Troubles immunitaires

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie de parabiose, qui consiste à coudre deux souris ensemble pour qu'elles partagent leur circulation sanguine, puis des prélèvements et injections, soit cinq interventions au total avant mise à mort et prélèvement des organes. Le porteur classe la parabiose en sévère du fait de l'inconfort postopératoire, tout en affirmant que les animaux se déplacent normalement dès deux à trois jours. Il décrit cette chirurgie et le modèle murin de la sclérose en plaques comme les seules alternatives pour localiser l'origine d'une cytokine.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune qui se caractérise par l'infiltration du système nerveux central (CNS) par des cellules immunitaires conduisant à la destruction de la gaine de myéline qui est à l'origine des désordres moteurs chez les patients. Afin de développer des traitements plus ciblés, il est essentiel de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie. Nous avons identifié une nouvelle fonction pour une cytokine pro-inflammatoire, le GM-CSF, en mettant en évidence son rôle crucial dès les premières étapes de la maladie. Nous souhaitons dans ce projet identifier la source cellulaire de cette cytokine.

Bénéfices attendus

L'utilisation d'anticorps antagonistes bloquant le GM-CSF est une piste thérapeutique prometteuse et les premiers résultats testant l'inocuité du traitement chez les patients sont prometteurs. Notre projet permettra de proposer un nouveau mécanisme d'action du GM-CSF en montrant que l'utilisation d'un anticorps monoclonal bloquant la cytokine agit non seulement au niveau du système nerveux central, mais aussi en périphérie au niveau des organes lymphoïdes secondaires dès les étapes les plus précoces de la maladie, renforçant ainsi la pertinence de son utilisation dans le traitement de la SEP.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie de parabiose sous anesthésie générale (durée de la chirurgie 60 min environ). Deux semaines après la chirurgie, un prélèvement sanguin sera effectué dans la veine mandibulaire sous anesthésie gazeuse (durée moyenne = 2 min). Quatre semaines après la chirurgie, les animaux recevront, sous anesthésie gazeuse, une injection sous-cutanée au niveau de la base de la queue ainsi qu'une injection intra-veineuse au niveau de la veine caudale (durée moyenne = 5 min) . Les animaux seront mis à mort aux alentours de 5 semaines après la parabiose par inhalation de CO2 (8 min) suivie d'une dislocation cervicale (10 sec). Au total les souris subiront 5 interventions.

Impact sur les animaux

Les expériences de parabiose sont des expériences classées sévères du fait de l'inconfort qu'elle crée en post-opératoire. Cependant, nous avons déjà réalisé ce type de chirurgie pour un autre projet, et dès 2-3 jours après la parabiose, les parabiontes se déplacent dans la cage, se suspendent à la grille et accèdent sans problème à la nourriture et au biberon.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort, afin de prélever leurs organes et d'analyser la réponse immunitaire.

Remplacement

L'objectif de notre projet est d'identifier la source de GM-CSF et de distinguer si le GM-CSF est sécrété par une population cellulaire circulante ou une population résidente dans les tissus lors des premières étapes de la mise en place de la réponse inflammatoire mise en place lors d'une encéphalite auto-immune expérimentale, le modèle murin de la sclérose en plaques. C'est un processus complexe et intégré qui nécessite l'implication de plusieurs types cellulaires dans des organes distincts avec une cinétique précise. Ces étapes ne peuvent pas être mimées in vitro. De plus, les expériences de parabiose, à savoir le partage du système sanguin, sont les seules alternatives expérimentales afin de répondre à notre question.

Réduction

Nous avons calculé que le nombre minimum pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement interprétables est de 7 souris/groupe et que les expériences seront reproduites 2 fois. Nous effectuerons le maximum d'analyse sur le même animal : analyse des tissus inflammés par histologie, analyse multiparamétrique en cytométrie en flux ...

