Troubles immunitaires

1 750 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à quatre injections de candidats vaccins contre l'allergie et trois prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire, une ponction derrière l'oeil que le porteur reconnaît pouvoir provoquer des douleurs oculaires, un blépharospasme et des écoulements. Il indique que les souris gardent une mémoire immunitaire des vaccinations et ne peuvent donc être réutilisées, d'où leur mise à mort. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode in vitro" pour remplacer ce type d'évaluation immunitaire.

Objectifs

Les allergies sont aujourd’hui un problème de santé publique. Ces affections très répandues, particulièrement dans les pays développés, touchent 25 % de la population européenne. Elles sont dues à un dérèglement du système immunitaire qui devient hypersensible à des substances généralement inoffensives. Ceci se traduit par la surexpression ou dérégulation de certaines cytokines (comme l’IL4 et l’IL13) et conduit à l’apparition de la pathologie. Ce projet s’inscrit dans le cadre de développement de vaccins contre les allergies. Au sein de notre société, nous avons développé une stratégie d’immunothérapie active (stimulation du système immunitaire du patient) reposant sur la production d’anticorps contre la ou les cytokine(s) surexprimée(s) après administration d’un vaccin appelé ‘Kinoïde™’. Ce dernier peut se présenter soit sous forme de proteine mélangé à un adjuvant, soit sous forme d’un acide ribonucleique messager (ARNm) encapsulé dans des particules lipidiques. Il n’existe pas à ce jour de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immunologique à un vaccin, ce qui nous contraint à les tester chez la souris. L’efficacité du vaccin Kinoïde™ est évaluée selon sa capacité à induire une réponse immunitaire capable de neutraliser l’activité biologique de la cytokine. Dans nos précédentes études, nous avons démontré que le vaccin kinoide (protéique ou ARN) murin induit une réponse immunitaire neutralisante contre la ou les cytokine(s) surexprimée(s). Nous avons également démontré que le vaccin kinoide protéique humain induit une réponse immunitaire dans une lignée murine humanisée. Dans cette nouvelle étude, nous avons 2 objectifs : -Optimiser la réponse immunitaire induite par le vaccin kinoide protéique humain en testant différentes doses de vaccins -Tester 27 candidats vaccins kinoides ARN humains Pour cela, nous utiliserons la lignée murine humanisée hIL-4/hIL-13KI ; hIL-4RαKI.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à définir les meilleures conditions d’immunisation du vaccin kinoide protéique, à savoir, la dose de vaccin à injecter. Il permettra également de sélectionner les meilleurs candidats vaccins kinoides ARN ainsi que la meilleure formulation de particules lipidiques. Les candidats vaccins sélectionnés seront ensuite évalués pour leur efficacité dans des modèles expérimentaux d’allergies developpés chez la souris.

Procédures

1) Administration du vaccin : L'injection du vaccin est réalisée sur animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes. -900 animaux seront injectés par voie intramusculaire avec du vaccin (50 à 100 μl). Parmis ces animaux, un groupe de 810 souris recevra 3 injections de vaccin aux jours 0, 7 et 28 et un groupe de 90 souris recevront 4 injections de vaccin aux jours 0, 7, 28 et 48. -810 animaux seront injectés par voie sous-cutanée avec du vaccin (50 à 100 μl). Ces 810 souris recevront 3 injections aux jours 0, 7 et 28. Il a déjà été démontré dans la littérature que pour obtenir une réponse immunitaire efficaces 2 ou 3 injections de vaccins ARN étaient nécessaires. De plus, des études préliminaires ont montré que chez les souris humanisées triple KI 3 à 4 injections étaient nécessaires pour obtenir une réponse immunitaire efficace. 2)Prèlévement sanguin: Les animaux sont anésthésiés à l'isoflurane pendant 5min. Ensuite, le prélévement de sang est réalisé en moins de 30 secondes. L’ensemble des 1710 souris subira 3 prélèvements sanguins aux jours -7, 38 et 58.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus à l’injection ou au prélèvement au sinus retro orbitaire. Les effets secondaires liées au candidat vaccin ne sont pas attendus. Le principe du vaccin étant de provoquer une réponse immune, des effets indésirables de type inflammatoire peuvent se produire principalement au site d’injection et se manifester par des oedèmes et érythèmes pouvant durer quelques heures à quelques jours. L’injection par voie intramusculaire se faisant dans le muscle de la patte arrière, une douleur musculaire localisée pourra être détectée quand l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les prélèvements sanguins se faisant au niveau du sinus rétro-orbitaire, des effets indésirables sur l’oeil peuvent se produire. La survenue de contractions répétées et involontaires des muscles des paupières (blépharospasme), la sécrétion lacrymale éventuellement accompagnée de photophobie, les écoulements, la survenue d'oeil rouge ou opaque seront examinés, puisqu'ils traduisent des douleurs oculaires et l'état des yeux.

