Troubles immunitaires

Générées pour créer des lignées transgéniques, 26 300 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance légère à modérée. Les femelles donneuses reçoivent des injections d'hormones, les receveuses une chirurgie de réimplantation d'embryons sous anesthésie, et les souriceaux de moins de huit jours sont identifiés par prélèvement de phalanges. Ce nombre, le plus élevé du lot, tient à la production en série d'animaux génétiquement modifiés. Les femelles fécondées sont tuées, les souris transgéniques transférées vers des partenaires et les non fécondées réutilisées pour de la formation.

Objectifs

Génération de souris génétiquement modifiées par des différentes techniques de transgénèse additive ou ciblée et validation génotypique

Bénéfices attendus

Les projets de transgénèse de cette demande vont contribuer à l’élargissement des connaissances scientifiques à partir de résultats ciblés liées aux différents modèles souris créés pour une vaste variété de sujets de recherche dans multiple domaines (immunologie, cancérologie, audition, développement, infectiologie, etc.). Les modèles murins de nouvelle création, seuls ou en combination avec d’autres déjà existants contribueront ainsi au progrès de la recherche fondamentale et/ou appliquée

Procédures

-Pour les femelles donneuses : injection d’hormones 2 fois à 46 heures d’intervalle. Durée 1-2 minutes -Pour les femelles receveuses, chirurgie bilatérale de réimplantation avec anesthésie chimique/gazeuse avec analgésie complémentaire. Intervention: 1 fois, 15 minutes d’intervention/femelle -Pour les animaux nés des femelles receveuses/accouplements, Identification des souriceaux par prélèvement de phalanges distales

Impact sur les animaux

-Douleur et inconfort légers de courte durée (1 min) liés à l’injection des hormones. -Douleur et inconfort modérés de durée de 3 jours, liés à la chirurgie. -Douleur et inconfort léger de courte durée liée à l’introduction de la aiguille (quelques sec-quelques min) liés à un putatif prélèvement sanguin (le cas échéant)

Devenir

-Toutes les femelles qui ont été fécondées devront être mises à mort (au moment du prélèvement d’embryons ou du sevrage des souriceaux). -Les souris mâles et femelles transgéniques positives identifiés seront utilisées pour la suite de l’établissement des modèles de souris génétiquement modifiée chez nos partenaires -Les souris mâles et femelles non fécondées peuvent être re-utilisés dans le cadre de formations sur animaux

Remplacement

Malgré le développement actuel croissant de différents modèles ex vivo incluant des modèles organoïdes, le modèle souris continue à être essentiel en recherche afin d’avoir accès à toutes les régulations dans le cadre de l’organisme entier. L’intérêt et besoin de recourir à l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées dans les projets scientifiques de nos collaborateurs est évalué et justifié dans le cadre de chacun des projets autorisés. Toutefois, nous avons réussi à remplacer un nombre important de nos femelles grâce à des embryons fertilisés congelés commerciaux capables de remplacer les embryons frais avec efficacité pour leur modification par transgénèse. Ainsi des embryons frais seront seulement nécessaires en cas de superovulation de souris génétiquement altérées précédemment et/ou fonds génétiques particuliers.

Réduction

-Le nombre de souris femelles donneuses vient principalement de notre longue expérience et est dépendant principalement du fonds génétique des embryons à modifier et du type de manipulation. Pour chaque fonds génétique de femelles donneuses, nous essayons d’optimiser l’âge et les conditions de d’injection afin d’obtenir un maximum d’embryons par femelle et réduire ainsi le nombre de femelles donneuses. -La technique montre une viabilité plus élevée des embryons modifiés et permet une réduction des femelles donneuses requises. -Le nombre de souris receveuses à réimplanter est en fonction du nombre d’embryons qui auront survécu à la manipulation. -Pour chaque transgène ou chaque clone de cellules injecter, nous arrêtons les séries de manipulation dès que nous arrivons dans un premier temps à une dizaine de femelles réimplantées. Nous attendons ensuite la naissance des souriceaux afin de décider, à partir du nombre de petits obtenu, de la reprise ou pas de nouvelles séries de micromanipulation. Ce qui nous permet encore de réduire le nombre de femelles donneuses et receveuses utilisées. -Le fonds génétique choisi pour les femelles receveuses (excellentes mères et capables de donner naissance à de grandes portées de nouveau-nés) permet aussi d’optimiser le nombre de femelles mères-porteuses utilisées par rapport à l’utilisation d’un autre fonds génétique moins « efficace » -Le renouvellement de la batterie de mâles reproducteurs et vasectomisés environ chaque 6-9 mois permet d’améliorer leur performance quant aux capacités d’accouplement et de fécondation permettant à son tour d’optimiser le nombre de femelles donneuses et receveuses et réduire son nombre.

