Troubles immunitaires

300 primates non-humains, ouistitis, macaques et singes vervets, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, puis transférés vivants vers d'autres laboratoires. Chez un fournisseur, chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie générale, jusqu'à deux heures, pour implanter des cathéters ou des dispositifs de télémétrie, avec douleur et inflammation à l'abdomen et aux membres et une mobilité réduite pendant sept jours. Le porteur présente cette préparation chirurgicale comme un "raffinement" bénéfique pour l'animal et le client, destiné à limiter les ponctions lors des études ultérieures. Les usages finaux, détaillés dans d'autres autorisations, ne figurent pas dans ce résumé.

Objectifs

La préparation des animaux chez le fournisseur en vue de l’utilisation chez les utilisateurs est une étape bénéfique pour l’animal et pour le client. Elle inclut l’équipement des animaux avec des dispositifs permettant de raffiner les études des utlisateurs. En effet, les dispositifs concernés permettront le suivi des paramètres physiologiques de manière non invasive ainsi que la réalisation d’administrations et/ou de prélèvements sanguins répétés en réduisant la douleur liée aux ponctions répétées.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de certaines études, le suivi des paramètres physiologiques (température, activité, ECG, pression artérielle…) est primordial non seulement en tant que variable de mesure mais également dans le cadre de l’application des points limites. L’implant de télémétrie permet de réaliser ce suivi de manière continue et non invasive sur un animal éveillé et libre de ses mouvements et représente ainsi un raffinement de l’étude. De la même manière, certaines études notament pharmacocinétiques peuvent nécessiter de nombreuses administrations ou prélèvements sanguins. L’implantation de cathéters à demeure avec chambre sous-cutanée permet de réaliser ces actes sur animal éveillé sans provoquer de douleur liée aux ponctions répétées. Ainsi, la fourniture de primates équipés permet de raffiner la réalisation d’études extérieures.

Procédures

Tous les animaux impliqués dans ce projet subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale pour l’implantation de matériel d’administration/prélèvement (durée maximum de la chirurgie: 2h) ou de monitoring des paramètres physiologiques (durée maxmimum de la chirugie 1h).

Impact sur les animaux

Stress dû à la contention et la capture, douleur et inflammation locale au niveau de l’abdomen liées à l’implantation du dispositif permettant de suivre les paramètres physiologiques de l’animal et douleur et inflammation locale au niveau des jambes liées à l’implantation des cathéters de prélèvement et d’injection. Durant 7 jours, l’animal peut présenter une réduction de la mobilité.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie après avis favorable d’un vétérinaire pour vérifier leur état de santé et autoriser le transfert des animaux chez le client réalisant l’étude.

Remplacement

Le primate est un modèle de choix pour l’étude de nombreuses pathologies, comme par exemple les fièvres hémorragiques ou encore le SIDA, mais également dans le cadre des études réglementaires de mise sur le marché de nouveaux candidats médicaments. Tous les projets des équipes partenaires dans lesquels les animaux issus du présent projet sont utilisés font l’objet d’une autre autorisation de projet où sont détaillées les raisons pour lesquelles l’utilisation des animaux et donc des primates non-humains ne peut pas être évitée.

Réduction

Le nombre d’animaux déclarés dans ce projet est seulement une estimation à la hausse mais dépendra de la demande. Notre expertise et nos compétences dans le domaine nous permettent de limiter les complications opératoires et donc le nombre d’animaux nécessaires. D'autre part, nous réutilisons des animaux issus de projets antérieurs.

Raffinement

Chaque chirurgie d’implantation est réalisée sous anesthésie générale et couverture antalgique appropriée et est supervisée par l’un des 3 vétérinaires du site. Ce projet ne nécessite pas l’isolement d’animaux, ils seront donc hébergés au minimum par paire. Un temps de récupération post-chirurgie de minimum 7 jours est laissé aux animaux avant tout transfert pendant lequel une surveillance accrue est mise en place pour vérifier l’absence de signes d’infection et de comportements anormaux évocateurs de douleur. Toutes nos animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires…), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises…). Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal du site.