Devenir

Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, celles-ci conserveront une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. L'ensemble des animaux sera donc mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

La stimulation du système immunitaire par vaccination ne peut s’effectuer que sur animaux vivants. Il n’existe pas à ce jour de méthode in vitro permettant de remplacer le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Ce protocole suit la condition pour laquelle un nombre de 10 animaux par groupe procure une puissance statistique suffisante (tests statistiques classiques).

Raffinement

Les animaux disposent d'une période d'acclimatation conséquente (minimum 7 jours), avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter leur angoisse. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections, réalisées en intramusculaire et en sous-cutanée et les prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse, ont lieu de façon ponctuelle et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance. Si un animal présente l'un des points limite à un seuil critique, il est mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (tunnel + coton) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus approprié du fait de sa physiologie proche de l’Homme (taux d’homologie 90 %) et de la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Souris adulte, c’est-à-dire de 7 semaines, soit environ 20-25g. En effet, nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature pour tenir compte de la réponse humorale.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'une alimentation riche en graisses, elles subissent des prélèvements sanguins et des injections intrapéritonéales destinées à provoquer une fibrose du foie, avant la mise à mort. Le porteur décrit une perte de poids et des lésions possibles au site d'injection, rougeur, infection ou nécrose. Il indique mener des travaux in vitro en parallèle, mais affirme l'expérimentation in vivo "nécessaire" pour reproduire les interactions entre organes.

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation du foie. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de CD44 est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour inactiver le gène CD44 dans toutes les cellules de l’organisme (CD44 Knock Out (KO) systémique), et soumis à un régime favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer l’implication et le rôle de CD44 et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans un contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie.

Procédures

En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections intra-péritonéales seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la perte de poids chez l’animal. Les injections par voie intra-péritonéale pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris WT et 50% de souris KO (50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel) ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes (tests non-paramétriques de Mann-Whitney et ANOVA). Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.

Raffinement

Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD ou Western Diet sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour la procédure 2 (souris mâles ou femelles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise.

350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse dans le sinus rétro-orbital de l'œil sous anesthésie, puis des prélèvements sanguins au même endroit, avant une mise à mort permettant de prélever leurs organes. Le projet vise à documenter un effet inattendu observé lors d'une étude précédente d'un candidat d'immunothérapie, en vue d'un dossier réglementaire. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne mime le système immunitaire complet et qu'il est "obligé" de recourir à la souris.