Raffinement

Le souris injectées et les femelles ayant subi la chirurgie seront surveillées quotidiennement. Les femelles receveuses reçoivent un traitement antalgique avant et après l'acte chirurgical et sont surveillées soigneusement pour assurer la bonne cicatrisation pendant au moins les 5 premiers jours après-chirurgie. Nous serons toujours particulièrement attentifs à tout signe de détresse (signes cli-niques externes, prostration, poils hérissés évaluation du Body Condition Score-BCS) afin de réduire/éliminer la souffrance des animaux transgéniques fondateurs et leurs descendants. En cas de souffrance et avant la mise à mort au plus tard au bout de 24h après con-firmation des signes cliniques externes, nous aurons recours au besoin de la nourriture humidifiée / gel hydrique, la réhydratation sous-cutanée ou le chauffage des animaux si hypothermie associée.

Choix des espèces

La souris est un mammifère de petite taille à reproduction rapide qui montre 90% d’homologie avec le génome humain, d’où l’intérêt majeur de la création de souris gé-nétiquement modifiées pour la découverte de mécanismes globaux en recherche fon-damentale ainsi que pour la modélisation de maladies humaines. La pertinence du choix de la souris pour ces projets est justifiée dans les projets scientifiques des parte-naires demandeurs. -Les mâles et femelles reproducteurs sont des adultes matures sexuellement (2-12 mois), les femelles receveuses sont des adultes (matures sexuellement, âgées de 8-12 semaines). -Les femelles donneuses d’embryons sont des jeunes, généralement prépubères âgées de 3-4 semaines, pour bien répondre au traitement hormonal de superovulation (âge dépendant du fonds génétique). -Les souris transgéniques positives seront des jeunes remises aux entités de recherche peu de temps après le sevrage une fois caractérisés génétiquement (pour avancement du projet)

1 510 souris dépourvues de système immunitaire sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une greffe de cellules souches sanguines humaines ou simiennes, puis une polyarthrite rhumatoïde lui est induite, avec douleur, gonflement des articulations et perte de poids, avant jusqu'à huit prélèvements de sang. Le projet cherche à modifier des lymphocytes B pour calmer l'inflammation. Le porteur écrit que les immunothérapies ont "révolutionné" la prise en charge de certains cancers et juge l'expérimentation animale "indispensable", quand ces souris sont maintenues sans défenses et rendues malades pour la durée de l'étude.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie chronique qui touche les articulations. Elle concerne environ 300 000 personnes en France, en majorité des femmes. Dans cette maladie, le système immunitaire, qui est censé nous protéger, se dérègle et attaque par erreur les articulations. Cela provoque une inflammation persistante, des douleurs, des gonflements et, avec le temps, une destruction du cartilage et de l’os. Les traitements actuels permettent de ralentir la maladie et de soulager les symptômes. Certains médicaments très utilisés, comme le méthotrexate ou les biothérapies, ont nettement amélioré la prise en charge des patients. Mais ils ne guérissent pas la maladie et doivent être pris régulièrement pendant des années, avec parfois une diminution de leur efficacité. Environ un tiers des patients répond mal à ces traitements ou rechute, ce qui montre qu’il reste un réel besoin de nouvelles solutions thérapeutiques. Depuis quelques années, les immunothérapies, des traitements qui agissent directement sur le système immunitaire, ont révolutionné la prise en charge de certains cancers et maladies graves. L’idée de ce projet est d’exploiter ces nouvelles thérapies pour la polyarthrite rhumatoïde. L’objectif de ce projet est de modifier génétiquement certaines cellules du système immunitaire, les lymphocytes B, ou les cellules souches du sang dont ils proviennent afin que les lymphocytes B modifiés soient capables de calmer durablement l’inflammation au lieu de l’entretenir. Pour cela nous devons réaliser des études précliniques de transplantation dans des modèles de souris ne disposant pas de système immunitaire : ces modèles permettent la prise de greffe de cellules souches sanguines humaines ou simiennes et l’induction d’une polyarthrite rhumatoïde permettant d’évaluer l’efficacité de notre approche.

Bénéfices attendus

A long terme, la validation de l’efficacité de notre approche pour traiter la polyarthrite rhumatoïde serait une avancée majeure pour les patients. Cette approche pourrait également être étendue à d’autres maladies auto-immunes ou des maladies infectieuses.

Procédures

Anesthésie générale (3 anesthésies, durée 2-3 minutes) pour les injections des cellules et de molécules thérapeutiques Injection de cellules génétiquement modifiées (2 maximum) qui ne dure que quelques secondes réalisée sous anesthésie Injections (2 fois) d’une molécule qui induit une polyarthrite rhumatoïde qui ne dure que quelques secondes réalisée sous anesthésie. Prélèvement de sang sur animal vigile (8 maximum) qui ne dure que quelques secondes

Impact sur les animaux

Les souris dépourvues de système immunitaire ont un risque de développer des infections diverses en lien avec des pathogènes (virus, bactéries). L’injection de cellules ne provoque pas de douleur et se fait sous anesthésie générale. Cependant, il y a un risque d’infection. La manipulation des souriceaux représente un risque de rejet de la mère. Les prélèvements sanguins peuvent générer du stress dû à la contention de l’animal, une brève douleur ainsi qu’un risque d’infection chez la souris dépourvue de système immunitaire. L’induction de la polyarthrite rhumatoïde entraine une douleur, un gonflement articulaire, une perte de mobilité et une perte de poids.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin d’analyser les cellules sanguines, les atteintes du cartilage et des os afin d’évaluer l’efficacité de l’approche thérapeutique.

