Troubles urogénitaux

216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les souris traitées étant tuées et les non traitées et leurs petits réutilisés. Des souris saines reçoivent une à trois injections d'anticorps dirigés contre des peptides de la fertilité, puis sont accouplées en trios pour mesurer le nombre de portées et de nouveau-nés. Le porteur indique que les injections intraveineuses peuvent provoquer saignement, inflammation, voire une opacification avec cécité. Il affirme que seul un "organisme complexe" comme la souris permet de prouver l'effet de ces anticorps, produits pour explorer un lien supposé entre Covid-19 et troubles de la fertilité.

Objectifs

Les agents infectieux jouent un rôle majeur dans la physiopathologie des maladies auto-immunes et ce par divers mécanismes dont le plus important est le mimétisme moléculaire consistant à déclencher une réactivité auto-immune lorsque l’agent pathogène et l’antigène tissulaire humain sont structurellement similaires(1). L'épidémie de COVID-19 a incité les immunologistes, à étudier l'impact de l'infection par le SARS-CoV-2 sur la population humaine mondiale. La préoccupation est de savoir si l'infection peut déclencher une auto-immunité par le biais d'une réactivité croisée. Les anticorps formés contre le SARS-CoV-2 se lieraient aux protéines des tissus humains partageant des séquences communes avec la protéine SPIKE, entraînant une réactivité auto-immune. Pour exemple, plusieurs études ont indiqué que les patients atteints de COVID-19 produisent des auto-anticorps et qu'une partie d'entre eux développent des troubles auto-immuns pouvant par exemple conduire à une altération de la spermatogenèse et notamment de l'étape de spermiogénèse nécessaire à la maturation des spermatozoïdes . Une première analyse in-silico a permis d'identifier 4 peptides liés à la spermatogénèse qui partageaient au moins 5 acides aminés communs avec la protéine Spike du SARS-CoV-2. Nous avons découvert que les patients infectés par la COVID-19 développaient des anticorps contre 2 peptides (peptide A et B dans l'étude) impliqués dans la spermiogénèse. Une analyse biochimique a prouvé que les anticorps anti-Spike S du virus Sars-COV2 peuvent reconnaitre les deux peptides A et B liés à la spermatogenèse chez les hommes mais également chez les femmes affectés par la COVID-19. Ce résultat indique l'apparition possible de nouveaux troubles de la fertilité et féconditité dans la population. Pour aller plus loin dans cette étude, nous avons produit des anticorps murins de sous-classe IgG réagissant avec les peptides A et B en immunisant des souris saines contre ces peptides. Le but de ce projet est d’évaluer la pathogénicité de ces anticorps en les administrant à des souris mâles et femelles saines et en déterminant leur effet sur la fertilité (nombre de portées) et la féconditité (nombre de nouveaux-nés)..

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet auront un impact à la fois sur la communauté scientifique et sur l'ensemble de la population. Cette étude permet de mieux comprendre les effets de l'infection par le SARS-Cov-2 sur les humains, en particulier la pathogénicité d'auto-anticorps sur le système reproducteur.

Procédures

Les souris mâles et femelles recevront 1 à 3 injections maximum d’une durée de 2 minutes chacune sur animal vigile ou anesthésié. L'accouplement est composé d'un trio : 1 mâle et 2 femelles. Temp d'accouplement 12 heures.

Impact sur les animaux

L'administration dans la cavité abdominale peut induire une inflammation, une induration, un hématome ou une infection de la cavité péritonéale et l'administration Intra-veineuse peut induire un un saignement, une inflammation, une infection ou une opacification avec cécitéselon que l'animal recevra une injection ou au maximum 3. Ces injections pourront induire une douleur légère transitoire si réalisée une seule fois sur l'animal voire modérée transitoire si au maximum selon les résultats de l'étude pilote 3 injections devaient être réalisées.

Devenir

Tous les souris traitées seront mise à mort pour analyses ultérieures. Les souris non traitées et les souricaux seront réutilisés.

