inconfort ou de douleur venaient à apparaitre, l’animal sera surveillé plus fréquemment et pesé. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera euthanasiée.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain, faisant du modèle murin le modèle de référence pour les analyses des complexes réponses immunes, se déroulant via de nombreux types cellules et dans divers organes. Il bénéficie en outre de l’existence de nombreuses souches modifiées pour des éléments du système immunitaire, permettant d’en analyser le rôle. Chez la souris, le système immunitaire est considéré comme adulte à partir de 6 semaines d’âge. Nous utiliserons donc majoritairement des souris jeunes adultes de 6-12 semaines pour étudier les réponses immunes d’organismes adultes. Les souris seront analysées et/ou euthanasiées entre 6 semaines et 6 mois afin d’évaluer les réponses immunitaires précoces et tardives, respectivement. Le cas échéant, des évaluations à plus long-terme pourraient être menées.
Étude préclinique de nouvelles thérapies dans les maladies auto-immunes, les maladies rares et en oncologie chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une partie des souris utilisées sont des NSG, dépourvues de système immunitaire fonctionnel, ce que le porteur nomme un "phénotype dommageable". 2 184 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par dislocation cervicale pour prélèvement d'organes. Les interventions déclarées se résument à une ou deux injections, quatre prélèvements sanguins sur animal éveillé et un prélèvement sous anesthésie, réparties entre deux établissements. Le porteur admet que l'une des procédures "peut induire des douleurs non prévues" parce que la toxicité des molécules testées n'est pas connue, sans en dire davantage sur le contenu de ces études d'oncologie et de maladies auto-immunes.
Objectifs
L’objectif de cette étude est de développer de nouvelles molécules innovantes pouvant être utilisées pour le traitement de maladies auto-immunes ou dans le cadre du cancer. L’objectif principal sera donc de réaliser, chez la souris, une analyse toxicologique de ces molécules mais également étudier leurs effets sur le développement de différents types de cancer chez la souris. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs, ; les deux premières procédures, dans le premier établissement utilisateur et les trois dernières dans le deuxième établissement utilisateur.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à déterminer si les molécules innovantes nouvellement identifiées permettent notamment d’inhiber ou de ralentir le développement de différents types de tumeurs chez la souris. L’ensemble des résultats obtenus sera crucial pour envisager l’utilisation de ces molécules en clinique chez l’homme.
Procédures
1 ou 2 injections (
Impact sur les animaux
Les procédures correspondantes au projet peuvent induire du stress et une angoisse liés à la manipulation/ contention des animaux. Les prises de sang effectuées ainsi que les injections de traitements peuvent induire un inconfort, une angoisse et une douleur légère de courte durée chez celles-ci. Une des procédures peut induire des douleurs non prévues, inhérentes au fait que la toxicité des nouvelles molécules n'est pas connue. Les manipulations des souris lors des prises de sang effectuées peuvent induire un inconfort, une angoisse et une douleur de courte durée chez celles-ci. L'utilisation d'un phénotype dommageable, les souris NSG.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale, des prélèvements d'organes sont réalisés sur ces animaux et des analyses ex-vivo sont effectuées sur ces derniers.
Remplacement
L'évaluation préclinique est une étape importante dans le développement d'un médicament avant son utilisation en clinique. Avant l’expérimentation sur animal, les molécules sont testées au préalable sur différents modèles bio-informatiques (modélisation des structures des molécules et d'affinités pour les cibles thérapeutiques choisies) in vitro (lignées de cellules tumorales et cellules non tumorales) afin d’évaluer leur activité. L'utilisation du modèle souris permet l’étude de différentes pathologies in vivo. Afin de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, il est nécessaire d’avoir recours à des organismes modèles de l’Homme. L’utilisation de modèles de souris permet d’étudier la physiologie de ces pathologies au sein d’un organisme vivant dans tout son ensemble.
Réduction
Le nombre de souris correspond au nombre minimal requis pour avoir une différence significative de réponse biologique entre les différents groupes. Dans les procédures expérimentales définies (études précliniques de pharmacocinétiques, de toxicité et d'efficacité), les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans un milieu enrichi et amélioré. Des analgésiques peuvent être administrés aux souris. L’utilisation d’une grille unique de score est mise en place ainsi que l'application de points limites stricts et spécifiques au projet. La grille de score est décrite dans chacune des procédures L’aspect général des animaux ainsi que le suivi pondéral seront transcrits dans la grille de score. Le bien-être des animaux est analysé et est pris en compte tout au long des protocoles expérimentaux. Des points limites pour lesquels les animaux seront mise à mort ont été défini. Il n'y a pas d'échanges d'animaux entre les deux établissements utilisateurs, pas de transports d'animaux entre ces deux sites.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal qui permet d’élargir nos connaissances sur le développement, la physiopathologie de différentes pathologies mais aussi tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Son utilisation permet de connaitre la physiologie in vivo des différentes pathologies chez des modèles de souris. Le choix de l'espèce se porte sur le fait que cette espèce est un modèle de mammifère dont le profil pharmacologique permet une utilisation préclinique. Jeunes adultes entre 5 à 8 semaines pouvant finir leur croissance. Les animaux plus âgés ne sont pas souhaités dans la mesure où la présence de graisse peut entrainer une modification de la biodisponibilité de la molécule.