Remplacement

La greffe de cellules souches de la moëlle osseuse est un processus très complexe pour lequel il n’existe aucune méthode alternative in vitro. Les cellules doivent être capables de trouver le bon endroit dans l’organisme (la moëlle osseuse), de s’y installer, de survivre, puis de se transformer en toutes les différentes cellules du sang (globules rouges, globules blancs, etc). La transplantation chez l’animal est le seul outil permettant d’évaluer la capacité des cellules modifiées par thérapie génique à se loger au niveau de la moëlle osseuse et reconstituer des cellules sanguines à long terme. Pour tester de nouveaux traitements contre la polyarthrite rhumatoïde, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux qui permettent d’observer l’ensemble du fonctionnement du système immunitaire. En effet, cette maladie fait intervenir à la fois des cellules immunitaires et des anticorps. Ces deux acteurs du système immunitaire interagissent entre eux et évoluent dans le temps sous l’effet d’un traitement. Or, il n’est pas possible aujourd’hui d’étudier correctement ces mécanismes complexes en dehors d’un organisme vivant. L’expérimentation animale reste aujourd’hui indispensable pour comprendre si des cellules modifiées restent fonctionnelles et évaluer l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la polyarthrite rhumatoïde.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, nous évaluerons d’abord l’efficacité du transfert de gène dans des systèmes de culture in vitro et seules les stratégies qui sont efficaces et ne génèrent pas de toxicité cellulaire seront évalués in vivo. Notre expérience dans le domaine de la thérapie génique des cellules sanguines ainsi que des données de la littérature nous indiquent que le nombre minimal d’animaux requis par groupe est de 6 à 8 animaux en fonction du type de cellules greffées pour rendre des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris dépourvues de système immunitaire sont élevées en conditions stériles. Les changes des cages sont réalisés sous poste de sécurité microbiologique afin de réduire au maximum les risques de contact avec des agents infectieux. L'eau de boisson est stérilisée. Toutes les manipulations des animaux sont réalisées avec des gants désinfectés à l'alcool. Les cages des animaux disposent de cotons (pour l’enrichissement des animaux) qui ont été au préalable stérilisés. Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux, les injections sont réalisées sous anesthésie. Les souris seront examinées entre 3 fois par semaine et tous les jours en fonction des symptômes et une grille de suivi sera remplie en plus de la visite journalière des techniciens animaliers afin de pouvoir alerter le vétérinaire et intervenir rapidement en cas d’effet inattendu. Des critères ont été définis pour mettre en place un traitement approprié ou envisager l’euthanasie si un des critères d’arrêt est atteint.

Choix des espèces

Les souris montrent de grandes similarités de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Elles sont couramment utilisées pour l’étude des cellules sanguines après transplantation de cellules souches du sang. Les souris utilisées pour ce projet sont dépourvues de système immunitaire ce qui permet d’éviter le rejet de greffe de cellules d’une autre espèce (humaine/simienne). De plus, ces souris n’ont pas besoin de traitement de chimiothérapie conditionnement avant la greffe des cellules souches sanguines contrairement à d’autres souches de souris ce qui évite les effets secondaires liés à ce traitement au conditionnement. Dans ce projet, les animaux sont utilisés au stade de jeune adulte (comme les patients) ou au stade de souriceaux chez lesquels la prise de greffe est encore plus forte.

Pour tester de nouvelles thérapies contre le lupus, une maladie auto-immune, 4 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Chez les animaux, la maladie ou son induction chimique provoque perte de poids, lésions cutanées, alopécie, prostration, difficultés respiratoires et douleurs abdominales. Ils reçoivent les composés à tester jusqu'à quatre fois par semaine, avec des prélèvements de sang et d'urine réguliers. Les organes sont prélevés après la mise à mort, et l'effectif de 4 500 animaux n'est pas justifié dans le résumé.

Objectifs

Le lupus érythémateux est une maladie auto-immune chronique qui existe sous deux formes principales : le lupus érythémateux systémique et le lupus cutané. Le lupus érythémateux systémique, forme la plus sévère, affecte plusieurs organes car le système immunitaire produit des auto-anticorps qui attaquent les tissus sains. Les symptômes caractéristiques incluent l'érythème en "ailes de papillon" sur le visage, une fatigue intense, des douleurs articulaires, de la fièvre et une photosensibilité. Ce projet vise à développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les maladies auto-immunes en utilisant des modèles murins spontanément lupiques ou des modèles induits. Les modèles murins de Lupus sont essentiels pour la recherche car ils permettent de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de cette maladie auto-immune. Ces modèles offrent une approche pour tester de nouvelles thérapies et interventions avant de les appliquer chez l'homme, De plus, ils aident à identifier les facteurs génétiques et environnementaux qui contribuent au développement du Lupus, facilitant ainsi la mise au point de stratégies de prévention et de traitement plus efficaces. Les objectifs du projet sont : Étude des mécanismes pathogéniques, le développement et l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, les études précliniques et la compréhension des facteurs de risques. Ces objectifs font des modèles murins un outil indispensable pour la recherche lupus, contribuant à des avancées significatives dans la compréhension et le traitement de cette maladie complexe. Environ 15 études sont prévues par an dans le cadre de ce projet.

