Troubles immunitaires

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à cinq injections dans l'abdomen, parfois une injection dans la veine située derrière le globe oculaire, et jusqu'à cinq prélèvements de sang à la veine de la mandibule. Le porteur indique que les injections derrière l'œil peuvent produire des effets indésirables sur cet organe, que les prélèvements exposent à la déshydratation et aux hématomes, et que le déclenchement de la réaction immunitaire altère l'état général des animaux. Elles sont tuées pour prélever la rate et en extraire les cellules productrices d'anticorps, une étape que le porteur juge "indispensable" faute de modèle informatique reproduisant une réponse immunitaire.

Objectifs

Depuis les années 1980, les anticorps ont profondément modifié la thérapeutique dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Bien que le développement des anticorps soit un processus complexe, et que certains d'entre eux peuvent entraîner des effets indésirables préoccupants, leur apport dans l'arsenal thérapeutique est majeur. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Après injection d'un élèment déchenchant une réaction immunitaire (c'est-à-dire une réaction de défense de l'organisme), l’objectif est de récupérer les cellules productrices d’anticorps (spécifiques de cet élèment) pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt. Ces dernières seront amplifiées à très petite échelle en plaques de culture. Les cellules seront ensuite éclatées pour développer les anticorps. L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif.

Bénéfices attendus

Les anticorps et leurs dérivés constituent la classe des principes actifs qui connaît le plus fort taux de développement actuel dans les domaines biotechnologique et pharmaceutique. En effet, ces anticorps sont des outils de recherche, des réactifs pour les tests d'analyses biologiques et des candidats potentiels à une utilisation thérapeutique. Ils offrent de nouvelles perspectives pour générer une réponse immunitaire protectrice et durable. Ainsi, ils sont aujourd’hui utilisés dans les traitements de cancers, de maladies inflammatoires, de migraine et plus récemment dans la lutte des formes graves de la Covid 19. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Ce présent projet a pour but d’engendrer une réponse immunitaire spécifique chez l'animal. L’objectif principal est de récupérer les cellules productrices d’anticorps pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt.

Procédures

Les souris seront soumises à des injections et des prélèvements de sang. En effet, la réaction immunitaire sera réalisée par une injection dans l'abdomen puis par une autre injection dans l'abdomen (durée: 1 minute par injection) ou dans une veine localisée derrière le globe oculaire (durée: 5min). Le volume administré sera choisi en respectant les volumes maximaux d’administration chez la souris. Des prélèvements de sang (5 au maximum) pourront être réalisés à la veine de la mandibule afin de suivre le niveau de production d'anticorps des souris (durée: 2 min).

Impact sur les animaux

Les souris subiront des injections répétées dans l'abdomen (maximum 4 +1 avec une stimulation forte selon le protocole) ou une injection par voie intraveineuse. Ces administrations peuvent entraîner du stress chez l’animal lié à la contention, des douleurs, inflammations ou risques d'infections aux sites d'injection. Les injections réalisées dans la veine derrière le globe occulaire, peuvent produire des effets indésirables sur l’œil. Elles nécessitent une anesthésie par voie gazeuse des animaux pouvant générer une irritation des voies respiratoires. Les prélèvements de sang peuvent entraîner des risques de déshydratation ou de chute du volume sanguin et des hématomes aux sites de prélèvements. Le déclenchement d'une réaction immunitaire entraîne une altération de l'état général des animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire de prélever les organes pour extraire les anticorps.

Remplacement

L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Ces développements nécessitent l’utilisation d’animaux. En effet, ces tests doivent être réalisés sur un organisme entier afin de prélever les organes tels que la rate où sont retrouvés les cellules produisant les anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est une estimation des projets à venir et a été fixé à N = 10 animaux maximum par série expérimentale. Cela constitut le nombre maximal pour générer des anticorps. Le nombre d’animaux nécessaires par expérience sera calculé en se basant sur les données de la littérature de la cible d’intérêt afin d’évaluer la difficulté à obtenir les anticorps. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, des prélèvements sanguins répétés seront effectués sur les mêmes individus au cours du temps, permettant de suivre précisément l’évolution de la réponse immunitaire sans avoir recours à différents animaux pour chaque point temporel. De plus, dès que le nombre d’individus présentant une réponse supérieure au seuil minimal requis pour les analyses statistiques sera atteint, la série expérimentale pourra être arrêtée avant d’atteindre les 10 individus initialement prévus.

Raffinement

A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation clinique. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Les injections au niveau du sinus retro-orbitaire sont réalisées après anesthésie gazeuse de l'animal et analgésie locale de l’œil.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux pour créer et produire des anticorps reste nécessaire car aucun modèle bio-informatique ne permet à l’heure actuelle de recréer la réponse du système immunitaire de l’animal en présence d'un organisme étranger. La maturité sexuelle des souris se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes de stimulation de système immunitaire. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite.

