Troubles immunitaires
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Evaluation préclinique de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle murin de vitiligo
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Pour reproduire un vitiligo, chaque souris reçoit une injection intradermique de cellules de mélanome, puis la tumeur lui est retirée par une chirurgie de quinze minutes. 1 500 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. S'y ajoutent neuf anesthésies gazeuses pour suivre la dépigmentation, trois prises de sang, deux injections dans l'abdomen et sept semaines d'administration de composés, jusqu'à deux fois par jour. Le porteur décrit les limites des cultures cellulaires, incapables selon lui de reproduire ensemble la vascularisation, l'innervation et le microbiote de la peau vivante, et conclut que l'animal reste "requis pour démontrer un effet in vivo avant le passage en clinique".
Objectifs
Le vitiligo est une pathologie de la peau caractérisée par l’apparition progressive de taches blanches au niveau du corps. Elle touche 1% de la population, homme ou femme, à n’importe quel moment n’importe quel âge, et quelle que soit la couleur de la peau. Bien que bénin, le vitiligo n’est pas anodin en raison de ses répercussions psychologiques importantes, qui peuvent fortement altérer la qualité de vie des personnes qui en souffrent. C’est une pathologie multifactorielle, essentiellement génétique et auto-immune. Elle est liée à un dysfonctionnement du système immunitaire, entrainant la perte de mélanocytes (cellules à l’origine de la pigmentation de la peau) au niveau de l’épiderme, couche superficielle de la peau. Bien que les traitements actuellement disponibles apportent dans la plupart des cas une amélioration, ils ne permettent pas d'obtenir une guérison complète et définitive. L’objectif du projet est de mettre en place dans notre laboratoire un modèle murin de vitiligo afin, de tester la capacité de différents composés à bloquer la dépigmentation et/ou permettre la repigmentation.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet résulteront de la découverte de nouvelles options thérapeutiques pour les patients souffrants de vitiligo ; les traitements actuellement disponibles apportant dans la plupart des cas une amélioration mais ne permettent pas d'obtenir une guérison complète et définitive.
Procédures
• 1 injection intradermique sur animal anesthésié : quelques secondes • 2 injections sous cutanées de buprénorphine sur animal vigile: quelques secondes • 2 injections intrapéritonéales sur animal vigile : quelques secondes • 1 chirurgie légère (résection de mélanome) sur animal anesthésié et analgésié: 15 minutes • 9 anesthésies gazeuse (5 min max chacune) pour le suivi de la zone de dépigmentation • 3 prélèvements sanguins sur animal vigile : quelques secondes • administrations de composés ou de véhicule pendant 7 semaines (quelques secondes à chaque traitement, au maximum 2 fois par jour en fonction de la voie d’administration
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus chez les animaux sont principalement liés à la croissance tumorale par voie intradermique, à la chirurgie et à la déplétion immunitaire. Ces effets sont considérés comme des contraintes éthiques et de bien-être animal, justifiant des critères d'euthanasie précoces. Toutefois, le modèle décrit dans la littérature est optimisé afin de minimiser ces risques tout en induisant le vitiligo. Des nuisances liées à l'administration (voie orale ou intra-péritonéale) des candidats médicaments (effets indésirables) ne sont pas à exclure sur le long terme
Devenir
Les souris seront mises à mort. Les tissus seront collectés pour l’analyse de la physiopathologie.
Remplacement
Les modèles in vitro et ex vivo ne permettent pas encore de reproduire simultanément : • la complexité de la peau vivante (vascularisation, innervation, microbiote), • la dynamique spatio temporelle de la maladie (extension, rechutes), • la mémoire immunitaire et les effets systémiques des traitements. L’animal est utilisé en dernier recours après criblage in vitro, mais reste requis pour démontrer un effet in vivo avant le passage en clinique
Réduction
Le nombre de souris à inclure est basé sur les données de la littérature et sur l’expérience partagée. Le nombre de souris par groupe a été calculé pour étudier 9 à 15 souris par groupe en se basant sur les proportions suivantes : 90% des souris injectées développeront un mélanome, 80% d’entre elles ne présenteront pas de récidive du mélanome à la suite de la résection et seules 60 à 80% des souris non traitées présenteront une dépigmentation
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera conforme aux recommandations. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement seront sous surveillance quotidienne. Les animaux seront manipulés avec des techniques limitant au maximum le stress. Un programme d’analgésie et d’anesthésie est mis en place pour la chirurgie. Les cages seront placées sur tapis chauffant jusqu’au réveil. De la litière douce et des igloos en carton seront mis dans la cage jusqu’à cicatrisation. Si les points limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance.
Choix des espèces
La littérature décrit l’utilisation de souris femelles C57BL/6 âgées de 7 à 9 semaines Des souris C57BL/6 âgées de 7 à 9 semaines sont utilisées pour induire le vitiligo car : • le système immunitaire est mature • le cycle pilaire entre en phase de repos ce qui permet d’assurer que la dépigmentation observée reflète au mieux la destruction des mélanocytes.
Plateforme préclinique de modélisation des réactions allergiques chez la souris [MODIFICATION]
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
14 500 souris sont utilisées sur trois ans pour 465 études précliniques, soit 100 à 400 souris par molécule testée, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles sont sensibilisées à des allergènes puis soumises à une épreuve qui peut déclencher un choc anaphylactique, avec hypothermie, démangeaisons, gonflements et troubles respiratoires, certaines lignées étant humanisées par greffe de cellules humaines. 12 400 sont tuées, le porteur indiquant qu'elles "ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général" après avoir reçu des candidats médicaments, et 2 100 passent au projet de formation interne aux gestes techniques, ce qui évite d'en commander pour la formation. L'effectif ne repose sur aucun calcul de puissance, le porteur écrivant qu'"Aucune approche statistique n'a été réalisée", l'estimation venant des études des années antérieures et d'une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
Les allergies médiées par les immunoglobulines E (IgE), ou hypersensibilités, sont des réactions immunitaires exagérées à des antigènes environnementaux inoffensifs tels que des allergènes alimentaires, des pollens, des acariens ou encore des venins. Ces réactions peuvent aller de simples manifestations locales (urticaire, rhinite) à des manifestations systémiques graves telles que l’anaphylaxie. L’hypersensibilité de type I, aussi appelée réaction allergique immédiate, est une réponse immunitaire excessive qui se produit rapidement (quelques minutes) après l’exposition à un allergène chez une personne sensibilisée. Conséquences : inflammation, rougeur, démangeaisons, œdème, bronchoconstriction, etc. L’hypersensibilité de type IV, aussi appelée hypersensibilité retardée, est une réaction immunitaire cellulaire qui se manifeste 24 à 72 heures après l’exposition à un antigène. Conséquences : infiltration cellulaire, œdème, rougeur, induration. La compréhension des mécanismes de l’hypersensibilité de type I et IV et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques nécessite le développement de modèles précliniques fiables, reproductibles et transposables à l’homme. L'objectif principal de ce projet est de développer et caractériser différents modèles murins d’allergie médiée par les IgE et les lymphocytes T, en utilisant des souris conventionnelles non-humanisées ou humanisées (système immunitaire ou foie) ou doublement humanisées (système immunitaire + foie ). Les modèles développés serviront à mimer les différentes formes de réactions allergiques, systémiques ou localisées, afin de mieux comprendre les réponses immunitaires et d’évaluer à terme des outils préventifs, prophylactiques ou thérapeutiques. Des souris « non allergiques » (non sensibilisées) pourront être utilisés afin de déterminer la pharmacocinétique / pharmacodynamique des candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à proposer une plateforme complète de modélisation préclinique des allergies médiées par les IgE, adaptée à l'étude des mécanismes immunologiques et à l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques. On entend par « une plateforme complète » toute la chaîne de valeur préclinique, dans une logique de personnalisation, qualité et efficacité scientifique, ne se limitant pas à la simple exécution technique d’un modèle. Cela repose sur une approche progressive, car les expériences peuvent débuter si nécessaire par l’utilisation de modèles murins classiques pour les phases exploratoires, puis intégrant des modèles humanisés uniquement lorsque cela est nécessaire pour affiner la pertinence des résultats dans un contexte proche de l’humain.
Procédures
Identification par puce électronique :2 fois maximum si puce non fonctionnelle ou perdue. Durée de quelques secondes. Administration : la fréquence dépend du protocole d’étude sauf pour les injections d’anticorps qui sera de 2 fois maximum. Chaque injection durera entre 10 et 15 secondes. Administration orale de l’allergène : 8-10 fois maximum. Chaque administration orale durera 20 secondes. Administration par nébulisation : la fréquence dépend du protocole d’étude, durée de 5 min maximum. Administration locale, par contact cutané, de l’allergène : 8-10 fois maximum. Chaque administration locale durera 20 secondes. Les volumes administrés seront proportionnels au poids de l’animal. Le nombre d’administration dépendra du traitement et de la voie d’administration choisie. Le suivi de la réponse anaphylactique se fera par un scoring allergique dans le cas d’allergie systémique active ou passive. Dans le cas d’allergie passive cutanée le suivi de la réponse allergique se fera par mesure de l’épaississement des oreilles, sous anesthésie, ainsi que par l’évaluation de la perméabilité vasculaire. Durée de 10 à 15 secondes. Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire et figurera dans le protocolé d’étude.
Impact sur les animaux
-Identification par puce électronique classique ou thermopuce (prise de température) : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides : les nuisances attendues sont des hématomes et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de traitements : il n’y a pas de nuisances attendues, mais il existe un risque d’observer des effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées. - Prélèvements sanguins : il n’y a pas de nuisance attendue mais un risque d’anémie, d’hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne. -Prise de température corporelle à l’aide d’une sonde : irritation, inflammation, stress. Le challenge est également susceptible d’induire une réaction allergique ou un choc anaphylactique pouvant se manifester notamment par une hypothermie, la présence de démangeaisons, de gonflements, de problèmes respiratoires et un impact sur l’activité de la souris. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car ils auront reçu des candidats médicaments pour lesquels un impact négatif sur la santé des souris ne peut être exclu. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de ce projet pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Cette réutilisation permet de ne pas commander des souris spécifiquement pour la formation mais d’utiliser nos souris déjà présentes.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer, in vitro, un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer les réactions physiologiques humaines responsables de la mise en place d’une allergie, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques de médicaments en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de traitements innovants pour les patients.
Réduction
Un total de [MODIFICATION] 14 500 souris seront utilisées, couvrant une période de [MODIFICATION] 3 ans, permettant de réaliser 465 études précliniques. Le nombre de souris par étude sera de 5 à 10 individus par groupe (pour faire face à la variabilité du modèle), avec un minimum de 4 groupes (1 groupe placebo et 3 groupes traités). Ce nombre total d’animaux inclut les groupes contrôles, les tests pilotes de validation de modèle, les répétitions inter-expérimentateurs et les pertes éventuelles. Il est prévu de tester approximativement entre 50 et 60 molécules de nature différente sur la durée de validité de ce projet. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum. Cette estimation permet de garantir la robustesse statistique des résultats tout en respectant le principe de Réduction, grâce à une mutualisation des groupes contrôles et des revalidations de modèles précédents. Chaque molécule nécessite entre 100 à 400 animaux selon le protocole expérimental (modèle local ou systémique, voie d’administration, durée, nombre de groupes, etc.)