Bénéfices attendus

Les modèles murins sont très utiles pour la recherche sur les maladies inflammatoires tel que le lupus. En recréant les conditions de cette maladie chez les souris, les chercheurs peuvent mieux comprendre les mécanismes de celle-ci, trouver de nouvelles cibles pour les traitements et tester l'efficacité de nouveaux médicaments. Les traitements actuels sont les anti-inflammatoires non stéroïdiens, les corticostéroïdes, des immunosuppresseurs et des biothérapies ciblées. Ces traitements visent essentiellement à contrôler les symptômes de la maladie et prévenir les poussées mais le lupus reste une maladie chronique incurable. Ces modèles permettent donc d'accélérer le développement de médicaments et d'améliorer les stratégies de prévention et de gestion des maladies inflammatoires intestinales, offrant ainsi de meilleures perspectives pour les patients. Les données obtenues grâce à ces recherches sont partagées avec la communauté scientifique et aident à faire avancer les essais cliniques et à obtenir les autorisations nécessaires pour la mise sur le marché de nouveaux médicaments.

Procédures

Pour l’induction du modèle par agent chimique, injection intrapéritonéale unique sur animal vigile, environ 10 secondes. Pour l’administration des composés à tester : Administrations sur animal vigile, environ 10secondes, réalisée au maximum 4 fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude. Prélèvements de sang, sur animal vigile, environ 15-20 secondes, au maximum 1 fois toutes les 2 semaines. Prélèvements urinaires, environ 10 secondes au maximum 5 fois par semaine.

Impact sur les animaux

L'utilisation de souris pour étudier le lupus peut entraîner plusieurs effets indésirables pour les animaux : Perte de poids progressive; Altération de l’état général : absence de toilettage, alopécie, lésions cutanées, sécrétions nasales ou oculaires; Troubles du comportement : prostration, agressivité, difficultés respiratoires; Présence de ganglions hypertrophiés; Douleurs abdominales.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés pour les prélèvements d’organes nécessaires à l’atteinte des objectifs de l’étude.

Remplacement

L'utilisation de modèles de souris pour le lupus est essentielle pour développer et tester de nouveaux traitements pour cette maladie complexe. Ces modèles permettent d'étudier les réponses du système immunitaire dans un environnement contrôlé, ce qui aide à comprendre comment les cellules interagissent et comment la maladie progresse. Contrairement aux tests en laboratoire (in vitro) ou aux simulations informatiques (in silico), les modèles de souris peuvent reproduire la complexité d'un organisme entier. Les tests en laboratoire sont utiles pour étudier les cellules, mais ils ne peuvent pas montrer les interactions dynamiques dans le corps. Les simulations informatiques sont limitées par la complexité biologique et la qualité des données. C'est pourquoi les modèles animaux sont nécessaires pour obtenir des résultats pertinents et applicables aux humains. En utilisant différents modèles de souris, nous pouvons explorer divers aspects du lupus. Les de souris spontanées nous aident à comprendre les aspects génétiques et auto-immuns et le modèle induit par une molécule de référence permettent de contrôler l'induction du lupus. Cette approche intégrée est cruciale pour développer des traitements efficaces et applicables aux humains.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est basé sur des publications scientifiques et optimisé par un biostatisticien en fonction des objectifs de l’étude Des méthodes statistiques sont appliquées pour minimiser le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats fiables et en réduisant les biais expérimentaux. Seules les molécules ayant montré en amont une activité anti-inflammatoire in vitro sont testées sur les animaux (in vivo). L’utilisation de techniques précises comme la cytométrie en flux, l’analyse de biomarqueurs et l’histologie permettra d’obtenir des données détaillées à partir de petits échantillons. De plus, on pourra avoir un suivi non invasif et multiparamétrique des animaux pour mesurer la distribution des composés et l’évolution de la réponse inflammatoire, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Les modèles décrits dans ce projet sont choisis pour leur pertinence clinique, réduisant ainsi le besoin de tests supplémentaires sur d’autres animaux.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe. Nous utiliserons également une litière adaptée, douce (exemple : litière de cellulose) et un enrichissement qui favorise l’expression des comportements normaux de la souris (abri, enfouissement, nidification…). Les techniques de manipulation douce, telles que l’utilisation de tunnels et la préhension dans le creux des mains, sont mises en œuvre pour réduire le stress et l’angoisse des animaux. Un apport nutritif (gel hydrique, gel boost …) pourra être mis en place 1 semaine avant le début de l’étude pour faciliter l’accès des animaux. Les animaux pourront être hébergés dans des cages connectées capables de détecter 24h/24 toute anomalie dans l’activité des animaux (hypoactivité ou hyperactivité) permettant de mettre en place très rapidement les actions pour la prise en charge vétérinaire. Une grille de score a été mise en place afin de permettre la définition et l’application de points limites, généraux et spécifiques à la procédure, une fréquence accrue des observations et ainsi intervenir de manière anticipée pour éviter toute douleur ou dommages pour les animaux au-delà de la classe de gravité définie pour la procédure. Les protocoles expérimentaux seront continuellement améliorés pour minimiser la douleur et le stress des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix en pharmacologie. Elles partagent une grande partie de leur génome avec les humains, permettant de modéliser les maladies humaines et d'étudier les effets des médicaments. Leur petite taille et leur cycle de reproduction rapide facilitent les études à long terme et les expériences génétiques. Les souris, étant des mammifères, ont des systèmes biologiques comparables à ceux des humains, rendant les résultats plus pertinents. Les souris adultes (à partir de 8 semaines d’âge) sont utilisées dans ce projet pour mimer la pathologie chez les patients adultes car l’immunité varie fortement en fonction de l’âge. De plus le système immunitaire est complètement mature à partir de 6 semaines d’âge chez la souris.