Le mode d'administration, le nombre de prélèvements et le rythme des doses dépendent ici de l'appréciation du client. 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Les expérimentateurs leur injectent des anticorps IgE, puis l'allergène vingt-quatre heures plus tard pour déclencher une réaction anaphylactique, qui provoque une chute de la température corporelle, de fortes démangeaisons et parfois un gonflement du museau. Aucun anti-inflammatoire ni analgésique ne leur sera administré, un tel traitement faussant la mesure de la réaction, et le porteur ajoute qu'une molécule doit avoir été testée chez l'animal pour obtenir une autorisation de mise sur le marché.

Objectifs

Quel que soit l’âge du patient, l’anaphylaxie est une réaction allergique grave qui apparait rapidement et peut être mortelle même en cas de prise en charge rapide. Elle est imprévisible et peut être déclenchée par différents types d'allergènes (l’ovalbumine contenue dans les œufs, le venin d’abeille…). Les patients qui déclenchant l’anaphylaxie ont été en contact une première fois avec l’allergène ce qui a induit une réponse de leur système immunitaire qui, lors d’un deuxième contact, va réagir de manière excessive pour combattre l’allergène. L’anaphylaxie peut alors déclencher une baisse de la pression artérielle, des douleurs abdominales, des démangeaisons autour de la bouche…amenant jusqu’à la mort du patient en quelques heures ou minutes. À ce jour, il est donc impératif d’améliorer le suivi des patients et de diminuer le risque de décès. Pour ce faire, il est nécessaire de disposer de modèles animaux fiables mimant la physiopathologie de l’anaphylaxie. L’objectif scientifique de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques sur la récupération des souris suite à l’induction d’une anaphylaxie générale ou d’une anaphylaxie locale cutanée. Les animaux seront d’abord mis en contact avec l’allergène une première fois par injection, puis une deuxième fois avec une deuxième injection qui déclenchera alors la réaction anaphylactique. Les animaux recevront la molécule thérapeutique à tester avant, pendant ou après l’induction de l’anaphylaxie, dépendamment du mode d’action et de la connaissance que possèdent nos clients sur l’efficacité potentielle de leur molécule. Le sang et les organes prélevés dans les études inclues dans ce projet permettront de répondre à l’objectif de caractérisation et de quantification de l’inflammation et d’évaluer l’efficacité de la molécule testée. L’objectif général de ce projet est de contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients et réduire leur risque de mourir.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu à court et moyen termes réside dans l’identification des mécanismes impliqués dans l’atténuation des symptômes de l’anaphylaxie. Le bénéfice attendu à long terme de ce projet est l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients sujets à l’anaphylaxie et une réduction de la mortalité associée.

Procédures

Plusieurs interventions pourront être mises en place sur les animaux. L’induction de la pathologie (une seule fois par animal) pourra se faire par injection intraveineuse ou intrapéritonéale des IgE (anticorps produits en cas de réponse allergique) et de l’allergène correspondant 24h plus tard (allergène de synthèse). Pour cela, les souris seront anesthésiées (5minutes) à l’aide d’un gaz anesthésiant et recevront l’injection intraveineuse (1 minute) pour la voie intraveineuse. L’injection se fera sans anesthésie pour la voie intrapéritonéale (30 secondes). L’induction de la pathologie pourra aussi se faire par injection sous-cutanée des IgE (anticorps produits en cas de réponse allergique) puis injection intraveineuse de l’allergène correspondant 24h plus tard. Pour cela, les souris seront anesthésiées (5minutes) à l’aide d’un gaz anesthésiant et recevront l’injection sous-cutanée (1minute) puis, 24h plus tard, les souris seront de nouveau anesthésiées à l’aide du gaz anesthésiant et recevront l’injection intraveineuse (1 minute). Au cours de la procédure, les souris recevront des administrations répétées de composés client : les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire, intradermique (environ une minute par animal : saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). Selon l’appréciation du client, un ou plusieurs prélèvements de sang pourrons être effectués. Les prélèvements de sang n’excèderont pas 12 % du volume de sang total de l’animal et seront suivis d’une semaine minimum de récupération avant le prochain prélèvement. Le volume prélevé est dépendant du poids de l’animal.

Impact sur les animaux

L’anaphylaxie généralisée provoque comme effets indésirables : une baisse de la température corporelle et une sensation de démangeaison importante. Parfois, un gonflement du museau peut être observé. L’anaphylaxie cutanée provoque comme effets indésirables : une sensation de démangeaison localisée à l’oreille ainsi qu’un léger gonflement de l’oreille. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations (uniques ou répétées, selon les études) pourront également générer un stress chez l’animal. Les modes d’administration considérés comme nuisibles (pouvant induire une gène ou une douleur) incluent tous les modes d’injection.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire terminal.

