Troubles immunitaires

Les souris seront mises à mort dès l'apparition de lésions oculaires ou cutanées sévères, ou d'une perte de poids supérieure à 20 % de leur poids initial. 700 souris immunodéficientes greffées de cellules immunitaires humaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 640 d'entre elles. Elles sont rasées sous anesthésie, reçoivent trois injections sous-cutanées, une à deux injections intraveineuses au niveau de l'œil, des injections abdominales cinq jours par semaine pendant deux semaines, un gavage sur le même rythme, un traitement cutané et trois à cinq prélèvements sanguins. Le projet déclenche chez elles une nécrolyse épidermique toxique, réaction allergique médicamenteuse qui détruit la peau, et les retombées annoncées se limitent à une meilleure compréhension de la maladie et à de futures pistes thérapeutiques, quand les atteintes attendues sont des rougeurs et larmoiements puis des plaies et décollements cutanés.

Objectifs

La nécrolyse épidermique toxique (NET) est une réaction allergique rare mais très grave à certains médicaments. Elle provoque la destruction d’une partie importante de la peau, pouvant mettre en danger la vie du patient, avec des symptômes semblables à ceux observés chez les grands brûlés. Cette réaction est due à une réponse excessive du système immunitaire, lorsque certaines cellules de défense s’attaquent aux cellules de la peau après la prise d’un médicament. À ce jour, il n’existe aucun traitement spécifique, et la prise en charge repose sur l’arrêt du médicament responsable et sur des soins intensifs destinés à prévenir les complications et à favoriser la cicatrisation. Un des premiers signes observés est une douleur cutanée intense, ressentie avant l’apparition des lésions visibles. Cela suggère que le système nerveux sensoriel, responsable de la perception de la douleur, pourrait jouer un rôle dans le développement de la maladie. Le projet utilise un modèle de souris humanisées, dans lequel des cellules immunitaires humaines sont greffées à des souris dépourvues de système immunitaire. Ce modèle présente l’intérêt d’intégrer le médicament déclencheur directement dans le processus immunitaire, permettant d’étudier plus fidèlement les mécanismes à l’origine de cette pathologie. Ces recherches visent à mieux comprendre les interactions entre le système immunitaire et les neurones sensoriels, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension de la réponse immunitaire mise en place dans cette pathologie, du rôle du médicament et des neurones sensoriels. À long terme, ces travaux aideront à mieux comprendre la nécrolyse épidermique toxique et à favoriser la recherche de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les souris seront rasées, une seule fois par animal, sous anesthésie gazeuse (durée environ 30 secondes). Les injections sous-cutanées seront réalisées à raison de trois injections consécutives, d’une durée de 30 secondes chacune, également sous anesthésie au niveau du train arrière. Les injections intraveineuses au niveau de l’œil seront effectuées une ou deux fois par animal sous anesthésie, après application d’un collyre anesthésiant local, pour une durée d’environ 40 secondes. Les injections au niveau du ventre seront réalisées 5 fois par semaine pendant maximum 2 semaines et dureront environ 30 secondes chacune. Les animaux recevront un traitement administré par gavage oral cinq jours par semaine, hors week-end, pendant une durée maximale de deux semaines ; chaque gavage dure environ 30 secondes et ne nécessite pas d’anesthésie. Les animaux recevront un traitement cutané cinq jours par semaine, sur une durée maximale de deux semaines sous anesthésie générale. Trois à cinq prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse d’une durée d’environ une minute chacun, chacun espacé d'au moins 1 semaine exceptée celui de la mise à mort. Les souris seront pesées et observées chaque jour (durée environ 30 secondes par animal et par jour). En fin de protocole, ou dès l’apparition de signes cliniques définis, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale (durée inférieure à 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les souris sont anesthésiées pour les gestes nécessitant une immobilisation. Des injections seront réalisées selon le protocole ; elles peuvent provoquer un stress bref ou une gêne passagère. La déplétion des neurones sensoriels, réalisée à l’aide d’un produit spécifique, peut entraîner dans l’heure suivant l’injection une baisse temporaire de la température corporelle et de légères démangeaisons ; les animaux sont alors placés sur un tapis ou dans une armoire chauffante jusqu’à récupération complète. À plus long terme, ce traitement peut réduire la sensibilité à la chaleur et provoquer de petites zones de dépigmentation du pelage (taches blanches), sans modification du comportement ni impact sur le bien-être. Les animaux reçoivent également un traitement par voie orale à l’aide d’une sonde souple adaptée à leur taille. Après chaque administration, ils sont surveillés attentivement pour détecter tout signe de gêne respiratoire, de régurgitation ou de distension abdominale ; si cela se produit, l’animal est retiré de l’étude et mis à mort. Un contrôle sanguin est effectué au cours du suivi pour vérifier le bon équilibre des cellules greffées. Si le taux mesuré est trop élevé, l’animal sera également mis à mort. Les premiers signes cliniques attendus concernent essentiellement les yeux (rougeur, larmoiement), observés généralement une quinzaine de jours après l’initiation de la procédure, et potentiellement des signes cutanés (plaies, décollement). Les souris sont observées cinq jours sur sept et seront mises à mort dès l’apparition de signes oculaires ou cutanés sévères, ou d’une perte de poids supérieure à 20 % de leur poids initial.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses sur les tissus, notamment au niveau des yeux, de la peau et des organes lymphoïdes. Ces analyses permettront de caractériser la réponse immunitaire induite dans le modèle humanisé et d’évaluer l’implication des neurones sensoriels dans le développement et la modulation de la nécrolyse épidermique toxique.