Objectifs

L’équipe s’intéresse au développement de petites molécules exprimées par des vecteurs viraux notamment pour restaurer le système immunitaire dans certaines pathologies. Plusieurs de ces molécules sont déjà en développement clinique mais il est possible que l’expression d’une ou plusieurs de ces molécules via un vecteur pourrait permettre une expression prolongée et/ou une distribution différente dans l’organisme de ces protéines, voire engendrer une activité biologique différente de celle de la forme non vectorisée et ainsi avoir une efficacité accrue. Des études précédentes (dans des modèles murins) ont permis d’obtenir une preuve de concept pour un candidat, administré par voie intraveineuse, basé sur vecteur virale modifié codant pour une protéine agissant sur le système immunitaire majoritairement décrite pour agir sur un certain type de lymphocyte. Lors de ces études, il a été observé un effet non négligeable et inattendu de ce candidat sur un autre type de cellule. Malheureusement, nous n'avons pas pu investiguer en détails les effets du candidat sur ces cellules, ces dernières n'étant pas la cible privilégiée dans notre étude précédente. Par conséquent, nous souhaitons réaliser une nouvelle étude préclinique ayant pour objectif l'étude de l'impact de ce candidat sur ce type cellulaire dans des souris naïves. Ces résultats permettront de mieux appréhender le(s) mécanisme(s) d’action de notre candidat, dans le but d’étoffer les dossiers règlementaires nécessaires pour initier un développement clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet rentre dans une thématique de recherche plus large dont l’objectif global est de développer de nouveaux traitements pour traiter l’immunosuppression en restaurant le système immunitaire des patients et ainsi prévenir les infections secondaires pouvant leur être fatales. Précédemment, nous avons montré la pertinence de vectoriser une protéine particulière sur sa capacité à booster le système immunitaire de souris saines. Néanmoins, lors de cette évaluation, nous avons observé un effet inattendu sur un type particulier de cellule, qui n’a pas pu être pleinement étudié, les tests d’analyse étant focalisé sur la réponse cellulaire T. L’objectif à court terme de ce projet de recherche est donc de confirmer et de documenter plus en profondeur l’effet biologique observé sur ces cellules cibles. Ces résultats permettront de mieux appréhender le mécanisme d’action du produit ce qui peut être critique pour la suite du développement du produit en phase clinique. En effet, mieux connaître le mécanisme d’action d’un produit d’immunothérapie permettrait de mieux cibler les patients pour lesquels le produit pourrait être testé.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Injections des produits en intraveineuse au niveau du sinus rétro-orbital sous anesthésie locale suivie d’une anesthésie gazeuse à l’isoflurane sur tous les animaux : (1 fois/souris et 2 à 3 min/animaux) - Prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbital sur animaux vigiles après anesthésie locale (1 fois/ souris et 1 à 2 min/souris)

Impact sur les animaux

Aucune toxicité du produit n’est attendue puisque celui-ci a déjà été évalué chez la souris. Néanmoins, les animaux peuvent ressentir un désagrément voire une douleur modérée au moment de l’injection des candidats (injection intra veineuse au niveau du sinus rétro-orbital) qui est minorée par l’utilisation d’une anesthésie locale suivie d’une anesthésie générale mais également lors des prélèvements sanguins à l’œil. La douleur est sont atténuée par l’utilisation d’une anesthésie locale.

Devenir

Le but du projet étant d’évaluer l’activité biologique de notre candidat sur différents types cellulaires provenant de différents organes au cours du temps, il est donc nécessaire de mettre à mort tous les animaux inclus dans la procédure.

Remplacement

Les objectifs de ce projet étant d‘évaluer un candidat d’immunothérapie, susceptible de suivre un développement clinique chez l’homme, nous sommes donc contraints de respecter les obligations réglementaires à savoir qu’un produit ne peut pas passer en clinique en se basant uniquement sur des résultats générés in vitro. La caractérisation in vitro de ce candidat a déjà été réalisée. Désormais, nous voulons évaluer au cours du temps les effets de notre candidat sur une population lymphocytaire et ses sous-types dans différents organes dont le pic de la réponse peut différer, ce qui nécessite l’utilisation d’un organisme vivant entier. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro mimant le système immunitaire complet murin et susceptible d’apporter le même niveau d’information pour répondre à ces objectifs. L’utilisation des invertébrés ne semble pas judicieuse en raison d’un système immunitaire très différent de celui d’un vertébré. Nous sommes donc obligés de faire appel à un vertébré, la souris.