Choix des espèces

A ce jour, le primate est le modèle de choix pour de nombreuses études notament dans le domaine infectieux par exemple mais également dans le cadre des études réglementaires de mise sur le marché de nouveaux candidats médicaments. Le choix de l’espèce utilisée par les équipes partenaires dépend de leurs recherches et est dûment justifiée dans chaque autorisation de projet dont elles font l’objet. Animaux jeunes sevrés et adultes (soit entre 8 mois et 30 ans), dépendant des besoins des utilisateurs. Le choix du stade de développement des animaux utilisés par les équipes partenaires dépend de leurs recherches et est dûment justifié dans chaque autorisation de projet dont elles font l’objet. Nous apportons conseil et expertise au client pour un choix pertinent face à la question scientifique posée.

7 440 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des composés candidats et des agents inducteurs par diverses voies pendant deux semaines, avec des prélèvements sanguins sous anesthésie, avant d'être tués pour prélever des tissus. Le projet vise à cribler de nouvelles molécules anti-inflammatoires dans le cadre d'un programme de recherche pharmaceutique. Le porteur annonce peu de signes cliniques hormis des inflammations locales, et affirme que le recours au modèle animal est "indispensable" une fois les molécules validées in vitro.

Objectifs

On dénombre environ 80 maladies immuno-inflammatoires telles que le psoriasis, la sclérose en plaques, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus et les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. On estime que 5 à 8% de la population mondiale est touchée par une maladie auto-immune, caractérisée par une réponse inadaptée du système immunitaire qui se retourne contre les propres tissus du patient. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients.

Bénéfices attendus

L’objectif ultime est de pouvoir supprimer spécifiquement le mécanisme à l’origine d’une maladie auto-immune, sans impacter le bon fonctionnement du système immunitaire. Ces nouvelles molécules fourniront aux patients des thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices ciblées qui pourront grandement améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Dans ce projet, les animaux recevront des agents biologiques et composés par diffrentes voies d'administration définies par la réglementation. L'administration des composés (durée = 1 min/animal) se fera 1 à 2 fois par jour sur une durée de maximale de 2 semaines. L'induction avec des agents biologiques (durée = 1 min/animal) se ferra 1 à 2 fois au cours de l'étude de 2 semaines. Un à deux prélèvements sanguins seront également effectués sur animaux préalalement anesthésiés (durée = 2-3 min/animal) pour suivre la pharmacocinétique des composés testés sur l'ensemble de l'étude de 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux ne développeront pas de signes cliniques notoires hormis des inflammations locales légères.

Devenir

Les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés pour collecte de tissus

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro.

Réduction

Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir une distribution normale et présentent une variabilité acceptable. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec du materiels de nidification. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie sera envisagé. Des analgésiques seront utilisées en cas de signes de douleur. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 444 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent selon les groupes une greffe de peau sous anesthésie, des traitements immunosuppresseurs répétés et jusqu'à douze prélèvements sanguins, pour tester une stratégie vaccinale par thérapie cellulaire chez des patients immunodéprimés. Le porteur indique que l'immunosuppresseur employé peut provoquer une toxicité rénale, suivie par la perte de poids. Il affirme que la production d'anticorps ne peut avoir lieu qu'au sein d'un ganglion ou de la rate, impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

Afin d'éviter les rejets de greffe, les patients transplantés sont traités avec des immunosuppresseurs. Malheureusement, ces traitements affaiblissent l'ensemble du système immunitaire, les patients sont plus sujets aux infection et cancers et ils répondent moins éfficacement aux vaccinations. L'objectif de ce projet est de mettre en place une nouvelle statégie vaccinale par thérapie cellulaire. Il est prévu de vacciner les animaux avec des schéma vaccinaux classiques (injection sous cutanée de l’antigène avec adjuvant), ou par l’injection de cellules T vaccinales modifiées par voie intraveineuse après anesthésie. Différentes souches de souris, présentant des défauts plus ou moins importants du système immunitaire seront utilisées. Ces modèles de souris permettront de répondre sur les interactions entre différentes populations immunitaires, présentes ou non dans ces modèles. Afin d’évaluer les doses d’immunosuppresseurs optimales, une expérience de greffe de peau sera réalisée. La greffe de peau a été choisi dans un premier temps comme modèle de transplantation car elle est beaucoup moins invasive que le greffe d’organe tel que cœur ou rein. La production d’anticorps ainsi que les différentes populations immunitaires seront étudiées chez les souris receveuses., c’est-à-dire ayant recu les cellules vaccinales.