Remplacement

Ce projet vise à mieux comprendre comment le système immunitaire réagit dans la nécrolyse épidermique toxique (NET), une réaction allergique grave à certains médicaments, et à explorer le rôle des nerfs sensoriels dans ce processus. Le modèle utilisé reproduit de façon très proche ce qui se passe chez l’être humain, car la réaction immunitaire y est déclenchée par un médicament, comme dans la maladie réelle. Le principal signe observé dans ce modèle est une atteinte des yeux. Ce type de réaction complexe ne peut pas être reproduit dans des cellules cultivées en laboratoire ; l’expérimentation sur l’animal reste donc indispensable pour comprendre comment le système nerveux et le système immunitaire interagissent dans cette pathologie.

Réduction

Le nombre de souris a été déterminé de façon à obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum l’utilisation d’animaux. Environ 30 % des souris ne développant pas la réponse immunitaire attendue, chaque groupe comprendra environ 20 animaux. Ce nombre est suffisant pour assurer la robustesse des analyses statistiques et permettre une interprétation adéquate des résultats. Les procédures seront réalisées en deux temps, en cas de réussite à la première les suivantes ne seront pas engagées.

Raffinement

Tout est mis en œuvre pour réduire le stress et l’inconfort des animaux. Les souris sont hébergées par groupes de cinq pour conserver leurs repères sociaux. Leur état général, leur comportement et leurs yeux sont observés quotidiennement. Le poids est suivi chaque jour ; si une perte modérée est constatée, une alimentation gélifiée est ajoutée pour encourager l’appétit. Les manipulations comme le rasage ou les injections sont réalisées sous anesthésie gazeuse pour éviter la douleur. Une goutte d’anesthésiant local est également appliquée avant les injections près de l’œil. Enfin, des matériaux de nidification (cotons et abris en carton) sont ajoutés pour améliorer leur confort et leur thermorégulation après les interventions. En cas d'atteinte de points limites (mauvais équilibre des cellules greffées, gêne respiratoire, atteintes occulaire ou cutanées sévères, perte de poids importante), l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour étudier les maladies liées au système immunitaire, comme les allergies ou les inflammations de la peau. Elle partage avec l’être humain plusieurs mécanismes de défense similaires, ce qui permet d’obtenir des résultats pertinents. Dans ce projet, on utilise des lignées particulières de souris qui possèdent un système immunitaire affaibli. Cela permet de greffer des cellules humaines sans risque de rejet. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 5 semaines, afin que le système immunitaire soit mature.

660 000 souris et rats sont élevés pour être livrés aux laboratoires porteurs de la mutation voulue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 535 000 d'entre eux et modéré pour 125 000. Chacun peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue pour vérifier son génotype, jusqu'à quatre prélèvements sanguins par jour et une injection d'hormone destinée à activer sa mutation. Une partie part vers d'autres établissements, le reste est mis à mort, ces animaux appartenant au scientifique et ne pouvant, selon le porteur, être replacés. Il annonce une hausse d'environ 10 % des effectifs et indique que les scientifiques s'engagent par écrit à l'absence de solution de remplacement, l'objectif affiché étant de leur livrer le "modèle parfaitement adapté" à leurs expérimentations.

Objectifs

Ce projet consiste à maintenir des lignées de rongeurs dont certains gènes ont été modifiés. Ces modifications peuvent provoquer chez les animaux des changements visibles ou des symptômes particuliers, appelés phénotypes. L’objectif est d’observer ces animaux, de comprendre si la mutation génétique a un impact sur leur santé et leur bienêtre, et d’ajuster la manière dont ils sont suivis et soignés en fonction de ces observations. Ces animaux sont utilisés comme modèles dans la recherche scientifique, par exemple pour mieux comprendre des maladies génétiques comme la mucoviscidose, l’hémophilie ou certaines myopathies, et contribuer au développement de nouveaux médicaments. Pour savoir si un animal porte réellement la mutation recherchée, on effectue une biopsie, généralement en prélevant un morceau d’oreille. Ce prélèvement sert à extraire l’ADN et à vérifier si la mutation est présente. Cela est indispensable, car dans une même portée, tous les animaux ne sont pas forcément porteurs, et il faut pouvoir identifier précisément ceux qui seront utiles pour les recherches et garantir la fiabilité des résultats. Lorsqu’une nouvelle lignée génétiquement modifiée arrive ou est créée, et que l’on ne connaît pas encore les effets de la mutation, une phase d’observation détaillée est mise en place pour comprendre comment celleci influence l’animal et s’assurer que son bienêtre est préservé. Lorsque les effets de la mutation sont déjà connus, le suivi et les soins sont adaptés directement, en surveillant les éventuels signes cliniques et en mettant en place des mesures de prévention ou de traitement si nécessaire. Pour certaines lignées, la mutation ne s’exprime que lorsque l’animal reçoit une substance déclenchante, par exemple une hormone, ce que l’on appelle un ligand. Une administration peut donc être réalisée afin d’activer la mutation et de permettre à l’animal de manifester les caractéristiques liées à cette modification génétique. Dans l’ensemble du projet, environ 660 000 animaux sont concernés, avec une augmentation d’environ 10 % liée à une utilisation croissante de ces modèles. Ils sont répartis dans 500 à 600 projets de recherche différents. Parmi ces projets, environ 35 % portent sur des lignées génétiquement modifiées, pour lesquelles les animaux font l’objet d’une attention particulière en matière de suivi et d’évaluation des phénotypes, afin d’anticiper et de limiter au maximum l’impact potentiel de la mutation sur leur bienêtre. 

