Troubles immunitaires

1290 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent trois modèles d'inflammation provoquée, dont un psoriasis induit par une crème et une péritonite par injection, avec perte de poids, lésions cutanées et diarrhée déclarées. Le porteur teste des molécules ciblant la résolution de l'inflammation, en réponse aux effets secondaires des traitements actuels du psoriasis. Il indique avoir présélectionné ses molécules in vitro pour limiter le nombre d'animaux.

Objectifs

L’objectif de ce projet sera d’étudier l’efficacité préclinique de molécules ciblant les voies de la résolution de l’inflammation dans des pathologies pour lesquelles il a été décrit un déficit de cette résolution. Depuis quelques années il a été démontré que de nombreuses maladies inflammatoires chroniques sont causées par un échec de résolution de l’inflammation, c’est notamment le cas dans les maladies de la peau telles que le psoriasis. Les traitements les plus utilisés sont des pommades locales à base de dermocorticoïdes. Pour les formes les plus graves, des immunosuppresseurs peuvent être prescrit mais aussi de la chimiothérapie . Elles visent à inhiber le système immunitaire permettant une rémission des patients mais apportant de nombreux effets secondaires. Aujourd’hui de nouvelles stratégies thérapeutiques doivent être développées afin de proposer aux patients résistants ou en échecs de nouvelles possibilités d’avenir. Chez ces patients, un échec de résolution de l’inflammation a déjà été démontré. Ce mécanisme de résolution met en jeu différents récepteurs exprimés par les cellules de l’immunité et ciblés par des médiateurs lipidiques. Nous souhaitons, par ce projet, étudier l’efficacité préclinique chez la souris, de nouvelles molécules ciblant les récepteurs de la résolution de l’inflammation et permettant d’activer cette résolution lorsqu’elle est mise en échec. Pour cela nous comparerons notre traitement à un traitement de référence défini pour chaque modèle. Le nombre d’animaux utilisé sera de 1290 pour combiner un nombre réduit d’animaux avec une pertinence statistique. Au préalable des études in vitro seront effectuées afin de sélectionner 2 molécules à tester. Le suivi des animaux sera quotidien lors de la phase d’inflammation et de récupération afin de maitriser le plus adéquatement possible la douleur chez l’animal et de lui apporter les soins nécessaires le plus rapidement possible. Pour limiter le stress et l’inconfort, les animaux sont maintenus dans des cages ventilées dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu’un nombre maximum de 5 animaux/cage et des brindilles de papier pour s’enfouir et se cacher.

Bénéfices attendus

Actuellement les traitements pour les patients atteints de psoriasis sont des dermocorticoïdes, de la chimiothérapie ou bien des immunosuppresseurs. Depuis quelques années, les immunothérapies sont utilisées pour les formes sévères du psoriasis qui touchent environ 20% des patients. Les dermocorticoïdes, la chimiothérapie ainsi que les immunosuppresseurs induisent néanmoins de nombreux effets secondaires tels qu’une prise de poids, de l’hypertension, vomissement, perte de cheveux et des vertiges. Les immunothérapies utilisées lors des formes sévères, induisent, elles, une immunodépression du patient le rendant plus sensible aux infections du quotidien. De plus, et malheureusement, il a été démontré un échappement à ces immunothérapies dans 60% des cas moins d’un an après le début du traitement. Il est donc primordial de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces patients. Nous avons donc développé une nouvelle molécule ciblant les récepteurs de la résolution de l’inflammation. Ces molécules ne modifient pas l’initiation de l’inflammation et donc permettraient aux patients de ne plus être immunodéprimés et de pouvoir répondre à tout type d’attaque extérieur puisque leur système immunitaire serait totalement fonctionnel. Chez l’animal nous espérons pouvoir accélérer la phase de récupération des différents modèles que ça soit au niveau des signes cliniques pour le modèle de psoriasis ou sur l’infiltration cellulaire pour les modèles d'inflammation aigue. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’Homme afin de traiter les patients ayant échappés aux immunothérapies et de leur proposer une nouvelle stratégie thérapeutique.

Procédures

Pour l'un des modèles d'inflammation aigue les animaux subiront des injections en sous-cutanée afin de former la poche d'air (2 injections) et d'injecter l'agent inflammatoire (une injection), de plus ils subiront une injection intrapéritonéale pour les traitements. Le second modèle d'inflammation aigue sera induit par une injection intraperitonéale de l'agent inflammatoire et une injection intraperitonéale pour les traitements. Pour le modèle de psoriasis, les animaux seront traités par voie intrapéritonéale (injection 3 fois/semaine) et pourront subir un prélèvement sanguin (une fois). De plus une application quotidienne de crème Aldara sera faite durant 6 jours.