Remplacement

Lorsque cela sera possible, les composés de nos clients seront préalablement testés sur culture cellulaire ou organes isolés permettant ainsi de mieux définir les doses à administrer par exemple. Cependant, l’utilisation des animaux sera nécessaire car les modifications physiopathologiques liées à l’anaphylaxie sont très complexes, doivent être mesurées dans un organisme entier. De plus, pour obtenir une autorisation de mise sur le marché, une molécule doit avoir été testée chez l’animal afin d’engranger des preuves d’efficacité fonctionnelle et de détecter d’éventuels effets indésirables. Nous devons donc être en mesure de prévoir l’apparition d’effets secondaires dans l’éventualité de l’utilisation future des candidats médicaments en clinique. Les effets indésirables ne peuvent s’observer que sur un animal vivant car ils peuvent impliquer plusieurs organes et plusieurs régulations physiologiques. L’utilisation des animaux sera donc essentielle à nos études mais nous nous efforcerons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés en effectuant des tests préliminaires sur d’autres modèles n’impliquant pas les animaux.

Réduction

Au sein de cette étude, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum pour une étude statistique soit 8 animaux par groupes. La comparaison des groupes entre eux sera faite à l'aide de test statistiques. Le nombre d’animaux nécessaires pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant sur des travaux préliminaires ainsi que sur l’expertise de notre société sur l’utilisation de ces modèles animaux. Les doses à tester seront au préalable, systématiquement évaluées après documentation dans la littérature ou par retour d’expérience du client. Par ailleurs, compte tenu de la variabilité des paramètres observés au sein d’un groupe homogène, une analyse sur des groupes de 8 animaux sera nécessaire afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Les tests statistiques seront réalisés sur un ligiciel spécifique afin de vérifier les différences obtenues entre les groupes.

Raffinement

Les procédures seront réalisées en respectant le bien-être animal, afin de limiter souffrance, douleur et angoisse. Les souris seront hébergées conformément à la réglementation avec enrichissement environnemental (igloo, carrés de ouate systématiquement et, si nécessaire, tunnel en carton, buchettes et boulettes en bois). Après induction de la pathologie, un suivi régulier sera effectué (score 1 et/ou score 2). Le score 1, reportera l’aspect général de l’animal et sera mis en place dans les deux modèles. Le score 2 reportera la réponse clinique à l’induction de la pathologie. L’atteinte d’un score trop important induira la sortie de l’animal de l’étude et sa mise à mort s’il ne récupère pas dans les heures qui suivent. Étant donné que l’anaphylaxie est basée sur l’inflammation, aucun traitement anti- inflammatoire ou analgésique ne sera administré, car cela compromettrait les résultats en agissant sur les voies de signalisation ciblées ainsi que sur le comportement et l’état physique, paramètres clés de l’évaluation. De plus, des interactions possibles entre le traitement testé et les médicaments anti-inflammatoires ne peuvent être exclues. Les prélèvements et administrations répétées pouvant induire du stress, un enrichissement sera maintenu. Les aiguilles et sondes de gavage seront adaptées au poids et au mode d’administration. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des anesthésiques pourront être utilisés.

Choix des espèces

L’utilisation de souris dans la modélisation de pathologies présentes chez l’Homme a longuement été décrite et justifiée de par leur proximité avec l’Homme. Par ailleurs, la souris est largement décrite comme une espèce de choix dans les modèles de développement de maladies inflammatoires telles que l’anaphylaxie compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. Il s’agit en effet d’un modèle bien établi et bien documenté dans la littérature pour l’analyse de la fonction immunitaire. Par ailleurs, l’étude de l’anaphylaxie nécessite des animaux ayant un système immunitaire mature, c’est-à-dire âgées de 7 à 12 semaines.

Une partie des souris utilisées développe spontanément une maladie auto-immune dès vingt-cinq semaines d'âge, et le projet cherche à accélérer ce développement par une infection. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de protocole ou plus tôt si elles atteignent un point limite. Les expérimentateurs leur injectent des bactéries dans l'abdomen pour provoquer un sepsis, les traitent aux antibiotiques deux heures après, puis prélèvent leur sang derrière l'œil sous anesthésie jusqu'à cinq fois, avec cinq à dix semaines entre deux prélèvements. Une partie d'entre elles sera gardée jusqu'à quarante semaines après l'infection, le porteur indiquant ne pas pouvoir prédire les symptômes qui apparaîtront.

