Troubles immunitaires

80 souris et 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont isolés jusqu'à 168 heures dans des cages à métabolisme, sur grille et exposés à la lumière, ce que le porteur décrit lui-même comme un inconfort, après administration de candidats médicaments par diverses voies. Ces études d'excrétion s'inscrivent dans le cadre réglementaire obligatoire pour la mise sur le marché d'un médicament, et les animaux sont tués pour doser ce qui reste dans leur corps. Le porteur indique qu'il n'existe "aucun modèle in vitro" applicable à l'excrétion dans un organisme vivant.

Objectifs

Ce projet a pour but de décrire les études d’excrétion réalisées dans le cadre des études de pharmacocinétique réalisées chez les rat ou les souris. Chaque étude permet d’évaluer le devenir de molécules contenues dans un candidat médicament dans l'organisme. L’objectif est de récolter des données concernant la quantité des molécules excrétées par rapport aux quantités administrés ainsi que de déterminer la durée d’excrétion. Après l'administration, des recueils d’urines, fèces ou de bile pour mesure de la concentration de la molécule seront réalisés. L’objectif de ces tests n’est pas de démontrer une efficacité de la molécule ou de mettre en relief les effets secondaires possibles, mais de démontrer que le produit est bien excrété du corps après une période définie.

Bénéfices attendus

Ce type d'étude permet de comprendre comment et pendant combien de temps des molécules sont excrétées de l'organisme après leur administration et sont nécessaires pour évaluer la sécurité d'un médicament.

Procédures

Les animaux sont placés individuellement dans les cages pendant une certaine durée : Pour les études d’excrétion biliaire (procédure 1), 3 à 4 jours d’acclimatation des rats sur litière + 24h maximum dans les cages à métabolisme. Pour les animaux utilisés pour les études d’excrétion urine et fèces (procédure 2), la durée, seul dans les cages à métabolisme, est au maximum de 168h. Les administrations iv, vaginale, rectale, oculaire, intranasale, intra-auriculaire, topique sont réalisées une seule fois sous anesthésie en moins d'une minute Les administration PO sont réalisées une seule fois sur animaux vigile en moins d'une minute

Impact sur les animaux

Dans le cas des études pour récupérer l'urine et fèces, les animaux sont placés individuellement dans les cages à métabolisme. Les animaux sont seuls dans la cage, sur grille et plus exposé à la lumière que dans les cages classiques, ce qui provoque un inconfort chez l’animal et ne correspond pas à son environnement habituel.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, afin d’analyser la quantité retrouvée dans le corps de l’animal et non excrétée.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro permettant d’étudier l’excrétion d’une molécule dans un organisme vivant. Un autre modèle n’est pas applicable dans la mesure où ces études rentrent dans un cadre réglementaire obligatoire pour la sécurité d'un médicament.

Réduction

Pour les études réglementaires le nombre minimum utilisé est défini par les guidances. Pour les études précoces dans le développement d’un médicament, un nombre d’animaux inférieur ou égal à celui recommandé par les guidances est utilisé. Dans la mesure du possible un maximum de données est collecté sur un même animal afin de ne pas avoir à reproduire l’expérimentation.

Raffinement

Une procédure de point limite est en place au laboratoire. Dans le cadre de l'utilisation des cages à métabolisme ou le placement seul dans une cage, les cages sont regroupées sur le même portoir afin que les animaux soient proches l’un de l’autre pour favoriser le lien et la communication entre animaux (instinct grégaire). Une plaque métallique finement perforée est ajoutée dans les cages afin de permettre à l’animal de se reposer. Des panneaux opaques sont placés sur un des quatre côtés de la cage pour éviter l’exposition directe à la lumière. Les animaux sont observés tous les jours et les points limites (voir annexe) basés sur l’apparence et le comportement de l’animal sont définis dans une grille afin de décider si l’animal doit être soulagé de son inconfort.

Choix des espèces

Les espèces rat ou souris seront utilisées conformément aux guidances techniques. Le choix de l’espèce pour chaque étude sera en cohérence avec les espèces utilisées pour toutes les études nécessaires pour le dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM) de la molécule. Les animaux utilisés sont âgés au minimum de 6 à 12 semaines conformément aux recommandations de la règlementation.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le champignon Candida albicans injecté dans la veine de la queue, puis suivies pendant deux à sept jours avant une prise de sang et une mise à mort par dislocation cervicale, pour étudier le rôle du gène Card9 des neutrophiles dans la dissémination de l'infection. Le porteur qualifie la dose de subléthale et estime la souffrance modérée, l'infection pouvant entraîner une perte de poids jusqu'au point limite de 20 %. Il indique avoir mené des expériences préliminaires in vitro et s'être limité à un seul modèle d'infection pour réduire le nombre d'animaux non-humains.