Raffinement
En début d’étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées en cage ventilée, préférentiellement par groupe social stable composé de 5 individus. Des compléments alimentaires (ex : Diet Gel) pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Entre autres, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple des morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, tunnel en carton, kraft et/ou boules de coton. A leur entrée dans l’animalerie, les souris recevront une période d’acclimatation de 4 jours minimum. Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique, du score d’allergie et de la perte de poids. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique et allergique ainsi que perte de poids dépassant les seuils définis.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. L’utilisation de modèles murins d’allergie au pollen a déjà été démontré dans la littérature scientifique. Poursuivre sur cette espèce est donc indiqué. De plus, lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain, ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente, permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur system immunitaire. Pour les souris humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
MODIFICATION Evaluation de la tolérance induite par des antigènes en vue de l’identification de nouveaux candidats vaccins pour la prévention des troubles allergiques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Les souris dont le score clinique atteint un seuil jugé critique sont mises à mort avant la fin de l'étude, le porteur écartant les analgésiques au motif qu'ils "modifient la réponse immune étudiée". 5 200 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles reçoivent un allergène alimentaire, arachide ou œuf, jusqu'à quatre fois pour les sensibiliser, puis subissent une épreuve allergique par voie orale, cutanée ou respiratoire, dont les effets déclarés vont jusqu'aux signes neurologiques et aux troubles respiratoires. Une partie sert de donneuse de cellules immunitaires ou de sérum à des souris receveuses déjà sensibilisées, l'ensemble visant l'essai clinique puis la mise sur le marché de préparations vaccinales.
Objectifs
Les allergies sont des réactions d’hypersensibilité à des substances, appelées allergènes, présentes dans l’environnement et qui sont normalement inoffensives car tolérés par le système immunitaire. Les réactions peuvent être diverses, des plus bénignes aux plus sévères. Les allergies correspondent à une perte de tolérance envers ces substances. La tolérance immunitaire se définit par la capacité du système immunitaire à ne pas manifester de réaction agressive vis-à-vis de certains antigènes avec lesquels il a été au préalable en contact. Le projet s’organise en 3 étapes, le développement des modèles d’allergie et l’évaluation, sur l’animal, de l’efficacité d’un candidat vaccin contre les troubles allergiques alimentaires connues chez l’homme. 1/Mise en place des modèles d’allergie alimentaire dit de sensibilisation à l’allergènes : dans un premier temps des études seront réalisées pour établir les modèles animaux afin de représenter la maladie d’intérêt dite « allergique » par exemple l’allergie aux arachides. Ces études permettront de définir entre autres les doses d’allergène générant d’une part la sensibilisation à l’allergène et d’autre part la réaction d’hypersensibilité qui seront inoculées chez l’animal ou encore la voie d’administration. 2/ étude d’évaluation des vaccins anti-allergies Une fois ces modèles d’allergies établies, des études d’évaluation de la capacité d’un vaccin à restaurer la tolérance contre ces allergènes alimentaires seront effectuées. Pour cela, les animaux recevront le candidat vaccin dont l’efficacité sera mesurée par le degré d’efficacité induit contre l’inoculation de l’allergène. ---------------- AJOUT :3/ Comprendre et documenter le mécanisme d’action d’un vaccin thérapeutique en opérant le transfert de populations de cellules immunitaires ou sérum d’une souris dite « donneuse », qui aura reçu préalablement le candidat vaccin ou un « placebo », vers une souris dite « receveuse », laquelle aura préalablement été sensibilisée à un allergène alimentaire (ex l’arachide, œufs...) La souris « receveuse » sera alors éprouvée par cet allergène. La réaction allergique sera monitorée et la réponse immunitaire sera analysée ex vivo. Il est attendu que le transfert de certaines cellules immunitaires ou sérum de la souris donneuse permettrait à la souris receveuse sensibilisée de ne pas développer de manifestations cliniques allergiques à la suite d’une épreuve.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont l’utilisation en essai clinique, et éventuellement la mise sur le marché, de différentes préparations vaccinales permettant de protéger efficacement les patients contre les troubles allergiques alimentaires et répondre aux besoins cliniques des patients. Ce projet permettra également, d’évaluer les nouvelles voies d’administration ou les nouvelles formes pharmaceutiques qui permettent d’améliorer la performance du vaccin tolérogène. Enfin, ce projet permet de comprendre les mécanismes d’action, la caractérisation de la réponse immunitaire dans le cadre d’hypersensibilité. La découverte de nouveaux candidats permettra de lutter contre les phénomènes croissants d’allergie alimentaire et de sauver des vies humaines dans le monde. ---------------------------------- AJOUT : Le développement de candidats vaccins tolérogènes constituerait une avancée majeure dans la lutte contre l’augmentation continue de la prévalence des allergies alimentaires. À terme, ces approches innovantes pourraient améliorer significativement la qualité de vie des patients, tout en réduisant le risque de réactions allergiques sévères, voire potentiellement mortelles, à l’échelle mondiale.
Procédures
Les études de tolérance consistent à administrer des vaccins dont la dose peut être unique ou multiple (un à six fois) sous différentes voies d’immunisation en vue de protéger contre une épreuve d’hypersensiblité par un allergène. La sensibilisation à l’allergène se fait par des doses répétées (deux à quatre fois). L'épreuve allergique est unique, plus rarement répétée. Plusieurs voies d'épreuve allergique en fonction du type d’allergie (orale, topique, respiratoire) peuvent être utilisées. Ces différents types d’injection durent moins d’une minute.
Impact sur les animaux
L’administration des candidats vaccins ou de traitements anti-allergiques génère des signes cliniques légers (réactogénicité locale avec principalement de l’érythème voire parfois un gonflement et une induration des tissus, rarement des poils hérissés et une perte de poids transitoire de moins de 10%). ---------------AJOUT / L’injection de cellules ou sérum par voie intraveineuse génère des signes cliniques légers FIN.-------------- Dans le cas de l’induction de l’allergie, en fonction du protocole appliqué, les effets indésirables sont légers à sévères (poils hérissés, baisse d’activité, hyper/hypothermie, signes neurologiques et troubles respiratoires et une perte de poids transitoire de moins de 15%). ------------AJOUT Ces signes seront surtout attendus dans les groupes de souris qui ne seront pas vacciné ou encore dans le cadre ayant reçu les cellules ou le sérum des souris « placebo ». FIN ---------------------Les nuisances associées aux prélèvements sont un inconfort local, il peut y avoir un petit hématome (prélèvement sanguin) en conséquence la contrainte représentée par les prélèvements est évaluée en degré léger.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés après épreuve allergique afin d’évaluer la réponse immune. Les volumes sanguins prélevés nécessaires ou le prélèvement d’organes ne permettant pas le maintien en survie des animaux. L’euthanasie pourra être pratiquée plus précocement en fonction du type de test, de l’évolution des signes cliniques et de l’expérience du technicien animalier ou de recherche pour abréger la souffrance.
Remplacement
Dans le cadre du développement de candidats vaccins ou de traitements anti-allergiques la réponse immunitaire ainsi que l'effet tolérogène doivent être évalués sur un organisme entier. Ainsi à ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro pour évaluer les capacités d’un vaccin ou d’un traitement anti-allergique à induire une tolérance contre un allergène, et reproduire la complexité des réponses cellulaires et humorales impliquées dans la mise en place d’une immunité contre un allergène. Le recours à l'animal de laboratoire s'avère donc nécessaire.
Réduction
Chaque étude est évaluée au plus juste et est revue par les biostatisticiens afin de définir le nombre minimum et suffisant d'animaux requis permettant une analyse statistique des résultats. Quelques soient les espèces, les scientifiques après revue bibliographique sur la maladie d’intérêt et en fonction du nombre de lots à tester élaborent le plan de l’étude. Afin de réduire le nombre de lots, ceux-ci sont d’abord présélectionnés en amont sur des modèles vitro existants. Le plan d’étude est revu par l’équipe de recherche qui comprend d’autres scientifiques ainsi que des biostatisticiens afin de revoir les groupes et le nombre d’animaux afin de le réduire à un nombre suffisant pour que l’étude soit robuste
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Pour chaque étude, une période d’acclimatation est prévue et permet de diminuer le stress des animaux avant les épreuves. L’ensemble des contentions et des gestes techniques sont réalisés par du personnel qualifié. En fonction de l’allergène, une grille d'évaluation des signes cliniques post-induction sera mise en place entre le responsable d'étude, les biostatisticiens et les vétérinaires cliniciens. Cette grille permet d’évaluer le niveau de souffrance des animaux selon des critères cliniques spécifiques de l’allergène, par un personnel spécifiquement formé. Dès que le score atteint un seuil jugé critique, les animaux sont euthanasiés avant la fin de l'étude pour abréger leur souffrance. Les autres options de traitement des points limites sont malheureusement exclues car les analgésiques modifient la réponse immune étudiée Des points limites sont mis en place et seront appliqués. Ainsi, un suivi clinique quotidien 7/7 jours est réalisé tout au long de l’étude, avec surveillance du poids. La voie, la fréquence et le volume des prélèvements sont conformes aux pratiques en vigueur décrites dans le module interne de formation aux manipulations. En fonction des voies, des anesthésiques sont utilisés.
Choix des espèces
La souris est sélectionnée du fait des modèles d’allergie décrits dans la littérature et des connaissances scientifiques. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux, disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…).
Modélisation et caractérisation de modèles murins précliniques d’infection par le métapneumovirus humain (hMPV) : étude des mécanismes physiopathologiques et évaluation de candidats thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Infectées par le métapneumovirus humain, 1 350 souris développent une bronchoconstriction et des lésions pulmonaires inflammatoires que le porteur annonce comme attendues, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des organes. Elles subissent des gavages, des injections intramusculaires, intranasales et rétro-orbitaires, ces dernières pouvant provoquer un saignement autour de l'œil, ainsi qu'une vaccination par électroporation susceptible d'entraîner un problème de mobilité. Aucun anti-inflammatoire ne leur est administré, le porteur expliquant que ces molécules "pourraient interférer avec nos résultats". Le nombre de souris par procédure n'est pas donné, renvoyé au protocole, et la mesure de la respiration peut immobiliser chaque souris jusqu'à trois heures sans que sa fréquence soit précisée.
Objectifs
Ce projet a pour objectif principal la modélisation, la caractérisation et l’utilisation de modèles murins précliniques pour l’étude des infections par le métapneumovirus humain (hMPV), incluant les différentes souches virales, dans le but de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et d’évaluer de nouvelles stratégies de traitements. Plus précisément, les objectifs sont les suivants : (1) Développement et validation de modèles murins d’infection par le hMPV : -Utiliser des lignées murines sensibles à l’infection afin de reproduire les différentes formes cliniques de la maladie ou réaliser de l’adaptation virale chez nos modèles murins, -Evaluer le mécanisme de l’infection, la multiplication ainsi que la répartition du virus dans les tissus. (2) Caractérisation des réponses immunitaires : -Etudier la réponse immunitaire et inflammatoire induite par le virus, notamment dans les poumons et autres organes (système nerveux central, intestin, ORL, foie), -Identifier les paramètres associés aux formes plus sévères ou prolongées de la maladie. (3) Evaluation de vaccins ou traitements candidats : -Tester l’efficacité de nouvelles molécules antivirales, modifiant le système immunitaire ou encore de vaccins pour limiter la quantité de virus, réduire les symptômes et prévenir les complications, -Etudier les mécanismes d’action des ces traitements in vivo. (4) Application des principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement) : -Effectuer une analyse à grande échelle préalable des molécules sur des modèles cellulaires pour réduire l’utilisation d’animaux, -Optimiser les plans expérimentaux pour minimiser le nombre d’animaux et réduire leur inconfort.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette étude est de mettre au point et de valider de nouveaux modèles de souris pour mieux comprendre l’évolution de la maladie provoquée par les hPMV et d’identifier les facteurs qui rendent certains individus plus sensibles à l’infection. Ces modèles permettront d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches de traitement et de prévention contre ces virus. Les résultats attendus de ce projet visent à améliorer les modèles utilisés avant les essais chez l’Homme ainsi qu’à valider des stratégies médicales prometteuses, contribuant ainsi au devéloppement de solutions plus efficaces pour la santé humaine.