Objectifs

Les maladies auto-immunes à autoanticorps sont des maladies où le système immunitaire, qui est censé protéger le corps, se met à produire des anticorps contre l’organisme lui-même (autoanticorps), et à attaquer certains organes voire tout le corps (on dit alors que c’est systémique). Ces maladies sont rares (moins d’une personne sur 2000) et peuvent être causées par l’environnement (comme la pollution ou l’alimentation), des hormones (elles touchent plus souvent les femmes), et/ou des prédispositions génétiques, c’est-à-dire que certaines personnes sont plus à risque à cause de leurs gènes. On a remarqué que les personnes qui font une infection grave (comme un sepsis, qui est une infection très sévère) et qui vont en réanimation ont un risque cent fois plus élevé que les autres de développer une maladie auto-immune dans les six mois qui suivent leur sortie de l’hôpital. On ne comprend pas pourquoi, après une infection très grave, certains patients développent une maladie auto-immune et d’autres non. Si on arrive à prédire quels patients risquent de développer ce genre de maladies dans ces conditions, on pourra mieux les soigner et essayer d’empêcher que la maladie auto-immune ne se développe, car ces maladies diminuent la qualité de vie des patients et coûtent très cher à la société. Notre projet a pour but de comprendre comment une infection grave peut déclencher une maladie auto-immune, en utilisant des souris pour faire des expériences et observer ce qu’il se passe. On veut répondre à deux questions principales : 1) Est-ce qu’une infection sévère peut déclencher une maladie auto-immune chez des souris déjà à risque ? 2) Est-ce qu’une infection sévère peut aussi déclencher une maladie auto-immune chez des souris normales qui ne sont pas à risque ? En comprenant mieux ces mécanismes, on espère trouver de nouvelles façons d’identifier les individus à risque et ainsi améliorer leur prise en charge et mettre en place des stratégies de prévention.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension des mécanismes du lien entre infection sévère et développement de l’auto-immunité. Les cellules et molécules impliquées dans cette induction auto-immune seront ainsi identifiées. Le deuxième niveau concerne la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et l’identification des biomarqueurs (marqueurs de maladie faciles à détecter dans le sang ou les urines) associés à cette évolution de l’inflammation aiguë vers l’auto-immunité permettront de pouvoir identifier les patients à risques et de prévenir le développement de telles affections chroniques.

Procédures

Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : des injections dans le ventre (« intrapéritonéales ») et sous la peau (« sous-cutanées), des contentions (attrapés et immobilisés dans une main) et les animaux seront soumis au prélèvement d’un petit volume de sang sous anesthésie générale. Les gestes réalisés durent moins de 30 secondes chacun. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale avec des bactéries une seule fois pour imiter une infection sévère. 2 heures plus tard, elles seront traitées avec des antibiotiques par injection sous-cutanée quatre fois sur une période de 24h dans le but de les guérir de l’infection, comme les patients en réanimation. Ces souris auront un prélèvement sanguin sous anesthésie générale avant l’infection, puis certaines seront à nouveau prélevées 4 fois avec 5 à 10 semaines entre deux prélèvements. Cela nous permettra de comparer les paramètres sanguins des souris avant et après infection pour voir si elles ont développé une maladie auto-immune.

Impact sur les animaux

Certaines souris utilisées ici développent une maladie auto-immune légère mais quantifiable dès 25 semaines d’âge. Ces animaux entreront en procédure à l’âge de 10 semaines (+/- 2 semaines), c’est-à-dire à l’âge adulte, et ne seront conservés que deux semaines supplémentaires après l’infection sévère traitée par antibiotique. Nous nous attendons à cette procédure entraîne une accélération du développement de la maladie avec des signes d’auto-immunité à 12 semaines d’âge équivalents à ceux d’animaux non-infectés de 25 semaines. Une autre procédure utilisera des animaux normaux qui seront conservés sur un maximum de 40 semaines après l’infection sévère afin de déterminer s’ils développent une maladie auto-immune ou non, sans que nous puissions prédire concrètement les symptômes éventuels induits. Une grille d’évaluation clinique sera utilisée sur toute la durée de l’expérience afin d’éviter les éventuelles nuisances sur le bien-être des animaux. Lors des procédures, les souris seront soumises à quatre types de nuisance. 1) les contentions nécessaires à la réalisation des actes (injections et prélèvements d’urine) entraîneront un stress léger et bref pour les animaux (moins de 30 secondes chacun). 2) les injections intrapéritonéales (ip) et sous-cutanées (sc) (1 ip et 4 sc/animal réparties sur 24 heures) entraineront des douleurs brèves de piqure à chaque occurrence (moins de 30 secondes). 3) les prélèvements sanguins de faible volume par voie rétro-orbitale sous anesthésie générale gazeuse (1 à 2 minutes) pourront entraîner ensuite un inconfort à l'orbite le temps que la cicatrisation soit complète (24 heures). 4) l’infection entraînera une gêne pour les souris (fièvre et inconfort) durant les deux premières heures. Le traitement antibiotique sera alors réalisé ce qui soulagera les souris rapidement.

Devenir

Les animaux seront systématiquement euthanasiés en fin de procédure pour analyse ou avant dans le cas d’atteinte de points limites.

Remplacement

Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers vivants avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes, ni des maladies étudiées, ni de la séquence infection/auto-immunité à l’échelle d’un organisme. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour ces études visant à améliorer la prise en charge des patients.