Bénéfices attendus

Cette nouvelle approche vaccinale par thérapie cellulaire permettrait de surmonter les effets délétères des immunosuppressions chez les patients transplantés mais aussi de manière plus générale chez les patients présentant des défauts de réponse immunitaire, et qui ne répondent pas aux stratégies de vaccnations conventionnelles.

Procédures

IV : intraveineux/ SC : sous-cutané / IP : intrapéritonéal Procédure 1 : injection IV de cellules à des souris anesthésiées puis 1 seul prelevement sanguin avec anésthésique local en fin de procédure. Durée 24-48h. Procédure 2 : les souris subiront 2 injections SC et 5 prelevements sanguins (avec anésthésique local) sur une durée 42 jours. Procédure 3 : greffe de peau sous anesthésie gazeuse + analgésie morphinique, traitements immunosuppresseurs 2 à 3 fois par semaine par injection IP sous isoflurane, 7 prelevements sanguins (avec anésthésique local) sur une durée 42 jours. Procédure 4 : les souris seront sous traitements immunosuppresseurs (ou contrôle placebo) (2 à 3 fois par semaine par injection IP) et vaccinées par 2 injections SC à 28 jours d’intervalle. 10 prelevements sanguins (avec anésthésique local) sur une durée 98 jours. Procédure 5 : injection de cellules par voie IV sous anesthésie gazeuse et 10 prelevements sanguins (avec anésthésique local) sur une durée de 42 jours. Un groupe sera en plus sous traitements immunosuppresseurs (2 à 3 fois par semaine par injection IP) Procédure 6 : les souris seront vaccinées soit par 2 injections SC à 28 jours d’intervalle soit par injection de cellules par voie IV sous anesthésie gazeuse. Un groupe sera en plus sous traitements immunosuppresseurs (2 à 3 fois par semaine par injection IP). Au total, 12 prelevements sanguins (avec anésthésique local) sur une durée de 102 jours. Prélèvement sang total sous anesthésie générale à la fin de plusieurs procédures, juste avant mise à mort. Les injections durent moins d'1 minute, la greffe de peau environ 20 minutes, un prelevement de l'ordre de 30 Secondes (contention comprise).

Impact sur les animaux

Les doses d’immunosuppresseurs utilisées dans ce projet sont décrites dans la littérature. L’immunosuppresseur (appelé tacrolimus ou FK506) que nous utiliserons peut engendrer une toxicité rénale chez les patients. Nous avons pu montrer au laboratoire que, chez la souris, la perte de poids est un bon indicateur de cette toxicité rénale, les pesées sont donc adaptées dans les procédures ad hoc. Nous n’attendons pas d’effets indésirables dus aux injections : intrapéritonéales, sous cutanées ou intraveineuses) ni lors prélèvements repetés au niveau du sinus retro-orbital ou par voie submandibulaire. La greffe de peau est un geste bien documenté, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie (non reveil de l'animal malgré des doses d'analgésie et anésthésie adaptées). De manière générale, les procédures ne doivent pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux (hormis la greffe de peau). Les points cliniques généraux (aspect du poil, comportement, pesée) seront observés selon une fréquence déterminée pour chaque procédure ou étape au sein d’une même procédure. Des points limites propres à chaque procédure ont été définis pour éviter toute souffrance.

Devenir

Les souris de la procédure 1 seront mises à mort avec une méthode reglementaire en fin de procédure pour récupération des organes lymphoïdes Les souris des 5 autres procédures seront anesthésiées pour un prélèvement de sang maximum puis mises à mort avec une méthode reglementaire pour récupération des organes lymphoïdes. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques. Toutes les souris ayant atteint un point limite seront mises à mort avec une méthode reglementaire.

Remplacement

Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent à la production d’anticorps ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro.

