Troubles urogénitaux

588 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection d'anticorps déclenchant une maladie rénale, des injections répétées et des prélèvements sanguins, dont des prélèvements dans l'orbite de l'œil que le porteur reconnaît associés à un risque de lésions oculaires. Il fixe comme points limites une perte de poids importante et des saignements urinaires, déclenchant la mise à mort. Il affirme que les conditions de circulation sanguine ne peuvent être reproduites in vitro, les biopsies humaines étant rares et limitées.

Objectifs

Les vascularites humaines (maladies inflammatoires des petits vaisseaux sanguins) sont associées avec le développement de maladies rénales. Celles-ci sont induites par des anticorps dirigés contre les petits vaisseaux du rein et provoquent des lésions, de l'inflammation, de l'activation des plaquettes et le remodelage du tissue. La chronicité de cette lésion vasculaire rénale provoque une perturbation des fonctions rénales (insuffisance rénale), et peut nécessiter une greffe d'organe pour remplacer le rein défaillant. Nous avons montré récemment que l'inflammation rénale provoque la production de molécules qui stimulent la production de plaquettes et de cellules immunitaires dans la moelle osseuse. Les objectifs de ce projet sont : 1/de comprendre quelles molécules stimulent la production de plaquettes et de cellules immunitaires au cours de la maladie. 2/ d'identifier les cellules immunitaires qui participent à l'inflammation rénale au cours de la maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont multiples : 1- mieux comprendre le rôle de l'inflammation dans la maladie rénale. 2- cibler l'inflammation pour prévenir le développement de la maladie rénale et améliorer la santé des patients. 3- Proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le développement de médicaments plus spécifiques ayant moins d'effets secondaires.

Procédures

Nous effectuerons des prélèvements d'urines à l'aide d'un dispositif de collecte (pendant la nuit) permettant de ne pas changer les animaux d'environnement (adaptation à la cage), et les animaux recevront une injection de liquide contenant les anticorps dans une veine (5 minutes); cette injection se fera au niveau de la queue sur animal vigile. 3 injections dans l'abdomen seront effectuées par semaine, pendant 2 semaines (3 x 2 minutes) pour les traitements pharmacologiques. Des prélèvements sanguins sous anesthésie seront effectués sur une période de 3 semaines (3 prélèvements, 5 min par prélèvement). Les prélèvements seront effectués sous l'oeil . Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de chaque procédure afin d'étudier les organes d'intérêts avec différentes techniques.

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental a un effet modéré sur le bien-être de l'animal. Une injection en intraveineuse de sérum contenant les anticorps qui induisent la maladie sera réalisée à la veine caudale sur animaux vigils. La collection d'urine se fera sur la nuit, pendant une période de temps restreinte (

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour une utilisation post-mortem (prélèvement d'organes).

Remplacement

Les pièces opératoires (biopsies rénales) chez l’homme sont limitées en nombre et en nature (petite quantité de tissue, une seule biopsie/patient). De plus, l'étude des facteurs de croissances produits par le rein et agissant sur la moelle osseuse, et l'étude du role des cellules immunitaires pendant la maladie rénale nécessite la présence des conditions mécaniques et fluidiques caractéristiques de la circulation. Ces conditions ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux au strict minimum, tout en garantissant l'obtention de résultats fiables, une étude statistique a permis de determiner que 12 animaux/groupe seraient necessaire pour obtenir une différence significative entre 2 groupes. Pour confirmer ces résultats, une étude cinétique sera effectuée par la suite, et nécessitera 5 animaux/groupe.