Réduction

Dans notre laboratoire, on a déjà fait le modèle de péritonite avant, ce qui nous permet d’utiliser seulement le nombre de souris nécessaire. Il y aura 10 souris par groupe pour bien prendre en compte les différences entre chaque animal et voir comment ils réagissent à l’infection et au risque de maladies auto-immunes. Cela nous aide à être sûrs que nos résultats sont fiables et qu’on peut vraiment voir s’il y a une différence entre les groupes, sans utiliser plus d’animaux que nécessaire. Les souris qui servent de contrôles seront juste traitées avec des antibiotiques et on n’ajoutera pas d’autres groupes pour ne pas en utiliser trop. Après les expériences, on gardera des échantillons pour pouvoir répondre à d’autres questions plus tard, toujours dans l’idée d’utiliser le moins d’animaux possible. Enfin, pour prouver que nos résultats sont solides et que l’expérience peut être refaite par n’importe quel autre laboratoire avec le même résultat, on fera chaque test trois fois, ce qui est le minimum demandé pour que ce soit accepté scientifiquement.

Raffinement

Avant et pendant les expériences, les souris vivent dans de bonnes conditions pour éviter qu’elles soient stressées. Elles ne sont jamais seules, ont toujours des objets pour s’occuper (comme du coton pour faire leur nid ou des petites maisons pour se cacher) et sont observées tous les jours. Pendant les expériences, on fait tout pour que les souris souffrent le moins possible. Après l’infection, on les surveille toutes les 6 heures pendant 24 heures et il n’y a que quelques souris à la fois pour pouvoir bien toutes les observer. Le traitement avec des antibiotiques commence 2 heures après que les souris ont reçu les bactéries, et donc aucune ne mourra à cause de cela. Si une souris est trop malade, elle sera euthanasiée tout de suite, sans attendre la fin de l’expérience. L’état de santé des souris est suivi grâce à une grille d’évaluation. On regarde à chaque fois trois choses : sa posture, sa façon de bouger et l’état de ses poils. À chaque critère, on donne un score de 0 à 3. Si la souris a 6 points ou plus au total, ou si elle a 3 points dans la posture ou la mobilité, elle sera euthanasiée. Après le traitement, en plus de surveiller les souris chaque jour, on continue de calculer les scores des souris chaque jour pendant 3 jours, puis une fois par semaine pendant 40 semaines, pour vérifier si elles restent en bonne santé. On regarde aussi leur poids et si elles n’ont pas de problèmes de peau, de poumons ou d’articulations. Si une souris atteint certains scores qui montrent qu’elle va trop mal, elle est euthanasiée et analysée immédiatement.

Choix des espèces

Notre projet s’inscrit dans l’objectif de définir des mécanismes de développement de maladies d’intérêt pour la santé humaine afin de pouvoir améliorer la prise en charge des patients. Les procédures et les souris utilisées dans le présent projet nous permettront d’atteindre cet objectif. L’espèce Mus musculus domesticus est le seul modèle de mammifères disposant des lignées modifiées génétiquement pertinentes pour les objectifs scientifiques de notre projet et dont la biologie se rapproche suffisamment de la biologie humaine pour que son étude puisse y être transférée. De plus les outils d’analyse disponibles et l’expertise acquise des modèles utilisés ici justifient l’utilisation de ce modèle. Les animaux entrant en procédure auront tous un âge supérieur ou égal à 10 semaines (stade adulte). Ce stade adulte correspond au stade de la population de patients concernés par la présente investigation.

Pour classer six peptides selon qu'ils freinent ou stimulent le système immunitaire, 160 souris subissent une réaction allergique provoquée sur l'oreille, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole tient en huit jours : rasage de l'abdomen sous anesthésie, dépôt d'un produit allergisant sur la peau, deux injections des peptides à tester, puis application du même produit sur l'oreille droite pour déclencher un gonflement, mesuré à l'épaisseur. Toutes sont tuées le lendemain de la dernière mesure pour prélever leurs oreilles. Le porteur affirme que l'étude chez l'animal est "indispensable" pour valider ces molécules, après un tri de plus de cinquante peptides sur cellules en culture, et indique qu'aucune des plus de 200 souris déjà utilisées dans ce modèle n'a nécessité de mise à mort anticipée.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l'efficacité de nouvelles molécules (appelées peptides) capables de réguler le système immunitaire, c'est-à-dire notre système de défense contre les infections et les maladies. Notre système immunitaire possède des mécanismes de contrôle comparables aux freins et accélérateurs d'une voiture. Parfois, ces mécanismes sont déréglés : le système immunitaire peut être trop actif (causant des maladies auto-immunes comme la polyarthrite ou des allergies) ou pas assez actif (permettant aux cancers de se développer). Nous testerons six molécules différentes : - Quatre molécules « freins » qui pourraient calmer un système immunitaire trop actif - Deux molécules « accélérateurs » qui pourraient stimuler un système immunitaire insuffisant Pour évaluer ces molécules, nous utiliserons un modèle de réaction allergique cutanée chez la souris. Ce modèle reproduit ce qui se passe lors d'un eczéma de contact chez l'homme : la peau devient rouge et gonflée au contact d'une substance à laquelle l'organisme a été préalablement sensibilisé. En mesurant l'intensité de cette réaction inflammatoire, nous pourrons déterminer si nos molécules sont capables de la diminuer (pour les « freins ») ou de l'augmenter (pour les « accélérateurs »), et ainsi identifier les candidats les plus prometteurs pour le développement de futurs traitements.