Remplacement

Le projet actuel représente la partie finale d'une étude plus étendue préalables visant l'identification des peptides partageant des identités de séquence avec la protéine Spike (S) du SARS-CoV-2 et les protéines liées à la spermatogenèse. Ensuite, elle a été suivie des studios dans les sérums des patients atteints de COVID-19 . Actuellement, le seul modèle disponible pour prouver le rôle des anticorps anti-peptides sur le système reproducteur est un organisme complexe comme le modèle murin. Aujourd'hui, notre objectif ne peut pas être atteint en utilisant des modèles cellulaires artificiels. Le modèle murin représente la meilleure stratégie pour générer des données qui peuvent avoir un impact translationnel futur pour l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux dans le projet est évalué selon les calculs de puissance visant à réduire l'utilisation d'animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats biologiquement valides et significatifs pour les objectifs de cette étude.

Raffinement

Nous avons établi des points-limites qui permettent de soustraire l'animal à la souffrance sur la bse d'une grille de score permettant d'évaluer l'état de santé des animaux ainsiq ue la douleur. L'injection intra-veineuse est réalisée sous anesthésie. Afin de réduire la douleur, une goutte d'anti-douleur sera ajoutée après l'injection. Les souris sont logées en groupe social et chaque cage sera équipée de matériaux de nidification pour que les mères puissent construire le nid et d'un bâton à ronger.

Choix des espèces

Les souris ont un génome très proche de celui de l'homme et elles développent des pathologies similaires à celles observées chez l'homme. De plus, le modèle murin a un taux de reproduction élevé permettant d'obtenir rapidement des résultats. Les souris CD1 sont utilisées à l'âge de 6-8 semaines après avoir atteint leur maturité sexuelle.

750 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à trois anesthésies, deux laparotomies dont l'une pour léser le nerf des corps caverneux et poser des électrodes, ainsi que la pose de cathéters dans l'aorte et le pénis pour mesurer des pressions. La dernière anesthésie, irréversible, est menée sans réveil et dure jusqu'à trois heures, avant la mort et le prélèvement d'organes. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne reproduit la dysfonction érectile dans sa complexité et conclut au caractère incontournable de l'expérimentation animale.

Objectifs

Après 40 ans, un homme sur trois a des troubles de l’érection, pouvant avoir une incidence sur la qualité de vie des patients. La dysfonction érectile (DE) est un symptôme sentinelle des maladies cardio-vasculaires mais peut être également due à des traumatismes (chirurgicaux ou accident). Les traitements actuels présentent soit des contre-indications importantes soit des contraintes d’utilisation et/ou de prescription, d’où l’importance de développer de nouveaux candidats médicaments sur différents types de modèles. L’érection est une fonction complexe faisant intervenir des mécanismes vasculaires, musculaires et nerveux. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de candidats médicaments dans un modèle de dysfonction érectile chez le rat mâle anesthésié.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de dysfonction érectile.

Procédures

Les animaux subiront : - 3 anesthésies au maximum (2 gazeuses qui vont durer 15-20 min et 1 fixe sans réveil qui va durer jusqu’à 3 heures), - 2 chirurgies (1 laparotomie pour la lésion du nerf des corps caverneux qui va durer 20-30 min selon les expérimentateurs, 1 laparotomie pour installation d’électrodes au niveau des nerf du corps caverneux qui va durer 1 heure). - L’administration des composés à tester pourra se faire sous anesthésie gazeuse pour l’administration dans les corps caverneux (directement via le pénis, anesthésie de 20 min) ou via des voies plus classiques (i.p., s.c….). Les gestes étant réalisés par du personnel qualifié, les administrations de composés, d’antalgiques ne dureront que quelques secondes. De plus des cathéters seront implantés dans l’aorte carotide et dans le pénis au niveau du corps caverneux afin de mesurer des pressions. Le dernier acte fait sur l’animal est sans réveil pour l’animal.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Cependant, les animaux vont être manipulés, ce qui d’une part peut engendrer un stress, une nuisance, une douleur. Les animaux vont également subir 1 laparotomie sous anesthésie gazeuse pouvant induire une gêne post-opératoire. L’administration du produit à tester pouvant se faire sous anesthésie gazeuse (pour l’administration dans les corps caverneux par exemple), cette succession d’anesthésie pour induire une nuisance à l’animal. De plus, une troisième anesthésie sans réveil sera réalisée pour l’évaluation de l’effet des candidats médicaments avant l’euthanasie de l’animal (ceci ne devant pas conduire à des nuisances particulières) à part la douleur de l’aiguille pour l’administration intrapéritonéale de l’anesthésiant).