Impact sur les animaux

Modèle 1) l’application de crème induit une perte de poids chez l’animal durant les 4 premiers jours d’application, les souris récupèrent spontanément ensuite. Une perte de poids ainsi que la formation d’érythème et de desquamation seront observés chez l’animal, induisant une douleur légère durant les cycles d’application de la crème. Modèle 2) l’injection de l'agent inflammatoire dans le péritoine provoque quelques effets indésirables les premières heures : diarrhée, frisson, immobilité. Dès le lendemain les animaux ont récupéré. Modèle 3) La poche d’air n’induit aucune nuisance sur l’animal. L’injection de l’agent inflammatoire peut parfois amener des effets indésirables les premières heures : diarrhée, frissons mais cela est transitoire et s’estompe rapidement.

Devenir

Les animaux ne seront pas gardé une fois l'expérience terminée. En effet pour chaque modèle, differents prélèvements seront fait induisant obligatoirement la mort de l'animal.

Remplacement

Avant l’utilisation chez l’animal, nous sélectionnerons préalablement nos molécules par différents tests in vitro notamment d’affinité et d’avidité pour le récepteur mais aussi d’efficacité sur des cellules humaines. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux puisque seulement 2 molécules seront étudiées dans nos modèles.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis ainsi que les études pilotes permettent de réduire l’utilisation de l’animal puisque l’étude principale ne sera exécutée que sur l’étude pilote ayant démontrée une efficacité thérapeutique. En amont nous avons définis par un test statistique le nombre d'animaux nécessaire afin d'observer une différence significative dans nos expériences. Basé sur un test de distribution normale d'échantillons nous avons déterminé un nombre de 25 animaux necessaire pour obtenir une différence significative entre le groupe contrôle et le groupe traité dans nos expériences.

Raffinement

Les animaux auront une phase d’acclimatation de 5 jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront des anti-douleurs 2 fois/jours puis dans l’eau de biberon pour la nuit. Lorsque les points limites seront atteints, les animaux seront mis à mort. Les animaux ne seront pas maintenus au de-là des délais décrit pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire. L’animal sera maintenu en groupe (5 animaux/cage), avec des brindilles pour se camoufler ainsi que des dômes lorsque cela sera nécessaire. Si un animal montre de l’agressivité il sera isolé afin de préserver les autres animaux et mis dans une cage avec des enrichissement de type : dôme ou tunnel, brindilles

Choix des espèces

Le modèle de psoriasis et de péritonite seront étudié sur une souche de souris qui est la plus sensible pour déclencher un psoriasis et une péritonite. Le modèle d’AirPouch sera lui étudié sur une autre souche qui est la souche décrite pour ce modèle. Les animaux seront utilisés entre 7 et 10 semaines car l’inflammation générée les différents agents inflammatoires est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces où avancés ou les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections d'un anticorps thérapeutique et subissent huit prélèvements de sang sur 42 jours, avant une mise à mort pour prélèvements terminaux. Le porteur cherche à vérifier si son anticorps déclenche une réaction immunitaire, une étape qu'il présente comme imposée par la réglementation avant un passage en clinique. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" non animale pour reproduire ces mécanismes physiologiques.

Objectifs

Le potentiel thérapeutique des anticorps médicaments ne cesse de croître avec d’indiscutables succès. Mais le bénéfice clinique de leur utilisation peut être compromis par l’induction d'une production d’anticorps anti-médicaments par l'organisme lui-même. Cette réaction, de production d’anticorps anti-médicaments, est appellée communément "réponse de type ADA", elle altère l’efficacité des anticorps médicaments ainsi que leur devenir dans l'organisme, ce qui peut aboutir à leurs éliminations. La réglementation, concernant le développement préclinique de molécules médicaments, impose de rechercher dans des modèles animaux une éventuelle production d'anticorps anti-médicaments. Nous souhaitons dans cette étude savoir si des injections répétées d'un anticorps médicaments développé pour le traitement d'une maladie auto-immune, le lupus, induit une réponse de type ADA chez la souris. La voie d’injection étant un paramètre non négligeable dans l'apparation des ADA, trois voies d'inoculation seront comparées : la voie intraveineuse, la voie sous-cutanée et la voie intrapéritonéale (cette dernière étant la plus immunogène).