Des injections répétées dans une veine proche de l'œil, deux fois par semaine pendant un à cinq mois, avec un risque reconnu de nécrose et de cécité : 201 souris vont être utilisées, toutes tuées, la plupart dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit d'abord un allergène sur la peau, puis ces injections de cellules sanguines traitées aux ultraviolets, l'épaisseur de l'oreille étant mesurée sous anesthésie gazeuse répétée. Le projet vise à préciser la durée utile d'un traitement déjà employé chez des patients depuis parfois plus de vingt ans. Le porteur situe les points limites au moment où surviennent cécité ou troubles du comportement, complications qu'il juge rares.

Objectifs

Le traitement des cellules du sang par ultraviolets est un traitement de référence de nombreuses maladies immunologiques et permet de traiter des complications sévères de greffes de moëlle osseuse ou de certains rejets sévères de greffes d’organes. Il consiste à collecter des cellules du sang des patients, les mettre en contact avec des ultraviolets (comparables à des rayons du soleil grâce à une machine spécifique) et à les réinjecter par voie intraveineuse, ceci pendant plusieurs mois voire plusieurs années. Il entraine des améliorations de la maladie et limite les complications sévères en agissant sur de multiples cellules ou molécules. Compte tenu de la complexité des maladies chez l’homme et des multiples organes touchés, les études chez l’homme sont difficiles. Il faut souligner que les principales avancées concernant la connaissance des mécanismes d’action de ce traitement ont été permises grâce aux études chez la souris. Récemment l’analyse des réponses du système immunitaires a été améliorée avec la mise en évidence du rôle de cellules mémoires résidant dans les tissus (peau, muqueuse, organes...) appelées cellules résidentes mémoires. Ces cellules protègent d’infections mais peuvent également générer des réactions immunitaires pathologiques et sévères (rejet de greffes, etc…). En plus de ses effets sur le système immunitaire dans le sang ou les ganglions lymphatiques, nous pensons que le traitement des cellules du sang par ultraviolets a un effet bénéfique sur la fonction de ces cellules anormales présentes au niveau de la peau ou d’autres organes et ce traitement pourrait éviter d’entrainer ou d’aggraver la maladie. Plusieurs arguments soutiennent cette hypothèse. Premièrement, l’effet d’un traitement par ultraviolets chez les patients persiste plusieurs mois après son arrêt (suggérant un effet sur des populations cellulaires mémoires des tissus). Deuxièmement, il diminuerait la disponibilité de molécules indispensables à la formation ou la survie des cellules mémoires résidant dans les organes. Il a d’ailleurs été montré que ce traitement par ultraviolets entraine une diminution du nombre de ces cellules mémoires résidant dans le colon, associée à une amélioration de la maladie. Notre projet a donc pour objectif d’étudier la formation de ces cellules résidentes mémoires de la peau ainsi que leurs fonctions et survie dans la peau après un traitement des cellules du sang par ultraviolets. Ceci améliorera le schema de traitement des patients.

Bénéfices attendus

Le traitement des cellules du sang par ultraviolets est un traitement de référence de nombreuses complications immunologiques mais l’insuffisance de connaissance de ses mécanismes d’action limite son utilisation. Ce projet permettra de mieux comprendre son influence sur un plan inexploré des réactions immunitaires anormales, c’est à dire sur les cellules immunitaires persistant au sein des tissus. Sur un plan pratique ceci permettra de préciser les schémas thérapeutiques et la durée d’utilisation de ce traitement chez des patients avec des pathologies sévères et étant souvent hospitalisés, et ceci en se basant sur des arguments scientifiques. A titre d’exemple certains patients sont traités depuis plus de 20 ans par ce traitement et inversement certaines équipes arrêtent ce traitement systématiquement après 6 mois de traitement sans argument scientifique. Sur un plan scientifique, ce projet vise à montrer que le traitement des cellules du sang par ultraviolet exerce un effet bénéfique sur la formation, la fonction, la survie des cellules immunitaires persistant au sein des tissus. Il sera suivi, par des travaux complémentaires aynat pour but d'explorer les voies impliquées dans ce bénéfice induit par ce traitement. Cette étude permettra également de savoir comment utiliser ce traitement pour éviter une récidive au sein des tissus et comment améliorer le planning et l'éfficacité du traitement des patients en ce sens.