Devenir

Les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure car l’anesthésique utilisé est irréversible et les animaux ne pourront pas se réveiller. De plus, des organes pourront être collectés à la fin de la procédure.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de la dysfonction érectile. Tous les traitements existants ont d’importants effets secondaires. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Le modèle de dysfonction érectile se faisant sous anesthésie, cela permet de réduire la douleur et le stress chez l’animal. Dans une étude classique, il y aura 5 groupes expérimentaux. Un nombre minimum de 15 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et interprétables.

Raffinement

Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux (tunnel, aspen brick…). L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Ce modèle est très bien décrit dans la littérature chez le rat. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.

1314 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une insuffisance rénale leur est induite par injection d'acide folique à forte dose, suivie d'administrations de molécules à tester, de séjours en cage à métabolisme et de prélèvements sanguins. Le porteur indique ignorer "ni la nature ni les effets secondaires" des molécules de clients qu'il évalue, et reconnaît une perte de poids et une baisse du volume urinaire. Il présente le recours aux rongeurs comme "incontournable", aucun modèle ne mimant selon lui la fibrose rénale.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur la transition de l’insuffisance rénale aiguë vers l’insuffisance rénale chronique et sur le développement de la fibrose rénale.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients présentant une insuffisance rénale.

Procédures

Les animaux subiront une injection intrapéritonéale d’acide folique et une administration de molécules à tester en total respect de la législation (voies, fréquence et durée dépendantes de chaque protocole expérimentale). Ils pourront également être mis dans des cages à métabolisme pour récolter de l’urine pendant 24 heures maximum. De plus, les animaux pourront être anesthésiés à l’isoflurane, afin d’attacher un capteur permettant la mesure du débit de filtration glomérulaire. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements de sang. Enfin, différents prélèvements pourront être réalisés sur l’animal post-mortem.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. De plus, toute manipulation de l’animal pour les traitements ou expérimentations peut provoquer un certain stress, désagrément, douleur qui seront minimiser par le fait que les expérimentateurs auront les formations et les compétences nécessaires pour réaliser tous les gestes expérimentaux. De plus, le modèle pathologique induisant une insuffisance rénale, les animaux pourront ressentir tous les effets indésirables de cette pathologie (perte de poids possible, volume urinaire diminué…).

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation car des prélèvements d’organes et des examens post-mortem pourront être réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de la fibrose rénale. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité (développement d’une fibrose rénale). Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

L’évaluation de l’effet de candidats médicaments sur l’insuffisance rénale se fera au cours du temps par des techniques non-invasives : mesure du poids, récolte urinaire par cage à métabolisme avec phase d’habituation à la cage pour limiter le stress, mesure du débit de filtration glomérulaire. De plus, une évaluation en basal (avant traitement) ainsi que des évaluations à différents temps pendant le traitement permettent pour chaque animal d'être son propre contrôle et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Toutefois, il est nécessaire de garder un groupe contrôle (sans la pathologie) afin de pouvoir le comparer avec un groupe pathologique afin de valider le modèle de l’étude. Une étude pilote préalable sur quelques animaux sera réalisée afin de mettre au point ce modèle. Aucun test statistique pour calculer le nombre d’animaux par groupe n’a été réalisé mais de par notre expérience et en tenant compte des études déjà publiées sur ce modèle, un nombre d’animaux par groupe de 15 pour la souris et 12 pour le rat est le minimum nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs, principalement due à la variabilité inter-individuelle des réponses étudiées. Tout geste expérimental sera réalisé par du personnel compétent et expérimenté, limitant ainsi le stress et la douleur possible lors de chaque manipulation des animaux.