Objectifs

La présence de champignons dans les différents microbiotes de nos muqueuses, et notamment de l’intestin, est associée à diverses pathologies. Parmi les champignons intestinaux, le plus connu est Candida albicans. C'est une espèce pathogène opportuniste, c'est-à-dire qu'elle est la plupart du temps inoffensive, mais qu’elle peut déclencher une infection dans certaines circonstances, comme après un traitement antibiotique, une chimiothérapie intense ou dans le cas des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse. En effet, un échec des cellules immunitaires à contrôler les champignons intestinaux, et notamment C. albicans, peut mener à ce type d’inflammation sévère et chronique de l'intestin. Il est ainsi important de comprendre le rôle des gènes de susceptibilité aux MICI également impliqués dans la réponse aux champignons. Par exemple, une mutation ponctuelle (appelé polymorphisme) dans le gène Card9 est associé au développement de MICI, et les mutations plus importantes entraînant une perte de fonction de la protéine CARD9 sont quant-à-elles associées à des infections fongiques invasives, notamment à C. albicans. CARD9 est exprimé dans les cellules de l'immunité innée, mais les types cellulaires impliqués dans la pathologie et les mécanismes en jeu ne sont pas connus. Nous avons montré in vitro que les neutrophiles mutés pour le gène Card9 ont une capacité réduite à éliminer C. albicans. Cependant, le rôle des neutrophiles, cellules immunitaires innées en première ligne de défense contre les envahisseurs, reste très peu compris. Les patients dont les neutrophiles ne sont pas fonctionnels peuvent développer différentes formes d'inflammation intestinale et les neutrophiles des patients atteints de MICI présentent des défauts fonctionnels. Ainsi, l’utilisation d’un modèle d'infection systémique nous permettra de mieux comprendre le rôle des altérations génétiques liées aux MICI, et notamment de CARD9, dans la réponse contre les champignons. Nous étudierons aussi d’autres gènes en lien avec CARD9 impliqués dans la reconnaissance des champignons par les neutrophiles.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances précieuses sur le rôle de Card9 et des neutrophiles dans le développement d'infections fongiques invasives, telles que celles causées par Candida albicans. Le modèle d'infection à Candida albicans par voie intraveineuse est un modèle très bien caractérisé, reproductible et qui permet de mimer les infections invasives humaines dues aux cathéters, notamment. Candida albicans est une levure naturellement présente dans l’organisme mais qui peut causer des infections graves chez des personnes immunodéprimées ou avec une mutation génétique dans CARD9 par exemple. En effet CARD9 est protecteur dans le sens où il permet de protéger l’organisme contre ces infections en éliminant le champignon. CARD9 est principalement exprimé sur les cellules de l’immunité innée, mais son rôle dans les différents types cellulaires (neutrophiles, macrophages, cellules dendritiques, monocytes…) reste inconnu. Ici, nous nous intéressons aux neutrophiles, d’où l’intérêt de la lignée mutée pour CARD9 dans les neutrophiles. Cependant il est important de comprendre comment CARD9 est activé, si cela passe par les récepteurs de surface aux champignons de type Dectin, ou pas ; et si les cellules de l’immunité adaptative ont effectivement aucun rôle dans le phénotype protecteur de CARD9, ou pas. Comprendre les mécanismes en jeu, et surtout les types cellulaires impliqués, permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives aux patients souffrant de ce type d'infection chronique et invasive.

Procédures

L'infection à C. albicans sera réalisée par injection intraveineuse dans la veine caudale, en une dose subléthale et unique, sur animal vigile. Le poids corporel sera suivi quotidiennement le jour d'avant et après l'infection, soit pendant 2 ou 7 jours (quelques secondes sur la balance). Les fèces seront prélevées quotidiennement, pendant 2 ou 7 jours. Pour cela, les souris sont délicatement déposées dans des pots en plastique. Lorsqu'elles ont fait 1-3 crottes (au bout de quelques minutes), elles sont rentrées dans leur cage. Le jour de la fin de l'expérimentation, 2 ou 7 jours après l'infection, nous réaliserons le prélèvement sanguin juste avant l’euthanasie de l’animal (300ul, 30 secondes environ).

Impact sur les animaux

La douleur imposée aux animaux est d'origine infectieuse. Du fait de l'utilisation d'une dose subléthale, c'est-à-dire ne menant pas à la mort de l'animal, on peut estimer que son intensité sera modérée. La douleur de la piqure est une douleur seuil considérée comme légère en expérimentation animale. Les animaux seront également pesés quotidiennement pendant 2 ou 7 jours, et placés quelques minutes dans des pots en plastique afin de prélever leurs fèces. Un prélèvement sanguin juste avant l’euthanasie de l’animal sera également réalisé.

Devenir

La méthode de mise à mort prévue à l'issue de chaque procédure est la dislocation cervicale. Celle-ci est réalisée dans une pièce dédiée (pièce de manipulation post-mortem) par des personnes formées et autorisées.

Remplacement

Des expériences préliminaires in vitro, sur neutrophiles murins de la moelle osseuse, ont été réalisées afin de remplacer des expériences in vivo et de ne réaliser qu'un seul modèle infectieux chez la souris pour ce projet. Par exemple, un « endpoint dilution assay » (dilution au point limite, où l'on compte grâce à un microscope le nombre de colonies de C.albicans ayant résisté aux neutrophiles) a permis de mettre en évidence que les neutrophiles mutés pour Card9 sont moins capables d'éliminer C. albicans in vitro. Ces résultats obtenus par expérimentation in vitro auraient pu faire l'objet d'expérimentation in vivo, par exemple par des modèles complémentaires d’infection à C. albicans par voie orale chez la souris. Nous avons décidé de nous limiter à ce modèle in vivo par voie intra-veineuse, pour réduire l’expérimentation animale tout en assurant une compréhension optimale de la maladie.