Bénéfices attendus

A court terme, la réalisation de ce projet permettra de recueillir des données in vivo et vérifier si notre anticorps thérapeutique induit ou pas une réponse de type ADA chez la souris. A long terme, ce projet va permettre la poursuite du développement de notre anticorps en clinique humaine.

Procédures

Les souris seront soumises à 5 injections d'anticorps d'une durée de 1 à 5 minutes maximum sur animal anesthésié ou vigile. 8 prélèvements sanguins sur animal vigile seront réalisés sur une durée de 42 jours (soit une moyenne d'un prélèvement tous les 6 jours).

Impact sur les animaux

Du stress sera engendré lors des pesées, 5 pesées de moins de 30 secondes au total pour chaque animal et lors des 5 anesthésies gazeuses d'une durée de 5 minutes réalisées pour les injections sous-cutanées ou intraveineuses. Une douleur légère sera engendrée par les injections intrapéritonéale d'anticorps, un total de 5 injections de moins de 30 secondes par animal espacée de 3 à 4 jours. Du stress lors des prélèvements sanguins sera engendré lors de la manipulation des souris qui seront positionnées dans un tube à contention prévu à cet usage (durée de 2 minutes maximum) ainsi qu'une douleur légère liée à la piqûre de l'aiguille dans une des veines saphènes (8 piqûres par animal espacées d'une semaine) pour collecter le sang (durée de moins de 30 secondes). Une douleur légère sera également engendrée lors de l'injection intrapéritonéale d’un mélange anesthésique/antalgique réalisée avant la mise à mort de l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure pour réaliser des prélèvements terminaux de tissus et de sang.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animales pour réaliser ce projet car les études de pharmacocinétique font intervenir des mécanismes physiologiques complexes qui ne peuvent être reproduits en dehors d’un être animal. Nous avons besoin de réaliser des prélèvements de sang pour évaluer si la souris produit des anticorps contre notre anticorps thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par lot est calculé pour obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Si tous les prélèvements de sang étaient réalisés sur un même animal, l'état d’anémie serait certain et leurs fréquences auraient également un impact sur la tolérance aux futurs prélèvements et surtout aux interférences avec les résultats. Ce projet ayant une approche longitudinale, nous avons fait le choix de doubler chacun des groupes afin d'alterner les prélevements sanguins, ce qui nous permet d'une part d'éviter de déstabiliser l'homéostasie de la souris et nous permet d'intégrer des points pour gagner en puissance. Les volumes de prélèvements de sang seront limités pour obtenir la quantité nécessaire afin de réaliser les analyses voulues. Dans le principe de la réduction, nous avons un seul groupe contrôle, celui avec l'anticorps contrôle injecté par voie intrapéritonéale, cette voie d'injection est la plus immunogène si cette réponse est visible, elle le sera dans ce groupe. Ceci nous permet de réduire le nombre d'animaux de 20 souris.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Une anesthésie sera mise en place pour réaliser les injections sous-cutanées et intraveineuses.

Choix des espèces

Pour ce projet nous avons choisi d’employer des souris BALB/c qui sont couramment utilisées dans des études de pharmacocinétique et de bio-distribution des anticorps thérapeutiques. Les animaux utilisés seront âgés de 7-8 semaines, c’est-à-dire un stade adulte pour que leur système immunitaire soit à maturité et la réponse métabolique optimale.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées puis greffées par injection, pour étudier le rôle d'une hormone du fer dans la maladie du greffon contre l'hôte, complication fréquente des greffes de moelle. Le porteur indique que la maladie provoque une perte de poids, une alopécie et une desquamation de la peau, et que les souris sont mises à mort pour prélever peau, intestin et foie. Il affirme qu'il est impossible de reproduire le système immunitaire in vitro et conclut que l'expérimentation animale est un "élément clé" du projet, les retombées thérapeutiques restant formulées au conditionnel.