Raffinement

Pour prévenir la souffrance et détecter les points limites les animaux seront pesés et observés de façon journalière, du lundi au vendredi (suivi de poids). Si douleur avérée un analgésique sera injecté jusqu'à la disparition des signes de douleur. Ce modèle de maladie rénale est caractérisé par une perte d’appétit, une réduction de l'activité et du sang dans les urines. Les points limites que nous avons identifiés sont: une perte de poids importante, et des saignements urinaires associés à une réduction importante du nombre de globules rouges circulants. Pour prévenir l’apparition de ces signes, plusieurs approches sont en place: nourriture humidifiée dans la cage, injection de liquide pour hydrater, mesure des fonctions rénales (bandelettes urinaires) et prélèvement de sang pour évaluer le nombre de globules rouges. L'atteinte des points limites entrainera la mise à mort des animaux. Une phase d'habituation aux insert de collection d'urine sera effectuée la semaine précédant l'induction de la maladie afin de réduire le stress des animaux. Afin de réduire l'angoisse, les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie. Afin de prévenir la douleur, les prélèvements sanguins seront effectués en alternant les sites de prélèvements. Conditions d'hébergement: les animaux ont accès à la nourriture/eau ad libitum, alternance jour/nuit (12h/12h), accès à du matériel pour se nicher (coton, petite maison en plastique), litière classique, en portoir ventillé (système Techniplast). Lors de la collection d'urine, les animaux seront placés dans un système adapté aux cages d'hébergement, pendant la nuit, avec accès à de la nourriture/eau sous forme de gelée (CLEARH2O). Les animaux sont replacés dans leur environement après chaque periode de collection.

Choix des espèces

Les modèles murins de maladie rénale induits par des anticorps sont préférables aux modèles utilisant d'autres animaux dans le cas de ce projet car : - Ce modèle est déjà en place dans le laboratoire et maitrisé. -Les outils pour étudier ce modèle murin sont aussi maitrisés au laboratoire, en particulier les anticorps neutralisants et capable de supprimer les cellules immunitaires in vivo. -Nous avons montré avec ce modèle que la production de plaquettes et de cellules immunitaires contribuent au développement de la maladie rénale. Chez l'Homme, cette maladie se développe chez l'adulte, donc nous utiliserons des souris adultes.

4 576 rongeurs, 2 288 souris et 2 288 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour induire une infertilité, une partie des animaux subit une hyperthermie du scrotum par immersion de l'arrière-train dans une eau à 43 °C pendant vingt minutes, jusqu'à quinze fois, sous anesthésies répétées, tandis que d'autres reçoivent de l'acyline, puis tous des candidats médicaments et des prises de sang. Le porteur reconnaît tester des molécules de clients dont il ignore la nature et les effets secondaires, et signale des bagarres entre mâles pouvant les blesser. Il conclut que ces modèles d'infertilité rendent le recours à l'animal "incontournable", aucune méthode in vitro ne reproduisant la production de sperme et son contrôle hormonal.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur des modèles d’infertilité masculine chez le rongeur. L’infertilité masculine joue un rôle très important dans le couple infertile, car environ 30% des problèmes liés à la grossesse correspondent à un facteur masculin. La plupart du temps, l'homme infertile présente une faible qualité séminale, ce qui signifie que son sperme n'a pas la capacité suffisante pour féconder l'ovule. L’azoospermie, caractérisée par une absence totale de spermatozoïdes dans l’éjaculat ou l’oligospermie, caractérisée, quant à elle, par une concentration en spermatozoïdes insuffisante dans le sperme conduisent à une infertilité masculine. Pour mimer une infertilité masculine en jouant sur la spermatogénèse, le modèle d’hyperthermie scrotale est décrit dans la littérature chez la souris. Ce modèle consiste à tremper dans le l’eau chaude la partie basse de l’animal (pattes arrières, queue, scrotum) pour créer une hyperthermie scrotale et ainsi altérer la spermatogénèse. Une administration hormonale sera réalisée afin de réverser l’infertilité et induire une réactivation de la spermatogénèse. L'hypogonadisme, autre pathologie provoquant une infertilité masculine, est défini par une synthèse insuffisante des hormones sexuelles (d'origine testiculaire telle que la testostérone). Pour mimer cette pathologie, l’administration d’acyline est décrite dans la littérature chez le rat.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints d’infertilité.