Réduction

Le nombre d’animaux est basé sur le rapport de biostatisticiens. 20 souris par groupe sont nécessaires à l’obtention de différences statistiquement significatives pour l’étude de la résistance à l’infection et de la dissémination dans les organes à 2 ou 7 jours. Cela prend en compte un effet attendu de ±60% (hypothèse nulle moyenne de 1500 cfu C. albicans/organe dans le groupe contrôle, hypothèse nulle alternative de 2400 cfuC. albicans/organe dans le groupe expérimental), une P-value de 5%, puissance de 80%, déviation standard Sigma de 0,5, et test 2-sided. Nous utiliserons des groupes de mâles et de femelles afin d'optimiser l'utilisation des souris générées pour ce projet, tout en veillant à ce que les souris mutées et leurs contrôles soient du même sexe, afin de pouvoir conclure quant à l’importance de la mutation sur le contrôle de la dissémination du champignon.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans les conditions standard. Nous veillerons à enrichir le milieu de vie par l’ajout de feuille de cellulose dans les cages et d’un abri prévu à cet effet. Les souris seront au maximum 5 par cage. Les souris seront observées quotidiennement afin de surveiller leur état de santé et bien-être. Si un animal des signes liés à la perte de poids et à la déshydratation (sans atteindre une perte de 20% correspondant au point limite), du Diet Gel sera placé dans la cage afin de faciliter l’accès pour l’animal à une source d’hydratation. Si la perte de poids atteints 20% du poids initial, l’animal sera mis à mort par limiter sa souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle largement utilisé dans le cadre de l'étude de pathologies intestinales humaines. Le modèle d'infection à C. albicans par voie intraveineuse est un modèle très bien caractérisé, reproductible et qui permet de mimer les infections invasives humaines dues aux cathéters notamment, dans le contexte nosocomial. Les lignées utilisées sont déjà en élevage. Aucun de ces génotypes n'est dommageable. Nous utiliserons des souris de fond génétique C57BL/6, âgées au début de chaque expérimentation de 7 à 11 semaines, mâles ou femelles, afin d'optimiser l'utilisation des animaux. A chaque fois, les souris mutées et leurs contrôles seront du même sexe. Les souirs utlisées seront âgées d'au minimum 7 semaines, soit à partir du moment où le système immunitaire est mature. L'utilisation de l'espèce Mus musculus pour l'étude des infections fongiques invasives à Candida albicans est cruciale pour mieux en comprendre le mécanisme infectieux dans un organisme complexe. Cela permettra de développer des solutions préventives et thérapeutiques innovantes pour les patients souffrant d'un affaiblissement immunitaire, soit causé par une mutation génétique, soit par un contexte fragilisant comme les séjours prolongés à l'hôpital.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois injections intramusculaires dans les pattes arrière sur animal vigile maintenu par contention, puis deux prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, pour comparer des candidats vaccins anticytokines en développement. Le porteur indique que les prélèvements oculaires peuvent provoquer douleurs, blépharospasme et écoulements. Il conclut que l'absence de méthode in vitro rend le recours à la souris "incontournable", préférant une lignée transgénique produisant des protéines humaines.

Objectifs

Les cytokines sont des protéines naturelles qui assurent la communication intercellulaire et orchestrent les réponses immunitaires, inflammatoires ou allergiques. Leur surexpression ou dérégulation conduit à l’apparition ou au développement de pathologies auto-immunes, inflammatoires ou cancéreuses. Ces pathologies sont aujourd’hui de véritables enjeux de santé publique. C’est pourquoi, une nouvelle stratégie d’immunothérapie active a été développée, reposant sur la production d’anticorps anti-cytokine, par le système immunitaire du patient, après administration d’un candidat vaccin. Ce dernier est composé d’une protéine porteuse couplée à une cytokine. Un test d’activité chez la souris permet de sélectionner les meilleurs candidats vaccin lors de la phase de développement. Il n’existe à ce jour pas de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immunologique à ce vaccin. Cette limitation rend incontournable le recours à l’expérimentation animale, pour tester l’efficacité de nouveaux candidats vaccins. Cette étude sert à valider la conformité des lots de vaccins produits pour les études précliniques, ainsi qu’à valider les évolutions du procédé inhérentes au développement jusqu’aux études cliniques. A terme ce test chez la souris sera standardisé pour être utilisé comme test de contrôle qualité pour la libération des lots de vaccins.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider que les modifications apportées au cours du développement du procédé de fabrication du vaccin n’affectent pas l’activité in vivo de ce dernier qui à terme sera administré chez l’homme au cours d’un programme d’évaluation clinique.

Procédures

Chaque animal recevra trois injections de vaccin par voie intramusculaire aux sites d’injections des pattes arrière (100 µl au total, 50 µl par patte). Les injections sont réalisées sur animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes. Ensuite, chaque animal sera prélevé 2 fois au sinus retro orbitaire sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane (anesthésie sur une durée de 5min). Le prélèvement de sang est réalisé en moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus à l’injection ou au prélèvement au sinus retro orbitaire. Les effets secondaires liées au candidat vaccin ne sont pas attendus. Le principe du vaccin étant de provoquer une réponse immune, des effets indésirables de type inflammatoire peuvent se produire principalement au site d’injection et se manifester par des œdèmes et érythèmes pouvant durer quelques heures à quelques jours. L’injection se faisant par voie intramusculaire dans le muscle de la patte arrière une douleur musculaire localisée pourra entre autres être détectée si l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les prélèvements sanguins se faisant au niveau du sinus rétro-orbitaire, des effets indésirables sur l’œil peuvent se produire. La survenue de contractions répétées et involontaires des muscles des paupières (blépharospasme), la sécrétion lacrymale éventuellement accompagnée de photophobie, les écoulements, la survenue d'œil rouge ou opaque seront examinés, puisqu'ils traduisent des douleurs oculaires et l'état des yeux.