Objectifs

La greffe de moelle est un traitement majeur de nombreux cancers du sang. Dans certaines formes de leucémies aiguës notamment, il s’agit du seul traitement permettant potentiellement d’obtenir la guérison. L’efficacité de la greffe de moelle est limitée par les complications de ce traitement. En effet, dans près de 50% des cas, la greffe de moelle se complique d’une réaction immunitaire appelée maladie du greffon contre l’hôte. La maladie du greffon contre l’hôte est caractérisée par une toxicité de certains organes : principalement la peau, le tractus gastro-intestinal et le foie. Cette complication est parfois gravissime puisqu’elle entraîne le décès du patient dans environ 15% des cas. Il s’agit de la principale cause de décès après greffe de moelle. De manière intéressante, il a été montré que la surcharge en fer chez les patients exacerbait la maladie du greffon contre l’hôte, suggérant un rôle du fer dans la pathogenèse. L’hormone clé de régulation du fer est principalement secrétée par le foie mais peut être exprimée localement dans la peau et intestin et joue un rôle majeur dans le recrutement de cellules immunitaires. Des données montrent l’expression de cette hormone dans la peau et l’intestin de patients souffrant de la maladie du greffon contre l’hôte. Le projet visera à comprendre le rôle de cette hormone et du fer dans le développement de cette maladie.

Bénéfices attendus

Dans la peau et l’intestin, l’hormone du fer pourrait avoir un rôle inflammatoire en induisant d’une part la surcharge en fer dans les cellules de ce tissu et d’autre part en activant les cellules immunitaires. Ce projet pourrait avoir des retombées en recherche fondamentale (meilleure connaissance des processus de la GVH) mais également en recherche appliquée en proposant de cibler l’hepcidine ou le fer en thérapeutique dans cette pathologie.

Procédures

Sur animaux vigiles : - Les souris seront irradiées pendant 3 minutes 30 (quelques secondes de contention pour les placer dans les boites d’irradiation). - 3 heures après irradiation: les souris subiront une injection intraveineuse caudale (100 ul ; temps de contention de 20 secondes). - 14 jours post-greffe : prélèvement sanguin de 50 ul via la veine mandibulaire par simple contention (20 secondes) à l’aide d’une lancette. - 1 mois post-greffe : Injection sous-cutanée (100 ul Buprénorphine à 0,1mg/kg) avec une aiguille de 26G 1⁄2 (temps de la réalisation impliquant la contention: 20 secondes). 30 minutes après, sur animaux anesthésiés à l’isoflurane (1 minute par souris) à 4% avec un mélange d’air, 500ul de sang sera prélevé par voie rétro-orbitale à l'aide de capillaires héparinés (Hirschmann TM).

Impact sur les animaux

L’irradiation (sans transplantation) provoque (aux cinétiques étudiées) une rougeur de la peau. La maladie du greffon contre l'hôte va induire une perte de poids, une alopécie et une desquamation de la peau (formation « d’écailles »).

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever la peau, l’intestin et le foie ainsi que le sang afin de mesurer différents paramètres biologiques.

Remplacement

Des tests in vitro sur des cellules de la peau ont été effectués en amont pour déterminer le rôle de l’hormone du fer dans l’inflammation. Nous avons en parallèle accés à des biopsies de patients atteints de la maladie du greffon contre l'hôte. Les modèles animaux sont utilisés ici dans le but d'obtenir un modèle pathologique proche de celui développé chez l’homme. Au cours de la « maladie du greffon contre l’hôte » de nombreuses cellules immunitaires sont impliquées et leurs interactions ont un rôle fondamental dans le développement de la maladie. De plus, cette réaction du greffon congre l'hôte est caractérisée par le déclenchement de symptômes, uniquement observables in vivo. Il est donc impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire uniquement par des études in vitro. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permet de calculer au plus juste le nombre d'animaux à utiliser.

Raffinement

La durée et la dose de traitements utilisées seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les souris sont mises sous antibiotique pour éviter tout risque d’infection. Des analgésiques et anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin et en cas de mal être. Les animaux sont en groupes sociaux et disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.

Choix des espèces

Les réactions observées au cours de la « maladie du greffon contre l’hôte » chez la souris sont les mêmes que celles observées chez l'homme. Des souris adultes de de 8 à 12 semaines seront utilisées, car à cet âge, le système immunitaire est mature ce qui est indispensable à l’étude de la « maladie du greffon contre l’hôte ».

441 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie des mâles subit une ablation des testicules sous anesthésie, toutes sont infectées par un ver intestinal avec prélèvements sanguins répétés, puis euthanasiées quatorze jours après l'infection pour analyser la charge parasitaire et la réponse immunitaire. Le porteur indique que la chirurgie peut induire de faibles douleurs abdominales et affirme que le parasite, éliminé naturellement par les animaux, ne s'accompagne pas de douleur. Il conclut que la coordination des cellules immunitaires dans plusieurs organes ne peut être reproduite in vitro.