Raffinement

Avant la procédure de parabiose, les futurs parabiontes seront isolées dans une cage enrichie (igloo/papier kraft pour nidification) pendant deux semaines afin qu'elles s'habituent l'une à l'autre. Lors de la procédure de parabiose, les souris seront anesthésiées pendant 60 min. Nous nous assurerons de la perte de conscience des animaux avant la chirurgie par une absence de reflexe palpébral et du reflexe du retrait. Durant l'opération, un gel oculaire sera appliqué afin d'éviter tout dessèchement de la cornée. Après la chirurgie et jusqu'à leur réveil, les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de limiter l'hypothermie. En post-opératoire, les animaux seront analgésiés pendant 48h, 2 fois/24h. Durant 10 jours, les animaux recevront des antibiotiques sous forme d'un traitement dans l'eau de boisson. Nous nous assurerons aussi que les animaux aient une prise hydrique et alimentaire correcte en rajoutant dans la cage du gel d'hydratation ainsi que des croquettes sous forme de gel. Une attention particulière sera portée aux sutures cutanées pendant la première semaine. Les animaux seront surveillés et pesés quotidiennement pour détecter des signes de douleur et de détresse (tremblement, léthargie, dos arqué, manque de toilettage...). Une perte de poids sévère (>20% du poids initial) ou des signes de douleur et de détresse >24h et non soulagé par le traitement analgésique constituent des points limites et la mise à mort des animaux. Pour réaliser l'immunisation, les animaux seront anesthésiés sous anesthésie gazeuse. La procédure n'entraîne pas de douleurs, ni de dommages aux animaux.

Choix des espèces

Du point de vue immunitaire, les souris présentent des caractéristiques proches de l'espèce humaine. Elles nous permettent d'étudier la physiopathologie des maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques, avec son modèle murin l'EAE (encéphalite auto-immune expérimentale). Nous disposons aussi des modèles murins génétiquement modifiés qui nous permettront d'évaluer l'origine du GM-CSF dans la réponse mise de place da réponse immune encéphalitogène. Des souris adultes seront utilisées dans ce projet afin que le système immunitaire soit mature.

230 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur induit une cirrhose par ligature chirurgicale du canal biliaire ou par injection d'un toxique hépatique, puis une infection bactérienne provoquée par injection de bactéries ou perforation de l'intestin, ce qui entraîne jaunisse et souffrances pouvant durer plusieurs semaines, pour tester un stimulant du système immunitaire. Le porteur indique arrêter l'étude au bout de neuf jours d'infection pour éviter le prolongement des souffrances. Il affirme que ce modèle animal est "incontournable" pour déterminer les doses avant des essais cliniques.

Objectifs

La cirrhose est une maladie du foie d’origine diverse (abus d’alcool, virus, obésité) qui entraine une défaillance du système de défense immunitaire, notamment des neutrophiles. Ces cellules représentent la plus grande famille des globules blancs du sang chez l’homme (50-60%) et jouent un rôle majeur dans l'élimination des bactéries. La défaillance des neutrophiles s’aggrave durant l’évolution de la maladie, ce qui augmente le risque d’infection bactérienne et de mortalité des patients, malgré le traitement de ces derniers par des médicaments antibiotiques. Ces médicaments sont généralement efficaces pour détruire la plupart des bactéries mais pas les bactéries « résistantes ». De plus, ils s’accumulent notamment dans les neutrophiles et inhibent leurs activités anti-bactériennes. Notre projet vise à corriger les défaillances d’activités antibactériennes des neutrophiles acquises au cours de la cirrhose, ce qui constitue une stratégie anti-infectieuse innovante. Elle est basée sur l’utilisation des molécules chimiques qui stimulent fortement les globules blancs. Des travaux invitro ont montré que ces molécules rétablissent efficacement l’activité anti-bactérienne des neutrophiles provenant de patients hospitalisés pour une cirrhose alcoolique sévère. De travaux préliminaires invivo chez des rats, confirment l’efficacité de ces molécules pour réduire l’infection bactérienne au cours de la cirrhose. Ce projet a pour objectif principal d’optimiser les conditions de traitement de l’infection bactérienne par ces molécules chimiques en recherchant notamment les doses thérapeutiques minimales. Les résultats attendus sont nécessaires pour mettre en place les premiers essais cliniques chez les patients ayant une cirrhose sévère, particulièrement ceux en attente de greffe de foie. Ils ouvrent également des perspectives originales en vue du traitement des infections par des bactéries résistantes aux antibiotiques. Ce projet utilisera un nombre réduit d’animaux (230 rats) sur une période de 4 ans, en respectant les principes fondamentaux de l’expérimentation animale. Les rats seront hébergés à raison de 2 animaux par cage avec un accès illimité à la nourriture et l’eau, dans un environnement enrichi pour apporter un confort maximal. Les opérations chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale avec un traitement analgésique pour prévenir les douleurs post-opératoires.