Devenir

Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, ce dernier conservera une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement-vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. Après le deuxième prélèvement, soit à jour 56 après la première injection, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale.

Remplacement

La stimulation du système immunitaire par vaccination ne peut s’effectuer que sur animaux vivants. Il n’existe pas à ce jour de méthode in vitro permettant de remplacer le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Ce protocole suit la condition pour lequel un nombre de 10 animaux par groupe procure une puissance statistique suffisante (tests statistiques classiques, i.e. Wilcoxon). Les groupes de souris sont divisés en sous-groupes de 10 selon leur sexe.

Raffinement

Les animaux disposent d'une période d'acclimatation conséquente (minimum 7 jours) avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter l'angoisse subie. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections réalisées en intramusculaires et les prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, ont lieu de façon ponctuelle et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance (Buprénorphine à 0,05 mg/kg par voie sous-cutanée). Si un animal présente l'un des points limite à un seuil critique, il est mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (igloo + copeaux) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

Il n’existe à ce jour pas de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immune à un vaccin. Cette limitation rend incontournable le recours à l’expérimentation animale, préférentiellement la souris, pour tester l’efficacité de nouveaux candidats vaccins. La réponse immunitaire chez la souris est assez proche de celle de l’Homme. Dans le cas des tests de nos vaccins candidats pour l’Homme, il est nécessaire d’utiliser une lignée de souris transgénique. Ces souris sont capables de produire des protéines d’intérêt ayant une séquence humaine. Ces conditions sont ainsi proches des réponses immunes attendues chez l’Homme lors de l’administration de nos vaccins et sont donc plus pertinentes pour en évaluer l’efficacité.

8 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Fortement immunodéprimées, elles reçoivent des cellules T humaines et des cellules tumorales, avec une à deux injections ou prélèvements par semaine, pour optimiser l'efficacité de ces cellules contre le lymphome. Le porteur indique une perte de poids possible et l'arrêt de l'expérience en cas de souffrance. Il affirme que cette analyse de cellules humaines ne peut se faire qu'in vivo, sur un modèle murin très immunodéprimé.

Objectifs

Le traitement des cancers des cellules du sang représente un enjeu majeur et dans ce contexte, de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer ont récemment été développées en utilisant notre système de défense pour cibler et éliminer les tumeurs. Notamment, des immunothérapies basées sur l’injection de cellules immunitaires spécifiques de protéines tumorales, comme par exemple les approches utilisant des cellules T modifiées pour reconnaitre spécifiquement une tumeur, ont démontré leur potentiel thérapeutique, et sont maintenant approuvées en clinique pour certaines applications. Cependant des cas de résistances/rechutes pour ces patients restent trop nombreux et de nombreuses questions demeurent pour en comprendre les raisons et en conséquence, pouvoir optimiser la persistance et la réactivité des cellules T greffées chez ces patients. Dans ce projet, nous proposons de déterminer dans un modèle murin adapté : 1) l'efficacité anti-tumorales de cellules T humaines générées à partir d’échantillons de patients atteints de lymphome 2) de quelle manière le processus de préparation des cellules T et la nature de la tumeur, affectent le devenir et l’efficacité des cellules T greffées. Les résultats obtenus pourraient permettre une amélioration de l’efficacité de ces nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de notre projet sont tout d’abord une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans une réponse anti-tumorale efficace d’une population de cellules de notre système immunitaire, les cellules T. D’autre part, nous espérons que nos résultats auront pour conséquence l’amélioration dans un premier temps du traitement des lymphomes mais également, à plus long terme, d’autres types de cancers. Cette problématique reste en effet une problématique majeure puisque le traitement des cancers des cellules sanguines en général, et du lymphome en particulier, représente toujours un enjeu de santé majeur (plus de 5000 nouveaux cas/an dont 1/3 de cas réfractaires aux traitements de premières lignes). Dans ce contexte, comme indiqué ci-dessus, le développement de nouvelles stratégies anti-tumorales, basées sur les propriétés du système immunitaire pour cibler et éliminer les tumeurs, a permis d’améliorer les traitements contre le cancer et notamment les hémopathies. Ainsi, les traitements basés sur l’injection de cellules T anti-tumorales sont maintenant approuvés en clinique pour le traitement de différents cancers hématologiques tels que les leucémies ou les lymphomes. Toutefois, malgré des résultats spectaculaires, des formes réfractaires à cette approche persistent. Différentes explications peuvent être invoquées comme une faible/absence d’expansion des cellules T anti-tumorales après infusion, un défaut de persistance ou encore une altération de leur fonctionnalité. Ainsi, il est crucial de déterminer les causes de ces échecs afin d’optimiser l’efficacité de ces nouvelles thérapies pour cet enjeu majeur de santé publique. Ce projet permettra ainsi comme indiqué précédemment d’accroître nos connaissances sur les paramètres pouvant impacter l’efficacité des cellules T anti-tumorales et ainsi, identifier de nouvelles pistes pour optimiser cette approche thérapeutique prometteuse.

Procédures

Les animaux subiront différents types d'injections ou prélèvements pour lesquelles la douleur est faible à modérée et ne requièrent pas plus que quelques minutes par animal. Par souci du bien être animal et en fonction du type d'injection, l'intervention sera réalisée sous anesthésie ou contention appropriée de l'animal. En moyenne, un animal subira 1 à 2 injections ou prélèvements par semaine au cours d’une expérience.