Procédures
Les souris recevront différents traitements selon le protocole étudié et la nature des molécules testées. Les produits pourront être administrés par différentes voies : - Par la bouche : Une à deux fois par jour pendant quelques jours, - Par injection dans le ventre : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu, - Par injection sous la peau : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu, - Par le muscle, - Par le nez, - Par voie intraveineuse. L’état général des animaux sera observé attentivement avant et après chaque manipulation afin de s’assurer de leur bon rétablissement. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à différentes étapes (avant et après infection) afin de suivre la réponse de l’organisme. Les fonctions respiratoires seront mesurées à l’aide d’un appareil permettant d’enregistrer la respiration de la souris sans la contraindre : l’animal reste éveillé et peut bouger à l’intérieur de la chambre. L’acquisition comprendra entre 5 minutes et 1h d’adaptation permettant à la souris de stabiliser sa respiration et entre 5 minutes et 2h d’acquisition de données. Une observation clinique sera réalisée avant et après chaque mesure pour vérifier qu’il n’y a pas de signe d’inconfort. Certaines procédures nécessiteront une anesthésie, réalisée avec des produits adaptés au poids de l’animal. Avant la perfusion terminale, un antidouleur sera administré avant l’anesthésie afin d’éviter toute douleur. En fin d’étude, une anesthésie profonde sera pratiquée avant la perfusion terminale, qui consiste à faire circuler une solution dans les organes pour pouvoir ensuite les prélever et les analyser. Cette étape est effectuée uniquement lorsque l’animal est totalement endormi et insensible.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables généralement attendus dans le cadre de nos projets et procédures expérimentales sont principalement liés à la répétition des manipulations : gavage oral, injections (intramusculaire, intraveineuse, intranasale), prélèvements sanguins et mesures physiologiques (comme la pléthysmographie). Ces interventions peuvent entraîner des effets transitoires, essentiellement dûs à la douleur locale, au stress de contention ou à des réactions tissulaires passagères. -Gavage oral : Un risque d’étouffement existe en cas de fausse route. -Injection intramusculaire : La mise en place d’une réaction inflammatoire locale peut provoquer une sensibilité à la palpation, un léger gonflement ou une réduction temporaire de la mobilité des membres postérieurs. -Injection intraveineuse : L’injection par voie rétro-orbitaire peut entrainer un saignement localisé au niveau de l’œil. -Injection intranasale : Une irritation locale transitoire peut être provoquée avec un écoulement nasal ou une respiration plus rapide suite à l’administration. -Pléthysmographie : La restriction temporaire de mouvement et l’isolement de l’animal peut induire un léger stress pendant la mesure. -Prélèvement sanguin : Le prélèvement sanguin par voie submandibulaire est une procédure rapide. Le volume de sang prélevé est adapté au poids de l’animal. La ponction peut induire une douleur brève. Vaccination par électroporation : peut entrainer un problème de mobilité. L’infection par le virus hMPV peut entraîner altération de l’état général (aspect du poil, posture), perte de poids, fièvre, modifications comportementales et respiratoires. Ces paramètres sont suivis via une grille de score spécifique. Une bronchoconstriction et des lésions pulmonaires inflammatoires sont attendues et évaluées respectivement par analyses respiratoire et d’organes.
Devenir
Pour toutes les procédures prévues dans ce projet, les animaux sélectionnés seront mis à mort conformément aux recommandations réglementaires, afin de permettre le prélèvement des organes et leur analyse.
Remplacement
À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet pas de reproduire de manière satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires lors d’une infection naturelle ou après une vaccination. En effet, les modèles in vitro ne parviennent pas à capturer la complexité des interactions entre les différents types cellulaires, les tissus et les mécanismes systémiques qui se produisent dans un organisme vivant. C’est pourquoi, il est indispensable de recourir à des modèles animaux, qui permettent une étude plus fidèle des réponses immunitaires dans un contexte biologique complet et dynamique. Ces modèles animaux offrent une plateforme essentielle pour mieux comprendre les mécanismes de défense de l’organisme et pour tester l’efficacité des traitements et des vaccins avant toute application clinique.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque type de procédure sera précisé dans le protocole. Les effectifs sont déterminés sur la base d’expériences antérieures et/ou de calculs de puissance statistique, afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des animaux des deux sexes, âgés de 6 à 20 semaines et répartis en groupes homogènes pour garantir des analyses statistiques pertinentes. Lorsque possible un même groupe témoin sera partagé entre plusieurs expériences afin de réduire encore le nombre d’animaux.
Raffinement
Les souris sont élevées dans des conditions optimales, avec un soin ainsi qu’un respect constant, et sont exposées à divers éléments d'enrichissement pour favoriser leur bien-être. Elles seront hébergées en groupes de 2 à 5 souris afin de prévenir le stress lié à l'isolement. Les cages seront systématiquement enrichies par l'ajout d'éléments comme un dôme, offrant aux animaux un abri, et de la nourriture hydratée, qui sera fournie dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids ou déshydratation durant leur hébergement. Pour tous les actes nécessitant une anesthésie, nous privilégions une anesthésie chimique par voie intrapéritonéale. Les souris en expérimentation feront l'objet d'une surveillance quotidienne par du personnel qualifié et formé pour mener ces expérimentations. L'utilisation d'une grille de score spécifique et un suivi pondéral quotidien permettront de détecter rapidement tout signe de souffrance et de mettre en place les actions nécessaires pour la soulager. Étant donné que notre étude porte sur la réponse immunitaire, il est impératif de ne pas administrer d'anti-inflammatoires aux souris. En effet, ces molécules pourraient interférer avec nos résultats en altérant l'expression des marqueurs d’intérêt, ce qui pourrait fausser l’interprétation des réponses immunitaires observées.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle murin car ce sont des mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’Homme. C’est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose à ce jour d’une bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l’étude du système immunitaire dans les conditions d’infection grâce aux connaissances acquises et à l’arsenal d’outils existants. En effet, un vaste répertoire d’anticorps ciblant des marqueurs murrins sont disponibles, permettant de caractériser finement la réponse immunitaire par des méthodes à très haut contenu. Pour ces expériences nous utiliserons des animaux adultes âgés de 6 à 20 semaines, présentant un système immunitaire mature. Ainsi que des souris âgées de 70-78 semaines afin d’étudier l’effet de hMPV chez les individus âgés.
Étude des mécanismes inflammatoires des surdités progressives et liées à l’âge : impact de l’exposition sonore 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
Exposition à un bruit fort pendant une à deux heures, tests auditifs sous anesthésie avec électrodes placées sous la peau, prélèvements de sang répétés jusqu'à six semaines : ces actes sont déclarés dans le premier des deux établissements, le résumé précisant qu'aucune intervention ne sera effectuée dans le second. 4 590 souris sont pourtant déclarées ici aussi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ce second résumé reprenant mot pour mot le texte du premier, publié sous le même titre suivi de 2/2. Les 1 530 souris transférées dans ce second établissement y sont mises à mort pour analyser les mêmes tissus de l'oreille interne que les 3 060 autres. Le passage consacré au raffinement reprend lui aussi, mot pour mot, celui qui porte sur la réduction du nombre d'animaux non-humains, si bien que rien n'est dit des conditions faites aux souris.
Objectifs
Le projet se réalise dans deux établissements utilisateurs (EU1/2 et EU2/2). La perte auditive présente dès la naissance, touche 26 millions de personnes dans le monde, dont 60 % (environ 15 millions) sont dues à des facteurs génétiques. Cependant, plus de 440 millions de personnes souffrent d’une surdité acquise ou progressive après la naissance, qu’elle soit liée à l’âge, au bruit ou à d’autres facteurs. La perte auditive liée à l'âge (ou presbyacousie) a un impact significatif sur la qualité de vie : 1 adulte sur 3 âgé de plus de 65 ans souffre d'un certain degré de perte auditive. Bien que les mécanismes sous-jacents à ces déficiences auditives restent à élucider, il est de plus en plus reconnu que l'inflammation joue un rôle crucial dans le développement et la progression des troubles auditifs, qu’ils soient d’origine génétique, environnementale (exposition au bruit) ou lié à l’âge. En étudiant des modèles de souris présentant une surdité progressive ou liée au bruit, ciblant des gènes clés liés à l'immunité et ses voies de régulation, nos objectifs sont de : - caractériser les voies moléculaires, découvrir des marqueurs précoces, précis, et spécifiques pour la manifestation et l'évolution de la perte auditive - Étudier les liens entre l’inflammation, les marqueurs immunitaires et la perte auditive, en conditions normales et après exposition à des bruits. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à des traitements ciblant l’inflammation dans l’oreille interne, réduisant ainsi les dommages auditifs et améliorant la fonction auditive.
Bénéfices attendus
Les données obtenues de ce projet nous permettront de mieux comprendre la relation entre la surdité progressive ou liée au bruit et la dérégulation des voies immunitaires. Nous identifierons également des biomarqueurs précoces, précis et spécifiques pour la manifestation et l'évolution de la perte auditive. Cela nous permettra de développer des thérapies ciblées pour atténuer les lésions auditives, applicables aux patients. À court terme, nous identifierons des marqueurs biologiques et des mécanismes physiopathologiques. À long terme, ces connaissances permettront de concevoir des traitements innovants pour préserver l'audition, avec des applications potentielles pour les humains et les animaux. Les résultats pourraient également contribuer à la prévention de la surdité induite par le bruit, un problème de santé publique majeur. Ce travail fondamental aura ainsi un impact significatif sur la recherche médicale et les applications cliniques futures.
Procédures
Dans l’EU1/2 : Exposition sonore : Les souris âgées de 3 semaines seront exposées pendant 1 ou 2 heures à un bruit d’un niveau sonore comparable à celui d’une discothèque ou une circulation urbaine dense. Tests auditifs : Des tests auditifs seront effectués dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à différents temps post-exposition sonore : 1 jour, 3 jours, 1 semaine, 2 semaines et 6 semaines. Les souris seront anesthésiées puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Des mesures seront enregistrées à l’aide d’électrodes ou de sondes placées sous la peau ou à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Prélèvements de sang : Un petit échantillon de sang sera prélevé (quelques secondes par prélèvement) avant l’exposition sonore, puis à différents temps post-exposition sonore : 1 jour, 3 jours, 1 semaine, 2 semaines et 6 semaines. Aucune intervention ne sera effectuée dans l’EU2/2. Toutes les souris transférées dans l’EU2/2 seront mis à mort afin d’analyser des tissus.
Impact sur les animaux
Dans l’EU1/2 et l’EU2/2, certaines souris déficientes en protéine fonctionnelle de l’audition présentent des troubles de l’équilibre, qui apparaissent à partir de la 2ème semaine de vie post-natale et perdurent jusqu’à la mise à mort à l’âge de 60 jours. Les autres modèles murins, bien que sourds, ne présentent aucun autre symptôme et conservent un phénotype identique à celui des souris sauvages. Dans l’EU1/2, quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : L’exposition sonore peut potentiellement induire un stress temporaire sur l’animal. Les études scientifiques sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. Aucune dégradation durable de leur état de santé n’est anticipée, et aucun effet indésirable majeur (perte de poids, inactivité prolongée, comportement anormal) n’est attendu. Les tests auditifs nécessitent une contention de courte durée des souris, associée à une anesthésie générale légère pour les immobiliser. Bien que cette procédure puisse provoquer une angoisse passagère lors de la mise sous anesthésie, ses effets sont atténués par la courte durée du test (quelques minutes) et la réversibilité rapide de l'anesthésie. Aucun effet indésirable durable n'est attendu.
Devenir
À l'issue de cette procédure expérimentale, 3060 souris seront mises à mort dans l’EU1/2 pour récupérer des tissus de l’oreille interne afin de réaliser des analyses biologiques et histologiques. Les autres animaux (soit 1530 souris) seront transférées à un collaborateur dans l’EU2/2 où ils seront mis à mort pour une analyse complémentaire des mêmes tissus.