Bénéfices attendus

Les résultats préliminaires obtenus chez des rats ayant une cirrhose ont montré que les molécules chimiques qui stimulent fortement le système immunitaire permettent de réduire fortement le taux de mortalité des animaux infectés tout en corrigeant la défaillance de l’activité antibactérienne des neutrophiles acquises au cours de la cirrhose. Ce projet permettra de connaitre l’ensemble des doses thérapeutiques de ces agents stimulants, particulièrement les doses minimales. Ceci permettra d’initier sereinement les essais pré-cliniques chez les patients hospitalisés, de renforcer ainsi leur système immunitaire et de traiter les infections bactériennes en absence d’antibiotiques, y compris avec les bactéries « résistantes » aux antibiotiques. Ces effets bénéfiques devraient permettre de freiner l’évolution de la cirrhose vers ses formes plus sévères qui conduisent à des défaillances d’organes et au cancer. Il permettra ainsi d’améliorer l’état de santé des milliers de patients en attente de greffe de foie.

Procédures

Les animaux subissent une première étape d’induction de la cirrhose effectuée au jour zéro ( J0) par une opération chirurgicale consistant à sectionner le canal biliaire, après ouverture de l’abdomen. Cette étape est réalisée sous anesthésie générale et dure environ 15 minutes. Une deuxième méthode d’induction de la cirrhose, sans opération chirurgicale, est prévue; l'injection dans l’abdomen d’une substance chimique toxique pour le foie (2 injections par semaine jusqu’à J20). D'autres groupes d'animaux cirrhotiques subissent une infection déclenchée à J20 soit par injection dans l’abdomen de bactéries vivantes, soit par perforation de la partie initiale du gros intestin (caecum) après ouverture de la cavité abdominale. Cette opération est effectuée sous anesthésie et dure environ 15 minutes. Une partie des animaux infectés sont traités par injection de substances chimiques destinées à stimuler le système immunitaire. Des prélèvements de petits volumes de sang (100-250µl) sont effectués sur animaux à J0, puis à J15 et J20 pour les sous-groupes d'animaux non infectés. Pour les sous-groupes d’animaux infectés, 3 prélèvements sont effectués à J20, J21 et J22. Chaque animal subit ainsi au maximum 3 prélèvements effectués à différents endroits; à l'extrémité de la queue (par coupure) et à l’aide d’une micro-seringue au niveau de veine de la patte et de la queue. Ces prélèvements servent à vérifier différentes modifications pathologiques induites au cours de la cirrhose comme l’augmentation de la quantité de globules blancs dans le sang, les défaillances d’activités anti-bactériennes des globules blancs mesurées notamment par la production de agents antibactériens, et le taux de protéines directement impliquées dans la destruction des bactéries.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables sont attendus dès le début de l’étape d’induction de la cirrhose « BDL » à J0 car elle nécessite l'ouverture de l’abdomen puis la ligature et coupure du canal biliaire. Cette opération génère des douleurs et un risque d’infection bactérienne. Les animaux perdent un peu de poids (