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental mis en place afin de répondre à nos objectifs peut induire une perte de poids transitoire chez l’animal. Les animaux seront observés et suivis régulièrement afin de détecter l’apparition de tout signe de douleur détaillée dans une fiche de suivi clinique (perte de poids, altération du comportement, de la qualité du poil, de la mobilité, …). En cas de souffrance de l'animal, l'expérimentation sera arrêtée.

Devenir

La totalité des animaux impliqués dans cette demande sera mise à mort en fin d'expérimentation afin de prélever les organes lymphoïdes et réaliser des analyses par cytométrie en flux et microscopie.

Remplacement

La caractérisation des effets anti-tumoraux des cellules T de patients modifiées ex vivo en parallèle du suivi du développement tumoral ne peut être abordé à ce stade qu’in vivo. Il n’existe pas d’approches in vitro ou in silico qui permettent de s’en affranchir. Le projet décrit dans le cadre de cette demande requiert une analyse intégrée in vivo de la fonctionnalité de cellules T humaines anti-tumorales, en présence de tumeurs. Toutefois, de nombreuses conditions de culture et/ou modifications des cellules T de patients seront, dans une première phase, testées ex vivo de manière à sélectionner et ainsi optimiser, le nombre de conditions testées in vivo.

Réduction

Cette étude est basée sur les données de la littérature et l’expertise de nos collaborateurs dans la réalisation d’expériences comparables. Par ailleurs, de nombreuses conditions de culture et/ou modifications des cellules T de patients seront dans une première phase testées ex vivo de manière à sélectionner et ainsi optimiser le nombre de conditions qui seront ensuite testées in vivo. Les modèles tumoraux utilisés dans cette étude permettent un suivi facilité du développement tumoral par bioluminescence et une limitation du nombre d’animaux utilisés. De plus, nous avons évalué en fonction des données connues, du degré d’hétérogénéité de la pathologie et de la prise des greffes, que le nombre d’animaux par groupe expérimental (n=8) permettait d’atteindre une puissance statistique suffisante. Les expériences proposées sont décrites en deux phases ce qui permettra de sélectionner et limiter les conditions à tester dans la deuxième phase et ajuster, si nécessaire, le nombre d’animaux requis. Par ailleurs, mâles et femelles pourront être utilisés dans ce projet afin d’optimiser au maximum l’utilisation des animaux. Enfin, les données obtenues seront systématiquement évaluées au moyen de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Durant les expériences, les animaux seront suivis quotidiennement par les zootechniciens et/ou chercheurs. Pour leur bien être et réduire le plus possible souffrance et angoisse, les animaux seront maintenus systématiquement à plusieurs par cage avec un enrichissement suffisant pour leur permettre de construire des nids et ainsi améliorer leur bien être. Afin d'évaluer la souffrance des animaux en expérimentation, la qualité du poil, la mobilité, la posture et le poids des souris seront monitorés (en utilisant une grille d'évaluation clinique). Une attention toute particulière sera portée à la perte de poids : ainsi, le poids des animaux sera mesuré régulièrement et un peu de nourriture humidifiée (et/ou substitut gélifié) sera déposé si besoin directement dans la cage afin d’éviter aux souris d’aller chercher en hauteur la nourriture et l’eau. L’expérimentation sera arrêtée immédiatement si un état de souffrance est détecté chez les animaux.

Choix des espèces

Le projet décrit dans le cadre de cette demande requiert une analyse intégrée in vivo de la fonctionnalité de cellules T humaines anti-tumorales, en présence ou en absence de tumeurs. Ces questions ne peuvent pas être abordées à l’heure actuelle au moyen de méthodes alternatives in vitro ou in silico, et demandent ainsi de faire appel à des modèles animaux, murins dans le cas présent, en raison des grandes similitudes du système immunitaire murin et humain. Par ailleurs, pour cette étude faisant appel au transfert adoptif de cellules T humaines, seul un modèle murin fortement immunodéprimé peut être utilisé. Dans cette optique, des animaux adultes males et femelles (agés de 8-15 semaines) seront utilisés pour les expérimentations proposées.

39 600 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit l'injection d'un produit pharmaceutique et sa température est suivie, pour détecter d'éventuelles substances provoquant de la fièvre, environ un lapin sur cinq servant à un second test avant sa mise à mort. Le porteur reconnaît qu'un test sans animaux, décrit dans la Pharmacopée européenne, peut être une "vraie alternative", mais maintient l'essai sur lapins parce qu'il reste inscrit comme obligatoire dans les dossiers d'autorisation. Il présente le nombre et l'espèce comme fixés par les Pharmacopées.

Objectifs

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées internationales, qui sont les référentiels pharmaceutiques pour la réalisation des tests de contrôle qualité. L’objectif de ce test est de détecter la présence de molécules pyrogènes, c’est-à-dire pouvant provoquer une augmentation de la température, à l’intérieur de produits pharmaceutiques, médicaments expérimentaux ou de dispositifs médicaux. Pour cette détection, le produit à tester est injecté à un groupe de lapins, et la température de ces animaux est mesurée afin de déterminer la hausse de température éventuelle.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments ou des dispositifs médicaux à des patients. Ce test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire comme test libératoire de produits pharmaceutiques.

Procédures

Injection de NaCl 0.9% en intraveineuse (10mL /kg) -Injection de l’échantillon à tester en intraveineux (IV) à la dose maximum de 10 ml/kg ou en intra-musculaire (IM) à 1 ml/lapin maximum -Contention de l’animal durant l’essai.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour l’animal sont : -L’administration des produits pharmaceutiques, -L’euthanasie de l’animal utilisé en fin de protocole, - La contention de l’animal durant le test.