Remplacement
Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative in vitro ou in silico pour appréhender les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus mécanique par les cellules sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique à certains neurones de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. De fait, nous utiliserons des souris dans notre projet pour étudier les effets pathologiques de l’inflammation dans les surdités progressives ou liées au bruit, afin d’identifier des marqueurs biologiques, avec des applications potentielles pour les humains.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel d’analyse statistique. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et appliquerons les mesures sur le même animal le cas échéant.
Raffinement
Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel d’analyse statistique. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et appliquerons les mesures sur le même animal le cas échéant.
Choix des espèces
Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Grâce à la transposabilité des résultats entre la souris et l’homme, ces modèles vont nous permettre d’explorer la relation entre la dérégulation des voies immunitaires et la surdité progressive ou liée à l'âge, et fournir ainsi de nouvelles stratégies thérapeutiques chez l’homme. Le projet impliquera principalement des souris adultes âgées de 3 semaines, correspondant au stade jeune adulte, afin d'étudier l'effet du bruit sur la réponse immunitaire dans l'oreille interne. Ce stade de développement a été choisi car l'oreille interne est complètement mature à ce stade, la réponse immunitaire est pleinement fonctionnelle, et cela permet d'étudier les effets du bruit sur un système auditif développé. La mise à mort se fera à 22 jours (soit 1 jour après exposition sonore) pour évaluer les effets immédiats, et entre 1 et 2 mois post-exposition pour évaluer les effets à long terme. Ces stades permettent d'étudier les réponses immunitaires aiguës à 22 jours, les changements chroniques entre 1 et 2 mois, et la progression potentielle de la perte auditive.
Étude des mécanismes inflammatoires des surdités progressives et liées à l’âge : impact de l’exposition sonore 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
4 590 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 3 060 tuées dans le premier établissement pour prélever l'oreille interne, les 1 530 autres transférées chez un collaborateur où elles sont tuées pour les mêmes analyses. Dès l'âge de trois semaines, elles sont exposées une à deux heures à un bruit que le porteur compare à celui d'une discothèque, puis anesthésiées pour des tests auditifs avec électrodes sous la peau, répétés jusqu'à six semaines après l'exposition, et prélevées de sang à chaque échéance. Une partie d'entre elles, privées d'une protéine de l'audition, présentent des troubles de l'équilibre dès la deuxième semaine de vie, qui durent jusqu'à leur mise à mort à 60 jours. Le porteur écrit pourtant n'anticiper aucune "dégradation durable de leur état de santé".
Objectifs
Le projet se réalise dans deux établissements utilisateurs (EU1/2 et EU2/2). La perte auditive présente dès la naissance, touche 26 millions de personnes dans le monde, dont 60 % (environ 15 millions) sont dues à des facteurs génétiques. Cependant, plus de 440 millions de personnes souffrent d’une surdité acquise ou progressive après la naissance, qu’elle soit liée à l’âge, au bruit ou à d’autres facteurs. La perte auditive liée à l'âge (ou presbyacousie) a un impact significatif sur la qualité de vie : 1 adulte sur 3 âgé de plus de 65 ans souffre d'un certain degré de perte auditive. Bien que les mécanismes sous-jacents à ces déficiences auditives restent à élucider, il est de plus en plus reconnu que l'inflammation joue un rôle crucial dans le développement et la progression des troubles auditifs, qu’ils soient d’origine génétique, environnementale (exposition au bruit) ou lié à l’âge. En étudiant des modèles de souris présentant une surdité progressive ou liée au bruit, ciblant des gènes clés liés à l'immunité et ses voies de régulation, nos objectifs sont de : - caractériser les voies moléculaires, découvrir des marqueurs précoces, précis, et spécifiques pour la manifestation et l'évolution de la perte auditive - Étudier les liens entre l’inflammation, les marqueurs immunitaires et la perte auditive, en conditions normales et après exposition à des bruits. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à des traitements ciblant l’inflammation dans l’oreille interne, réduisant ainsi les dommages auditifs et améliorant la fonction auditive.
Bénéfices attendus
Les données obtenues de ce projet nous permettront de mieux comprendre la relation entre la surdité progressive ou liée au bruit et la dérégulation des voies immunitaires. Nous identifierons également des biomarqueurs précoces, précis et spécifiques pour la manifestation et l'évolution de la perte auditive. Cela nous permettra de développer des thérapies ciblées pour atténuer les lésions auditives, applicables aux patients. À court terme, nous identifierons des marqueurs biologiques et des mécanismes physiopathologiques. À long terme, ces connaissances permettront de concevoir des traitements innovants pour préserver l'audition, avec des applications potentielles pour les humains et les animaux. Les résultats pourraient également contribuer à la prévention de la surdité induite par le bruit, un problème de santé publique majeur. Ce travail fondamental aura ainsi un impact significatif sur la recherche médicale et les applications cliniques futures.
Procédures
Dans l’EU1/2 : Exposition sonore : Les souris âgées de 3 semaines seront exposées pendant 1 ou 2 heures à un bruit d’un niveau sonore comparable à celui d’une discothèque ou une circulation urbaine dense. Tests auditifs : Des tests auditifs seront effectués dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à différents temps post-exposition sonore : 1 jour, 3 jours, 1 semaine, 2 semaines et 6 semaines. Les souris seront anesthésiées puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Des mesures seront enregistrées à l’aide d’électrodes ou de sondes placées sous la peau ou à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Prélèvements de sang : Un petit échantillon de sang sera prélevé (quelques secondes par prélèvement) avant l’exposition sonore, puis à différents temps post-exposition sonore : 1 jour, 3 jours, 1 semaine, 2 semaines et 6 semaines. Aucune intervention ne sera effectuée dans l’EU2/2. Toutes les souris transférées dans l’EU2/2 seront mis à mort afin d’analyser des tissus.
Impact sur les animaux
Dans l’EU1/2 et l’EU2/2, certaines souris déficientes en protéine fonctionnelle de l’audition présentent des troubles de l’équilibre, qui apparaissent à partir de la 2ème semaine de vie post-natale et perdurent jusqu’à la mise à mort à l’âge de 60 jours. Les autres modèles murins, bien que sourds, ne présentent aucun autre symptôme et conservent un phénotype identique à celui des souris sauvages. Dans l’EU1/2, quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : L’exposition sonore peut potentiellement induire un stress temporaire sur l’animal. Les études scientifiques sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. Aucune dégradation durable de leur état de santé n’est anticipée, et aucun effet indésirable majeur (perte de poids, inactivité prolongée, comportement anormal) n’est attendu. Les tests auditifs nécessitent une contention de courte durée des souris, associée à une anesthésie générale légère pour les immobiliser. Bien que cette procédure puisse provoquer une angoisse passagère lors de la mise sous anesthésie, ses effets sont atténués par la courte durée du test (quelques minutes) et la réversibilité rapide de l'anesthésie. Aucun effet indésirable durable n'est attendu.
Devenir
À l'issue de cette procédure expérimentale, 3060 souris seront mises à mort dans l’EU1/2 pour récupérer des tissus de l’oreille interne afin de réaliser des analyses biologiques et histologiques. Les autres animaux (soit 1530 souris) seront transférées à un collaborateur dans l’EU2/2 où ils seront mis à mort pour une analyse complémentaire des mêmes tissus.
Remplacement
Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative in vitro ou in silico pour appréhender les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus mécanique par les cellules sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique à certains neurones de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. De fait, nous utiliserons des souris dans notre projet pour étudier les effets pathologiques de l’inflammation dans les surdités progressives ou liées au bruit, afin d’identifier des marqueurs biologiques, avec des applications potentielles pour les humains.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel d’analyse statistique. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et appliquerons les mesures sur le même animal le cas échéant.
Raffinement
Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel d’analyse statistique. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et appliquerons les mesures sur le même animal le cas échéant.
Choix des espèces
Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Grâce à la transposabilité des résultats entre la souris et l’homme, ces modèles vont nous permettre d’explorer la relation entre la dérégulation des voies immunitaires et la surdité progressive ou liée à l'âge, et fournir ainsi de nouvelles stratégies thérapeutiques chez l’homme. Le projet impliquera principalement des souris adultes âgées de 3 semaines, correspondant au stade jeune adulte, afin d'étudier l'effet du bruit sur la réponse immunitaire dans l'oreille interne. Ce stade de développement a été choisi car l'oreille interne est complètement mature à ce stade, la réponse immunitaire est pleinement fonctionnelle, et cela permet d'étudier les effets du bruit sur un système auditif développé. La mise à mort se fera à 22 jours (soit 1 jour après exposition sonore) pour évaluer les effets immédiats, et entre 1 et 2 mois post-exposition pour évaluer les effets à long terme. Ces stades permettent d'étudier les réponses immunitaires aiguës à 22 jours, les changements chroniques entre 1 et 2 mois, et la progression potentielle de la perte auditive.
D?veloppement et caract?risation de deux mod?les murins humanis?s pour l??tude d?une infection virale humaine dans un contexte de greffe
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Jusqu'à seize anesthésies générales pour une même souris : 300 souris fortement immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Un fragment de poumon humain leur est greffé au cours d'une opération de vingt à soixante minutes, puis un cytomégalovirus humain est injecté directement dans le greffon, et l'infection est suivie par imagerie jusqu'à huit fois, avec neuf prélèvements sanguins au maximum par animal. Certaines restent dans le protocole plusieurs mois, jusqu'à l'âge de neuf mois. Le porteur écrit que leur déficit immunitaire, qui les rend fragiles aux infections et impose un hébergement particulier, est aussi ce qui permet la greffe de tissus humains, et interdit ensuite toute réutilisation comme toute adoption.
Objectifs
Les personnes ayant re?u une greffe d?organe doivent prendre des traitements diminuant l?activit? du syst?me immunitaire afin d??viter le rejet du greffon. Cette diminution des d?fenses immunitaires augmente cependant le risque d?infections. Parmi elles, le cytom?galovirus humain est l?une des plus fr?quentes et peut provoquer des complications importantes ainsi qu?alt?rer la survie du greffon. L??tude de cette infection est difficile car ce virus infecte uniquement les cellules humaines. Les mod?les animaux classiques ne permettent donc pas de reproduire correctement les interactions entre le virus, les tissus humains et le syst?me immunitaire. L?objectif de ce projet est de d?velopper et caract?riser deux mod?les de souris portant des tissus humains afin d??tudier l?infection par le cytom?galovirus humain dans un contexte proche de la transplantation d?organe. Le premier mod?le permettra d??tudier l?infection du virus dans un greffon pulmonaire humain et de suivre son ?volution au cours du temps gr?ce ? des m?thodes d?imagerie non invasives. Le second mod?le permettra, en plus du greffon pulmonaire, de reconstituer un syst?me immunitaire humain chez la souris. Il servira ? ?tudier les interactions entre le virus, le greffon et les cellules immunitaires humaines, ainsi que la capacit? du syst?me immunitaire ? contr?ler l?infection. Ces mod?les seront ?valu?s en termes de stabilit?, de reproductibilit? et de qualit? de l?infection observ?e. Ce projet a pour objectif d??tablir des mod?les exp?rimentaux robustes pour mieux comprendre les interactions entre le virus, les tissus humains et le syst?me immunitaire dans un contexte de transplantation. Il ne vise pas directement ? tester un traitement, mais ? pr?parer de futures ?tudes th?rapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de d?velopper et caract?riser des mod?les exp?rimentaux reproduisant certaines caract?ristiques de l?infection par le cytom?galovirus humain dans un contexte proche de la transplantation d?organe. ? court terme, il permettra de mieux comprendre la mani?re dont ce virus infecte et persiste dans des tissus humains greff?s, ainsi que les interactions entre le virus et le syst?me immunitaire humain. Il permettra ?galement de valider des m?thodes de suivi de l?infection au cours du temps chez les m?mes animaux, afin de limiter le nombre d?animaux n?cessaires aux exp?riences. ? moyen terme, ces travaux fourniront des mod?les exp?rimentaux robustes et reproductibles pour l??tude des infections virales humaines chez les patients immunod?prim?s, notamment apr?s une transplantation d?organe. Ils contribueront ? am?liorer les connaissances sur les m?canismes impliqu?s dans le contr?le ou la persistance de l?infection. ? plus long terme, ces mod?les pourront servir de base au d?veloppement et ? l??valuation de nouvelles approches th?rapeutiques contre les infections opportunistes chez les patients greff?s ou immunod?prim?s. Ils pourront ?galement ?tre adapt?s ? l??tude d?autres infections humaines n?cessitant la pr?sence de tissus et de cellules immunitaires humaines. Les b?n?fices attendus concernent principalement l?am?lioration des connaissances en sant? humaine et le d?veloppement futur d?outils de recherche pr?clinique.