Bénéfices attendus

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés (avec une analyse de la présence de la mutation validée) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. L’altération génétique de ces animaux permet de les rendre plus spécifique à une question scientifique posée, et ainsi réduire le nombre d’animaux qui aurait dû être utilisé si on avait utilisé des lignées moins adaptées à la maladie étudiée. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et un raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la cartographie génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production, de l’élevage et de la qualité des animaux qui doivent être sains, sans agent pouvant induire des biais dans les études et porteur de la mutation génétique voulue afin de fournir aux scientifiques le modèle parfaitement adapté pour leurs expérimentations.

Procédures

Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis (par animal) : à 1 à 2 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique : un prélèvement par animal à la queue maximum) (maximum 4 biopsies sur validation par l’équipe vétérinaire), acte d’une durée maximale de 2sec par biopsie. à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale de max 3sec. à une injection d’un ligand, acte d’une durée maximale de 10sec par injection. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront exprimer un phénotype ayant un impact négatif sur eux (ex : mutation induisant de l’arthrite).

Impact sur les animaux

Expression d’un phénotype ayant un impact négatif sur les animaux et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques, mortalité innatendue ou stress exprimé pendant l’évaluation bien etre animal d’une nouvelle lignée. Douleur et stress léger de courte durée associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum) en plus d’une identification. Douleur et stress léger de courte durée associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress léger de courte durée dûs aux contentions. Douleur, stress léger de courte durée dus à l'injection d’un produit.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).

Remplacement

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro. Les scientifiques s’engagent par écrit à ce qu’il n’y ait pas de solution de remplacement à cette lignée.

Réduction

Le nombre d’animaux hébergés et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet. Par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur génétiquement altéré quand il est accouplé avec des animaux non génétiquement altéréesafin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction) ; éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels ; fécondation in-vitro pour ne produire qu’une génération d’animaux d’intérêt et éviter le vieillissement ; cryoconservation des lignées non utilisée et arrêt des colonies respirantes si pas de besoin. Nous encourageons les scientifiques à utiliser les petits au génotype sauvage (non d’intérêt) en tant que contrôles. Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée, n’est utilisé que le nombre d’animaux minimum requis. Nous ne faisons pas naître d’animaux spécifiquement pour cette évaluation. Pour le génotypage, nous encourageons les scientifiques à choisir des méthodes de prélèvement qui associent identification et génotypage. Nous les encourageons à choisir des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage (homozygotes x homozygotes par exemple). Nous avons aussi réduit le nombre d’animaux utilisés pour l’évaluation du bien-être des nouvelles lignées en adaptant les anciens requis Suisses et Allemands (100 animaux sur 3 générations) aux recommandations européennes (au moins 7 animaux de chaque sexe et génotype, sur 2 générations).

Raffinement

En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés au suivi vétérinaire des animaux. Pour les lignées à phénotype dommageable, des observations cliniques plus fréquentes et spécifiques, avec des points limites, peuvent être mises en place. Pour limiter la douleur, une euthanasie pourrait être demandée à un point limite ou âge précis pour éviter l’expression du phénotype. Cela est évalué lors de la caractérisation du phénotype, en lien avec le scientifique et les vétérinaires. Les observations sont facilitées par des outils internes comme des grilles de score. En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype, des points d’intervention sont adoptés pour un suivi précis et des soins adaptés (soutien nutritionnel…). Si des signes cliniques peuvent être atténués ou guéris par traitement, avec accord du scientifique, le traitement est mis en place. Les animaux présentant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final pour assurer leur réception et utilisation selon les normes éthiques et de bien-être animal.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement altérés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5 jours après la fécondation.