Réduction

Tout au long du projet, nous avons essayé de réduire le nombre de souris sans toutefois compromettre la fiabilité des résultats. Ce type d’expérience ayant déjà été réalisé au cours du projet global, nous avons donc pu calculer la taille de l’effet de notre produit sur cette population at ainsi déterminer le nombre de souris nécessaire par groupe pour avoir une puissance statistique adéquat. Vingt souris par groupe seront donc nécessaires pour comparer deux à deux les moyennes des groupes et pour montrer une différence statistique entre les groupes d’intérêt, moins de souris (10 souris/temps) pour le groupe injecté par le tampon de dilution du MVA car les effets biologiques ne varient pas au cours du temps. Dans ce projet, nous prélèverons post mortem la plupart des organes cibles de notre candidat afin de répondre à un maximum de question dans un seul protocole.

Raffinement

Mise en place du raffinement dans la procédure : L’injection intraveineuse au niveau du sinus rétro orbital de notre candidat est réalisée sur animaux anesthésiés, une anesthésie locale par de la tétracaine suivie d'une anesthésie générale gazeuse. Les prélèvements sanguins à l’œil se font sur animaux vigiles après application d’un anesthésique local quelques minutes avant. Les points limites ont été définis de manière suffisamment prédictive et précoce pour éviter toute souffrance de l'animal de la naissance à la mort. Tout au long de la procédure nos animaux sont surveillés au moins 5 fois par semaine avec une observation accrue quelques heures après l’injection des produits (entre 4h et 6h post injection) même s’il n’est pas attendu d’effet délétère de ces derniers sur l’état général des animaux. Néanmoins, en cas d’apparition de signes cliniques (pelage ébouriffé, terne), une surveillance accrue avec suivi de la température sera effectuée. En cas de fièvre (température > 39°C), du doliprane sera donné dans l’eau de boisson (0.6mL/mL). Si persistance de la fièvre (> 2 jours) ou de tout autre signe clinique (immobilité, prostration, apathie) pouvant traduire une douleur/détérioration de l’état général, ce sera un critère de point limite et il y aura mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le modèle murin est un bon modèle animal pour étudier la réponse cellulaire car le système immunitaire de la souris est bien décrit et les réactifs nécessaires sont largement disponibles. D’autre part, ayant déjà validé l’efficacité de ce candidat chez la souris, il nous semble pertinent de confirmer et d’approfondir les résultats inattendus précédemment observés dans le même modèle. Nous utiliserons des souris avec un système immunitaire mature, c'est à dire des animaux d'au moins sept semaines pour ces études précliniques

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On provoque une inflammation chez des femelles gestantes porteuses d'une mutation, pour observer les effets sur le développement nerveux des embryons, avec suivi par échographie. Le porteur indique que l'injection peut induire un développement anormal in utero et une mise bas prématurée. Il affirme qu'il est impossible de remplacer ce modèle muté, les retombées cliniques étant renvoyées à une meilleure compréhension des pathologies.

Objectifs

Lorsque des infections sont contractées durant la grossesse, il en résulte l’apparition de davantage de pathologies du neuro-développement (PND), autisme, paralysie cérébrale, schizophrénie etc. Ces pathologies sont dues en particulier à un développement anormal du système nerveux. De plus, les naissances prématurées qui peuvent s’y ajouter sont un facteur également aggravant. Il a récemment été montré que des anomalies de motricité apparaissent précocement, avant que les anomalies cognitives ne puissent être diagnostiquées. Des travaux récents ont mis en évidence des mutations dans certains gènes, qui jouent un rôle crucial dans le développement du système nerveux central, et qui sont impliqués dans de telles pathologies neuro-développementales. L’existence simultanée d’une inflammation placentaire accentuerait les conséquences de ces modifications génétiques. Lors d’infections au cours de la grossesse, une inflammation du placenta peut être décelée et impacter le développement des embryons. En cas de fragilités génétiques dues à des mutations chez certains embryons, le développement normal du système nerveux est perturbé, ce qui peut conduire à différentes pathologies neurodéveloppementales. Nous provoquerons une situation d’inflammation chez la souris gestante, et nous analyserons l’effet de mutations dans les embryons sur : (i) des marqueurs inflammatoires présents dans les fluides amniotiques des portées, (ii) le développement neuro-anatomique du système nerveux, (iii) de l’appareil neuro-moteur dont les masses musculaires, ainsi que (iv) le développement du placenta.