Devenir

Les infections bactériennes aigües induites sont susceptibles de générer des souffrances pendant plusieurs semaines. Pour éviter le prolongement des souffrances, l’étude sera arrêtée au bout de 9 jours d’infection des animaux, ce qui est suffisant pour atteindre l’objectif de l’étude et tous les animaux infectés seront euthanasiés

Remplacement

La capacité des stimulants du système immunitaire à corriger les défaillances des neutrophiles a déja été montrée dans des expériences «in vitro » avec des cellules provenant de patients ayant une cirrhose. A ce stade du projet, le modèle de cirrhose chez l’animal vivant est nécessaire car il reproduit les réponses inflammatoires pathologiques complexes conduisant à la perte des fonctions anti-infectieuses des globules blancs, comme celles observées au cours de la cirrhose humaine. Ce modèle animal est donc incontournable pour la détermination précise de la gamme des doses thérapeutiques du candidat-médicament en vue de futurs essais cliniques chez les patients hospitalisés, et patients en attente de greffe de foie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en préservant les minima nécessaires pour les analyses statistiques des résultats entre les différents sous-groupes d'animaux, et en tenant compte du taux de mortalité élevé, particulièrement dans les deux modèles d’infection bactérienne aigüe (injection de bactéries purifiées dans l’abdomen, et perforation du caecum).

Raffinement

Tout au long de l’expérimentation, les procédures seront appliquées dans un souci permanent de préserver le bien-être animal et réduisant au maximum le stress, douleurs et souffrances occasionnés. Les opérations chirurgicales sont effectuées sous anesthésie générale. Un traitement anti-douleur sera appliqué juste avant l’opération chirurgicale pour l’induction de la cirrhose à J0 et pendant les 3 jours suivants. Les animaux seront remis dans leur cage sous lampe chauffante jusqu’au réveil (2 animaux par cage) et surveillés minutieusement tous les jours pendant la première semaine puis tous les 2 jours. Dès le déclenchement de l’infection bactérienne à J21, des traitements non médicamenteux seront appliqués. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour et des aliments humidifiés et un biberon d’eau seront déposés à l’intérieur de la cage à proximité des animaux afin qu’ils puissent s’alimenter sans faire d’effort. Au besoin, les rats seront réhydratés et alimentés manuellement à l'aide d'une sonde de gavage en vue de minimiser la perte de poids post-infection ou chirurgicale. Des mesures de poids des animaux et de température seront effectuées en vue d’examiner des signes de souffrance, et signes cliniques plus précoces que l’état moribond et prédictifs de la mortalité. En cas de signes de souffrance intense, les animaux seront euthanasiés. Enfin, tous les animaux infectés survivants après une courte période d’infection (9 jours) seront euthanasiés afin de ne pas prolonger d’éventuelles souffrances susceptibles de persister pendant plusieurs semaines.