Une minipompe implantée sous la peau du dos infuse en continu de la bléomycine pendant six semaines, jusqu'à épaissir la peau comme dans la sclérodermie et parfois atteindre les poumons. 3 000 souris vont subir ce protocole dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, avec des pesées quotidiennes, jusqu'à dix prélèvements sanguins et des administrations de composés pouvant aller jusqu'à deux fois par jour. Le porteur écrit que la gestion de la douleur est délicate parce que certains analgésiques pourraient fausser les résultats, et s'en remet à une surveillance quotidienne avec retrait de l'étude en cas de détresse. La mise à mort finale se fait par ponction cardiaque sous anesthésie, sans réveil, pour prélever les organes et mesurer les biomarqueurs.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de tester l’efficacité de nouveaux traitements contre la sclérodermie systémique, une maladie auto-immune rare mais grave qui provoque un durcissement progressif de la peau et des organes internes comme les poumons, le cœur ou les reins. Cette affection touche principalement les femmes entre 45 et 65 ans et entraîne des douleurs, une perte de mobilité, une baisse de qualité de vie et un risque élevé de mortalité. En France, on estime qu’entre 6 000 et 9 000 personnes en souffrent, et malgré les traitements actuels qui visent à soulager les symptômes et ralentir la progression, il n’existe aucun remède capable d’inverser la fibrose, principal facteur de gravité. Les options disponibles, comme les immunosuppresseurs ou les antifibrosants, offrent des résultats limités, ce qui rend urgent le développement de thérapies innovantes ciblant les mécanismes précoces de la maladie et la fibrose. Notre projet consiste à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques dans un modèle expérimental chez la souris, reproduisant la fibrose systémique grâce à une infusion continue de bléomycine, afin d’identifier des solutions plus efficaces qui pourraient transformer la prise en charge et améliorer la survie et la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Les études prévues dans ce projet serviront à tester si de nouveaux médicaments peuvent être efficaces contre la fibrose systémique. À court terme, elles permettront de décider de la suite du projet : si les résultats sont insuffisants, nous chercherons à améliorer le médicament (par exemple en modifiant sa structure pour qu’il agisse mieux), ou nous arrêterons le projet. Si les résultats sont encourageants, nous passerons à l’étape suivante, qui consiste à vérifier comment le médicament se comporte dans l’organisme et s’il est bien toléré. À plus long terme, ces recherches aideront à déterminer les doses à utiliser chez les patients et, nous l’espérons, à proposer un traitement efficace et mieux toléré pour les personnes atteintes de sclérodermie systémique.

Procédures

• Les gestes techniques concernent tous les animaux. • Pesées : Durée 30 secondes, sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour pendant 6 semaines. • Implantation d’une minipompe osmotique en sous-cutanée sous anesthésie générale gazeuse. Durée 5 minutes. 1 fois par animal. • Prélèvements de sang via la veine caudale, saphène ou mandibulaire : Durée 30 secondes, sur animal vigile ou sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. Jusqu’à 10 fois par animal. • Prélèvement de sang terminal par ponction cardiaque : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. 1 fois par animal. Sans réveil. •​Administrations des composés à potentiel thérapeutique : Durée 10-30 secondes, 1 fois par semaine à 2 fois par jour, pendant 6 semaines, sur animal vigile ou anesthésié selon voie d'administration.

Impact sur les animaux

Pour provoquer la fibrose cutanée, une petite pompe est implantée sous la peau du dos des souris afin d’infuser en continu une solution qui entraîne un épaississement localisé de la peau, similaire à ce qui se produit dans la sclérodermie, et parfois une atteinte légère des poumons. Les animaux peuvent perdre du poids de manière transitoire et présenter des signes d’inconfort liés à l’inflammation et à l’épaississement cutané. Ce modèle est considéré comme étant de gravité modérée selon les normes du bien-être animal. La gestion de la douleur est délicate, car certains analgésiques pourraient fausser les résultats. Les animaux sont donc surveillés quotidiennement et retirés de l’étude en cas de détresse.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour permettre le prélèvement des organes d’intérêts qui feront l’objet d’analyses comme le dosage de biomarqueurs et les paramètres pharmacocinétiques.

Remplacement

Notre analyse des recherches existantes montre qu’il n’existe pas aujourd’hui de systèmes mathématiques ou de modèles en laboratoire capables de reproduire toute la complexité de la sclérodermie systémique et d’évaluer correctement l’effet de nouveaux traitements. Les modèles les plus avancés, comme les organoïdes, ne représentent que des versions simplifiées d’organes, alors que cette maladie touche plusieurs tissus et organes (vaisseaux, peau, poumons, reins, système immunitaire, sang…). Pour comprendre ces interactions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal. Cependant, nous limiterons autant que possible le recours à l’animal en nous appuyant sur des études réalisées sur des cellules en culture et d’autres systèmes en laboratoire. L’utilisation d’animaux reste une étape indispensable pour vérifier l’efficacité des nouveaux traitements avant de passer à des essais chez des volontaires sains, puis chez des patients

Réduction

Avant d’être testés chez l’animal, les médicaments candidats passent par une série de tests en laboratoire et in silico. Ces tests permettent de vérifier comment le médicament se comporte (par exemple, s’il peut être bien absorbé et distribué dans l’organisme) et s’il agit sur la cible prévue. Seuls les candidats les plus prometteurs sont retenus pour les études chez l’animal, ce qui augmente les chances d’obtenir des résultats utiles. Le nombre d’animaux utilisés est calculé à partir de données scientifiques et de méthodes statistiques pour garantir que les résultats soient fiables tout en limitant le recours à l’animal. Les mesures comme l’épaisseur de la peau ou certains marqueurs biologiques seront analysés avec des outils statistiques afin de confirmer que les différences observées entre les groupes sont réelles et non dues au hasard. Cette approche rigoureuse est essentielle pour valider l’efficacité des traitements avant de passer aux étapes suivantes de développement.