Raffinement

L’état général des animaux sera observé tous les jours par du personnel qualifié permettant d’appliquer les points limites décrits dans les procédures (prostration, perte de poids importante, difficulté à se nourrir, se mouvoir…) et des critères d’arrêt des souffrances de l’animal. Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, différents types d’enrichissement pourront être ajoutés aux animaux (coton, aspen brick (bout de bois) ou igloo/tunnel en polycarbonate). Les procédures nécessitant une anesthésie seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin d'éviter une hypothermie à l'animal. Certaines expérimentations (récolte urinaire ou mesure de la filtration glomérulaire) nécessitent un isolement temporaire des animaux dans des cages individuelles. Toutefois, les animaux pourront voir leurs congénères du fait que toutes les cages sont transparentes. Si un animal présentait des symptômes de mal-être tels que perte de poids, poils hérissés, plaies, déshydratation, il serait soigné, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière et isolé si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h et que un des points limites était atteint, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Le modèle de pathologie rénale induite par une injection d’acide folique à forte dose est largement décrit dans la littérature chez le rongeur (souris et rat) Classiquement nous utiliserons des animaux matures sexuellement d’au moins 8 semaines car la fibrose rénale apparaît principalement chez l’adulte. Néanmoins cet âge pourra être amené à être modifié à la demande du client.

3 615 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections d'antigènes combinés à un adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund qui peut provoquer ulcérations et fièvre, puis des prises de sang répétées, à raison de deux lapins par protocole pour 1 590 protocoles. Il s'agit d'une production commerciale d'anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche publiques et privées, non d'une étude scientifique. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace pour cette production et écarte les banques d'anticorps existantes au nom du temps et du budget.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation de substances médicamenteuses. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 1590 protocoles sont envisagés.

Procédures

Injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) Prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

1 260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs sectionnent les deux nerfs caverneux sous anesthésie pour provoquer une dysfonction érectile, administrent des composés pendant une à douze semaines, puis mesurent l'érection par stimulation du nerf sous anesthésie. Le porteur reconnaît des risques de douleur, d'infection et d'inconfort liés aux chirurgies de l'abdomen, à la lésion nerveuse et aux prélèvements en cage à métabolisme. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer l'érection, résultat de l'interaction entre système nerveux et vaisseaux, ce qui imposerait le recours au rat.

Objectifs

La dysfonction érectile (DE) est définie comme l’incapacité à obtenir et ou à maintenir une érection suffisante pour l’accomplissement d’un rapport sexuel, de manière constante ou récurrente. La DE peut être psychogénique (médié par l’adrénaline), d’origine organique ou mixte. Les causes d’une DE organique sont nombreuses : neurogéniques (lésion de la moelle épinière, sclérose en plaques, maladie de Parkinson etc..), vasculaires (athérosclérose, hypertension artérielle, diabète etc…), iatrogéniques (suite à la prise de certains médicaments comme les béta-bloquants, certains antidépresseurs etc..) ou hormonales. Toutes les études ont montré une augmentation de l'apparition de la DE avec l’âge. En effet, la DE touche entre 1 et 9% des hommes de moins de 40 ans, et plus de la moitié des hommes de plus de 70 ans. La DE a des conséquences personnelles négatives telles que la frustration, soucis, souffrance psychologique et ou l’évitement de l’intimité sexuelle, ce qui occasionne une altération de la qualité de vie et des difficultés relationnelles dans le couple. Actuellement, différents traitements sont disponibles pour la DE, comme les comprimés de sildénafil (viagra) ou de vardenafil (Levitra), les injections dans l'urètre ou directement dans le corps caverneux du pénis d’alprostadil, les pompes à vide, la pose d’implant, ou plus récemment les thérapies par onde de choc. Cependant, ces traitements peuvent être inconfortables (nécessité de planifier l’acte sexuel, des injections invasives) ou contre-indiquées avec certains autres traitements (contre-indication entre la prise de sildénafil ou vardénafil avec les dérivés nitrés, ces derniers étant utilisés pour traiter l’angor). De plus, certains types de patients (diabétique, personne ayant eu une prostatectomie) répondent difficilement ou sont insensibles aux traitements actuels. Au final, il y a encore une forte proportion de patients avec une DE qui nécessite une alternative thérapeutique dans leur prise en charge. Ce projet s’inscrit donc dans le cadre du développement des traitements pharmacologiques pour la DE, ou dans la recherche d’un effet indésirable sur la fonction érectile d’un traitement médicamenteux.