Procédures

Les animaux du modèle hyperthermie seront anesthésiés et la partie basse de leur corps (pattes arrière, queue et scrotum) sera trempée dans le l’eau chaude à 43°C pendant 20 min, et ce plusieurs fois par semaine (15 fois au maximum en tout). Ils recevront également des traitements de candidats médicaments et d’hormones pour restimuler la spermatogénèse (voie d’administration et fréquence dépendantes de chaque protocole). Les animaux du modèle acyline recevront uniquement des traitements de candidats médicaments et d’hormones (voie d’administration et fréquence dépendantes de chaque protocole). Tous ces animaux pourront également avoir des prélèvements sanguins (en terminal ou prélèvements intermédiaires). De plus, des animaux utilisés uniquement pour des études de pharmacocinétique recevront des administrations de candidats médicament, d’hormones et auront des prélèvements sanguins à des temps précis dépendants du protocole expérimental.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possible, il nous ait, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux liées à ces produits. Toutefois, des manipulations, administrations répétées sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille), un hématome possible selon la voie d’administration. De plus, les animaux vont subir plusieurs anesthésies répétitives pour le modèle d’hyperthermie scrotale (procédure 1) et être en partie immergés dans de l’eau à 43°C. Toutes ces séries successives peuvent provoquer un stress à l’animal, une nuisance physiologique respiratoire ou cardiaque dues aux successions d’anesthésies. De ce fait, une attention particulière des animaux sera observée lors des sessions d’hyperthermie scrotale et pendant les phases d’endormissement et de réveil. Les animaux étant des mâles, des bagarres peuvent facilement intervenir selon la hiérarchie dans les cages, pouvant stresser, voire blesser certains d’entre eux. Les plaies possibles seront désinfectées avec de la vétédine et les animaux seront séparés si nécessaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de l’infertilité masculine. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En effet, aucun de ces modèles ne peuvent mimer la fertilité masculine (production de sperme, viabilité des spermatozoïdes) en tenant compte des différents organes intervenants et des différentes hormones pouvant intervenir sur les différents paramètres observés, sachant que le paramètre hormonal est primordial pour cette pathologie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Le modèle d’infertilité par hyperthermie scrotale se faisant sous anesthésie, cela permet de réduire la douleur et le stress chez l’animal. D’après notre expérience sur les modèles in vivo, un nombre minimum de 8 animaux par groupe est le minimum nécessaire pour avoir des résultats statistiquement différents. Un premier test sur quelques animaux (8 maximum) pourra être réalisé comme « étude pilote » afin d’évaluer la faisabilité technique du modèle (surtout pour l’hyperthermie scrotale et le prélèvement de sperme). De plus, ce premier test pourrait être fait sur des animaux issus d’autres projets et non euthanasiés à la fin, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Ce projet étant nouveau, il nous semble que 3 études par an soit une estimation raisonnable par rapport à nos autres modèles et aux demandes de nos clients.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Après chaque anesthésie, une attention particulière sera apportée lors du réveil de l’animal. Un contrôle de la température de l’eau (utilisation de matériel type bain-marie thermostaté) sera effectué lors de chaque expérimentation. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris ou du rat dans les modèles d’infertilité sont très bien décrits dans la littérature. Chaque modèle peut être extrapolé aux deux espèces. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7-8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.

150 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en cinquante protocoles de trois animaux, ils reçoivent une injection sous-cutanée d'antigène couplé à l'adjuvant complet de Freund puis trois prélèvements de sang, avant mise à mort à dix jours, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur reconnaît que l'injection peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et un inconfort. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et présente la production sur animal vivant comme "indispensable", au service d'une activité commerciale répondant aux "besoins" des laboratoires.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole envisagé est particulier, car il vise à récupérer uniquement les anticorps générés lors d'une réponse primaire. Par conséquent, la procédure expérimentale est plus courte que des protocoles classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et ne nécessitera qu'une seule injection. Les anticorps seront récupérés à l'aide de prélèvement d'échantillons de sang, dont les volumes seront adaptés au poids de l'animal en suivant des recommandations. Le protocole durera 10 jours, ce qui est plus court que les protocoles classiques de 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une subtsance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 50 protocoles sont envisagés.

Procédures

1 injection en sous cutanée de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 2% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J10.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquilisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

894 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles sont mises en reproduction, échographiées chaque semaine sous anesthésie puis isolées en cage individuelle jusqu'à la mise bas sous surveillance vidéo, et une soixantaine subit un prélèvement sanguin et une amniocentèse avant d'être tuée, pour repérer les régions chromosomiques liées à la durée de gestation. Le porteur ne déclare comme atteinte que le stress lié à la manipulation et à l'isolement, alors que l'effectif dépasse largement les animaux décrits dans les procédures. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut étudier cette question.