Procédures

Les animaux recevront une application sur la peau d’un produit allergisant entrainant une réaction immunitaire localisé sur la peau L’application de ce produit sera effectuée sur le ventre rasé des souris au début des procédures. Ce geste n’entraine pas de douleur (rasage + application du produit) sera réalisé sur animal vigile et durera au maximum 1 minute. Cinq jours après, les animaux recevront des applications du même produit sur les oreilles à raison de 2 fois sur l’ensemble du protocole afin d’induire une réaction immunologique. Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale par injection d’un produit anesthésiant (durée d’injection de quelques secondes et durée d’anesthésie d’une heure) afin d’éviter que les souris ne lèchent le produit avant sa pénétration dans la peau. L’anesthésie durera environ 30 minutes. Les animaux auront également une injection veineuse (qui dure 5 secondes) de cellules du sang préalablement traitées par ultraviolets à raison de 2 fois par semaine sur une période de 1 à 5 mois. Cette injection a lieu dans un veine proche de chaque œil, en alternant le coté d’injection à chaque injection. Les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse (1 minute) le temps de l’injection et auront une application d’une pommade ophtalmique anesthésiante. Enfin, les oreilles des souris seront mesurées 5 fois par semaine pendant 2 semaines, afin de suivre l’inflammation (l’augmentation de l’épaisseur de l’oreille étant un des signes de l’inflammation). Ces mesures seront effectuées sur animaux anesthésiés par anesthésie gazeuse (durée de l’anesthésie gazeuse : 1 minute) afin d’éviter de générer un stress trop important chez les souris et pour réaliser les mesures les plus fiables et reproductibles possible. Tous ces gestes seront réalisés par des personnes expérimentées qui les ont déjà réalisés de nombreuses fois.

Impact sur les animaux

L’application de la substance allergisante sur la peau n’entraine pas de douleurs et a l’avantage de n’induire que très peu de démangeaisons. Des anesthésiques injectables seront utilisés avant application cutanée de la substance allergisante pour éviter que les souris se grattent et se lèchent au sein de la zone appliquée. Les souris pourraient avoir des douleurs lors de l’injection intraveineuse dans la veine proche des yeux (ceci est prévenu par pommade ophtalmologique anesthésique et par anesthésie gazeuse) et lors de la mesure de l’œdème de l’oreille avec un petit appareil commercialisé et adapté à ces mesures chez la souris (ceci est prévenu par anesthésie gazeuse). Les injections dans les veines proche des yeux répétées pourraient induire des risques de blessure aux yeux (et au pire une nécrose ophtalmique et donc une cécité) et les anesthésies gazeuses répétées pourraient induire des troubles du comportements (souris prostrées, mouvements répétitifs désorganisés, mutisme, isolement et absence de prise alimentaire). La probabilité que ces complications surviennent reste très faible lorsque les expérimentateurs sont formés. De plus la définition de points limites avec la survenue de ces complications et la décision d’euthanasie en cas de leur survenue permet d’éviter des souffrances aux souris. Ces points limites bien définis (correspondant aux complications ophtalmologiques et troubles du comportement décrits ci-dessus), suffisamment précoces et prédictifs ont été mis en place pour prévenir tout stress et toute souffrance de l’animal et en cas de leur survenue la décision sera alors prise d’euthanasier les souris concernées.

Devenir

Une mise à mort sera réalisée à l'issue des procédures du fait du prélèvement nécessaire d'oganes vitaux (oreille et sa peau).

Remplacement

Il n’existe pour l’instant aucun test in vitro satisfaisant permettant d’évaluer la réponse au traitement par ultraviolets des cellules sanguines

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe a été réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique. Dans toutes les procédures, nous incluons suffisamment d’animaux avec un nombre de 10 animaux par groupe afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous avons associé la mesure de l’épaisseur de l’oreille sur 10 souris de J30 à J35 et la quantification du nombre de cellules immunitaires de la peau à J30 sur les mêmes expérimentations. Le minimum de souris donneuses sera utilisé pour préparer les différents types de cellules traitées par ultraviolets et injectées aux souris. En effet 1 seule souris permettra de réaliser les 3 types de cellules qui sont réinjectées. Il y aura plus de groupes d’intérêt au début de l'expérimentation mais ceci permettra de définir le meilleur type de cellules à traiter par ultraviolet. Nous garderons alors cette condition expérimentale et ce type de cellules à traiter par ultraviolet pour les autres procédures. Ceci permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés dans la suite de l'expérimentation et dans les projets futurs qui seront réalisés à la suite des avancées scientifiques permises par ce projet. De plus pour toutes les procédures, nous n’utiliserons que 2 souris pour le groupe témoin nommé « témoin irritation » et qui vise à valider les résultats des mesures d’épaisseur de l’oreille.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l’animalerie, une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début de la procédure expérimentale. Des mesures sont prises pour éviter les douleurs et stress avant chaque geste : utilisation de pommade ophtalmologique anesthésiante et anesthésie générale gazeuse avant injection dans les veines proches de l’œil (qui sera alternée sur chaque œil pour éviter d’éventuels dommages aux yeux, par des expérimentateurs ayant une grande expérience de ce geste), anesthésie générale par injection d’anesthésiques avant application de substance allergisante sur l’oreille (pour éviter que les souris se lèchent) et anesthésie gazeuse lors de chaque mesure d’épaisseur de l’oreille. Le volume injecté par voie intraveineuse de cellules traitées par ultraviolet est limité à 0,1 ml afin d’éviter toute surcharge de volume sanguin à la souris. L’application du produit entrainant une réaction immunitaire sur le ventre de souris sera effectuée après rasage, sans anesthésie car ces 2 gestes n’entrainent aucune douleur. Tous ces gestes sont effectués en routine par notre équipe. Un suivi des souris sera réalisé après chaque injection de cellules traitées par ultraviolet et après chaque application cutanée de produit entrainant une réaction immunitaire afin de contrôler l’absence de modification du comportement ou de la prise alimentaire. L’observation des animaux sera effectuée 5 jours/7 et nous attacherons une grande importance à l’apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs ont été mis en place pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal.