Choix des espèces

Le modèle de cirrhose chez le rat est bien établi depuis une trentaine d’années pour la méthode par ligature/section du canal biliaire et pour l'induction avec les agants chimiques toxiques pour le foie. Les dégâts induits au niveau du foie (lésions) sont proches de ceux de la cirrhose humaine. Chez la souris en revanche, les lésions du foie induites sont plus proches de la fibrose (état pathologique du foie qui précède l’état cirrhotique), ce qui justifie le choix du rat. Les rats sont âgés de 4 à 6 semaines et considérés comme adultes, et la maturité de leurs systèmes de défense immunitaire est confirmée dans de nombreux nombreux travaux publiés.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections pour supprimer la protéine Pax6, puis on leur induit une encéphalomyélite proche de la sclérose en plaques, jusqu'à une paralysie des pattes arrière qui déclenche leur mise à mort. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de démontrer le rôle de Pax6 dans un modèle animal et que les données ne peuvent être obtenues autrement. Il attend que la suppression de Pax6 aggrave la maladie et en avance l'apparition.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’implication de la protéine Pax6 dans l’inflammation du système nerveux à l’aide d’un modèle de souris de sclérose en plaques. La protéine Pax6 est essentielle à la formation du cerveau embryonnaire. Nos données récentes non publiées indiquent que cette protéine est importante pour contrôler l’inflammation du système nerveux, ce qui laisse penser que sa régulation puisse aider à traiter certaines maladies neurodégénératrices. La sclérose en plaques (SEP) est une maladie chronique inflammatoire du système nerveux central ou la gaine protectrice des neurones est détruite par des cellules immunitaires. Cela conduit à la dégradation des neurones et la perte de communication entre le cerveau et les organes périphériques. Les cellules immunitaires du cerveau qui participent à la réparation de la gaine protectrice, sont défectives chez les patients atteints de SEP. Toutes les données originales que nous venons d'accumuler des expériences réalisées sur des cellules suggèrent que la protéine Pax6 est présente dans ces cellules immunitaires du cerveau et a un rôle essentiel dans la régulation de l’inflammation dans ces cellules. Afin de confirmer ce lien, il est indispensable de le démontrer dans un modèle animal. Pour la première fois, nous testerons des souris qui présentent une inflammation sévère de type sclérose en plaques en présence ou non de la protéine Pax6.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de comprendre le rôle de la protéine Pax6 dans la régulation de l’inflammation du système nerveux. Elle ouvrira de plus des perspectives concernant toutes les pathologies neuroinflammatoires, de type Alzheimer, Parkinson, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) et autres. Les données que nous obtiendrons permettront d'identifier de nouveaux outils pronostics et peut-être thérapeutiques pour ces maladies du système nerveux.

Procédures

- Les souris recevront une injection dans le ventre pendant 4 jours consécutifs d’un produit qui permet de supprimer la protéine Pax6 dans les souris qui ont une modification génétique spécifique pour ceci. Cette injection dure moins de 2 minutes. - Les souris recevront au moins 8 jours plus tard, deux injections en dessous de la peau et dans le ventre d’une combinaison des substances qui produisent le modèle de sclérose en plaques chez l'animal (EAE). Ce traitement consiste à injecter deux produits qui induisent une inflammation du système nerveux. Cette intervention dure moins de 15 minutes sur des souris anesthésiées pour ne pas induire du stress chez la souris. Toutes les souris seront quotidiennement observées pour le niveau de gravité de la pathologie et ceux qui présentent une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou souffrent de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pates avant seront immédiatement sacrifiées et analysées. Les autres seront sacrifiées au bout de 30 jours pour analyse.

Impact sur les animaux

Les souris permettant d’obtenir les souris étudiées après injection du produit, vivent normalement. Il a été démontré que ces souris continuent à vivre normalement après l’injection avec le produit et ne présentent aucune souffrance. Cependant, l’injection du produit pendant 4 jours consécutifs peut être une source de stress pour les animaux. Par la suite, l'induction de la maladie peut entraîner des souffrances aux animaux si la paralysie complète des pattes arrières et partielle des pattes avant est atteinte. Dans ce cas, les souris seront immédiatement euthanasiées et analysées. Enfin, nous nous attendons que la suppression de Pax6 après injection du produit dans les souris, va probablement induire la maladie plus tôt avec des symptômes plus forts.

Devenir

Les 120 souris étudiées (souris d’intérêts et souris contrôle) seront euthanasiées à la fin de l’étude, sauf celles qui présentent une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou souffrent de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pattes avant qui seront immédiatement euthanasiées et analysées. Toutes les souris seront euthanasiées. Des études post-mortem seront réalisées sur les cellules immunitaires prélevées à partir de cerveaux de ces souris.