Réduction

Des expériences préliminaires seront réalisées pour établir les paramètres optimaux, le nombre de cellules, ou encore les doses d’immunosuppresseurs. Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs. Les procédures dites « pilotes » permettront d’établir les conditions / protocoles optimaux pour les procédures suivantes, afin de réduire égaiement le nombre de groupe. Les groupes controles comporteront 3 animaux alors que les groupes experimentaux seront de 5 ou 10 selon les procédures. (10 animaux pour les groupes d’interet, 5 pour les groupes controles). Nous prévoyons des duplicats experimentaux pour valider la reproductibilité des transferts de cellules, cellules qui sont au préalable modifiées, ce qui peut augmenter la variabilité des transferts adoptifs de cellules thérapeutiques. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 480 souris (mus musculus). Les analyses statistiques se feront par un test non paramétrique de mann -whitney.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement aspect general). Les douleurs attendues dans ce protocole sont anticipées et devront etre évitées grâce à l’administration d’analgésiques lors des gestes tels que greffe de peau ou prélèvements, les points limites ont tout de même été définis afin d’intervenir en cas de nécessité. Différents traitements seront administrés : anesthésie gazeuse pour l’injection intraveineuse des cellules et la greffe de peau et pour le suivi du greffon . Analgésie (morphinique) pour la greffe de peau, local pour les prélèvements sanguins. Pesée hebdomadaire, et fréquence augmentée à 2 fois par semaine si perte de poids > 10%. La taille du greffon cutané, couleur, necrose seront des indicateurs de la perte de greffe et l’infection éventuelle du greffon sera considéré comme point limite. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement (Si un animal prend pour habitude de retirer les bandages de ces congenères, alors cet animal sera isolé, de meme s'il présente des signes d'agressivité sur les autres souris.)

Choix des espèces

Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire allogénique, c’est-à-dire entre souris de fond génétique différent. Notre projet nécessite le recours à des animaux génétiquement modifiés précédemment développés et disponibles présentant des défauts immunitaires plus ou moins importants. De tels modèles n'existent que dans l'espèce souris. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées, afin qu'elles aient un système immunitaire mature capable de répondre aux vaccinations. Il n'y a pas de variabilité liée au sexe attendue dans ces protocoles. Mais pour éviter les rejets liés à l’antigène mineur d'histocompatibilité sexuel (HY), toutes les souris donneuses utilisées seront des femelles. Les receveuses pourront être des mâles ou des femelles.

5 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Greffées avec des cellules humaines, elles subissent une irradiation sublétale, des prélèvements de sang, des chirurgies puis une infection par des virus comme le VIH ou les hépatites B et C, pour étudier ces infections et tester des traitements. Le porteur indique que certaines souris présentent un poids réduit lié à une déficience hépatique et peuvent développer une dermatite, avec mise à mort si le score de souffrance atteint le point limite. Il présente ce modèle comme le "seul" permettant ces infections et comme une alternative au recours aux primates non-humains.

Objectifs

Ce projet utilise le seul modèle murin expérimental qui permet de suivre la progression in vivo des infections par des virus à tropisme restreint aux humains et aux primates non-humains. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la physiopathologie induite par l’infection des virus de l’immunodéficience humaine (VIH), d’Epstein-Barr (EBV), de l’hépatite B (VHB), et de l’hépatite C (VHC) en suivant les réponses immunitaires, et évaluer l’impact des nouvelles approches antivirales ou vaccinales. Ce type d’expérimentation ne peut pas être mené chez l’hôte naturel de ces virus pathogènes (l’homme) et s’avère de plus en plus difficile à mettre en place chez des primates non-humains. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces virus, des modèles de souris humanisés pour le système immunitaire (souris HIS), ou pour le foie avec l'ajout d'hépatocytes humains (souris HUHEP), ont été développés au cours des deux dernières décennies. Comme premier modèle, nous avons généré des souris immunodéficientes (BRGS), par l’invalidation fonctionnelle des gènes codant pour certaines protéines. Les principaux mécanismes de rejet de greffe sont absents chez ces souris ce qui permet l’établissement d’une xénogreffe hématopoïétique humaine après injection de cellules souches hématopoïétiques humaines (HSC). Des études précédentes ont montré que les souris HIS étaient susceptibles aux infections par les virus HIV ou EBV, et modélisaient les réponses immunitaires humaines. Un second modèle murin immunodéficient porte en plus un gène urokinase plasminogen activateur (uPA) qui est toxique pour les hépatocytes dans le foie, ce qui induit une déficience hépatique. Ces souris sont greffées avec des hépatocytes humains adultes sains qui participent à la régénération du foie et constituent le modèle HUHEP. Des études précédentes ont montré que les hépatocytes humains pouvaient être infectées par les virus VHB et VHC ainsi que par le parasite de la malaria (Plasmodium falciparum) chez ces souris HUHEP. La combinaison des deux modèles ci-dessus, dite HIS-HUHEP permet une étude approfondie des interactions entre le système immunitaire et le foie dans le cadre d’infections hépatiques (VHB, VHC, P. falciparum). Celui-ci permet de décortiquer les mécanismes d’infection et de mieux comprendre la pathogénèse complexe induite par ces microbes invasifs.