Bénéfices attendus

Le gène étudié permet la transmission de signaux de l’environnement en permettant notamment le développement embryonnaire du cerveau. Son étude dans des modèles de souris nous permettra d'obtenir une meilleure compréhension des signaux moléculaires et cellulaires et des facteurs multiples conduisant aux pathologies neuro- développementales dans le contexte inflammatoire de la grossesse. Elle devrait également conduire à une amelioration du pronostic des troubles précoces du développement neuro-moteur.

Procédures

Les souris seront accouplées pour déclencher une gestation. Les accouplements seront réalisés jusqu’à l’obtention de 6 souris gestantes par groupe. Les souris suivies subiront 4 examens d'imagerie non invasive pour le suivi des gestations sous anesthésie générale ne dépassant pas 20 minutes. Au cours de cette gestation, une réponse inflammatoire suite à une seule injection (durée maximale : 30 sec) sous-cutanée d’une molecule déclanchant l’inflammation sera générée pouvant entraîner des défauts de développement in utero.

Impact sur les animaux

Impact de l’agent inflammatoire sur l’état général des souris : une vigilance sera portée sur l’inflammation provoquée, même si des conséquences telles que l’hypothermie sont peu probables aux doses faibles utilisées ici (jusqu’à 40 fois moins que les doses rapportées). Il est attendu que les injections d’un composant bactérien, qui provoque de l’inflammation, induisent un développement anormal des embryons in utero et une possible mise bas prématurée.

Devenir

Mort pour utilisation des tissus : analyses anatomiques et dosages immunologiques.

Remplacement

Il est impossible de remplacer ce modèle murin porteur d’une mutation constitutionnelle pour le gène d’intérêt, mais des études en culture ont permis de montrer son rôle sur le développement de certaines structures du système nerveux. Par ailleurs, nous avons déjà identifié des toxines utilisables en culture cellulaire pour renforcer certains des résultats que nous aurons obtenus dans les souris.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe sera de 6 pour atteindre une robustesse statistique. L'échographie non invasive permettra de déterminer in utero l'apparition d'une létalité dans les portées et de préciser à quel stade elle apparaît, évitant une mise à mort séquentielle des femelles gestantes au cours de la gestation, comme cela est habituellement le cas pour les études de mortalité in utero. Ce suivi nous permettra également d’éviter d’engager une inflammation dans des femelles n’ayant pas ou trop peu de petits.

Raffinement

L'échographie non invasive permettra de caractériser in utero plusieurs paramètres fonctionnels (fréquence cardiaque, flux sanguin et résistance hémodynamique) en plus des informations anatomiques (rapport périmètre cranial / périmètre abdominal). A partir des expériences préliminaires, nous établirons rapidement le timing auquel l’injection sera réalisée (précoce ou tardive) pour n’effectuer dans un premier temps l’étude que sur le stade d’injection qui donne les résultats les plus évidents. Les échographies seront faites sous anesthesie, et nous avons établi une grille qui nous permet d’évaluer l’éventuelle détresse et souffrance des animaux et de les supprimer ou soulager et ainsi d’améliorer leur bien-être. Les conditions d’hébergement seront optimisées en évitant l’isolement des animaux et leur maintien en groups sociaux dans des cages enrichies de cylindres en carton.