Objectifs

Les anomalies de la durée de la gestation compliquent plus d’un quart des grossesses dans l’espèce humaine. La prématurité est la première cause de morbi-mortalités périnatales et dans les premières années de vie, et de handicaps dans la petite enfance. Le dépassement du terme est associé à une incidence accrue de mortinatalité ou de décès néonatal et de dysmaturité fœtale, ainsi qu’un taux accru d’accouchements par césarienne qui sont associés à un risque plus élevé de morbidité maternelle aiguë sévère. Chez la souris, les lignées de laboratoires présentent des différences de durée de gestation qui sont génétiquement fixées. Nous utiliserons deux souches consanguines murines (FVB/N et Balb/c) montrant plus de 30h d’écart dans la durée de gestation pour identifier des régions chromosomiques affectant la durée de la gestation. Nous obtiendrons également des données de l’expression des gènes à l’interface fœto-maternelle chez les cas les plus extrêmes avec des technologies de dernière génération. La combinaison de ces deux analyses et la puissance de la génétique de la souris ouvrent la possibilité d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans le déterminisme de la durée de la gestation, question non résolue actuellement dans de nombreuses espèces de mammifères, incluant l’espèce humaine.

Bénéfices attendus

L’étude des déterminants génétiques de la durée de la gestation chez la souris nous permettra de mieux connaitre les mécanismes de la cascade de la parturition. Une meilleure connaissance de ces mécanismes pourrait permettre d’identifier des déterminants du déclenchement du travail dans l’espèce humaine et de mieux comprendre la physiologie de l’accouchement à terme et la physiologie de l’accouchement prématuré.

Procédures

Toutes les souris (414 souris) : - seront mises en accouplement - auront une échographie par semaine pour la détection de la gestation (deux fois pendant la gestation). Pour cet acte, les souris seront sous anesthésie générale et rechauffée par une platine chauffante. La durée de l’échographie est d’environ 5 minutes. - seront mises seules dans un cage si elles sont gestantes, dans la mesure où nous avons besoin de connaître précisément la durée de gestation de chaque femelle. Une surveillance vidéo en continu (Infra-rouge, non invasive) de la cage permettra de dater précisément la mise bas. Les souris seront isolées dès le diagnostic de gestation par échographie et jusqu’à la mise bas. Pour quelques souris seulement (60 souris): En fin de gestation, un unique prélèvement sanguin (200μl prélevés à la veine sous-mandibulaire avec une lancette, ainsi qu’un unique prélèvement de liquide amniotique (amniocentèse) seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie, avant la mise à mort. L'analgésie se fera par injection d'un traitement antidouleur. L'injection dure quelques secondes et les effets antidouleurs plusieurs minutes. Le prélevement sanguins durent moins d'une minute et le prélèvement de liquide amniotique dure environ 1 minute par unité foeto-placentaire. Il est prévu un total de 15 minutes pour effectuer le prélèvement sanguin et le prélèvement de liquide amniotique

Impact sur les animaux

Stress potentiel due à la manipulation et à l’isolement.

Devenir

Mise à mort des animaux en fin de procédure afin de limiter la souffrance animale potentielle.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle alternatif (organoïde, culture cellulaire) pour étudier la durée de la gestation et ses déterminants génétiques.

Réduction

Utilisation de croisement de différentes lignées de souris dont le fonds génétique est stable. Utilisation de l’échographie pour le suivi de gestation qui permet de détecter les gestations de façon précoce et de diminuer le nombre d’animaux à utiliser dans la phase d’élevage. Les gestations courtes et le fait qu’il y ait une dizaine de petits par portée permet de réduire aussi le nombre de croisement nécessaire pour obtenir les effectifs nécessaires pour les études statistiques. Les données de la littérature permettent de réduire le nombre d’animaux pour la deuxième génération. Des tests statistiques seront réalisés pour analyser les données et ont été utilisés pour ajuster le nombre minimal d'animaux nécessaires.