Remplacement

Toutes nos données réalisées dans des cellules montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine Pax6 est exprimé par les cellules immunitaires du cerveau. Pax6 est connue comme essentielle au développement normal du cerveau et nos travaux récents démontrent qu'il régule aussi la réponse inflammatoire du cerveau. Nous utilisons une lignée de souris qui permet de supprimer la protéine Pax6 chez l'adulte car sa suppression au cours du développement de l'embryon est létale. Par ailleurs, le modèle de sclérose en plaques que nous utilisons chez la souris est simple expérimentalement. Il permet de mimer au mieux la sclérose en plaques chez l’homme, une des maladies sévères du système nerveux qui est liée à une inflammation des cellules immunitaires du cerveau. Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être actuellement obtenues par d’autres méthodes compte-tenu de la complexité physiologique du développement de l’inflammation du système nerveux. La suppression de la protéine Pax6 ne peut être fait que chez l'animal et la complexité du cerveau et des interactions entre les nombreux types cellulaires impliqués (neurones, cellules immunitaires) ne peut être reproduit par des cultures en trois dimensions à partir des cellules souches.

Réduction

Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir une puissance statistique pour tester nos hypothèses. D'après la littérature du domaine, le nombre d’animaux pour le modèle de sclérose en plaques que nous proposons est normalement fixé à 10 par groupe de témoins et d’animaux d’intérêt avec au moins 2 expériences reproductibles. Cependant, compte tenu de la variabilité de l’efficacité de la suppression de la protéine Pax6 par le produit injecté, nous avons besoin d'augmenter sensiblement le nombre de souris traitées pour obtenir suffisamment de souris à comparer en présence et absence de Pax6. Donc, nous allons utiliser 10 souris par groupe pour 4 expériences indépendantes. Si dans la première expérience, l’efficacité du produit injecté et le développement de la maladie présentent peu de variabilité, nous pourrons réduire le nombre d’expériences. De plus, pour réduire le nombre total de croisement et donc de souris, nous utiliserons aussi bien des femelles que des mâles, le modèle de sclérose en plaques ne montrant pas de différence dans le développement de la maladie due au genre.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées dans des portoirs ventilés, 5 individus par cage. La température, l'hygrométrie, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec 1 bâtonnet en bois, des cotons et du kraft. Avant les injections sous la peau, les souris seront anesthésiées, pour éviter l’induction de stress. Des points limites suffisamment précoces et prédictives ont été définis pour éviter toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux. Ces points limites concernent l’apparence, le poids, le comportement et les signes cliniques de chaque animal. D’ailleurs nous avons choisi une dose des substances injectées pour induire la maladie, qui permet un bon développement des symptômes sans induction de douleur et sans perte significatif de poids. A partir du moment où les souris présentent une queue molle et faiblesse des pattes postérieures après l’induction de la maladie, nous veillerons à disposer de la nourriture dans la cage sous forme d’hydrogel (gel rempli d'eau). Cela permettra aux souris de continuer de s’hydrater et s’alimenter sans difficulté. Dans des cas rares des petits ulcères formés sur les sites d’injection, ceux-là seront traités avec une pommade cicatrisante après désinfection. Le suivi quotidien de l'état des souris permettra de réagir immédiatement en cas de souffrance par leur mise à mort dès la détection d’une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pates avant. Ces points limites seront surveillés 1 fois par jour (état général et pesée). Enfin, nous nous attendons à ce que la suppression de Pax6, qui est un facteur anti-inflammatoire, va probablement induire la maladie plus tôt avec des symptômes plus forts. Si notre hypothèse est correcte, nous allons raccourcir la durée de l’expérience.