Raffinement

Toutes les procédures susceptibles d’induire douleur ou stress seront réalisées sous anesthésie afin de prévenir toute souffrance. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel qualifié, sous la responsabilité du vétérinaire désigné. Des soins appropriés seront administrés en cas de besoin. Tout animal présentant des signes de détresse sera retiré de l’étude et euthanasié conformément à la réglementation en vigueur. Le nombre de manipulations sera limité au strict nécessaire afin de réduire le stress, susceptible d’altérer la qualité des données. Des critères d’arrêt prédéfinis permettront d’interrompre l’expérimentation avant l’apparition de douleurs ou lésions irréversibles. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes aux prescriptions réglementaires et aux recommandations en matière de bien-être (température, hygrométrie, cycle lumineux). La taille des groupes sera adaptée à la souris et donc à son comportement social, afin de favoriser les interactions naturelles et prévenir l’isolement ou la surpopulation. Des dispositifs d’enrichissement environnemental seront mis en place pour stimuler les comportements exploratoires et réduire le stress. Ces mesures visent à garantir le respect des principes de raffinement tout en assurant la fiabilité scientifique des résultats.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés en recherche médicale et pharmaceutique ont été développés chez le rat et la souris. Ces espèces sont les plus couramment utilisées car elles permettent d’obtenir des résultats fiables tout en limitant la douleur et la souffrance, conformément à l’article R.214-106 du Code rural. De nombreuses données existent déjà dans la littérature sur les modèles de maladies auto-immunes chez la souris, notamment pour la sclérodermie systémique, ce qui facilite la mise en place des protocoles et l’interprétation des résultats. L’utilisation de la souris, espèce bien caractérisée et adaptée aux études précliniques, répond ainsi à l’exigence de choisir les animaux les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants tout en minimisant les dommages durables. Les données de la littérature indiquent que la sclérodermie systémique expérimentale peut être induite chez la souris adulte, généralement entre 6 et 12 semaines d’âge. Ce stade est choisi pour des raisons scientifiques : il correspond à un organisme pleinement développé, avec un système immunitaire mature et une physiologie stable, ce qui est indispensable pour reproduire les mécanismes complexes de la maladie et évaluer la réponse aux traitements. L’utilisation de souris adultes permet également de limiter la variabilité liée à la croissance ou à l’immaturité des organes, garantissant ainsi la fiabilité des résultats tout en respectant le principe de réduction et de pertinence scientifique.

Tester un complexe sucrant breveté, issu de fruits fermentés et de fibres, pour une filière qui cherche un substitut au saccharose : 6 680 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur appareil digestif, leur foie, leurs reins, leur pancréas, leurs dents et leur cerveau. Chaque souris est mise à jeun cinq heures par semaine, vingt-quatre fois, et subit jusqu'à douze prélèvements sanguins. Une partie reçoit un régime hypercalorique jusqu'à l'obésité, une autre est privée de nourriture pour reproduire une anorexie, avec des périodes d'isolement pouvant atteindre vingt-deux heures. Le porteur situe le projet dans une demande croissante de la population et des acteurs de l'agroalimentaire pour des produits plus sains et sensoriellement satisfaisants, et annonce une contribution à la reformulation de produits.

Objectifs

Le sucre, et plus particulièrement le saccharose, occupe une place centrale dans notre alimentation en raison de ses propriétés organoleptiques (goût sucré, texture…) et fonctionnelles (conservation, structure...). Toutefois, sa consommation excessive est associée à de nombreuses pathologies chroniques telles que le diabète de type 2, les maladies neurodégénératives, les maladies cardiovasculaires, l’obésité, les troubles du comportement alimentaire ou encore l’inflammation. Au-delà des impacts physiopathologiques, plusieurs études mettent en évidence un lien entre consommation excessive de sucre et troubles du comportement, en particulier chez les enfants. En effet, la consommation de sucre serait associée à des troubles de l’attention, de l’impulsivité, voire à une augmentation de l’agressivité. Face à ces enjeux de santé publique, la recherche de substituts sucrants plus sains devient essentielle. L’objectif est double : maintenir les caractéristiques sensorielles et fonctionnelles du sucre tout en réduisant son impact sur la santé. Dans ce contexte, un nouveau substitut de sucre, un complexe sucrant breveté issu de fruits fermentés et de fibres, apparait comme prometteur dans cet enjeu. Ce substitut présente une particularité majeure : il possède des propriétés physiques similaires à celles du sucre, ce qui lui permet de s’intégrer aisément dans les préparations culinaires classiques, tout en limitant l’impact sur la santé. Au-delà de ces propriétés, ce substitut de sucre suscite un intérêt croissant pour son potentiel à limiter les pics glycémiques postprandiaux. Il permettrait aussi de palier aux dysrégulations émotionnelles et cognitives induites par le sucre. Par ailleurs, sa faible valeur énergétique pourrait jouer un rôle dans le contrôle du poids corporel et des apports caloriques, éléments clés dans la lutte contre l’obésité. Ce projet, à l’interface entre nutrition, physiologie et comportement, a pour objectif de déterminer si le substitut de sucre représente une alternative crédible au sucre classique du point de vue de la santé à court et long terme. NOUS AVONS CHANGE LA FAÇON DE FAIRE LES PRISES DE SANG POUR UTILISER UNE METHODE PLUS RAPIDE, MOINS STRESSANTE ET MOINS FREQUENTE POUR LES ANIMAUX.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à générer des connaissances sur les effets d’un substitut sucrant innovant. Les bénéfices attendus sont : scientifiques, sanitaires et sociétaux. 1-Avancées scientifiques : Ce projet permettra d’approfondir la compréhension des effets des substituts du sucre sur la régulation de la glycémie, la sécrétion d’insuline et les marqueurs d’inflammation de bas grade. Il explorera également les effets neurocomportementaux d’une consommation chronique ou aiguë de sucre et de ses substituts, notamment en ce qui concerne la concentration, l’impulsivité et les comportements agressifs. Par ailleurs, les mécanismes de régulation de la satiété feront l’objet d’une attention particulière, en lien avec la fermentation colique et la production d’acides gras à chaîne courte. Enfin, le rôle de ce substitut de sucre sera évalué dans des contextes de surconsommation alimentaire (modèle d’obésité) et de réalimentation après une phase de dénutrition (modèle post-anorexique). 2-Bénéfices sur la santé humaine : Les retombées potentielles pour la santé sont significatives. Le bénéfice principal réside dans la réduction des risques associés à une consommation excessive de sucre, tels que le diabète de type 2, l’obésité, les maladies cardiovasculaires et certaines dysrégulations neurocognitives. Une attention particulière sera portée à l’amélioration de la régulation des fonctions cognitives et émotionnelles, en lien avec les variations de neurotransmetteurs observées lors de la consommation de sucre chez certains individus sensibles. 3- Impact sur la santé publique : Ce projet répond à une demande croissante de la population et des acteurs de l’agroalimentaire pour des produits alimentaires à la fois plus sains et sensoriellement satisfaisants. Il pourrait ainsi contribuer à la formulation de nouvelles recommandations nutritionnelles et à la reformulation de produits à moindre impact métabolique. En apportant des données robustes sur les effets d’un substitut sucrant à faible index glycémique, ce projet ambitionne de participer à la transition vers une alimentation plus favorable à la santé métabolique et mentale, tout en préservant le plaisir alimentaire.