Procédures
Les animaux utilis?s dans ce projet subiront diff?rentes interventions r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale. Dix souris recevront une anesth?sie g?n?rale dans le cadre d?une ?tude pilote de validation chirurgicale. Trente souris recevront jusqu?? 10 anesth?sies g?n?rales au cours de la mise en place et du suivi d?un mod?le comportant l?implantation de tissus pulmonaires humains. Soixante-quinze souris recevront jusqu?? 16 anesth?sies g?n?rales dans le cadre du d?veloppement d?un mod?le associant des tissus humains et un syst?me immunitaire humain reconstitu?. Les interventions chirurgicales seront r?alis?es une seule fois et dureront environ 20 ? 30 minutes pour le mod?le d?implant pulmonaire et 45 ? 60 minutes pour le mod?le de reconstitution immunitaire. Apr?s une p?riode de r?cup?ration, certains animaux recevront une injection locale de virus dans les tissus implant?s. Des suivis r?guliers seront r?alis?s tout au long du projet. Ils comprendront des s?ances d?imagerie sous anesth?sie g?n?rale afin de suivre l??volution de l?infection au cours du temps. Chaque s?ance durera moins de 15 minutes et pourra ?tre r?p?t?e jusqu?? 8 fois selon les groupes exp?rimentaux. Certains animaux feront ?galement l?objet de pr?l?vements sanguins sous anesth?sie afin d??valuer la reconstitution du syst?me immunitaire humain et le suivi de l?infection. Ces pr?l?vements seront r?alis?s ? intervalles espac?s, avec un maximum de 9 pr?l?vements de faible volume par animal sur l?ensemble de la proc?dure. Les animaux issus de l??levage feront ?galement l?objet d?un g?notypage, et les animaux inclus dans les proc?dures exp?rimentales seront identifi?s individuellement avant leur inclusion dans l??tude. La dur?e totale de participation des animaux au projet pourra atteindre plusieurs mois selon les proc?dures exp?rimentales.
Impact sur les animaux
Les souris utilis?es dans ce projet pr?sentent un d?ficit important du syst?me immunitaire, ce qui les rend plus sensibles aux infections et n?cessite des conditions d?h?bergement et de surveillance adapt?es. Les principales nuisances attendues sont li?es aux interventions chirurgicales n?cessaires ? l?implantation des tissus humains. Ces interventions peuvent entra?ner une douleur et un inconfort transitoires, principalement dans les jours suivant la chirurgie. Une prise en charge adapt?e de la douleur sera mise en place. Les manipulations r?p?t?es, les s?ances d?imagerie et les pr?l?vements sanguins peuvent ?galement provoquer un stress l?ger et temporaire. L?infection exp?rimentale pourra entra?ner des modifications localis?es des tissus implant?s, telles qu?une inflammation ou des l?sions du greffon pulmonaire humain. Une alt?ration mod?r?e de l??tat g?n?ral des animaux reste ?galement possible en raison de leur fragilit? immunitaire. Les animaux feront l?objet d?une surveillance r?guli?re tout au long du projet afin de d?tecter rapidement tout signe de souffrance ou d?alt?ration de l??tat g?n?ral. Des crit?res d?arr?t anticip? seront appliqu?s si n?cessaire afin de limiter la douleur et les nuisances.
Devenir
? l?issue des proc?dures exp?rimentales, tous les animaux seront mis ? mort afin de permettre le pr?l?vement des tissus et organes n?cessaires aux analyses finales. Ces analyses sont indispensables pour ?valuer la pr?sence du virus, l??tat des tissus humains greff?s et la reconstitution du syst?me immunitaire humain. Les animaux ne pourront pas ?tre r?utilis?s ou propos?s ? l?adoption en raison de leur immunod?ficience, des interventions chirurgicales subies et de la n?cessit? de r?aliser des analyses terminales incompatibles avec leur maintien en vie.
Remplacement
Le cytom?galovirus humain infecte uniquement les cellules humaines et ne peut pas ?tre ?tudi? de mani?re satisfaisante dans des mod?les animaux classiques. Des m?thodes alternatives, comme les cultures cellulaires, les organo?des ou les mod?les de tissus humains en laboratoire, sont utilis?es lorsque cela est possible pour ?tudier certains m?canismes de l?infection. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l?ensemble des interactions entre le virus, les tissus humains et le syst?me immunitaire dans un organisme vivant. Elles ne permettent pas non plus de suivre l??volution de l?infection au cours du temps dans des tissus humains vascularis?s et int?gr?s ? un organisme. Les mod?les de souris humanis?es utilis?s dans ce projet constituent actuellement la seule approche permettant d??tudier ces interactions dans des conditions proches de celles observ?es chez les patients greff?s et immunod?prim?s.
Réduction
Le nombre d?animaux utilis? dans ce projet a ?t? d?fini ? partir des donn?es de la litt?rature et des caract?ristiques des mod?les ?tudi?s, notamment les taux attendus de prise des greffons et de reconstitution du syst?me immunitaire humain. Ces param?tres ont ?t? pris en compte afin d??viter de r?p?ter les exp?riences et de limiter l?utilisation d?animaux suppl?mentaires. Le nombre d?animaux par groupe a ?t? limit? au strict n?cessaire pour obtenir des r?sultats scientifiquement exploitables tout en tenant compte de la variabilit? li?e aux tissus humains utilis?s. Le suivi de l?infection sera r?alis? de mani?re r?p?t?e chez les m?mes animaux gr?ce ? des techniques d?imagerie non invasives. Cette approche permet de limiter le nombre total d?animaux n?cessaires en r?duisant les comparaisons entre individus diff?rents. Le protocole exp?rimental a ?galement ?t? con?u afin de limiter le nombre de groupes exp?rimentaux et de r?duire autant que possible le recours ? des groupes t?moins suppl?mentaires.
Raffinement
Plusieurs mesures seront mises en place afin de limiter la douleur, le stress et les nuisances subies par les animaux tout au long du projet. Les souris seront h?berg?es dans des conditions adapt?es ? leur fragilit? immunitaire afin de limiter le risque d?infections. Elles seront maintenues en groupes sociaux autant que possible et b?n?ficieront d?un environnement enrichi pour r?duire le stress. Une p?riode d?acclimatation sera respect?e avant le d?but des proc?dures exp?rimentales. Les interventions chirurgicales seront r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale avec administration syst?matique de traitements contre la douleur avant et apr?s la chirurgie. Les animaux seront surveill?s jusqu?? leur r?veil complet puis feront l?objet d?un suivi r?gulier portant notamment sur leur ?tat g?n?ral, leur comportement, leur poids et la cicatrisation. Les techniques utilis?es ont ?t? choisies afin de limiter la dur?e des interventions et les complications. Les s?ances d?imagerie seront r?alis?es sous anesth?sie br?ve afin de limiter le stress li? aux manipulations. Des crit?res d?arr?t anticip? seront appliqu?s en cas de signes de souffrance ou d?alt?ration de l??tat g?n?ral afin de permettre une prise en charge adapt?e ou une euthanasie si n?cessaire.
Choix des espèces
La souris est un mod?le largement utilis? en recherche biom?dicale, notamment pour l??tude du syst?me immunitaire et des maladies infectieuses. Elle permet de r?aliser des ?tudes reproductibles dans un organisme vivant tout en limitant le nombre d?animaux n?cessaires. Les souris utilis?es dans ce projet pr?sentent un d?ficit important du syst?me immunitaire, ce qui permet l?implantation de tissus humains et, dans certains cas, la reconstitution d?un syst?me immunitaire humain. Ce mod?le est particuli?rement adapt? ? l??tude du cytom?galovirus humain, un virus qui infecte uniquement les cellules humaines et ne peut donc pas ?tre ?tudi? correctement dans des souris classiques. Cette souche permet ?galement l?implantation de cellules humaines sans recourir ? certaines proc?dures plus invasives habituellement n?cessaires dans d?autres mod?les, ce qui contribue ? limiter les nuisances pour les animaux. Les animaux seront inclus dans les proc?dures exp?rimentales ? l??ge de 8 ? 10 semaines, ?ge auquel leur d?veloppement et leur ?tat physiologique permettent de supporter les interventions chirurgicales dans de bonnes conditions. Selon les proc?dures exp?rimentales, les animaux pourront ?tre suivis pendant plusieurs mois afin de permettre la stabilisation des tissus humains implant?s, la reconstitution du syst?me immunitaire humain et le suivi de l?infection. Au maximum, les souris seront ag?es de 9 mois en fin de proc?dure.
Purpura thrombopénique immunologique : évaluation de l’efficacité de molécules thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
1 800 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à cinq administrations pour déclencher la maladie puis jusqu'à quarante administrations de composés, toutes sur souris éveillée. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger à modéré, avec cinq prises de sang au maximum puis un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse, et toutes les souris sont tuées pour des analyses immunologiques et histologiques. Le porteur écrit que les injections répétées peuvent provoquer de petits hématomes, et que la contention et la piqûre entraînent une douleur légère de quelques secondes. Aucun traitement ne guérit aujourd'hui le purpura thrombopénique immunologique, et l'attente affichée se limite à une hausse du taux de plaquettes chez les groupes traités.
Objectifs
Le Purpura Thrombopénique Immunologique (PTI) est une maladie rare dans laquelle le système immunitaire attaque par erreur les plaquettes, des cellules du sang indispensables pour arrêter les saignements. Cette destruction entraîne une diminution du nombre de plaquettes, appelée thrombopénie, qui peut provoquer l'apparition de bleus, de petites taches rouges sur la peau ou des saignements plus importants. Même si cette maladie n'est généralement pas douloureuse, elle peut avoir un impact important sur la vie quotidienne des patients, qui doivent parfois limiter certaines activités afin de réduire le risque de saignement. Chez l'enfant, la maladie guérit souvent spontanément en quelques semaines. Chez l'adulte, elle devient fréquemment chronique et peut persister pendant plusieurs années. Des traitements existent pour augmenter temporairement le nombre de plaquettes et réduire le risque de saignement. Cependant, leur efficacité est souvent limitée dans le temps et aucun traitement ne permet aujourd'hui de guérir définitivement la maladie. C'est pourquoi il est nécessaire de poursuivre la recherche afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques plus efficaces et durables.
Bénéfices attendus
Aucun traitement n’est efficace à ce jour pour guérir les patients atteints de PTI, l’efficacité des traitements proposés est transitoire. Le but est ici d'étudier d’autres pistes thérapeutiques. Nous nous attendons dans ce projet à une amélioration de la pathologie pour les groupes traités qui consiste notamment à une augmentation du taux plaquettaire dans le sang.
Procédures
Induction de la maladie: maximum 5 administrations (30 secondes/souris). Administrations de composés: maximum 40 administrations (30 secondes/souris). L’induction et les administrations se font sur animaux vigiles. Prélèvements de sang: maximum 5 prélèvements (30 secondes/souris) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes/souris).