Choix des espèces

Choix du modèle murin : le modèle de souris a été choisi car il permet d’étudier les conséquences durant le développement embryonnaire de l’absence d’expression d’une protéine. Modèle mammifère, adapté pour les études à visée clinique : études sur la reproduction/gestation, rôle du placenta. Reproduction rapide, fond génétique homogène, nombre important d’animaux dans une même portée, avec des génotypes différents, permettant une comparaison interne fiable. Nombre de publications ont récemment rapporté que les mutations murines introduites miment la pathologie humaine. Les animaux seront utilisés à pour les études anatomiques du système nerveux, la mise en place des motoneurones qui a lieu précocement et le développement des masses musculaires.

370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie porte une mutation qui provoque une arthrite spontanée avec inflammation et douleurs articulaires dès l'âge de quatre semaines et jusqu'à la fin du protocole à vingt semaines, pendant lequel elles reçoivent les molécules testées durant douze semaines. Elles sont ensuite tuées pour des prélèvements. Le projet évalue des dendrimères contre la polyarthrite rhumatoïde, le porteur invoquant le "besoin" de nouveaux traitements et le caractère difficilement modélisable in vitro de la maladie.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie chronique, inflammatoire qui affecte principalement les articulations, induisant de forte douleur et une réduction de la mobilité articulaire. Dans la polyarthrite rhumatoïde, un réseau de médiateurs inflammatoires favorise l’inflammation chronique et la destruction osseuse. L’objectif de ce projet est d’utiliser le modèle animal basé sur la délétion d’un gène impliqué dans la résolution de l’inflammation, IL-1ra, pour étudier l’efficacité thérapeutique de nouveaux candidats médicaments dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Ce modèle animal conduit à un développement spontané et rapide d’une arthrite inflammatoire dont les caractéristiques tissulaires sont fortement similaires à la polyarthrite rhumatoïde humaine. Ce modèle animal a déjà été utilisé pour évaluer l’efficacité d’une molécule anti-inflammatoire pour le traitement de la polyarthrite rheumatoïde. Notre équipe étudie ces nouvelles molécules ayant une activité modulatrice du système immunitaire en ciblant plusieurs cellules inflammatoires. Nous avons validé ces propriétés anti-inflammatoires sur des cellules humaines et, pour certains, dans des modèles animaux en prouvant l’efficacité thérapeutique de ces nouvelles molécules dans d’autres modèles de maladies inflammatoires chroniques et aigües. Dans ce projet, ayant recours à 370 animaux, notre objectif est d’évaluer leur potentiel thérapeutique pour traiter la polyarthrite rhumatoïde dans le modèle IL1ra -/-, seuls ou en combinaison avec un traitement de référence pour cette maladie, le méthotrexate.

Bénéfices attendus

Dans la polyarthrite rhumatoïde, le système immunitaire attaque les tissus de l'organisme affectant principalement les articulations, ce qui peut entraîner de graves lésions articulaires, de fortes douleurs et un véritable handicap pour les patients. Cette maladie affecte près de 150 000 personnes en France et 10 % des patients montrent une invalidité grave en moins de 2 ans. Les traitements, dits de fond, pour cette maladie tels que le méthotrexate présentent une efficacité limitée et présentent de conséquents effets secondaires. Plus récemment, les biothérapies ciblées mises au point permettent l’obtention d’une réponse favorable dans près de 75% des cas, mais ces traitements sont très couteux et n’entrainent une rémission prolongée que chez 25% des patients. Ainsi, ces données, bien qu’encourageantes, montrent la nécessité du développement de nouveaux traitements ayant peu d’effets secondaires, peu couteux et entrainant des réponses durables. Des résultats préliminaires laissent à penser que les dendrimères PPH que nous avons développés pourraient répondre à ce besoin. Ainsi, les bénéfices attendus de ce projet sont de démontrer l’activité anti-inflammatoire et l’efficacité thérapeutique des dendrimères PPH sur un nouveau modèle de polyarthrite rhumatoïde. Cette étude - en combinaison avec nos datas confirmant l’activité immuno-modulatrice de nos composés obtenus dans d’autres modèles (in vitro et in vivo) et des études de toxicologie menées chez le rongeur et chez des primates non humains montrant que notre molécule candidate principale ne présente pas de toxicité - permettra d’avancer considérablement notre étude pré-clinique dans le but de mener par la suite des études cliniques chez l’Homme.