Devenir

Tous les animaux entrant en test pyrogène sont mis à mort : -soit en cas de détection d’un signe clinique -soit à la fin de la réalisation des tests pyrogènes -soit s’il ne réussit pas le prétest 2 fois consécutives, et n’est donc pas éligible pour un test pyrogène A noter néanmoins qu’environ 20% des lapins effectuent un deuxième test pyrogène (réutilisation) avant d’être euthanasiés.

Remplacement

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM de clients. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques. Cet essai ne peut pas aujourd’hui être réalisé ex vivo pour plusieurs raisons : -Le test des endotoxines bactériennes, qui peut être utilisé comme variante au test pyrogène, ne détectera que les molécules type endotoxines, alors que le test sur lapins pourra détecter tout type de molécules pyrogènes. -Il existe maintenant le test MAT qui est décrit dans la Pharmacopée européenne, et peut être une vraie alternative au test pyrogène. En revanche ce test peut ne pas être validable pour certains produits pour cause d'interférences. -Il s’agit d’un test réglementaire, obligatoire à partir du moment où il est enregistré dans le dossier d’AMM (autorisation de mise sur le marché) du produit.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est défini par les Pharmacopées (entre 3 et 5 lapins selon les Pharmacopées – note : 3 lapins sont usuellement utilisés) ou le cas échéant dans les dossiers d’AMM des scientifiques. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, une réutilisation des lapins est possible dans un même projet dans la mesure où un lapin ne reçoive pas deux produits immunisants (exemple : antibiotique).

Raffinement

Hébergement : Les Pharmacopées demandent que les lapins utilisés en test pyrogène soient hébergés individuellement or la directive européenne exige un hébergement en groupe sociaux. Afin de respecter la pharmacopée tout en préservant au mieux le besoin d'hébergement social les lapins sont stabulés 2 par cage de 4329 cm². Présence d’une séparation avec ouverture, permettant aux 2 animaux de se déplacer librement sur toute la surface de la cage. La veille du prétest ou test, l’ouverture est condamnée, et chaque lapin est donc stabulé individuellement dans une demi-cage. Quand l’hébergement par groupe de 2 n’est pas possible (ex : incompatibilité sociale) : Stabulation d’un seul lapin dans une cage de 4329 cm² tout en gardant le contact visuel et olfactif avec ses congénères. Enrichissement : Des enrichissements sont fournis aux animaux (e.g. balles de foins, balles en plastique). Surveillance : Pendant la procédure, la présence permanente d'un technicien est planifiée et l’état clinique général des animaux est vérifié toutes les heures après l’injection jusqu’à la fin de l’essai, et la durée d’enregistrement des températures après l’injection est limitée à 5h30 maximum. Les animaux sont ensuite replacés dans leurs cages de stabulation pour qu’ils aient un accès à l’eau et l’aliment. Autre : Lorsque cela correspond à un raffinement de la méthode, l’administration d’un produit approuvé au préalable par le service vétérinaire peut être utilisé dans le cadre d’un test pyrogène (exemple : injection de glucose 5% lors d’un essai de test pyrogène d’une insuline).

Choix des espèces

Le lapin est l’espèce requise par les Pharmacopées pour la réalisation de ce test. Le poids des lapins minimum pour la réalisation de ce test est de 1.5kg (lapins adultes) en accord avec les exigences des pharmacopées.

1500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Maintenues vigiles par contention, elles reçoivent des injections de nanoparticules lipidiques puis cinq injections quotidiennes de luciférine, avant prélèvements sanguins et imagerie sous anesthésie. L'expérience ne teste pas encore un vaccin mais sert à choisir la meilleure formulation lipidique à l'aide d'un ARNm marqueur. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'évalue la réponse à un vaccin et juge le recours à la souris "incontournable".

Objectifs

Les allergies sont aujourd’hui un problème de santé publique. Ces affections très répandues, particulièrement dans les pays développés, touchent 25 % de la population européenne. Elles sont dues à un dérèglement du système immunitaire qui devient hypersensible à des substances généralement inoffensives. Ceci se traduit par la surexpression ou dérégulation de certaines cytokines et conduit à l’apparition de la pathologie. Ce projet s’inscrit dans le cadre de développement de vaccins contre les allergies. Au sein de notre société, nous avons développé une stratégie d’immunothérapie active (stimulation du système immunitaire du patient) reposant sur la production d’anticorps anti-cytokine après administration d’un vaccin appelé ‘Kinoïde’. Ce dernier est présenté soit sous forme de protéine, soit sous forme de vaccin ARN véhiculé par des lipides. L’injection du vaccin Kinoïde™ a pour but d’induire chez la souris des anticorps contre la cytokine d’intérêt. Il n’existe pas à ce jour de méthodes alternatives permettant d’évaluer la réponse immunologique à un vaccin, ce qui nous oblige à les tester chez la souris. Afin de développer ces nouveaux candidats vaccins, nous devons sélectionner dans un premier temps les transporteurs lipidiques permettant de protéger l’ARN et de l’acheminer aux bonnes cellules afin d’induire la production d’anticorps. PPour cela, nous souhaiterions définir la composition des formulations lipidiques (nanoparticules lipidiques ou NPL) optimale dans lesquels seront encapsulés les ARNm afin de permettre une meilleure délivrance aux cellules et ainsi une meilleure expression de la protéine d’intérêt. Pour ce faire, nous utiliserons comme modèle un ARNm codant pour la Firefly luciférase (ARNm-FLuc). Cette dernière, après réaction avec son substrat, la luciférine, émet un photon lumineux, qui permettra d’évaluer par imagerie optique, technique non invasive et non traumatisante, le profil de distribution des différentes formulations lipidiques et l’expression de la protéine en fonction du temps. Ces travaux nous permettrons de sélectionner la meilleure formulation lipidique pour encapsuler nos constructions d’ARNm constituant ainsi une nouvelle voie de protection contre les pathologies allergiques chez l’homme.