Objectifs

Comme c'est le cas pour la plupart des infections microbiennes, les individus mâles éliminent plus difficilement les parasites que les femelles. Les objectifs de notre projet seront d'identifier les mécanismes biologiques à l'origine de la plus grande susceptibilité des mâles à des infections par des parasites intestinaux. Nous évaluerons si la réponse immunitaire anti-parasitaire est différente entre les souris mâles et les femelles lorsqu'ils sont infectés avec le ver intestinal Strongyloïdes Ratti. Nous étudierons si les hormones sexuelles mâles, les androgènes, influencent la réponse immunitaire anti-parasitaire en particulier en régulant une population immune clé dans l'élimination des parasites, les cellules lymphoïdes innées de type 2.

Bénéfices attendus

La prise en compte des différences liées les sexes dans la santé et la maladie a toujours été négligée, voire intentionnellement mise de côté. Cependant, à l'ère du développement d'approches thérapeutiques personnalisées, il est essentiel de considérer le sexe comme une variable critique pour les maladies infectieuses. Connaître les mécanismes à l'origine des biais de sexe dans l'immunité permettra non seulement une meilleure connaissance physiopathologique des maladies chez les hommes et les femmes mais aussi le développement de nouvelles pistes thérapeutiques. Ce projet permettra de contribuer à identifier les mécanismes à l'origine de la plus grande susceptibilité des individus mâles aux maladies parasitaires.

Procédures

Une partie des animaux sera orchidectomisée (ablation des testicules) afin d'éliminer la source principale de production des androgènes (durée de l'opération = 5 min/souris). L'opération aura lieu sous anesthésie générale (l'animal est anesthésié pendant 60 min environ par une injection qui dure moins de 10 secondes). Toutes les souris seront infectées avec le parasite S. ratti (durée de l'infection = 1 min). Leur sang sera aussi prélevé à jour 0, 6 et 12 post-infection (durée de la prise de sang = moins d'1 min). L'infection et le prélèvement de sang auront lieu sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie = 2 min). Nombre total d'interventions chez les animaux non castrés = 4. Nombre total d'interventions chez les animaux castrés = 6

Impact sur les animaux

Les animaux récupèrent parfaitement d'une orchidectomie. Cependant, la chirurgie peut induire de faibles douleurs abdominales post-opératoires. Le parasite qui sera administré est naturellement éliminé par les animaux immuno-compétents qui seront utilisés dans ce projet. Son administration ne s'accompagne pas de douleurs chez les animaux.

Devenir

A l'issue de l'orchidectomie, les souris mâles castrés ainsi que d'autres lots d'animaux seront infectés par le parasite s.ratti. 14 jours après l'infection, toutes les souris seront euthanasiées. Les souris seront euthanasiées afin que nous prélevions et analysions dans les tissus (intestin, poumons) la charge parasitaire ainsi que le niveau d'inflammation et la réponse immunitaire induite par le parasite.

Remplacement

Les mécanismes de défense mis en place pour éliminer les parasites sont complexes. Ils nécessitent l'implication de plusieurs types de cellules immunitaires qui agissent de manière coordonnée et séquentielle avec des cinétiques précises dans différents organes (Intestins, poumons). Ces différentes étapes ne peuvent donc pas être reproduites in vitro.

Réduction

Les calculs de puissance statistique pour obtenir des résultats interprétables et reproductibles ont mis en évidence qu'un nombre de 7 animaux par groupe est requis. Nous répéterons les expériences 3 fois. Nous essayons d'effectuer le maximum d'analyse sur le même animal : analyse des tissus inflammés par histologie, analyse en cytométrie en flux pour analyser la nature, le phenotype et la fonctionnalité des cellules immunitaires infiltrant les tissus post-mortem et prélevements sanguins et de fèces au cours du temps pour évaluer l'inflammation et la charge parasitaire sur animal vivant.

Raffinement

Ce modèle n'induit généralement pas de dommages chez la souris qui, lorqu'elle est immuno-compétente comme c'est le cas avec les animaux ici utilisés, est capable d'éliminer complètement le ver. Les souris infectées ne perdent généralement pas de poids et n'ont pas de signes de douleurs apparentes. Cependant, les animaux seront attentivement observés après l'infection. Le poids des animaux sera mesuré et si les souris devaient perdre 20% de leur poids initial ou si nous observons des signes de douleurs apparentes (isolement, baisse importante de l'activité, posture voûtée ou prostrée, pilo-érection, absence de toilettage), l'animal sera mis à mort. Le même soin sera apporté aux animaux ayant subi une orchidectomie qui est cependant une procédure dont les animaux se remettent parfaitement mais qui recevront en complément un bolus d'antalgique en post-opératoire. Les animaux seront placés dans des cages avec enrichissement : igloo/maison, papier kraft pour nidification.