Choix des espèces

Nous travaillons sur la souris car c’est le meilleur modèle pour réaliser des animaux avec des mutations génétiques et comparer les phénotypes de ces animaux avec les pathologies humaines. Les souris avec des mutations génétiques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques des différentes maladies. L’objectif du projet est d’étudier le développement de l’inflammation du système nerveux en présence ou absence de la protéine Pax6 grâce à un modèle de sclérose en plaques chez la souris. Toutes nos données obtenues dans des expériences réalisées sur des cellules démontrent que la protéine Pax6 est présente dans les cellules immunitaires du cerveau. Cette protéine a un rôle essentiel dans la régulation de l’inflammation dans ces cellules. Afin de confirmer ce lien, il est indispensable de le démontrer dans un modèle animal. Nous utilisons une lignée de souris qui permet de supprimer la protéine Pax6 chez l'adulte, alors que sa suppression à la naissance est létale (développement précoce anormal du cerveau). Par ailleurs, le modèle de sclérose en plaques chez la souris est simple expérimentalement. Il permet de mimer au mieux la sclérose en plaques chez l’homme, une des maladies sévères du système nerveux qui est liée à une inflammation des cellules immunitaires du cerveau. Toutes les souris seront adultes, âgées de 6-8 semaines pour le traitement avec le produit. L’efficacité de la suppression de la protéine Pax6 induite par le produit aura atteint son maximum 8 jours après la dernière injection, donc les souris auront de 7 à 12 semaines au moment d'induire la maladie.

1 608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune est induite sous anesthésie puis les souris reçoivent, selon dix-neuf protocoles, des injections de cellules régulatrices et d'autres composés, développant une paralysie ascendante des membres avant une phase de rémission. Le porteur indique que les souris sont mises à mort si elles perdent plus de 20 % de leur poids ou en cas de paralysie complète, et vise à faire de cette approche une thérapie pour guérir la sclérose en plaques. Il conclut que les migrations cellulaires en jeu ne sont pas modélisables in vitro.

Objectifs

L'objectif du projet est de caractériser l'effet protecteur d’une thérapie cellulaire utilisant des cellules B régulatrices dans un modèle de sclérose en plaques (SEP).

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l’optimisation de cette approche pour en faire une thérapie pour guérir la SEP.

Procédures

L'EAE sera induit dans les 1608 souris sous anesthésie générale. Ces souris suivront 19 traitements différents. Le nombre de souris est indiqué pour chaque traitement additionnel: 1) 1 prélèvement de sang par veine mandibulaire, analyse J30: 24 souris 2) 1 injection Bregs, analyse J30: 624 souris 3) 1 injection Bregs, 1 prélèvement de sang par veine mandibulaire, analyse J30: 24 souris 4) Analyse J7: 24 souris 5) 1 injection Bregs, analyse J7: 72 souris 6) Analyse J10: 24 souris 7) 1 injection Bregs, analyse J10: 24 souris 8) Analyse J17: 24 souris. 9) 1 injection Bregs, analyse J17: 24 souris 10) Analyse J19: : 48 souris 11) 1 injection Bregs, analyse J19: 144 souris 12) Analyse J30: 264 souris 13) 1 injection Bregs, 4 injections TACI-Ig, analyse J30: 24 souris 14) 1 injection anti-CD25, 1 injection Bregs, analyse J30: 24 souris 15) 1 injection anti-CD25, analyse J30: 24 souris 16) 3 injections toxine diphtérique, analyse J30: 48 souris 17) 3 injections toxine diphtérique, 1 injection Breg, analyse J30: 24 souris 18) 4 gavages tamoxifène, analyse J30: 48 souris 19) 4 gavages tamoxifène, 1 injection Bregs, analyse J30: 48 souris.