Procédures

MODIFICATION Procédure 1 : - La pesée, réalisée sur animaux vigile, durera 2 min.- PRELEVEMENT SANGUIN SERA REALISE 1 FOIS TOUTES LES DEUX SEMAINES PENDANT TOUTE LA DUREE DE L’ETUDE (SOIT 12 FOIS) ET DURERA 5 MIN - Le test de l’attention sera réalisé 3 fois par souris et durera 30 à 40 min - Le test de comportement sera réalisé 1 fois par souris et durera 23min divisé en 3 sessions sur 2 jours. - le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par groupe et durera 3h30 (à jeun) - le test de tolérance au glucose sera réalisé 1 fois par souris (sur un second lot) la semaine de la mise à mort et durera 6h (à jeun) -la mise à jeun pour la prise de la glycémie sera réalisé chaque semaine, soit 24 fois par souris et durera 5h Procédure 2 : -La période de jeun durera entre 15h30 et 19h selon la phase. -La période d’isolement durera entre 18h30 et 22h selon la phase --LE PRELEVEMENT SANGUIN SERA REALISE 1 FOIS PAR PHASE (1 PAR SEMAINE) SOIT 5 FOIS MAXIMUM DURERA 5 MIN. -Le gavage sera réalisé 1 fois par phase (1 par semaine) soit 5 fois maximum, et durera 2 min. Procédure 3 : -Le gavage sera réalisé 1 fois par jour pendant 8 jours soit 8 fois et durera 2 min. -L’injection sera réalisé 1 fois par souris et durera 2 min. -PRELEVEMENT SANGUIN SERA REALISE 1 FOIS PAR SEMAINE PENDANT TOUTE LA DUREE DE L’ETUDE (SOIT 4 FOIS), ET DURERA 5 MIN. -le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par souris et durera 3h30 (à jeun) Procédure 4 : - La pesée, réalisée sur animaux vigile, durera 2 min. -PRELEVEMENT SANGUIN SERA REALISE 1 FOIS PAR SEMAINE PENDANT TOUTE LA DUREE DE L’ETUDE (SOIT 4 FOIS) ET DURERA 5 MIN. -le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par souris et durera 3h30 (à jeun) -la mise à jeun pour la prise de la glycémie sera réalisé chaque semaine, soit 24 fois par souris et durera 5h Procédure 5 : - La pesée, réalisée sur animaux vigile, durera 2 min. - PRELEVEMENT SANGUIN SERA REALISE 1 FOIS TOUTES LES DEUX SEMAINES PENDANT TOUTE LA DUREE DE L’ETUDE (SOIT 12 FOIS) ET DURERA 5 MIN.. -le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par souris et durera 3h30 (à jeun) -la mise à jeun pour la prise de la glycémie sera réalisé chaque semaine, soit 24 fois par souris et durera 5h Procédure 6 : - La pesée quotidienne, réalisée sur animaux vigile, durera 2 min. -PRELEVEMENT SANGUIN SERA REALISE 1 FOIS TOUTES LES DEUX SEMAINES PENDANT TOUTE LA DUREE DE L’ETUDE (SOIT 12 FOIS) ET DURERA 5 MIN.. -le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par souris et durera 3h30 (à jeun)