Impact sur les animaux
Ce modèle n’induit aucune douleur à l'animal liée au développement de la pathologie. Aucune perte de poids n’est attendu. L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqûre de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Pour les traitements en gavage, aucune douleur n'est attendue mis à part un léger stress (quelques secondes) lié à la contention des animaux. Les effets secondaires liés aux candidats médicaments ne sont pas attendus.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques.
Remplacement
Le Purpura Thrombopénique Immunologique (PTI) est une maladie rare dans laquelle le système immunitaire attaque par erreur les plaquettes, des cellules du sang indispensables pour arrêter les saignements. Cette destruction entraîne une diminution du nombre de plaquettes, appelée thrombopénie, qui peut provoquer l'apparition de bleus, de petites taches rouges sur la peau ou des saignements plus importants. Même si cette maladie n'est généralement pas douloureuse, elle peut avoir un impact important sur la vie quotidienne des patients, qui doivent parfois limiter certaines activités afin de réduire le risque de saignement. Chez l'enfant, la maladie guérit souvent spontanément en quelques semaines. Chez l'adulte, elle devient fréquemment chronique et peut persister pendant plusieurs années. Des traitements existent pour augmenter temporairement le nombre de plaquettes et réduire le risque de saignement. Cependant, leur efficacité est souvent limitée dans le temps et aucun traitement ne permet aujourd'hui de guérir définitivement la maladie. C'est pourquoi il est nécessaire de poursuivre la recherche afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques plus efficaces et durables
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront soit de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou bien de comparer 2 groupes indépendants entres eux en prenant en compte 2 variables.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, des croquettes humides ou du gel de réhydratation seront ajoutés dans les cages. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : - Nos modèles d'études ont été développés sur les souches de souris C57BL/6, BALB/c dont les génomes possèdent 99% de similitude avec le génome humain, et ne présentent aucun gène manquant ou supplémentaire pouvant modifier l’intensité de la réponse immunitaire attendue. - La souris est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettent la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. - La souris de laboratoire est la plus utilisée par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. Le choix des souches de souris sera donné par le laboratoire donneur d’ordre, en fonction de ce qui a déjà été fait sur leurs candidats médicaments, de manière à assurer une continuité dans les résultats. Les animaux sont utilisés au stade adulte (7 semaines minimum) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature. Le paramètre étudié est l’évolution du taux plaquettaire sanguin. L’évolution de ce taux étant basé sur la destruction des plaquettes suite à la formation d’un complexe immun, une souris juvénile induira un biais dans l’expérimentation.
Nanomédecine pour la transplantation d’organes : évaluation de la tolérance induite par les nanoparticules dans un modèle porcin de transplantation hépatique.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Un carré de peau prélevé sur le flanc d'un porc donneur est greffé à un porc receveur pour le sensibiliser, et quatorze jours plus tard le foie du donneur lui est transplanté par ouverture de l'abdomen. 52 porcs, 26 donneurs et 26 receveurs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, l'intervention de transplantation durant deux heures trente. Les receveurs subissent ensuite des prélèvements de sang quotidiens pendant sept jours puis hebdomadaires, et jusqu'à huit d'entre eux une biopsie du foie sous anesthésie générale au trentième jour. Les donneurs sont tués immédiatement après le prélèvement de leur foie, les receveurs au plus tard quatre-vingt-dix jours après leur réveil, pour des prélèvements post-mortem.
Objectifs
A l’heure actuelle, la transplantation d’organes est limitée par l’utilisation d’une immunosuppression à vie (pour éviter les rejets de greffe) ce qui entraîne de nombreux effets indésirables parfois mortels tels qu’une plus grande susceptibilité aux infections, une fréquence accrue de maladies cardiovasculaires, et certaines formes de cancers. Le présent projet a été proposé pour explorer l’effet d’un traitement par nanoparticules pour induire une tolérance de l’organe transplanté afin d'éviter le rejet sans utiliser d’immunosuppresseur au long cours. Il s’agit ainsi dans un premier objectif d’évaluer un nouveau type de nanoparticules (nanoparticules d’oxyde de fer recouvertes de protéines capables de se lier à certains globules blancs) comme candidat médicament pour bloquer la réaction immune de rejet et induire la tolérance du greffon hépatique chez le modèle porcin. Ce projet a comme second objectif d’observer le bon fonctionnement des nanoparticules en recherchant la formation de cellules spécifiques du système immunitaire sous la forme de globules blancs aux propriétés anti-inflammatoires.
Bénéfices attendus
Il n’est pas possible actuellement de réaliser une greffe d’organe sans avoir recours à un traitement immunosuppresseur à vie. S’il s’avère efficace dans l’induction d’une tolérance durable, le traitement par nanoparticules faisant l’objet de ce projet pourrait transformer les suites à long terme de la greffe d’organes en supprimant les nombreux effets indésirables parfois mortels des immunosuppresseurs.
Procédures
Chez les animaux donneurs, sous anesthésie générale, prélèvement d’un carré de peau sur le flanc droit qui sera greffé au receveur pour le sensibiliser, puis 14 jours plus tard prélèvement du foie par laparotomie (incision de l’abdomen) qui sera greffé au receveur. Deux interventions (30 minutes et 1 heure). Chez les animaux receveurs, sous anesthésie générale, greffe du carré de peau prélevé sur le donneur. Ceci aura pour effet de sensibiliser le receveur à son donneur et favoriser la réaction de rejet. 14 jours plus tard, transplantation hépatique par laparotomie. Deux interventions (30 minutes et 2 heures 30 minutes). Des échantillons de sang de 5 mL environ seront prélevés après la procédure, puis tous les jours pendant 7 jours, via un cathéter spécifiquement mis en place afin d’éviter de multiplier les piqûres, une fois par semaine jusqu'au terme de la période de suivi. Chez 8 receveurs au maximum, une biopsie hépatique sous anesthésie générale sera réalisée en cours de suivi (30 jours). En fin de période d’observation, biopsie du greffon par laparotomie sous anesthésie générale avant euthanasie par surdose d’anesthésique (30 minutes).
Impact sur les animaux
Douleur modérée post-opératoire (laparotomie). Toxicité éventuelle du produit injecté pouvant induire un stress physique (les nombreuses études sur modèle murin utilisant ces nanoparticules aussi bien que des composés similaires n’ont mis en évidence aucun effet secondaire local ou systémique ; aucun effet de l’injection n’est donc attendu sur modèle porcin, d'autant plus qu'un précédent projet sur cette espèce n'a mis en évidence aucun effet secondaire du produit, mais dans l’hypothèse où cela se produirait, les points limites décrits par ailleurs seront respectés). Stress psychosocial léger du fait de l’hébergement initial en cages individuelles (même si les animaux ont toujours des contacts avec les congénères voisins).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort soit immédiatement après chirurgie de prélèvement hépatique sous anesthésie générale (animaux donneurs de foie, N=26), soit 90 jours maximum après le réveil post-transplantation (animaux receveurs, N=26) afin de pratiquer des prélèvements post-mortem à des fins d'analyses biologiques.
Remplacement
Les objectifs de ce projet sont d’une part d’évaluer l’effet thérapeutique in vivo d’un candidat médicament, et d’autre part de confirmer le mécanisme d’action de ce médicament au travers d’un modèle de transplantation hépatique. Le mécanisme d’action a déjà été montré expérimentalement dans un modèle in vitro. Avant d’envisager des études cliniques chez l’humain ce nouveau traitement doit impérativement être testé et montrer une efficacité sur un modèle in vivo pertinent. Le porc est l’animal de référence pour l’expérimentation médicale sur les greffes d’organes ; en effet son système digestif, son anatomie et sa physiologie générale sont proches de ceux de l’humain.
Réduction
Nous avons décidé d’inclure un nombre raisonnable d’animaux nécessaires pour obtenir une puissance statistique suffisante pour observer une différence significative entre les groupes expérimentaux en matière de rejet aigu ainsi que pour pallier d’éventuels imprévus (N=13 par groupe au total). Les différences entre les groupes seront analysées à l’aide de statistiques descriptives et de tests statistiques spécifiques à ce type d’étude. Chaque animal receveur sera associé à un animal donneur de même sexe. Les donneurs ne pourront pas servir à leur tour de receveur dans une optique de réduction car le foie doit être prélevé largement avec des vaisseaux les plus longs possibles empêchant la survie du donneur et l’implantation d’un foie en lieu et place de celui prélevé. De même, le foie explanté chez le receveur ne peut pas servir de greffon car les vaisseaux sont laissés les plus longs possible du côté du receveur pour permettre l’implantation du greffon.
Raffinement
Les techniques d’anesthésie et de chirurgie employées utilisent des appareillages de pointe et seront réalisées par des chirurgiens spécialistes de la transplantation hépatique chez l’humain, avec l’aide de personnels compétents en anesthésie et analgésie porcine. Le suivi et l’analgésie post-opératoires des animaux seront effectués par des personnels compétents de manière à réduire la douleur et la souffrance des animaux. Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et respecteront la charte nationale d’éthique sur l’expérimentation animale. Une prise en charge de la douleur per- et post-opératoire sera effectuée avec un traitement analgésique adapté à l'espèce et aux procédures. Des points limites précis ont été établis et une grille optimisée pour l'évaluation de la douleur et du bien-être animal sera utilisée.
Choix des espèces
Le porc est le modèle gros animal de référence pour l’expérimentation médicale sur les greffes d’organes. Son système digestif, son anatomie et sa physiologie générales sont proches de ceux de l’humain. Des porcs en croissance (30-40 kg) seront utilisés ca modèles porcins publiés dans le domaine de la transplantation et de la conservation des organes l’ont été sur ce type d’animaux.r les modèles porcins publiés en ischémie et transplantation hépatique l'ont été sur ce type d'animaux.