Choix des espèces

L’espèce souris est un modèle très utilisé dans les études immunologiques en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunitaires. Cette espèce est très proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique. Ce modèle reste indispensable dans le développement et la validation de nouvelles stratégies de traitement immunologiques chez ces patients avec complications immunitaires graves. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées une semaine. Le protocole démarre à 7 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une immunisation efficace.

Une partie des souris utilisées porte une modification génétique qui leur fait développer un lupus, les autres reçoivent une huile minérale qui déclenche la même maladie huit semaines plus tard. 2140 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont tondues puis exposées à des UVB sous anesthésie, ce qui provoque des rougeurs, une inflammation et, à force de répétition, des lésions de la peau. Le projet cherche à relier la sensibilité au soleil des patients lupiques à une molécule produite par certaines cellules immunitaires.

Objectifs

Le lupus érythémateux systémique (LES) est une maladie auto-immune (où le système immunitaire attaque le corps lui-même) qui touche principalement les femmes jeunes. Les traitements actuels ont de lourds effets secondaires et ne sont pas forcément efficaces pour tous les patients. Chez 30 à 50% des patients lupiques, les reins peuvent être touchés, ce qui peut mener à la nécessité d’une dialyse ou d’une greffe de rein. La moitié des patients sont aussi très sensibles au soleil (photosensibilité): les rayons UVB peuvent aggraver la maladie notamment au niveau des reins. Le lupus est une maladie complexe et implique des cellules qui font partie des défenses naturelles du corps. Par exemple, les basophiles, généralement connus pour leur rôle dans les allergies, participent à l’aggravation du lupus. Une substance appelée prostaglandine D2 (PGD2) joue un rôle important en activant ces cellules lors des poussées de la maladie. Un autre type de cellule, les mastocytes de la peau, sont aussi connus pour être impliqués dans les réactions allergiques et pour produire beaucoup de PGD2 après une exposition au soleil, mais leur rôle dans le lupus n’est pas connu. Le but de notre projet est de comprendre si la sensibilité au soleil chez les patients lupiques est liée à la PGD2 produite par les mastocytes de la peau lorsqu’ils sont exposés aux UVB. Cette PGD2 des mastocytes pourrait ensuite activer les basophiles et déclencher une poussée de la maladie. Pour vérifier cette hypothèse, nous allons utiliser des souris lupiques avec ou sans mastocytes, ou dont les mastocytes ne peuvent pas produire de PGD2, puis nous les exposerons aux UVB. L’objectif final est de mieux comprendre la photosensibilité dans le lupus, afin de mieux diagnostiquer la maladie et de développer de nouvelles façons de la traiter.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension des mécanismes du lien entre exposition au soleil et développement de l’auto-immunité. Les cellules et molécules impliquées dans cette induction auto-immune seront ainsi identifiées. Le deuxième niveau concerne la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et l’identification des marqueurs quantifiables associés à cette photosensibilité dans le lupus permettront de pouvoir identifier les patients à risques et de prévenir ou limiter les atteintes rénales graves du lupus..

Procédures

Un génotype (gène absent dans une des lignées de souris) dit dommageable est utilisé dans le présent projet. Ces souris développent une pathologie autoimmune (lupus) légère (pas de maladie grave) mais cependant quantifiable (détection de marqueurs inflammatoires spécifiques). Différentes lignées de souris modifiées génétiquement seront utilisées. Toutes les souris seront euthanasiées et analysées avant de développer une forme grave de la maladie. Des animaux seront injectés en intrapéritonéal avec une huile minérale pro-inflammatoire, ce qui entraînera 8 semaines plus tard une pathologie lupique également légère (pas de maladie grave) mais quantifiable (détection de marqueurs inflammatoires spécifiques). Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 4 types d’interventions : des contentions (attrapés et immobilisés dans une main) (souris vigiles), des injections dans la peau (« intradermiques ») et/ou dans le ventre (« intrapéritonéales ») (moins de 30 secondes par injection) (souris vigiles), des prélèvements d’un petit volume de sang (moins de 30 secondes) sous anesthésie générale (2 à 3 minutes), et des expositions à des doses contrôlées d’UVB avec un appareil de photothérapie (moins d’une minute), également sous anesthésie générale. Des animaux pourront recevoir jusqu’à 8 piqûres intradermiques et 8 piqûres intrapéritonéales. Pour certains animaux, l’exposition aux UVB sera répétée jusqu’à 3 fois tous les 3 jours pendant une semaine. Certains animaux seront prélevés deux fois d’un petit volume de sang avec une semaine entre les deux prélèvements.