Bénéfices attendus

L’évaluation du profil de distribution des différents transporteurs lipidiques en fonction du temps nous permettra de sélectionner la formulation lipidique optimale pour encapsuler nos ARN pour pouvoir ensuite évaluer leur d’immunogénicité .

Procédures

Les 1500 animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes recevront une injection unique de formulation lipidique NPL par voie intramusculaire dans le muscle de la patte arrière (750 souris) ou une injection sous-cutanée dans le flanc (750 souris). De plus, chaque animal vigile maintenu par contention pendant 30 secondes recevra au total 5 injections de luciférine par voie péritonéale, à raison d’une injection par jour pendant 5 jours. L’anesthésie des souris lors des injections n’est pas prévue. Le prélevement sanguin est réalisé en moins de 30 secondes sur souris anesthèsiees à l'isoflurane. Chaque animal subira 3 prélèvements au total. L’imagerie sera réalisée sous anesthèsie isoflurane sur une durée de 15min, au total. Chaque animal sera imagé 1 fois par jour pendant 5 jours.

Impact sur les animaux

Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Ainsi, la température de la pièce, la ventilation et l’éclairage seront contrôlés pour limiter le stress des animaux. De plus, le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage afin de leur assurer l’espace nécessaire. Ce milieu sera enrichi (igloo + copeaux) et la nourriture et l’eau sera fourni ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal. Les animaux disposent d'une période d'acclimatation (minimum 7 jours) avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter l'angoisse subie. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections, réalisées par voie intramusculaire, sous-cutanée ont lieu de façon unique et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Seul le stress de la contention impacte brièvement leur comportement. Des effets indésirables peuvent se produire aux sites d’injection (intramusculaire, sous-cutané) tels que des rougeurs, des gonflements ou des lésions pouvant durer quelques heures à quelques jours. Une douleur musculaire localisée pourra entre autres être détectée si l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse.

Devenir

Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, celles-ci conserveront une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. Après la dernière imagerie réalisée, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale.

Remplacement

Des tests cellulaires in vitro seront effectués au préalable pour sélectionner les formulations NPL constituées de différents lipides par analyse de l’expression de la luciférase par les cellules. Cette première sélection permettra de ne tester chez l’animal que les formulations optimales et de réduire ainsi le nombre d’animaux.

Réduction

L’utilisation de l'imagerie nous permet de suivre l’évolution de l’expression et de la biodistribution des formulations lipidiques encapsulant l’ARNm injectées chez la souris en fonction du temps. Cette technique non invasive nous permet ainsi de réduire le nombre d'animaux. Si une absence de réponse pour une formulation est observée, l’étude sera interrompue et de ce fait le nombre d’animaux sera réduit.

Raffinement

Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale à l’isoflurane. Les animaux subissent des contraintes très modérées puisque les procédures effectuées seront légères. Les injections, réalisées par voie intramusculaire et sous-cutanée ont lieu de façon unique et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Seul le stress de la contention impacte brièvement leur comportement. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance (Buprénorphine à 0,05 mg/kg par voie sous-cutanée) Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. Si un animal présente l'un des points limites à un seuil critique, une injection d’analgésique sera effectuée ou en fonction du grade il sera mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (igloo + copeaux) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus approprié du fait de sa physiologie proche de l’Homme (taux d’homologie 90 %) et de la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Les souris utilisées seront des souris adultes, de 7 semaines avec un système immunitaire mature pour tenir compte de leur réponse humorale. En effet, il n’existe à ce jour pas de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immune à un vaccin. Cette limitation rend incontournable le recours à l’expérimentation animale, préférentiellement la souris, pour tester l’efficacité de nouveaux candidats vaccins.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur induit chez elles une insuffisance rénale chronique, soit par une chirurgie des deux reins en deux temps, soit par un régime enrichi en adénine toxique pour le rein, avant de les immuniser et de leur infliger jusqu'à huit prélèvements sanguins. À la fin, toutes sont mises à mort sous anesthésie pour prélever ganglions, rate et sang. Il affirme que la complexité des mécanismes immunitaires et l'emploi d'une lignée génétiquement modifiée rendent les modèles in vitro insuffisants.

Objectifs

L'insuffisance rénale chronique (IRC) se définit par une diminution de la capacité de filtration des reins, et est une maladie extrémement fréquente (de causes multiples) touchant près de 10% de la population générale. Parmis les complications associées à l'IRC, on observe un profond défaut de réponse immunitaire humorale (capacité à générer des anticorps contre une cible) : cela se traduit par une augmentation de la mortalité infectieuse (100 à 1000x supérieure à celle d'une population non IRC du même âge), et à un défaut de réponse post vaccinale (par exemple, moins de 50% des patients ont une réponse anticorps satisfaisante après 2 doses de vaccin mRNA anti SARS-CoV-2). Cependant, les mécanismes responsables de ce défaut de réponse immunitaire humorale associée à l'IRC restent à ce jour non compris. Dans ce projet, nous souhaitons 1/ Valider dans un 2nd modèle les observations réalisées dans un 1er modèle murin d'IRC dans lequel nous avons identifié certains éléments de dysfonctions de l'immunité humorale. 2/ Determiner à quelle branche du système immunitaire (adaptatif et/ou inné) est du ce défaut de réponse immunitaire humorale.