Bénéfices attendus

Bénéfices scientifiques : Cette étude permettra de mieux comprendre comment réguler le système immunitaire avec de nouvelles molécules, ouvrant des pistes pour traiter des maladies actuellement difficiles à soigner. Bénéfices médicaux potentiels : Pour les molécules « freins » : elles pourraient aider à traiter des maladies où le système immunitaire attaque l'organisme par erreur (maladies auto-immunes comme la polyarthrite rhumatoïde, le lupus, la sclérose en plaques) ou pour prévenir le rejet après une greffe d'organe. Pour les molécules « accélérateurs » : elles pourraient renforcer les traitements contre le cancer (immunothérapie) ou améliorer la réponse aux vaccins chez les personnes dont le système immunitaire est affaibli. Avantages de ces nouvelles molécules par rapport aux traitements existants : - Coût de fabrication plus faible - Administration plus simple (injection sous la peau plutôt que perfusion à l'hôpital) - Meilleure diffusion dans les tissus.

Procédures

Le protocole s'étend sur 8 jours. Par convention, le jour du challenge (application sur l'oreille) est désigné Jour 0. Les étapes préalables de sensibilisation sont numérotées en jours négatifs (J-7, J-6, J-2, J-1), indiquant le nombre de jours avant le challenge. Les souris subiront les interventions suivantes sur une durée totale de 8 jours : 1. Rasage de l'abdomen (Jour -7, durée : 5 min) : réalisé sous anesthésie gazeuse brève (2-3 min) pour éviter le stress de contention. Récupération complète en moins de 5 minutes. 2. Sensibilisation cutanée (Jour -6, durée : 30 sec) : application d'une goutte de produit allergisant sur l'abdomen rasé. Ce geste est réalisé sur animal éveillé avec contention manuelle douce. Cette étape prépare le système immunitaire à réagir au produit. 3. Injections sous la peau (Jours -2 et -1, durée : 20 sec par injection) : deux injections des molécules à tester dans le haut du dos. Ces gestes sont réalisés sur animal éveillé avec contention manuelle douce. 4. Application sur l'oreille (Jour 0, durée : 30 sec) : application du même produit allergisant sur l'oreille droite pour déclencher la réaction allergique localisée. Ce geste est réalisé sur animal éveillé. 5. Mesures (Jours 0 et +1, durée : 2 min par souris) : mesure de l'épaisseur de l'oreille avec un instrument de précision pour quantifier l'inflammation. Ces mesures sont réalisées sur animal éveillé. À l'issue des mesures (Jour +1), les animaux sont euthanasiés et les oreilles sont prélevées pour des analyses au microscope.

Impact sur les animaux

Effets attendus : Rasage (Jour -7) : stress bref lié à l'anesthésie (quelques minutes), récupération rapide. Sensibilisation cutanée (Jour -6) : possibilité d'une légère rougeur temporaire sur l'abdomen, sans gêne notable pour l'animal. Injections (Jours -2 et -1) : stress bref lié à la contention (moins de 20 secondes). Possibilité d'une petite bosse sous la peau au point d'injection, disparaissant en 1-2 jours. Réaction allergique sur l'oreille (Jour 0 à Jour +1) : c'est la phase où les effets sont les plus visibles : - Gonflement de l'oreille traitée (augmentation d'épaisseur de 0,1 à 0,3 mm) - Rougeur et légère chaleur de l'oreille - Ces effets restent strictement localisés à l'oreille traitée État général : les souris conservent un comportement normal (alimentation, déplacements, interactions avec leurs congénères). Pas de perte de poids significative attendue. Signes pouvant nécessiter une euthanasie anticipée (observés chez moins de 2% des animaux selon notre expérience) : - Perte de poids importante - Extension des lésions cutanées au-delà de la zone traitée - Grattage excessif ou automutilation - Prostration ou isolement du groupe - Signes de douleur non contrôlée. Sur plus de 200 souris utilisées dans ce modèle dans notre laboratoire, aucun animal n'a nécessité d'euthanasie anticipée.

Devenir

Aucun animal ne sera maintenu en vie à l'issue de la procédure. Tous les animaux (160 souris) seront euthanasiés à la fin de l'étude, le protocole nécessitant le prélèvement des oreilles pour analyses microscopiques.

Remplacement

Avant de recourir à l'expérimentation animale, des tests sur cellules en culture ont été réalisés pour sélectionner les candidats les plus prometteurs parmi plus de 50 peptides. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de reproduire le fonctionnement complet du système immunitaire : elles ne peuvent pas évaluer le devenir des peptides dans l'organisme, les interactions entre les différents types de cellules immunitaires, ni le recrutement de ces cellules vers le site d'inflammation. L'étude chez l'animal est donc indispensable pour valider l'efficacité de ces molécules avant tout développement thérapeutique.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé mathématiquement au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Sur plus de 50 molécules conçues initialement, seules les 6 plus prometteuses — présélectionnées par des tests en laboratoire — sont testées chez l'animal. Chaque souris fournit plusieurs mesures (épaisseur de l'oreille, poids de la biopsie, analyses microscopiques), ce qui maximise les informations obtenues par animal. Les résultats seront publiés et rendus accessibles à la communauté scientifique afin d'éviter toute duplication inutile de ces expériences.