Choix des espèces

Tout comme chez l'Homme, il existe des biais de sexe dans les infections parasitaires chez la souris, les souris mâles étant plus sensibles aux infections. Du point de vue immunitaire, les souris présentent des caractéristiques proches de l'espèce humaine. Nous disposons aussi de modèles murins génétiquement modifiés qui nous permettront d'évaluer de manière directe si la plus grande susceptibilité des mâles à être infectés par un parasite est en partie expliquer par l'inhibition de la réponse immunitaire par les androgènes. Une partie des animaux mâles sera orchidectomisée autour de 4-5 semaines de vie, avant maturité sexuelle. Tous les animaux seront ensuite infectés à l'âge adulte avec les parasites (9-15 semaines).

390 lapins et poules vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections destinées à leur faire produire des anticorps, puis des prélèvements sanguins répétés, avant d'être mis à mort pour récupérer la quasi-totalité de leur sang. Le porteur décrit des réactions locales possibles, gonflement ou abcès, et générales, fièvre, perte de poids, baisse d'activité. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est assez efficace, écartant la production d'anticorps par criblage de phages jugée "décevante" malgré son existence depuis 1990.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux suite à des immunisations de poules et lapins. Ces anticorps seront notamment utilisés pour la recherche (immunologie, oncologie, immunohistochimie, biomédicale…), en médecine, pour la réalisation de test de diagnostic… Ce projet respecte la réglementation relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques en vigueur.

Bénéfices attendus

1) Obtenir des quantités suffisantes d'anticorps polyclonaux pour pouvoir travailler dessus. 2) Approfondir les connaissances nécessaires pour l'avancement de la recherche dans les domaines suivants : immunologie, oncologie, immunohistochimie, recherche biomédicale, médecine... 3) Faire évoluer les tests de diagnostic. 4) Trouver de nouvelles pistes d'applications thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types d'interventions : des injections et des prélèvements sanguins. Le nombre d'interventions sera dépendant du protocole de l'étude mais chaque intervention sera de courte durée. Un délai adapté au produit administré sera dispensé entre chaque injection. Un temps de récupération sera également dispensé entre chaque prélèvement sanguin. Ce temps de récupération sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention, stress dû aux injections et aux prélèvements, possibilité d'observation chez les animaux de réactions locales (gonflement, abcès...) et/ou générales (augmentation température, perte de poids, diminution de l'activité...) après les administrations.

Devenir

Les animaux inclus dans ces études seront mis à mort afin de récupérer la quasi-totalité du volume sanguin circulant selon les besoins et surtout de respecter le principe de précaution.

Remplacement

La production d'anticorps (AC) polyclonaux nécessite 1 immunisation de l'animal dans le cadre de ce projet. Il n'existe actuellement aucune méthode substitutive assez efficace pour répondre aux objectifs du projet. Une nouvelle approche a été publiée en 1990 pour le développement d'AC par un système de criblage de collection de phage qui ne nécessite pas l'immunisation d'animaux, mais les résultats restent très décevants. En effet, depuis 1990, aucun anticorps n'est utilisé en thérapie ou en diagnostic clinique malgré un certain nombre de publications scientifiques utilisant cette technologie. Seuls 1 AC anti-TNFα et plus récemment des AC neutralisants du SARS-Cov-2 ont été développés à partir de collection de donneurs humains dont les derniers sont des donneurs ayant été en contact avec le virus, donc immunisés. A ce jour, l'alternative aux immunisations animales consiste à développer des AC synthétiques à partir de banques ou "Library" synthétique pour le criblage d'un nombre important de fragments de molécules ("binders"), ayant une bonne interaction avec l'antigène. Ces fragments sont plus petits que les AC et peuvent réagir avec une certaine affinité avec l'antigène mais aussi tout autre antigène ayant une structure proche de celle recherchée. Ces réactions croisées sont, parmi d’autres inconvénients, souvent rencontrées par cette approche synthétique. Un autre inconvénient majeur, est que le fragment ne reconnait qu’1 seul épitope (partie d'une molécule capable de stimuler la production d'un anticorps), alors qu’un sérum polyclonal est multi-épitope, ce qui permet d’augmenter la sensibilité de la détection et aussi faciliter son développement dans le temps. Tous les AC synthétiques développés et publiés à ce jour sont dirigés contre des protéines recombinantes qui ont été utilisées pendant les étapes de criblage. Leur utilisation est très limitée et ne dépasse pas l’étape de résultats préliminaires, puisqu’ils ne reconnaissent pas les protéines endogènes (élaborées par l'organisme) qui ont des structures natives et conformationelles. Les AC synthétiques ne reconnaissent pas certaines modifications des protéines qui leur donnent telle ou telle fonction biologique. C'est pourquoi la majorité de ces anticorps n'est pas utilisée par la communauté scientifique qui continue de travailler et publier avec les anticorps conventionnels. L'approche de criblage par phage est testée en parallèle pour comparer les performances et valider ou non cette alternative.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum. Entre 2 et 6 animaux (poule ou lapin) seront inclus par étude. Le nombre sera choisi en fonction des volumes de sang que l'on peut prélever afin d'obtenir une quantité suffisante d'anticorps. Pour les poules, un nombre de 8 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 240 poules sur 5 ans (calcul à partir de 6 poules par étude). Pour les lapins, un nombre de 5 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 150 lapins sur 5 ans (calcul à partir de 6 lapins par étude). La réglementation en vigueur relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques sera respectée.