Procédures

Les animaux recevront des injections ou des administrations par voie orale des molécules à tester pendant 12 semaines (S8 à S19). Ces gestes, rapides et indolores pour les souris, seront réalisés sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les souris IL-1ra -/- peuvent subir une inflammation et des douleurs articulaires dès l’apparition des symptômes à l’âge de 4 semaines jusqu’à la fin du protocole expérimental (âge de 20 semaines). Si les animaux présentent des signes de douleur, nous administrons une analgésique. Si cela n’améliore pas leur état ou si une perte de poids trop importante est observée, l’expérimentation sera immédiatement arrêtée et les souris concernées seront euthanasiées. De plus, pour limiter le stress des animaux, les souris seront hébergées avec d’autres animaux tout au long du protocole (5 souris par cage) et des objets enrichissants (du coton et des tubes en cartion) seront disposés dans les cages.

Devenir

À l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des pélèvements seront effectués pour les dosages biochimiques et les analyses histologiques.

Remplacement

Le travail de notre équipe s’inscrit dans la recherche et le développement de nouveaux médicaments pour combattre les maladies inflammatoires. Le processus de développement d’un nouveau médicament comporte plusieurs étapes. L’étude préclinique est la seconde étape fondamentale de ce processus. Elle fait généralement appel à l’expérimentation animale. C’est un pré-requis obligatoire pour justifier l’investigation et la première administration chez l’Homme. Ces expériences in vivo ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées in vitro. En outre, la polyarthrite rhumatoïde est une pathologie complexe qui résulte de l’action concertée de plusieurs acteurs cellulaires et, de fait, est difficilement modélisable in vitro ou ex vivo.

Réduction

Nous avons planifié les expériences dans l’optique de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous réaliserons à l’issue des traitements des analyses anatomiques (histologie des articulations), cellulaires (analyses des cellules immunitaires dans les articulations et circulantes) et moléculaires (dosage de cytokines) à partir d’échantillons prélevés sur un même animal. Le nombre d'animaux à inclure sera déterminé, et nos résultats analysés, avec des analyses statistiques appropriées. Enfin, le modèle d’arthrite choisi est robuste (incidence élevée) et reproductible, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires par groupe.

Raffinement

Nous avons conçu nos expériences dans l’optique de réduire le stress et la douleur pour les animaux. Pour limiter le stress, les souris seront hébergées avec d’autres animaux tout au long du protocole (5 souris par cage). Du coton et des tubes en carton seront disposés dans les cages comme objets enrichissants. Si les animaux présentent des altérations physiques signes de douleur (flan creusé/dos voûté, yeux enfoncés/vitreux, anomalie respiratoire sévère, comportement anormal extrême tel qu’une aphasie ou un grattage excessif) un analgésique sera administré. Si cela n’améliore pas leur état ou si une perte de poids de plus de 20% est observée, l’expérimentation sera immédiatement arrêtée et les souris concernées seront euthanasiées.

Choix des espèces

Les souris sont fréquemment utilisées pour modéliser la polyarthrite rhumatoïde et, en particulier, avec le modèle expérimental (IL-1ra -/-), que nous avons sélectionnées. Le choix d’utiliser des souris a aussi été conforté par le fait qu’il existe un plus grand nombre d’outils d’analyse disponibles (dont les réactifs immunologiques), par rapport aux autres espèces comme le rat. Nous avons choisi la souris IL-1ra -/-. Cette souche mutée pour l’antagoniste au récepteur à l’IL-1, est adaptée pour étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments pendant une longue durée. La souris BALB/cA sera utilisée comme contrôle non arthritique. Les souris seront âgées de 8 semaines ce qui est en conformité avec les précédentes études.