Raffinement

De nombreuses mesures sont prises pour assurer le bien-être des animaux et minimiser leur inconfort : Hébergement adapté : - Souris hébergées en groupe (4-5 par cage) pour préserver les contacts sociaux - Cages enrichies avec matériel de nidification (papier, coton), abris et litière abondante - Conditions de température, humidité et lumière contrôlées - Période d'acclimatation de 7 jours avant le début des manipulations Réduction du stress lors des manipulations : - Rasage réalisé sous anesthésie gazeuse brève - Manipulations douces et rapides - Surveillance et prise en charge de la douleur : - Observation quotidienne de tous les animaux, renforcée (2 fois par jour) pendant la phase de réaction allergique - Utilisation d'une grille d'évaluation standardisée avec des critères objectifs (poids, aspect du pelage, comportement, aspect des lésions) - Points limites définis : si un animal montre des signes de souffrance importante, il est immédiatement euthanasié - La surveillance est renforcée lors de la phase de réaction, et que l'euthanasie est immédiate en cas de signes de souffrance (score 3) Durée limitée : - Protocole de 8 jours seulement - Euthanasie réalisée à la fin de l'étude, avant que l'inflammation ne devienne inconfortable, sous anesthésie profonde (méthode rapide et sans douleur)

Choix des espèces

Choix de l'espèce : La souris a été choisie pour les raisons suivantes : 1. Modèle validé : le modèle d'allergie cutanée utilisé est un standard international pour évaluer des molécules modulant le système immunitaire. Il existe de nombreuses données publiées permettant de comparer nos résultats. 2. Sensibilité adaptée : la souche de souris choisie présente une bonne sensibilité aux réactions allergiques cutanées, ce qui permet de détecter efficacement l'effet de nos molécules. 3. Pertinence pour l'homme : les mécanismes immunitaires ciblés par nos molécules sont très similaires chez la souris et chez l'homme (plus de 70% de ressemblance), ce qui permet d'envisager une application future chez l'homme. 4. Disponibilité : ces souris sont facilement disponibles auprès de fournisseurs agréés, avec des caractéristiques génétiques standardisées garantissant la reproductibilité des expériences. Stade de développement : Les souris utilisées seront des adultes jeunes (7-9 semaines), car : 1. À cet âge, le système immunitaire est pleinement mature, garantissant des réponses représentatives. 2. C'est l'âge standard utilisé dans la littérature scientifique, facilitant la comparaison des résultats. 3. Les souris sont suffisamment développées pour bien tolérer les manipulations.

Une ligature est posée chaque semaine autour des molaires supérieures de 90 souris, avec deux injections dans la gencive par semaine pendant quatre semaines, pour leur provoquer une parodontite. Elles reçoivent en parallèle, cinq jours par semaine, une injection d'un agent qui épaissit leur peau et peut fibroser leurs poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes, l'objet étant de vérifier si une maladie des gencives favorise la sclérodermie systémique, une maladie auto-immune rare dont la cause reste inconnue. Le porteur affirme que ces gestes ne sont pas douloureux et ne justifient donc aucun antalgique, et retient la souris parce que les outils d'analyse immunitaire et parodontale y sont, écrit-il, très développés.

Objectifs

La sclérodermie systémique est une maladie autoimmune rare qui touche près de 10 000 personnes en France, principalement les femmes. La cause n’est pour le moment pas connue. Les patients atteints de sclérodermie systémique présentent fréquemment une parodontite, qui est une pathologie inflammatoire très répandue dans la population mondiale, puisqu’elle touche plus de 50% de la population âgée de plus de 50 ans. Elle est due à une dysbiose du microbiote parodontal et se caractérise par une inflammation des tissus de soutien des dents appelé parodonte, qui comprend la gencive, l’os alvéolaire et le ligament alvéolodentaire. La parodontite aboutit au déchaussement, voire à la perte des dents. Notre hypothèse est que la parodontite pourrait constituer un facteur de risque et avoir un impact sur le développement de la sclérodermie systémique. L’objectif de ce projet est de développer un modèle de souris permettant d'étudier l'impact de la parodontite dans le développement de la sclérodermie systémique.