Évaluation d’un anticorps ciblant une voie immunitaire impliquée dans les maladies auto-immunes, dans un modèle d’inflammation cutanée induite.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Deux applications quotidiennes d'une crème inflammatoire sur le dos pendant quatorze jours, chacune avec dix à quinze minutes de contention, puis au quinzième jour une injection intraveineuse de trente minutes sur chaise de contention pendant une quarantaine de minutes : 20 macaques à longue queue vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent quatre prélèvements de sang de 2,5 ml, dix millilitres au total sur trois semaines, et quatre biopsies de peau par macaque sous anesthésie générale, précédées d'un jeûne pouvant aller jusqu'à seize heures. Le porteur attend des lésions cutanées, une fièvre par relargage de cytokines et des hématomes, signale qu'une déhiscence de plaie ou une infection du site de biopsie restent possibles, et projette un documentaire ou un dessin animé sur tablette pendant les contentions pour limiter l'ennui. Tous sont tués à la fin du projet pour que leurs organes soient récoltés.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de reproduire une réaction inflammatoire de la peau chez le macaque, similaire à celle observée chez l’Homme dans certaines maladies auto-immunes comme le psoriasis. Pour cela, une crème contenant un principe actif est appliquée sur la peau. Cette substance stimule le système immunitaire local et provoque une inflammation visible, avec des rougeurs, un épaississement de la peau et une infiltration de cellules immunitaires. Ce modèle permettra de tester l’efficacité d’un nouveau traitement. Ce traitement est un anticorps qui cible un type particulier de cellules immunitaires impliquées dans plusieurs maladies auto-immunes tel que le psoriasis. Au cours de l’étude, des échantillons de peau et de sang seront prélevés afin d’analyser les réactions de l’organisme, notamment au niveau de l’expression des gènes. Cela permettra de vérifier si le traitement agit comme attendu sur l’inflammation. Ce modèle a été développé en collaboration avec un partenaire scientifique afin de garantir sa pertinence. Les résultats obtenus pourraient contribuer, à terme, au développement de nouveaux traitements pour des maladies auto-immunes telles que le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la sclérose en plaques.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement basé sur un anticorps ciblant un type spécifique de cellules du système immunitaire, connues pour jouer un rôle important dans plusieurs maladies auto-immunes. L’étude permettra de vérifier si ce traitement est capable de réduire l’inflammation dans un modèle expérimental reproduisant certaines caractéristiques des maladies humaines. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre l’action de cet anticorps et de confirmer son intérêt comme approche thérapeutique. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer au développement de nouveaux traitements pour des maladies auto-immunes, comme le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la sclérose en plaques, avec l’objectif d’améliorer la prise en charge des patients grâce à des thérapies plus ciblées et adaptées.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux vigiles auront une application de crème sur une petite surface du dos identifiée, deux fois par jour pendant 14 jour. L’application de la crème et la contention durera environ 10 à 15 minutes. Cette contention pour l’application de la crème permettra également de faire une observation dermatologique rapprochée quotidienne du site d’application. Au 15ème jour, le modèle inflammatoire sera effectif, nous n’appliquerons plus de crème, et les animaux vigiles recevront un candidat médicament ou un contrôle par voie intra-veineuse de façon unique à différentes dose (contrôle, faible, moyenne, haute). L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux auront également 4 prélèvements de sang de 2,5ml, pour un volume total prélevé de 10 ml sur 3 semaines avant et après administration de l’élément d’essais. Les animaux seront vigiles lors des prélèvements de sang uniquement les jours sans biopsie de peau. Les jours de biopsie, les animaux seront anesthésiés, les prélèvements de sang se feront donc à ce moment-là. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris). Quatre prélèvements de peau par animal seront réalisés avant et après administration de l’élément d’essais, chez tous les animaux et sous anesthésie générale et analgésie (après une mise à jeun inférieur à 16h). Pendant cette anesthésie, des mesures spécifiques dermatologiques : plie de peau et taux de perte d’eau transépithéliale seront mesurés de manière non invasive avec des appareils de mesure spécifiques par un vétérinaire spécialisé. Le prélèvement durera environ 30 minutes (anesthésie et mesures comprises). Le suivi des paramètres physiologique (température et poids) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.
Impact sur les animaux
Sur la base du mode d’action du principe actif contenu dans la crème et de sa cible cutanée, des lésions au niveau de la peau pourront être observées. Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur potentielle cible sur le système immunitaire, une réaction systémique de type fièvre peut apparaître les jours suivant les administrations liées à un relargage de cytokines. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d’injection. Les prélèvements de peau sous anesthésie pourront provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement ainsi qu’un hématome et dans de très rare cas une déhiscence de plaie ou infection de la zone de prélèvement. L'anesthésie des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (maximum 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...). Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation.
Devenir
À la fin du projet, tous les animaux seront mis à mort dans le but de récolter les organes pour évaluer l’efficacité de l’élément d’essais.
Remplacement
Le modèle d’inflammation cutanée vise à reproduire une réponse inflammatoire cutanée complexe, impliquant des interactions immunitaires proches de celles observées chez l’homme. Ces caractéristiques sont essentielles pour garantir la pertinence des résultats et la prédictivité des réponses thérapeutiques. Bien que des modèles de peau in vitro permettent d’étudier certains mécanismes cellulaires, ils restent limités dans la reproduction de la complexité immunologique, vasculaire et systémique observée in vivo. À ce jour, aucune méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de capturer de manière fiable cette dynamique intégrée. La cible de l’anticorps est conservée chez le macaque et présente des caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques proches de celles observées chez l’Homme, justifiant le choix de cette espèce. L’utilisation des animaux demeure donc indispensable pour valider le modèle et assurer la transposabilité des données vers la clinique dans le cadre du développement de nouvelles thérapies.
Réduction
Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement exploitables. Un effectif de 5 animaux par groupe a été retenu afin de permettre la réalisation d’analyses robustes, tout en évitant une utilisation excessive d’animaux. Le design expérimental comprend 4 groupes (un groupe contrôle et trois groupes recevant des doses croissantes), permettant d’évaluer la relation dose-effet ainsi que de recueillir des données de pharmacocinétique au sein d’une même étude, limitant ainsi le recours à des expériences supplémentaires. Par ailleurs, le choix de cet effectif prend en compte la variabilité interindividuelle et génétique observée chez le macaque. Des études préliminaires menées sur un nombre restreint d’animaux ont mis en évidence plusieurs profils de réponse distincts à l’induction inflammatoire. L’augmentation du nombre d’animaux par groupe est donc nécessaire pour garantir la représentativité et l’homogénéité des groupes, tout en assurant la fiabilité de l’interprétation des résultats. Ainsi, le nombre total de 20 animaux constitue un compromis raisonné entre la réduction du nombre d’animaux utilisés et les exigences scientifiques nécessaires à la validation de l’étude.
Raffinement
Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux macaques d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, application de la crème). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple.
Choix des espèces
L’utilisation du macaque pour le modèle d’inflammation cutané induit par l’application d'une crème contenant un principe actif sur la peau est justifiée par sa similarité immunologique avec l’humain. Les macaques ont un système immunitaire proche de celui de l’humain, notamment au niveau des voies de signalisation impliquées dans la réponse inflammatoire. Ce modèle induit une inflammation cutanée et une activation immunitaire locale. Chez le macaque, ces récepteurs sont exprimés de manière comparable à l’humain, ce qui garantit une réponse pharmacologique et immunologique pertinente pour l’évaluation des thérapies. La cible de l’anticorp est conservée chez le macaque et présente des caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques proches de celles observées chez l’Homme, justifiant le choix de cette espèce. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements de peau seront réalisés dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.
Nouvelle stratégie de thérapie photodynamique avec un nouveau PS de 3ème génération pour le ciblage de la NRP1 dans le CPNPC
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Les souris utilisées sont immunodéficientes, privées de rate par ablation chirurgicale, et porteuses de cellules immunitaires et tumorales humaines greffées : 297 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après la splénectomie viennent une injection intrapéritonéale de cellules immunitaires humaines et une injection sous-cutanée de cellules tumorales, puis une injection intraveineuse d'un photosensibilisateur suivie trois heures plus tard d'une illumination de trente minutes, des injections intraveineuses hebdomadaires d'immunothérapie, des prélèvements de sang chaque semaine et des mesures de la tumeur au pied à coulisse. Dans les groupes témoins et chez les souris que le traitement ne freine pas, le porteur écrit que la tumeur continuera de croître jusqu'au point limite. Il conclut que "ces nécessités, éthiques et scientifiques" justifient la mise à mort des souris en fin de procédure, après avoir écrit : "Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite".
Objectifs
Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) est un cancer fortement immunogène. Le traitement de première intention repose sur des thérapies ciblées quand cela est possible ou des chimiothérapies de sels de platines avec ou sans immunothérapies. Cependant certains patients échappent au traitement. Dans ce contexte, il est indispensable de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Il s'agit pour nous d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements dirigés contre le CPNPC humain. Les paramètres de PDT-Neptune testées ont préalablement été sélectionnés sur un ensemble d'expériences réalisées sur les modèles cellulaires en laboratoire. Il s'agira donc de confirmer l'efficacité de la PDT-Neptune dans le cadre d'un être vivant complet humanisé. Les bénéfices à long terme seront de pouvoir mettre sur le marché un nouveau traitement et d'aider dans la lutte contre le CPNPC. L'analyse de l'importance de la réponse immunitaire sur leur mode d'action fait que ces futurs traitements pourront s'intégrer dans des programmes adaptés à chaque patient au bénéfice d'une médecine personnalisée.
Procédures
Toutes les procédures ont en commun la mise en place du modèle et pour cela les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale (10 min entre l’endormissement et le réveil). Une semaine après, les animaux subiront l’injection de cellules humaines (immunitaires en IP avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 26G (0.45 x 13 mm) et tumorales SC avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 23G (0.6 x 25 mm). Le modèle en place permettra de tester les traitements. Pour la PDT, les animaux auront une injection intra veineuse du PS Neptune et seront illuminées (extracorporel) 3h après pendant 30 min. L’immunothérapie sera ajoutée par une injection IV qui sera répétée toutes les semaines (1 fois par semaine) avec un cathéter 24G (0.7 x 19 mm) dans la veine caudale. Pour le suivi immunologique, un prélèvement de sang sera réalisé préalablement à tout traitement, puis une fois par semaine. Le suivi de la croissance se fera par 2 méthodes. Pour les procédures il s’agira d’utiliser les propriétés du modèle cellulaire et de faire un suivi par imagerie. Ce dernier nécessite l’endormissement sous anesthésie gazeuse des animaux, puis l’injection IP du substrat lumineux avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 26G (0.45 x 13 mm). Toutes les souris auront également le suivi régulier de la croissance par le pied à coulisse. En fin de protocole, l’ensemble des animaux sera euthanasié, le sang, la tumeur et les organes vitaux seront récupérés pour analyse complémentaires
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent être relevés sur ce projet lors de nos interventions : - injections / prélèvement sanguins / pesées ; ces actions nécessitent une contention qui peut générer un stress léger de courte durée mais répété - anesthésie; les anesthésies notamment gazeuses à l'Isoflurane peuvent également générer un stress léger de courte durée mais répété - acte chirurgical pour la splénectomie; peut générer un problème lors de la cicatrisation notamment une légère démangeaison pendant un maximum de 5 jours – la croissance tumorale: les cellules tumorales sont injectées en un point précis prévu pour ne gêner en rien le comportement normal de l'animal, un risque de gène du déplacement pourrait être observable au cours des 4 semaines mais cela sera strictement géré (cf. points limites).
Devenir
Tous les animaux auront reçu l'injection d’une masse tumorale suivi ou non d'un traitement expérimental. Selon l’efficacité des traitements la croissance de la tumeur sera ralentie voire disparaitra, dans le cas contraire et pour les groupes témoins, la tumeur continuera de croitre jusqu'au point limite critique pour son bien-être. Nous pouvons ajouter également que pour des raisons scientifiques, nous devons procéder à la récupération des tissus (sang, tumeur, organes vitaux) qui nous serviront à confirmer l'efficacité du traitement et confirmer son mode d'action. L'ensemble de ces nécessités, éthiques et scientifiques, justifient le sacrifice des animaux en fin de procédure.
Remplacement
Notre objectif est de tester l’efficacité anti tumorale de la PDT-Neptune (qui de plus est immuno-activatrice) seule ou en combinaison avec des Immunothérapies (réduction des mécanismes immunorégulateurs). Des travaux préalables ont été réalisés sur les modèles de lignées cellulaires. Ces résultats mettent en évidence la faisabilité du projet au travers de la validation de l'application de la PDT et/ou des Immunothérapies in-vitro ; dont plusieurs paramètres ont été ainsi fixés. Cependant, s'agissant de développer une nouvelle approche thérapeutique, il est primordial que celle-ci soit également évaluée dans un système physiologique complet, en ce sens un modèle in- vivo est le plus adéquat, voire nécessaire. Le suivi par bioluminecence permet de diminuer le nombre d'animaux, néanmoins, une validation de l'efficacité nécessite d'emblée que plusieurs groupes expérimentaux soient présents, notamment les groupes contrôles (PS Neptune seul ; pour la PDT), non traité, et traitement unique ou traitement combiné de manière à limiter quantitativement les expérimentations. Dans la mesure où la modélisation expérimentale cellulaire ou in-silico est trop imparfaite, ce type de modèle demeure indispensable à la validation de ces futurs traitements.