Impact sur les animaux

Les techniques de contention et l'administration de substances peuvent induire un stress significatif chez la souris. En particulier, l'administration sous-cutanée ou par gavage, ainsi que les prélèvements sanguins, peuvent être traumatisants si effectués par du personnel insuffisamment expérimenté, entraînant des complications telles que des hématomes ou une administration incorrecte, comme dans la trachée au lieu de l'estomac. Les tests comportementaux peuvent provoquer un stress léger. Les souris devront être isolées, or l’isolement social peut causer du stress et de l’anxiété chez les souris, qui sont des animaux sociaux par nature. Un régime hyper calorique sera administré aux souris afin de mimer une obésité, leur prise de poids va entraîner une réduction de leur mobilité, ce qui pourrait provoquer un inconfort. Une privation de nourriture sera mise en place afin de mimer une anorexie chez les animaux, une perte de poids trop élevée entraînera une sortie des animaux de l’étude. Les périodes de jeûne pourraient provoquer un stress et un inconfort modérés. Les pesées réalisées plusieurs fois par semaine pourraient générer un stress léger.

Devenir

A la fin de la procédure les animaux seront mis à mort afin de prélever leurs organes pour des analyses biologiques. Ces analyses permettront de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’effet de la consommation de ce substitut de sucre. Les animaux ne seront donc pas gardés en vie car nous allons collecter l’appareil digestif, le foie, la rate, les reins, le pancréas, les muscles, le tissu adipeux, les dents et le cerveau pour procéder à des analyses biologiques.

Remplacement

À ce jour, il n’existe pas d’alternative aux tests sur les animaux qui permette de comprendre de manière fiable et complète comment ce substitut de sucre agit sur l’ensemble du corps. Les méthodes en laboratoire (sur cellules ou par modélisation informatique) ne suffisent pas à reproduire la complexité des réactions de notre organisme, notamment en ce qui concerne le métabolisme, la satiété, l’inflammation ou encore le comportement alimentaire. C’est pourquoi les études sur l’animal, en particulier la souris, restent nécessaires. Elles permettent d’observer comment ce substitut de sucre influence la sensation de satiété, la régulation du sucre dans le sang, les réponses inflammatoires et ses effets dans des situations comme l’obésité ou l’anorexie. L’utilisation de la souris offre une vision globale et sur la durée, ce qui est essentiel pour mener à bien ce projet de recherche dans un cadre scientifiquement pertinent.

Réduction

Cette étude, qui s’étalera sur cinq ans, vise à mieux comprendre les effets du substitut de sucre en le comparant aux sucres et édulcorants déjà disponibles sur le marché. Elle prendra en compte les différences entre les sexes en étudiant ses effets à la fois chez les mâles et les femelles, car le métabolisme peut varier selon le genre. Pour évaluer les effets d’une consommation prolongée, un grand nombre de souris est nécessaire. Certaines seront analysées à différentes étapes de l’étude afin de détecter, le cas échéant, des effets sur des organes comme le foie, les reins ou les intestins. Toutefois, si aucun impact n’est observé après 24 semaines chez un premier groupe de souris, les autres groupes ne seront pas utilisés. Le nombre de souris a été calculé pour obtenir des résultats fiables : 20 souris par groupe permettront notamment de tester la réponse du corps au sucre (tolérance au glucose et à l’insuline).

Raffinement

Les souris seront logées en groupes de quatre ou cinq dans des cages respectant les normes réglementaires, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal, les souris seront manipulées quotidiennement par les mêmes expérimentateurs. Ces mêmes expérimentateurs feront les administrations de la molécule et les tests comportementaux tout au long du projet. Les expérimentateurs s’assureront quotidiennement du bien-être animal Des points limites seront mis en place. Les mises à mort seront effectuées sous anesthésie profonde. Enfin, pour limiter le stress des animaux lors des tests comportementaux, des phases d’acclimatations dans les différentes enceintes font partie intégrante du protocole.

Choix des espèces

Les souris sont des modèles animaux largement utilisés dans la recherche biomédicale en raison de leur similitude biologique avec l'homme. Elles ont des systèmes digestifs, hormonaux et métaboliques assez proches de ceux de l’homme, ce qui permet d'étudier les effets physiopathologiques des aliments, tels que les substituts de sucre. Le choix d’utiliser des souris a aussi été conforté par le fait qu’il existe un plus grand nombre d’outils d’analyse disponibles (dont les réactifs immunologiques), par rapport aux autres espèces. Nous allons utiliser des souris de 8 semaines afin de regarder l’impact de la prise du substitut de sucre au cours de la vie adulte.

Les souris homozygotes de cette lignée saignent plus longtemps que les autres, faute de plaquettes en nombre suffisant, et vivent moins longtemps : c'est ce phénotype dommageable qui fait l'objet du projet. 315 souris vont être utilisées, 165 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 150 un niveau léger. Le seul acte décrit est une prise de sang d'une minute sur les animaux homozygotes, entre six semaines et neuf mois d'âge, le reste de l'effectif relevant de l'entretien de la lignée, soit 55 mutantes et 50 témoins par an. Toutes sont tuées en fin de protocole pour prélever des organes et de la moelle osseuse, et le porteur précise que les homozygotes ne seront pas croisées entre elles afin d'éviter les mises bas.