Bénéfices attendus

La cause de la sclérodermie systémique n’est pour le moment pas connue, mais les facteurs environnementaux, et notamment la dysbiose du microbiote, jouent un rôle dans le déclenchement de la maladie. La mise en évidence de l’implication de la parodontite dans la physiopathologie de cette maladie autoimmune rare permettra ainsi d’améliorer la compréhension de la sclérodermie systémique, ce qui nécessaire pour pouvoir développer de nouveaux traitements dans le futur. Il n’existe en effet pour le moment pas de traitement permettant de guérir cette pathologie, qui a un fort impact sur la qualité de vie et la survie des patients

Procédures

Les animaux recevront une injection d’une molécule induisant une fibrose cutanée permettant de reproduire les caractéristiques de la sclérodermie systémique. Les premières injections seront réalisées sur animal anesthésié, puis, après une phase d’habituation et la mise en place d’un système de récompense, elles seront effectuées sur animal vigile. Ces injections, réalisées cinq jours par semaine, nécessitent moins de deux minutes. Les animaux subiront une pose d’une ligature autour des molaires supérieures (une fois par semaine, durée de 10 minutes) et deux injections gingivales (deux fois par semaine, durée de 5 minutes), toutes réalisées sur animal anesthésié, pendant une période de quatre semaines. Les animaux subiront trois prélèvements de sang, réalisés sur animal anesthésié, d'une durée d’environ 5 minutes chacun.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables liés à l’anesthésie générale sont le refroidissement corporel et une respiration un peu modifiée. Pour limiter ces effets, les souris seront placées sur une plaque chauffante et surveillées en continu jusqu’à leur réveil complet. L’anesthésie gazeuse peut être légèrement désagréable pour les animaux au moment de l’induction (du fait de l’odeur désagréable), mais elle reste moins stressante que de réaliser les gestes alors qu’ils sont éveillés. L’injection de l’agent fibrosant provoquera une fibrose (épaississement de la peau) au niveau du haut du dos, mais cela n’aura pas d’impact sur la mobilité des souris. Une réaction locale peut apparaître juste après l’injection, mais elle est généralement légère et disparaît rapidement. L’agent fibrosant peut également entraîner une fibrose au niveau des poumons, mais les signes cliniques restent en général très faibles. L’induction de la parodontite par la pose de ligatures et des injections gingivales entraînera une inflammation gingivale locale pouvant provoquer un inconfort transitoire. Toutefois, la durée limitée du protocole n’entraînera pas de mobilité ni de perte dentaire, et n’altèrera pas l’alimentation ou l’hydratation des animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans les procédures sera mis à mort à la fin des procédures (prélèvement post mortem de différents organes afin de réaliser les différentes analyses) ou en cas d'atteinte des points limites.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable dans le cas de ce projet. En effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier l’impact de la parodontite sur l’évolution de la sclérodermie systémique. Nous étudions notamment les réponses immunitaires, qui mettent en jeu la coopération de nombreuses cellulaires dans les organes tels que la rate et les ganglions. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à l'utilisation de modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire ainsi que les mécanismes physiopathologiques parodontaux, car les connaissances et les outils d’analyse chez la souris sont très développés dans les domaines de l'immunité et de la parodontologie.

Réduction

Afin de respecter pleinement le principe des 3R, une réduction du nombre d’animaux utilisés a été mise en œuvre. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été déterminé à partir de protocoles déjà bien établis dans la littérature et sur la base de calculs de puissance statistique. Ce travail a permis de définir, pour chaque question scientifique, le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Nous porterons une attention particulière au bien-être animal notamment via le raffinement des conditions d’hébergement. Les souris seront maintenues en groupes sociaux dans des cages expérimentales équipées d’un couvercle filtrant avec enrichissement (tubes en polycarbonate rouge translucides, nids, frisures de carton...) sur des portoirs ventilés deux semaines avant le début des procédures, afin de réduire au maximum le stress animal. Une habituation à la manipulation sera réalisée de façon quotidienne après la première semaine d’acclimatation, jusqu’au début de la procédure. La plupart des gestes sera réalisée sous anesthésie générale. Des soins péri- et post-opératoires seront également réalisés. Les souris anesthésiées seront placées sur une plaque chauffante afin de maintenir leur température corporelle jusqu’à leur réveil de l'anesthésie. Une application de gel ophtalmique sera réalisée à intervalles réguliers jusqu’au réveil pour lubrifier la surface des yeux et de prévenir la déshydration. La pose des ligatures au niveau des molaires doit être réalisée sous anesthésie générale car elle nécessite le maintien d’une ouverture buccale de la souris pendant quelques minutes. Les gestes réalisés ne sont pas des gestes douloureux et ne nécessitent pas la mise en place d'un traitement antalgique. Les animaux seront pesés et évalués cliniquement à l'aide d'une grille de scores définissant des points limites, afin de les soustraire à la souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé en immunologie, en particulier dans le domaine de l'auto-immunité, le système immunitaire des souris étant proche du système immunitaire humain. Nous disposons de nombreuses techniques d'analyse du système immunitaire chez la souris et de l'expérience requise pour le suivi des réponses immunitaires chez la souris, ce qui nous permet de limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous utiliserons des souris âgées entre 8 et 12 semaines, qui sont des souris avec système immunitaire complètement mature et chez qui la croissance osseuse du maxillaire et la physiologie du parodonte sont établies.