Raffinement

Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (exemples : lapins = bois à ronger, foin/paille, de quoi grimper et se cacher... ; poule = perchoir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères et un enrichissement compensatoire. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Surveillance accrue de l’animal durant les manipulations. 4) Une période d'acclimatation adaptée sera dispensée avant la 1ère administration et/ou prélèvement, afin de permettre aux animaux de s'adapter à leur environnement et de s'assurer de leur bon état de santé. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, les manipulations seront réalisées dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lapin est une espèce particulièrement immunoréactive, permettant ainsi d’obtenir un sérum disposant d’une concentration importante en anticorps, avec des anticorps de forte affinité. En plus de leur immunoréactivité importante, les poules disposent d’anticorps spécifiques, les immunoglobulines Y, notamment extraits à partir du jaune d’oeuf. Ainsi, l’immunisation de poules permet de contrôler facilement le taux d’anticorps en limitant la contrainte imposée aux animaux. De plus, il existe des différences de séquences entre la partie constante des immunoglobulines Y et des immunoglobulines G. L’utilisation d’immunoglobulines Y permet ainsi de réduire le bruit de fond, les réactions croisées et les signaux aspécifiques. Les anticorps de poules sont également une alternative aux anticorps de lapin pour les expériences nécessitant des anticorps provenant de plusieurs hôtes différents. Le choix de l’espèce se fera donc en fonction de l’utilisation prévue des anticorps. Les lapins seront âgés de 6 semaines à 2 ans environ et les poules d'1 jour à 2 ans environ, car c’est à ces stades qu’ils sont entièrement immunocompétents.

1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections vaccinales répétées et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire, geste pouvant provoquer des douleurs oculaires et des lésions de l'œil. Une société privée teste des candidats vaccins contre les allergies et affirme qu'aucune méthode in silico, in vitro ou ex vivo ne permet de mesurer la production d'anticorps neutralisants. Elle justifie de tuer toutes les souris par leur "mémoire" immunitaire les rendant inutilisables pour de nouvelles vaccinations.