Réduction
Grâce à notre expérience nous bénéficierons de protocoles déjà approuvés et mis en place au laboratoire, ce qui permet de ne pas avoir à faire de mise au point. L'ensemble des animaux ne servira uniquement que pour l'étude de l'effet des traitements. Néanmoins, dans un souci de conservation de la fiabilité des résultats et pour ainsi éviter d'avoir à refaire les expériences, nous réaliserons des groupes d'étude suffisamment solides d'un point de vue biostatistique (validé grâce à l'outils de l'EDA). Ainsi, pour des modèles humanisés des groupes de 5 souris pour 5 reconstitutions seront suffisants. Le suivi de croissance tumorale se fera de manière externe sans nécessité de recours à une dissection, permettant ainsi un suivi longitudinal optimisé sans sacrifice. Enfin, il s'agira de ne tester que les molécules déjà présélectionnés pour leur efficacité dans les modèles précliniques in-vitro. Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite. Enfin, l'étude préalable du nombre d'animaux strictement nécessaire (grâce aux outils de l'EDA), nous permettra d'obtenir des résultats en quantité suffisante pour ne pas avoir à réitérer des lots expérimentaux.
Raffinement
Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de 5 animaux maximum par cage, dans un environnement enrichi (maison, carré de coton) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycles jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés 7 à 10 jours dans leur salle d'hébergement. Concernant le projet, nous avons cherché à optimiser l'expérimentation en mettant en place une méthodologie d'étude courte et efficace : suivi de tumeur sur un temps limité (4 semaines maximum), tout en minimisant les douleurs ou détresse. Nous avons ainsi choisi des modèles de souris dont nous connaissons les comportements et la capacité de prise de greffe. Les animaux plus jeunes, seront manipulés régulièrement et ainsi entrainés en vue d'une réduction du stress. En cours d'expérimentation, nous avons choisi de faire les greffes tumorales uniquement sous-cutanées (au flanc) de manière à ne gêner en rien la vie de l'animal (locomotion, alimentation), le suivi sera ainsi facilité par mesure manuelle externe sur animal vigile (mesure au pied à coulisse), ou grâce à un système d'imagerie par bioluminescence (l'animal sera alors sous anesthésie dans l'appareil à +37°C et aura préalablement reçu une injection de luciférine). Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite. Enfin, l'étude préalable du nombre d'animaux strictement nécessaire (grâce aux outils de l'EDA), nous permettra d'obtenir des résultats en quantité suffisante pour ne pas avoir à réitérer des lots expérimentaux.
Choix des espèces
Les souris sont des petits rongeurs qui permettent de réaliser des groupes cohérents et limités pour l'étude efficace des effets des molécules thérapeutiques testées en faibles quantités. Nous utilisons des souris SCID pour permettre la xénogreffe de cellules humaines (tumorales et immunitaires). Par ailleurs le campus dispose d'outils performants spécialement adaptés à la souris (Imagerie du petit animal). Les souris entreront en phase expérimentales à partir de l’âge de 7 semaines. Elles seront déjà sevrées et sexées. A ce stade de développement elles seront suffisamment robustes pour supporter les traitements et suffisamment grande pour supporter les injections et le développement des cellules tumorales.
Évaluation de l’immunogénicité et de l’efficacité d’un vaccin nasal contre l’infection au virus influenza dans un modèle préclinique murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
4 712 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant recevoir deux vaccinations sous anesthésie, une infection grippale intranasale et quatre ponctions du sinus submandibulaire à l'état vigile. Les procédures vont d'un niveau de souffrance léger à sévère, cette dernière classification portant sur l'infection grippale, que le porteur décrit avec une perte de poids, une prostration, une anorexie et un pelage hirsute entre le deuxième et le neuvième jour, et une mortalité possible chez les souris non vaccinées, le suivi comportemental annoncé après l'infection restant sans détail. Aucun antidouleur ni anti-inflammatoire ne leur est administré, le porteur indiquant que ces traitements modifieraient les résultats de l'étude. Les retombées annoncées, des formulations "transposables à l'Homme" et un renforcement des stratégies prophylactiques, sont renvoyées à l'issue du projet, quand la mortalité et les pertes de poids, elles, sont attendues dès les premières semaines.
Objectifs
Malgré la disponibilité de vaccins prophylactiques, les infections virales respiratoires restent insuffisamment contrôlées à l’échelle mondiale. L’efficacité limitée des stratégies actuelles s’explique notamment par la grande diversité antigénique des virus, leur capacité à franchir la barrière d’espèce, la durabilité restreinte de l’immunité induite par l’infection ou la vaccination, ainsi que par une réponse vaccinale souvent suboptimale chez les populations vulnérables. À cela s’ajoutent des facteurs sociétaux tels que l’hésitation vaccinale. Ces limites soulignent la nécessité de développer des approches antivirales alternatives et/ou complémentaires. Dans ce contexte, notre projet vise à développer une plateforme innovante dédiée à la prévention des infections virales respiratoires, avec un focus particulier sur le virus de l’influenza A (grippe). S’appuyant sur des données préliminaires solides et sur l’expertise conjointe de spécialistes en vaccination et en administration par voie respiratoire, ce projet ambitionne de concevoir de nouvelles stratégies d’immunoprophylaxie ciblant directement les muqueuses respiratoires. L’objectif principal est de concevoir et d’évaluer des candidats vaccins par la voie respiratoire, afin d’optimiser la réponse immunitaire locale et systémique. Ces approches seront administrées par voie nasale ou pulmonaire, dans le but d’induire une protection rapide, efficace et durable au niveau du site d’entrée des pathogènes. Ce projet vise ainsi à répondre à des enjeux scientifiques et cliniques majeurs, en proposant des solutions mieux adaptées à la prévention des infections respiratoires, notamment dans des contextes d’émergence virale ou chez des populations à risque.
Bénéfices attendus
Le projet vise à développer et évaluer une vaccination nasale contre le virus influenza A (grippe), ciblant directement les muqueuses respiratoires pour limiter l’infection initiale et la transmission. Il permettra de caractériser les réponses immunitaires locales et systémiques, d’analyser leur durabilité et d’évaluer l’intérêt d’un rappel nasal en complément des vaccins classiques par exemple. Les résultats contribueront à valider des formulations transposables à l’Homme et à renforcer le développement de stratégies prophylactiques innovantes contre les infections respiratoires.
Procédures
Au maximum, chaque souris pourra être soumise à deux vaccinations, réalisées soit par instillation intranasale, soit par administration oro-trachéale, sous anesthésie gazeuse (isoflurane). Chaque intervention durera environ 2 à 5 minutes, incluant l’induction anesthésique et le geste technique. Une semaine après la dernière vaccination, les animaux des procédures concernées pourront être soumis à une infection intranasale par le virus Influenza, sous anesthésie gazeuse, d’une durée d’environ 2 à 5 minutes. Tout au long de l’expérimentation, une prise de sang hebdomadaire pourra être réalisée (4 prélèvements maximum au total selon la durée du protocole), chaque prélèvement durant quelques secondes à 1 minute maximum. Pour les animaux soumis à l’infection influenza (procédures concernées), un suivi clinique post-infection sera réalisé, comprenant pesée, observation comportementale et score clinique, en quelques minutes par animal. La fréquence et le nombre exacts d’interventions dépendront de la procédure expérimentale concernée.
Impact sur les animaux
La vaccination intranasale a été administrée, dans notre laboratoire, chez des souris BALB/c et K18-hACE2 sans effet secondaire observé. Classée légère, cette procédure implique une manipulation respiratoire et une anesthésie ; toutes les précautions sont prises pour limiter gêne et stress. La vaccination oro-trachéale (intrapulmonaire) permet une délivrance reproductible de la solution dans les poumons. Réalisée sous anesthésie gazeuse à l’aide d’un cathéter, elle est classée modérée en raison de son caractère invasif et des risques respiratoires potentiels. Le prélèvement sanguin, classé léger, est effectué par ponction du sinus submandibulaire sur animal vigile. La douleur est limitée à la piqûre, le stress est généralement très bref. Cependant ce geste, peut entrainer un hématome au site de ponction. Le nombre de prélèvements est limité à 1 ponction maximum par semaine et par animal, en respectant les volumes sanguins autorisés (100μL de sang maximum). Les infections respiratoires sont généralement peu douloureuses car le poumon n’est pas un organe nociceptif. Toutefois, elles entraînent une inflammation et une gêne respiratoire pouvant devenir douloureuse selon l’intensité. Dans le modèle d’infection grippale chez la souris, les signes cliniques apparaissent entre J2 et J5 post-infection selon la dose et l’effet vaccinal, avec un pic entre J7 et J9. Ils incluent une perte de poids liée à une altération des comportements (prostration, anorexie, réduction de la prise d’eau, pelage hirsute). L’amélioration survient progressivement entre J10 et J12 avec retour au poids initial. Cette procédure est classée comme sévère en raison du stress physiologique et d’une mortalité possible chez les animaux non vaccinés.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.
Remplacement
L’étude des réponses immunitaires de l’hôte ne peut pas être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement biologique (interaction cellulaire, recrutements cellulaires, etc.). Cependant, nous investiguerons au maximum possible la mise en place d’étude in vitro complémentaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum nécessaire. Avant toute expérimentation chez l’animal, les candidats vaccins sont d’abord testés en laboratoire sur des modèles in vitro. Seuls les candidats les plus prometteurs sont ensuite évalués chez l’animal. Le protocole expérimental a été conçu de manière à obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux. Plusieurs types d’analyses sont réalisés à partir d’un même animal (réponse immunitaire, analyses des tissus, présence du pathogène), et les organes prélevés sont utilisés pour différentes études. Cette approche permet de maximiser les informations obtenues sans augmenter le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux par groupe ainsi que l’organisation des expériences ont été soigneusement calculés afin d’assurer la validité scientifique des résultats tout en évitant toute utilisation excessive. Les deux sexes sont inclus dans l’étude afin de prendre en compte les différences biologiques éventuelles entre mâles et femelles. Chaque groupe comprend un nombre équilibré d’animaux des deux sexes. Les résultats sont analysés à l’échelle du groupe, avec la possibilité d’examiner également l’influence du sexe si nécessaire. Dans l’ensemble, ce projet vise à trouver un équilibre entre la qualité scientifique des résultats et la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages enrichies (matériaux de nidification et éléments favorisant leur comportement naturel). Tout au long de l’étude, leur état de santé est surveillé plusieurs fois par jour par du personnel formé, afin de détecter rapidement tout signe de gêne ou de souffrance. Une attention particulière est portée dans les jours suivant l’infection, période durant laquelle les effets sont les plus susceptibles d’apparaître. Des mesures sont mises en place pour faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau, notamment pour les animaux les plus affectés (par exemple, mise à disposition de nourriture adaptée directement dans la cage). L’utilisation de traitements antidouleur ou anti-inflammatoires n’est pas possible dans ce modèle, car ils pourraient modifier les résultats de l’étude. Toutefois, des critères d’arrêt stricts sont appliqués afin de prévenir toute souffrance excessive et garantir le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Ce projet est réalisé avec des souris adultes, dont le système immunitaire est pleinement développé. La souris est un modèle couramment utilisé pour l’étude des réponses immunitaires et du développement de vaccins. Elle présente des similitudes importantes avec l’Homme, ce qui permet d’obtenir des informations pertinentes pour la recherche en santé. Différents types de souris sont utilisés afin d’étudier de manière complémentaire les différentes composantes de la réponse immunitaire. Cela permet d’évaluer à la fois la production d’anticorps et les réponses immunitaires plus complexes. L’utilisation de l’animal est nécessaire dans ce projet, car la réponse immunitaire implique de nombreux mécanismes et interactions entre différents organes, notamment les voies respiratoires. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits entièrement en laboratoire sur des modèles non animaux. Ce modèle permet également de suivre l’évolution de l’infection et de la réponse immunitaire dans le temps, dans un organisme entier. Enfin, les expériences sont conçues de manière à optimiser les données obtenues à partir de chaque animal, notamment en réalisant plusieurs analyses à partir des mêmes échantillons, afin de limiter le nombre total d’animaux utilisés.