Raffinement

Les animaux disposent de rouleaux de cartons et du coton compacté comme enrichissement. Les femelles gestantes sont surveillées en continu par des cameras infrarouges. Les échographies sont réalisées sous anesthésie générale. Les souris endormies sont placées sur une plaque chauffante et leur température sera surveillée pendant toute la durée de l'échographie (durée de 5 minutes). Un traitement antidouleur sera administré avant le prélèvement sanguin et de liquide amniotique.

Choix des espèces

Une meilleure connaissance du déclenchement du travail permettrait de mieux prédire, voire de contrôler l'accouchement, afin de limiter la prématurité. Une des difficultés d'étude cette question dans l’espèce humaine est l'impossibilité pratique d'établir le moment exact de la parturition et ainsi d'effectuer des études longitudinales chez la femme. Nous pouvons lever cette barrière en utilisant des modèles de souris, où nous pouvons surveiller avec précision la progression de la gestation à l'aide de mesures par échographie et prédire et enregistrer l'accouchement. Des composants de la cascade de la mise en travail et de l'accouchement sont partagés chez la souris et l'homme, comme l’inflammation sans infection, dont l’origine est inconnue. De plus, la durée de gestation est génétiquement déterminée dans les souches consanguines, ce qui favorise l'étude de la génétique chez la souris. Nous utiliserons des souris sexuellement matures, à savoir dès 8 semaines de vie.

200 chiens, cochons et moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements sanguins et des chirurgies d'implantation de dispositifs urologiques pouvant durer plusieurs heures sous anesthésie, avant une mise à mort suivie de nécropsie et d'examen des tissus. Le porteur décrit des suites post-opératoires douloureuses pouvant durer plusieurs jours selon l'invasivité. Il affirme que l'expérimentation sur "organisme entier" est "incontournable" et relève d'une "obligation règlementaire" pour valider ces dispositifs implantables.

Objectifs

La chirurgie uro-néphrologique s’est développée rapidement dans la deuxième moitié du XXème siècle avec par exemple l’avènement de la transplantation rénale (années 60-70), ou encore de l’hémodialyse (années 50-60) permettant de sauver des millions de personnes par an, le développement de nouvelles technologies comme les circuits extracorporels avec filtre de dialyse permettant la déviation du sang vers un filtre externe et ainsi sa purification artificielle. Il est possible dès lors de pallier des dysfonctions importantes du rein par exemple. De même, le traitement des affections prostatiques, tumorales par exemple a fait des progrès immense grâce par exemple à l’avènement de techniques chirurgicales peu invasives. Les progrès diagnostiques et thérapeutiques se développent rapidement pour l’ensemble des organes de l’appareil urinaire et ses annexes. L’évaluation et le développement de nouvelles méthodes, molécules, dispositifs et techniques pour les affections de l’appareil urinaire et ses annexes par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives nécessitent une phase de recherche pré-clinique et développement qui permet de mettre au point ces méthodes et d’en vérifier leur sécurité. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. Jusqu'à une dizaine de dispositifs pourront être évalués dans ce projet. Les différentes versions de prototypes doivent être confrontées à la modélisation animale pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis elles entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - les suites postopératoires (inflammation, douleur : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), pour cela des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple la protection des plaies, l'usage de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients humains représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, une analgésie est mise en place et des protocoles de prise en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (AINS et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être de tous les stades de développement : juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous anesthésie une pompe diffusant de l'angiotensine II pendant quatre semaines, avec des administrations répétées de molécules candidates et des prélèvements sanguins, pour tester des composés censés freiner la fibrose rénale. Le porteur indique que l'hypertension provoquée peut évoluer vers une insuffisance rénale, avec polyurie et déshydratation, et que les reins sont prélevés après mise à mort. Il conclut que les tests sans animaux ne reflètent pas la complexité de l'organisme et que le modèle animal reste "indispensable".