Impact sur les animaux

L'induction de l'EAE est faite sous anesthésie générale. Le protocole d'induction de l'EAE par immunisation a été optimisé pour que la maladie entre en rémission, et pour réduire le nombre de souris requises, en rapport avec les 3Rs. Les souris développent la maladie vers J11 avec une phase de paralysie ascendante atteignant un maximum vers J17 puis une rémission avec récupération des fonctions motrices des quatre membres vers J22. L’évolution de la maladie est suivie de manière quotidienne sur un maximum de 30 jours, exceptionnellement 40 jours en cas de délai de développement. Nous employons une échelle de scores internationalement reconnue comprenant 6 stades. Les souris développent en général un score de 3 qui correspond à une paralysie partielle des membres postérieurs pendant quelques jours au pic de la maladie avant d’entrer en rémission et atteindre un score 2 correspondant à une démarche anormale vers J22. Ces souris restent donc mobiles et peuvent accéder à la nourriture et l'hydrogel placés au fond de la cage avant rémission des signes cliniques. Les souris souris seront systématiquement mises à mort si elles atteignent une perte de poids supérieure à 20%, ou bien une paralysie complète des membres postérieurs et partielle des membres antérieurs durant 24 heures, ou bien une paralysie complète des membres postérieurs et des membres antérieurs. Avant le développement de l'EAE, les souris sont suivies avec une grille de score incorporant poids, apparence et comportement. Les souris sont mises un mort lorsque l'un des critères ou la somme des critères dépasse un seuil limite tel qu'une perte de poids supérieure à 20%, ou bien un comportement très agité ou immobile ou avec automutilation, ou bien une apparence avec un poil très ébouriffé, des yeux plissés ou bridés, ou une posture anormale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Ceci est justifié par le fait que le statut de leur système immunitaire sera alors caractérisé.

Remplacement

Les protocoles expérimentaux nécessaires pour ce projet ont été optimisés par des expériences in vitro en vue de remplacement pour réduire le nombre de souris nécessaires. En outre, le protocole pour produire des Bregs a été sélectionné suite à un long travail d'optimisation in vitro afin de générer des cultures ne contenant que des Bregs. Les propriétés moléculaires de ces Bregs ont déjà été étudiées in vitro afin de réduire le recours à l'expérimentation animale. Ce projet vise à caractériser l’effet de Bregs dans un modèle de SEP. Les réponses immunitaires se développent dans les organes lymphoïdes secondaires, et impliquent des processus d’interactions entre différents types cellulaires et de migrations cellulaires qui ne sont pas modélisables in vitro actuellement. Les maladies auto-immunes du SNC impliquent aussi la migration des cellules du système immunitaire dans le SNC, puis l’interaction de ces cellules avec des cellules résidentes du SNC. Ces processus ne sont également pas étudiables in vitro. Il n’y a donc pas d’alternative au fait de conduire les investigations décrites chez la souris.

Réduction

Le protocole d'induction de l'EAE a été optimisé de manière à ce que la maladie se développe de manière homogène chez les souris identiques génétiquement, ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées tout en permettant d'obtenir des résultats statistiquement valides. Les mesures de remplacement et de raffinement décrites en 1 et en 3 ont également permis de réduire le nombre de souris nécessaires pour ce projet.Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum pour avoir des résultats statistiquement interprétables. Cest estimations sont basées sur notre expérience, et les estimations obtenues avec le programme d'analyse de puissance statistique G*Power.

Raffinement

Le protocole d'induction de l'EAE a été raffiné de manière à ce que les souris entrent en rémission rapidement après un court épisode clinique afin de réduire la souffrance des animaux. Le protocole a de plus été raffiné de manière à ce que la maladie se développe de manière homogène chez les souris identiques génétiquement, ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées tout en permettant d'obtenir des résultats statistiquement valides. Nous avons établi pour chaque procédure des points limites qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés par groupe de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des objets sont ajoutés dans leurs cages pour enrichir leur environnement. Ils sont observés tous les jours par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal, et les expérimentateurs. Le score clinique et le poids sont mesurés quotidiennement.

Choix des espèces

Le modèle d’EAE chez la souris proposé est bien standardisé. Le savoir disponible sur ce modèle permet de mieux définir les plans d’expérience et donc de réduire le nombre de souris nécessaires. De nombreux outils sont disponibles pour ce modèle, qui permettent d’aborder les problématiques posées de la manière la plus pertinente, et de récupérer le maximum d’information. Ce modèle expérimental a été utilisé pour le développement de thérapies aujourd’hui utilisées chez les patients atteints de SEP. Bien que ce modèle ne soit pas un calque parfait de la SEP, c’est un modèle utile pour le développement de pistes thérapeutiques pour cette pathologie humaine. L’utilisation de souris de fond génétique C57BL/6 de 6 à 14 semaines est appropriée pour ces études.