Bénéfices attendus

Ces modèles animaux permettront de mieux caractériser les mécanismes d'infection et de réplication des virus (VIH, EBV, VHB, VHC), le rôle du système immunitaire dans l'évolution des pathologies, ainsi que de tester des nouvelles stratégies thérapeutiques et vaccinales. Bien que des traitements thérapeutiques existent pour les patients atteints de VIH, un vaccin thérapeutique permettrait de contrôler les infections de manière pérenne. Il n’existe pas de vaccin préventif pour le VIH et le VHC, ainsi des millions de nouvelles infections surviennent par an, ne permettant pas d’éliminer ces virus de la population globale. Bien qu’un vaccin sûr et efficace existe pour le VHB, plus de 260 millions de personnes sont actuellement infectées et seul 1% de ces patients ont accès aux traitement thérapeutiques, le VHB induit des hépatocarcinomes à mauvais pronostique. Ces traitements, comme celui pour le VIH, doivent être pris à vie, induisant un coût élevé pour la société et un risque de survenu d’échappement virologique. Ainsi, les recherches se poursuivent pour développer des vaccins, ou des traitements curatifs, pour ces pathologies. L’interaction entre la réponse immunitaire et le virus est essentiel dans la progression de la pathologie, comprendre ces mécanismes d’action est une clé de voute pour développer des nouveaux concepts de traitements à visé thérapeutiques, ou des vaccins. Or, les modèles animaux qui permettent d’étudier ces interactions sont rares étant donné que ces virus n’infectent que des cellules humaines ou de chimpanzés. Afin de modéliser ces questions, nous avons développé des modèles de souris greffées avec des cellules humaines qui sont susceptibles à ces virus, permettant d’étudier les réponses immunitaires antivirales humaines. L’ensemble de ces études participe à comprendre la physiopathologie induite par ces virus chez l’humain, et à développer des nouveaux traitements thérapeutiques et des stratégies vaccinales afin d’éliminer ces maladies.

Procédures

Les procédures expérimentales décrites prévoient les interventions suivantes : irradiation avec des doses sous-létales (une fois par vie, 1-3 minutes), prélèvements sanguins en retro-mandibulaire (chaque prélèvement dure quelques secondes et est réalisé tous les 15 jours au maximum), anesthésie et procédures chirurgicales (une fois par vie, environ une heure et demi par animal), infection par des virus (une fois par vie, chaque infection dure quelques secondes).