Objectifs

La fibrose est un problème de santé publique affectant des millions de personnes à travers le monde. La fibrose n’est pas une maladie, mais elle se développe le plus souvent suite à un processus inflammatoire marqué. Elle se caractérise par le remplacement d’un tissu parenchymateux par du tissu connectif et la formation d’un tissu cicatriciel épaissi qui affecte de façon plus ou moins importante la fonction initiale de l’organe atteint. La fibrose peut impacter différents types de tissus parmi lesquels les poumons, le foie, le cœur ou encore les reins. Le vieillissement de la population et l’augmentation du nombre de patients atteints de diabètes ou d’hypertension entraînent une forte accélération de l’incidence des néphropathies menant à l’insuffisance rénale. Quelle qu’en soit l’origine, la majorité des atteintes rénales aboutissent au développement d’une fibrose tubulo-interstitielle dont la présence signe l’évolution vers la perte de la fonction rénale. La fibrose rénale représente le trait histologique commun des néphropathies associées à une insuffisance rénale chronique évolutive. Comprendre et lutter contre le développement de la fibrose représente ainsi un enjeu scientifique et médical de la plus grande importance. Il n’existe pas actuellement de médicament dont les effets anti-fibrosants soient clairement démontrés au niveau rénal chez l’homme. Ainsi le présent projet aura pour objectif d'évaluer l’efficacité préclinique de candidats médicaments susceptibles de lutter contre l’inflammation et la fibrose dans un modèle d’hypertension et de l'insuffisance/fibrose rénale induits par la perfusion d’angiotensine II chez la souris.

Bénéfices attendus

La fibrose rénale est un problème de santé publique. A l'heure actuelle il n'existe pas de traitements médicamenteux et les patients sont soignés par des thérapies lourdes que sont la dialyse et la transplantation. Ce projet permettra d'évaluer l’activité anti-fibrotique et/ou anti-inflammatoire de substances en développement qui pourraient trouver un intérêt dans le traitement de la fibrose rénale chez l’homme, réduisant ainsi les prises en charges lourdes utilisées actuellement.

Procédures

Les animaux sont anesthésiés transitoirement (la procédure ne dure que quelques minutes) pour être implantés avec un dispositif sous-cutané (pompe osmotique) permettant la perfusion d’une solution d’angiotensine II pendant 4 semaines. Les substances-test peuvent être administrées par bolus (la procédure ne dure que quelques secondes).. Les administrations peuvent être uniques ou le plus souvent répétées pendant plusieurs jours ou plusieurs semaines, et cela en fonction de l’objectif de l’étude. Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang (nombre limité au strict minimum selon les besoins de l'étude) peuvent être réalisés sous anesthésie (la durée de la procédure de prélèvement est d’environ 30 secondes).

Impact sur les animaux

Dans ce type de procédure, il est attendu une hypertension artérielle évoluant à terme vers une insuffisance rénale. Les symptômes peuvent comprendre une polyurie et une déshydratation malgré une augmentation de la consommation d’eau. Les phases d’induction de l’anesthésie et de réveil peuvent être source de stress ou d’inconfort pour l’animal, tout comme les phases de contentions nécessaires aux administrations substances (antalgique en post-chirurgie, produit test).

Devenir

Dans la procédure, les animaux sont euthanasiés, le prélèvement des reins (pour analyses) ne permettant pas le réveil et le maintien en vie.

Remplacement

Dans le cadre du développement des médicaments testés, de nombreux tests ex vivo, in vitro et in silico, ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substance à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité de l’environnement biologique et du système endocrinien chez l’Homme. De même, il n'est pas possible de prédire les effets secondaires des substances utilisées. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif de 8-12 animaux en standard par groupe (nombre d'animaux et groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Si à la suite des premiers essais, il est montrer (par une approche statistique) que les données permettent de diminuer le nombre d’animaux sans impacter la fiabilité des résultats, alors une décision sera prise en ce sens. Par ailleurs, en plus des organes cibles (reins) de ce modèle, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant l'euthanasie précoce de tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.

Choix des espèces

Aujourd’hui encore, les rongeurs (souris) demeurent essentiels pour étudier les fibroses. Le modèle proposé dans ce projet est bien décrit dans la littérature scientifique . Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, soit jeunes (il est notamment prévu de commencer les études autour de l'âge de 2-4 mois), soit agés (jusqu'à environ 18 mois) car l'apparition de la fibrose rénale dans ce modèle est décrite comme de plus en plus importantes avec l'âge.