Objectifs

Les allergies sont aujourd’hui un problème de santé publique. Ces affections très répandues, particulièrement dans les pays développés, touchent 25 % de la population européenne. Elles sont dues à un dérèglement du système immunitaire qui devient hypersensible à des substances généralement inoffensives. Ceci se traduit par la dérégulation de certaines cytokines et conduit à l’apparition de la pathologie chez l’individu. Ce projet s’inscrit dans le cadre de développement de vaccins contre les allergies. Au sein de notre société, nous avons développé une stratégie de vaccination qui permet de produire, chez le patient, des anticorps contre la cytokine sur-exprimée. Ce vaccin appelé ‘Kinoïde™’ peut se présenter soit sous forme de proteine, soit sous forme d’un acide ribonucleique messager (ARNm). Il n’existe pas à ce jour de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immunologique à un vaccin, ce qui nous contraint à les tester chez la souris. L’efficacité du vaccin sera évaluée selon sa capacité à induire une réponse immunitaire capable de bloquer l’activité biologique de la cytokine. Dans le cadre de ce développement, nous devons sélectionner le meilleur candidat vaccin qui induira une réponse immunitaire efficace et de longue durée chez la souris. Pour cela, nous devons dans un premier temps tester plusieurs paramètres spécifiques à chaque vaccin. Nous allons ainsi tester un nombre croissant de doses de vaccin (en deux et trois injections), plusieurs formulations vaccinales ainsi que deux voies d’administration (intramusculaire et souscutanée). Ces études permettront de valider et de sélectionner le vaccin induisant la meilleure réponse immunitaire. Dans un second temps, nous confirmerons l’efficacité du vaccin grâce à des modèles expérimentaux d’allergies développés chez la souris. Une fois l’effet thérapeutique démontré, le vaccin entamera les étapes de fabrication en vue des phases cliniques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à définir les meilleures conditions d’immunisation, à savoir, la dose de vaccin à injecter, la voie d’administration et le schéma d’immunisation et de prélèvements des vaccins kinoides développés dans notre laboratoire. Les candidats vaccins sélectionnés seront ensuite évalués pour leur efficacité dans des modèles expérimentaux d’allergies developpés chez la souris et à plus long terme chez l'Homme.

Procédures

1) Administration du vaccin : L'injection du vaccin est réalisée sur animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes soit par voie intramusculaire soit par voie sous-cutanée. Les animaux recevront soit deux injections de vaccin (aux jours 0 et 21) soit trois injections de vaccin (aux jours 0, 7 et 28). Il a déjà été démontré dans la littérature que pour obtenir une réponse immunitaire efficaces 2 ou 3 injections de vaccins étaient nécessaires. 2)Prélèvement sanguin: Les animaux sont anésthésiés à l'isoflurane pendant 5min. Ensuite, le prélévement de sang est réalisé en moins de 30 secondes. Les animaux subiront soit trois prélèvements (aux jours -7, 38 et 58) soit sept prélèvements (aux jours -7, 21, à mois 2, à mois 3, à mois 6, à mois 9 et à mois 12).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus à l’injection ou au prélèvement au sinus retro orbitaire. Les effets secondaires liées au candidat vaccin ne sont pas attendus. Le principe du vaccin étant de provoquer une réponse immune, des effets indésirables de type inflammatoire peuvent se produire principalement au site d’injection et se manifester par des oedèmes et érythèmes pouvant durer quelques heures à quelques jours. L’injection par voie intramusculaire se faisant dans le muscle de la patte arrière, une douleur musculaire localisée pourra être détectée quand l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les prélèvements sanguins se faisant au niveau du sinus rétro-orbitaire, des effets indésirables sur l’oeil peuvent se produire. La survenue de contractions répétées et involontaires des muscles des paupières (blépharospasme), la sécrétion lacrymale éventuellement accompagnée de photophobie, les écoulements, la survenue d'oeil rouge ou opaque seront examinés, puisqu'ils traduisent des douleurs oculaires et l'état des yeux.

Devenir

L'ensemble des animaux (1040) seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, celles-ci conserveront une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire.

Remplacement

L'étude de l'immunogénicité de nos candidats repose sur la mesure de la production d'anticorps neutralisant après immunisation. La production d'anticorps suite à l'injection d'un vaccin nécessite la mise en place de nombreux processus biologiques et le recrutement de divers types cellulaires. Il n’existe pas à ce jour de méthode in silico, in vitro ou ex vivo permettant de mimer ce contexte biologique et d'induire une production d'anticorps neutralisants.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, les différents groupes seront composés de 10 animaux qui le nombre minimal afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. De plus, afin de ne pas multiplier le nombre d'animaux, nous n'utiliserons que des souris femelles pour la recherche du meilleur candidat vaccin et l'optimisation du schéma vaccinal. Seul le meilleur candidat et le meilleur schéma vaccinal sera testé chez le mâle afin de les valider.

Raffinement

Les animaux disposent d'une période d'acclimatation conséquente (minimum 7 jours), avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter leur angoisse. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections, réalisées en intramusculaire et en sous-cutanée et les prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse, ont lieu de façon ponctuelle et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. De plus, l'administration d'antalgiques est prévue si l’animal présenté un signe de souffrance. Si un animal présente l'un des points limite à un seuil critique, il est mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (tunnel + coton) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus approprié du fait de sa physiologie proche de l’Homme (taux d’homologie 90 %) et de la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adulte, c’est-à-dire de 7 semaines, soit environ 20-25g. En effet, nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature pour tenir compte de la réponse humorale.