Objectifs

Les maladies rares d’origine génétique peuvent nous en apprendre beaucoup sur le fonctionnement du corps humain. En les étudiant, les chercheurs découvrent des informations précieuses sur les gènes, les protéines et les mécanismes essentiels de la vie. Ces découvertes peuvent aussi aider à mieux comprendre des maladies plus courantes. Dans notre recherche, nous nous intéressons à une maladie appelée syndrome de Hermansky-Pudlak (SHP). C’est une maladie rare qui touche plusieurs organes et se manifeste notamment par une forme d’albinisme (peau et yeux très clairs) et une tendance aux saignements. Chez certains patients atteints de cette maladie, nous avons découvert des anomalies dans un gène. Ces anomalies pourraient expliquer certaines difficultés de défense contre les infections (déficit immunitaire) ainsi que des troubles du sang, en particulier un manque de plaquettes – des cellules qui aident à arrêter les saignements – et des problèmes dans leur fonctionnement. Le but de notre projet est d'étudier les effets de cette anomalie génétique, en utilisant un modèle de souris spécialement conçu pour porter cette mutation. Nous allons nous concentrer sur l’étude du sang, et plus particulièrement sur les plaquettes. Pour cela, nous maintiendrons la lignée de souris portant la mutation et nous réaliserons des prises de sang sur des souris saines et sur des souris porteuses de la mutation, afin d’analyser les différences et mieux comprendre les conséquences de cette modification génétique.

Bénéfices attendus

L'objectif de notre projet est l'étude de système immunitaire et la fonction plaquettaire dans le cadre d'une maladie rare syndrome de Hermansky-Pudlak, nous souhaiterons comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de la mutation de notre gène d’intérêt et son effet sur la thrombopénie (réduction de nombre de plaquettes) ainsi que les dysfonctionnements de ces plaquettes.

Procédures

Dans le cadre de cette procédure, un prélèvement de sang sera réalisé sur certains animaux (homozygotes) au plus tôt à 6 semaines d'âges et au plus tard à 9 mois d’âge. Ce geste dure environ une minute.

Impact sur les animaux

Les animaux homozygotes présentent un phénotype qui se présente sous la forme d'une thrombopénie (réduction du nombre de plaquettes). Ce phénotype implique un temps de saignement plus long et à une incidence sur la coagulation des animaux. La durée de vie de ces animaux est inférieure à la moyenne. L’animal va ressentir un stress lors de la contention pour la prise de sang et une douleur légère lors de l’insertion de l’aiguille pour le prélèvement.

Devenir

En fin de protocole, tous les animaux sont mis à mort afin de procéder a la collecte d'organe, de la moelle ossuse, afin de l'analyser.

Remplacement

Une partie importante de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et peut être étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multi-systémique ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information. De plus, le système immunitaire est complexe et impliques plusieurs organes. Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification d’une protéine sur des fonctions métaboliques complexes lors d’une maladie immunitaire. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (régulation et production des cellules immunitaires). Seul une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (fonctionnement du système immunitaire), fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude. Vu l'expérience que nous avons sur les études précédentes, la génération de 55 animaux mutants et 50 animaux contrôles par an sont nécessaires pour obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Un suivi régulier de leur état général sera mis en place pour garantir leur bonne santé. Si la surveillance générale (apparence, comportement, la posture, la présence de vocalisation) indique un changement pouvant impacter la santé de l’animal, une surveillance rapprochée comportant un tableau de suivi sera mise en place. Par ailleurs, nous nous engageons à offrir les meilleures conditions d'hébergement possibles, avec un enrichissement adéquat (présence de matériel pour la construction du nid et un tube). Des soins locaux (Dermidine ou autre produit selon les recommandations vétérinaires) seront administrés à tout animal blessé. Si une douleur est présente, un antalgique déterminé par le service vétérinaire pourra être administré. Des points limites sont mis en place, si un des points limites est atteint la mise à mort de l'animal pourra être envisagée afin d'éviter toute souffrance. Afin d’éviter toute perte de sang excessive (hémorragie), le site de ponction sera comprimé avec un hémostatique local (Coalgan ou équivalent préconisé par notre service vétérinaire) afin d’atteindre l’hémostase. Le phénotype étant dommageable (thrombopénie), les animaux recevront des soins appropriés notamment en cas de blessures. En cas de bagarres récurrentes, les animaux seront séparés pour éviter les blessures. Les animaux homozygotes ne seront pas croisés afin d'éviter les mises bas pour les mêmes raisons.

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons du modèle porteur de modifications génétiques sur le gène d'intérêt. Le modèle de souris est notamment très utilisé pour étudier les fonctions immunitaires, où un large panel d’outils d’analyse est disponible. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. En particulier, les systèmes immunitaires chez l’humain et chez la souris ont de nombreuses similitudes (réponse innée et adaptative, même protéines exprimées…). Le prélèvement sera réalisé sur les animaux au plus tôt à 6 semaines et au plus tard à 9 mois car c'est un âge compatible avec un prélèvement sanguin suffisant pour effectuer les analyses. Plus tardivement, le phénotype dommageable pourrait entrainer des effets importants. A ce stade, le système immunitaire est mature.