Bénéfices attendus

Ce projet à pour but d'augmenter la compréhension des mécanismes physiopathologiques responsables du défaut de réponse immunitaire humoral lié à l'IRC, et donc par la suite de dévelloper des thérapeutiques permettant de diminuer le risque infectieux de ces patients et d'améliorer leur réponse vaccinale.

Procédures

Nous induirons l'IRC chez les animaux de 2 manières différentes (procédure 1: chirugie au niveau des 2 reins réalisée en 2 étapes à une semaine d'intervalle sous anesthésie générale et prise en charge de la douleur en pré et post-opératoire / Dans la deuxième procédure, le modèle d'IRC, modèle déjà utilisé dans une précédente étude, est mis place par un régime alimentaire enrichi en adénine pendant 6 semaines pour induire une toxicité rénale. Ces 2 modèles permettent d'induire une maladie rénale de stade modéré). Ces animaux seront ensuite immunisés par une injection sous cutanée réalisée sous anesthésie générale gazeuse (1min). Des prélévements sanguins seront réalisés (1min) sous anesthésie gazeuse, avec une alternance des techniques et des lieux de prélévement afin de limiter leur impact sur l'animal (8 prélévements au total pour la procédure 1 et 6 prélévements au total pour la procédure 2). Enfin, dans la procédure 2, les animaux recevront une injection intraveineuse (1min) après anesthésie générale gazeuse. La durée totale de la procédure 1 est basée sur 2 temps différents après l'immunisation soit 112 jours pour le lot 1 et 54jours pour le lot 2. La durée totale de la procédure 2 est de 45jours

Impact sur les animaux

Concernant le modèle chirurgical, dans de précédentes études, la mortalité était de moins de 5%. La mortalité est généralement liée à l'induction d'une maladie rénale chronique trop sévère et arrive généralement dans les 24-48h après la néphrectomie totale (2° chirurgie). De plus, il n’a pas été noté de comportements anormaux dénotant une souffrance ou une anxiété des animaux. Néanmoins, l’état général des animaux sera évalué le soir de la chirurgie, matin et soir pednant les 2 jours suivants puis 5 jours par semaine afin d’identifier l’apparition de troubles du comportement pouvant traduire une douleur ou une angoisse. Concernant le modèle adénine, la mortalité est exceptionnelle. Le régime entraine une perte de poids modérée, et les animaux seront donc suivis cliniquement et pesés 3x par semaines pendant l'ensemble de la procédure. Enfin, bien que les injections intraveineuses et sous cutanées ne soient pas connues pour entrainer d'effet indésirables particuliers, les animaux seront suivis de manière rapprochés et différents points limites ont été fixés qui si ils sont dépassés, entraineront la mise à mort de l'animal concerné.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris sont mises à mort sous anesthésie générale selon le protocole afin de permettre le prélévements de différents organes (ganglions, rate, sang) pour permettre des analyses complémentaires dans le but d'identifier et de comtabiliser les différentes cellules du système immunitaire.

Remplacement

Le but de cette étude est de préciser les mécanismes par lesquels l’insuffisance rénale chronique affecte la réponse humorale. La complexité des mécanismes immunologiques en jeu, ainsi que la complexité de l’état d’IRC ne peuvent être appréhendés par des modèles in vitro seuls. De plus, ce projet necessite l'emploi d'une lignée génétiquement modifiée permettant de disséquer l'effet de l'IRC sur l'immunité adaptative et innée, ne permettant pas d'être approchée par des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupes expérimentaux dans chaque procédure expérimentale a été calculé a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Ainsi, le nombre d'animaux controle à pu être diminué de moitié dans la procédure 1 compte tenu de l'homogénéité des résultats chez ces animaux. On prévoit cependant la possibilité de répéter une fois les procédures en cas de problème experimental.

Raffinement

Les chirurgies seront réalisées sur tapis chauffant (37°C), en condition d'asepsie, sous anesthésie générale médicamenteuse ou gazeuse. Une protection oculaire sera effectuée. L'antalgie sera assurée dans un délai suffisant en pré-opératoire (30min avant la chirurgie) puis pendant 48h matin et soir. Il n’a pas été noté de comportements anormaux dénotant souffrance ou anxiété. Une surveillance rapprochée sera mise en place 2 fois/jour pendant 48h en post-opératoire puis 1 fois par jour 5 jours/semaine et le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole. En post opératoire immédiat, de l'eau gélifiée et de l'alimentation seront mis dans les cages à disposition des souris pour faciliter leur alimentation/hydratation. Les mises à mort seront réalisées sous anesthésie générale pour permettre un prélèvement de sang total nécessaire aux dosages immunologiques. Des points limites suffisamment précoces ont été mis en place afin d'anticiper toute douleur liée aux protocoles et permettre d'internevir en cas de necessité. Le régime alimentaire enrichi en adénine est bien toléré par les souris. Les animaux seront placés 5/cage afin de garder leurs interactions sociales.

Choix des espèces

Le présent protocole sera conduit sur des souris de 8-10semaines, car le modèle de maladie rénale chronique, est facilement réalisable et permet l'induction d'une maladie rénale chronique de stade modéré. De plus, l'altération de la fonction rénale chez la souris reproduit les modifications systémiques que l'on peut observer chez l'homme. Enfin, et du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire humorale.