Impact sur les animaux

Une des lignées de souris utilisées développe une pathologie autoimmune (lupus) légère (pas de maladie grave) mais cependant quantifiable (détection de marqueurs inflammatoires spécifiques). D’autres animaux seront injectés en intrapéritonéal avec une huile minérale pro-inflammatoire, ce qui entraînera 8 semaines plus tard une pathologie lupique également légère (pas de maladie grave) mais quantifiable (détection de marqueurs inflammatoires spécifiques). Dans certains cas peu fréquents, l’huile minérale pro-inflammatoire peut induire une détresse respiratoire. Des animaux seront tondus sur le dos 48 heures avant la première exposition aux UVB avec une tondeuse adaptée, ce qui pourra entraîner un stress sur 2-3 minutes. L’exposition aux UVB n’entraînera pas de brûlure mais une rougeur et une inflammation légère de la peau des souris tondues. La répétition des expositions peut induire des lésions cutanées non sévères. Les injections intrapéritonéales induiront un stress et une douleur brève de piqûre. Les contentions des animaux induiront un stress bref.

Devenir

Les expérimentations du projet sur les lots de souris dureront au minimum 72 heures et au maximum 16 semaines. Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des expérimentations et en cas d’atteinte de points limites, et leurs organes prélevés et analysés.

Remplacement

Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers vivants avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études en milieu artificiel ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes, ni des maladies étudiées, ni de la séquence UVB/autoimmunité à l’échelle d’un organisme. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour ces études visant à améliorer la prise en charge des patients.

Réduction

Expérimentalement, le modèle d‘exposition aux UVB dans le contexte lupique a déjà été réalisé précédemment au sein de notre laboratoire et permet donc de réduire ici au strict minimum le nombre de souris nécessaires. Les nombres de souris par groupe ont été calculés pour tenir compte de la variabilité entre les souris dans la réponse aux UVB et au développement des paramètres lupiques. Cela nous donnera une puissance statistique suffisante pour pouvoir conclure scientifiquement sur les paramètres analysés. Des prélèvements post-mortem seront conservés pour répondre à d’éventuelles questions ultérieures afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet. Enfin, dans le but de démontrer la reproductibilité de nos résultats, chaque procédure ne sera répétée qu’une fois uniquement si lors de la première série d’expérience une tendance nette mais avec des statistiques ne permettant pas de conclure scientifiquement sont obtenues. Cette éventuelle répétition nous permettra de confirmer ou d’invalider scientifiquement les premiers résultats.

Raffinement

Avant et pendant les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales pour atténuer tout stress, jamais isolés, toujours avec des accessoires d’enrichissements (cotons pour nidifier, jouets type maisonnette pour pouvoir se cacher) et sont observés quotidiennement. Les procédures sont réalisées dans le but de limiter au maximum les nuisances induites aux animaux. La surveillance des animaux injectés avec une huile pro-inflammatoire sera renforcée entre la deuxième et la troisième semaine après injection, ce qui correspond au moment où les souris sont fragilisées et sensibles au stress. Une grille de score a été établie afin de suivre l’état général de ces animaux et d’identifier ceux nécessitant une intervention rapide d’interruption des procédures. Les animaux n’ayant pas un score nul (mais inférieur au point limite) se verront apportés une attention particulière. Passée la période où les animaux injectés avec une huile pro-inflammatoire sont plus fragiles (fin semaine 1 à fin semaine 2), ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans les procédures du présent projet. Si le point limite était malgré tout atteint, les souris seraient euthanasiées sans attendre la fin de la procédure. L’évaluation des points limites au cours d’une des procédures sera réalisée à l’aide d’une grille d’évaluation déjà validée et prenant en compte : l’évolution du poids de la souris, son comportement, son apparence et ses difficultés éventuelles à respirer. L’expérience acquise avec les expositions aux UVB nous a montré que dans les conditions utilisées dans le présent projet, aucune brûlure ou lésion cutanée n’est induite. Cependant, une grille de score de dermatite a été établie pour pouvoir vérifier cela pour tous les animaux avant chaque exposition aux UVB. En plus de la surveillance quotidienne des animaux, les évaluations « cliniques » seront réalisées une à trois fois par semaine.

Choix des espèces

Notre projet s’inscrit dans l’objectif de définir des mécanismes pathologiques d’intérêt pour la santé humaine afin de pouvoir améliorer la prise en charge des patients. Les procédures et les souris utilisées dans le présent projet nous permettront d’atteindre cet objectif. L’espèce utilisée (souris domestique) est le seul modèle de mammifères disposant des lignées modifiées génétiquement pertinentes pour les objectifs scientifiques de notre projet et dont la biologie se rapproche suffisamment de la biologie humaine pour que son étude puisse y être transférée. De plus les outils d’analyse disponibles et l’expertise acquise des modèles utilisés ici justifient l’utilisation de ce modèle. Les animaux entrant en procédure auront tous un âge supérieur ou égal à 10 semaines (stade adulte). Ce stade adulte correspond au stade de la population de patients concernés par la présente investigation.