Impact sur les animaux

Le degré de gravité des procédures est considéré comme léger (injections et prélèvements) ou modéré (conséquences potentielles à long terme de l’irradiation sous létale ou chirurgie). Les animaux portant le transgène uPA ont un poids réduit (autour de 10% en dessous du poids normal) du à leur déficience hépatique qui entraîne des défauts métaboliques. Ce poids diminué n’affecte pas le comportement des animaux, n’entraîne pas de souffrances, ni de stress, d’après nos observations sur plusieurs années d’expérimentation. Les animaux humanisés pour le système immunitaire et exprimant le transgène TSLP peuvent développer une dermatite. Afin de soulager la dermatite, les animaux seront traités avec une solution antiseptique (bétadine) avec un anesthésiant locale (lidocaine) et ils pourront être hébergés sur une litière de cellulose plus adaptée aux peaux sensibles. Leur phénotype est suivi toutes les semaines selon les critères et les points limites suivants : 1. Apparence global de l’animal score 0 : normal score 1: poils ébouriffés, rougeur de peau ou perte de poils sur moins de 50% du corps, expression faciale modérée, animal en mouvement score 2: dos voûté, perte de poils sur plus de 50% du corps, expression faciale sévère, absence de mouvement, prostration. 2. Conditions corporelles (cachexie) score 0: BCS (Body Condition Scoring) 3: L’animal est bien conditionné. La colonne vertébrale est continue. Vertèbres palpables seulement avec une pression ferme. score 1: BCS 2: L’animal est sous-conditionné. Segmentation de la colonne vertébrale évidente. Les os du bassin dorsal sont facilement palpables. score 2: BCS 1 : L’animal est amaigri. Structure squelettique extrêmement visible et peu ou pas couverte par la chair. Vertèbres distinctement segmentées 3. Poids score 1: perte de plus de 10% du poids score 2: perte de plus de 20% du poids Le point limite est défini par la détection d’un score =2 Si un score > 0 est observé, les animaux auront une surveillance renforcée. Si un score = 2 est observé, les animaux seront mis à mort.

Devenir

A l’issu de la procédure expérimentale #1 les animaux seront mises en expériences suivant les procédures expérimentales # 2, 3, 4 et 6. A la fin de ces procédures expérimentales les animaux seront mis à mort pour être analysés afin de caractériser la physiopathologie et la réponse immunitaire induite par les virus VIH, VHB, VHC, EBV. A l’issu de la procédure expérimentale #5 les animaux seront mis en accouplement.

Remplacement

Ce projet nécessite un modèle expérimental soutenant l’ensemble des mécanismes de la physiopathologie induite par une/des infection(s) virale(s). Or, de nombreux exemples démontrent que les tests d’efficacité de thérapies antivirales in vitro ne se confirment pas systématiquement in vivo en phase clinique chez l’Homme du fait des dynamiques complexes mises en jeu dans l’organisme (cinétique de l’infection; distributions cellulaires ; bio-distribution des composés; réponse immunitaire). Historiquement, les modèles infectieux de choix restent le macaque pour le VIH (avec le virus simien apparenté VIS ou l’hybride SHIV) et le chimpanzé pour le VHC et le VHB. En proposant comme modèle alternatif la souris humanisée pour le système immunitaire et/ou le foie, nous appliquons de manière relative le principe de remplacement en écartant l’utilisation de primates non-humains, avec l’avantage supplémentaire d’utiliser un modèle expérimental directement adapté au pathogène humain natif. A ce titre, les souris HIS et HIS-HUHEP sont le seul modèle expérimental correspondant à ces critères (mis à part l’Homme lui-même, chez lequel il est éthiquement inacceptable de tester directement de nouvelles stratégies préventives ou thérapeutiques).

Réduction

Le plan d’étude bénéficie de nos connaissances antérieures obtenues avec des souris humanisées sur l’infection par le VIH et le VHB. De plus, nous utilisons un modèle de souris HIS qui est à la pointe du domaine, ce modèle est sans cesse optimisé pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux requis par expérience. Il sera essentiel de compter un minimum de 10 animaux par groupe, du fait de cette variabilité intrinsèque, et d’inclure l’ensemble des groupes contrôles pour valider les conclusions de chaque étude. La planification des expériences en amont et la concertation entre les membres de l’équipe seront des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux.

Raffinement

Les cages d’hébergement sont enrichies avec un coton dentaire permettant une nidification, et avec des refuges en forme de dômes en cellulose dans les cages de croisements. Par ailleurs, le stress des animaux est largement diminué par l’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques lors de la majorité des procédures. L’isoflurane par voie respiratoire présente l’avantage d’être un anesthésiant permettant des séquences d’endormissement courtes et répétées. Les soins post-opératoires tels que des pansements, du gel oculaire, une réhydratation par voie sous-cutanée, et une alimentation hydratante (DietGel) sont inclus dans nos protocoles expérimentaux.

Choix des espèces

La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale soutenant une infection productive par le VIH. La souris HUHEP greffée avec des hépatocytes humains est permissive aux infections hepatotropiques (VHB, VHC, P. falciparum). Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris humanisées pour le système immunitaire (HIS) sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+ dans des souriceaux nouveau-nés (