Bénéfices attendus

La DE est une pathologie fortement liée à l’âge, ainsi l’allongement de l’espérance de vie augmente le nombre de personnes ayant une DE dans la population. Cependant, chez les patients souffrant de pathologies cardiovasculaires et ou métaboliques, la DE s’accompagne d’une résistance aux traitements thérapeutiques disponibles actuellement. De plus, il n’existe pas encore de traitement médicamenteux curatifs à la DE, en effet, les traitements médicamenteux actuels restent symptomatiques. La recherche de médicaments pour compléter l’arsenal thérapeutique actuel contre la DE est donc indispensable et reste active. Ce projet permettra de sélectionner les candidats médicaments efficaces dans le traitement de la DE et ou de discriminer ceux qui pourraient avoir un effet néfaste sur la fonction sexuelle. De même, ce projet donnera une preuve d’efficacité à un candidat médicament, dans un modèle animal standardisé, complétant les études précliniques règlementaires avant les essais chez l’homme.

Procédures

Les interventions que vont avoir les animaux sont : - L’induction du modèle de DE par lésion bilatérale du nerf caverneux chez le rat anesthésié. Cette procédure est réalisée une seule fois afin de mettre en place la DE, et l’opération dure environ une heure. Elle permet de mimer la lésion du nerf caverneux au cours d'une chirurgie de prostatectomie, sans réaliser la chirurgie. - Une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et de la molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 12 semaines). Tout type d’administration, réalisé par des personnels tutorés, dure moins d’une minute sur un animal vigile, et moins de 30 min sur un animal anesthésié. - Mesure de la fonction érectile suite à une chirurgie sur animal anesthésié: stimulation artificielle du nerf caverneux et mesure de l’augmentation de la pression intracaverneuse (signe de l’érection). Cette procédure est sans réveil, donc réalisée une fois par animal, et la mesure dure environ 2 heures incluant le temps de chirurgie. - Si le protocole le requiert, des prélèvements de sang et d’urines pourront être envisagés. Les prélèvements sanguins respecteront les normes en vigueur, limitant le volume inférieur à 10% du volume total sanguin de l’animal, et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours. Chaque prélèvement sanguin, réalisé par des personnels tutorés, durera moins de 3 minutes. Si le protocle le recquiert, des récoltes d'urine par isolement de l'animal dans un hébergement individuel peuvent être réalisés, à raison d'une fois par semaine au maximum, et l'isolement est inférieur à 24 heures. A noter que tous les animaux n’auront pas forcément toutes ces interventions. En effet, les interventions seront limitées selon leur pertinence et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont : - Les chirurgies de l'abdomen (pour réaliser les lésions nerveuses, les administrations intraprostatiques ou intracaverneuses, ou encore pour mesurer la fonction érectile) présentent des risques de douleur, d’infection et d’inconfort. - La lésion des nerfs caverneux pour créer la dysfonction érectile peut présenter des risques de douleur - L’administration du composé à tester qui nécessitera une contention, et l’implantation des pompes osmotiques peuvent entraîner des risques de stress et de douleur - Prélèvements de sang et d’urine en cage à métabolisme peuvent stresser l’animal. Les risques de douleur et d'infection sont pris en compte pendant le projet par l’utilisation des antalgiques et/ou antibiotiques. De plus, les personnels qualifiés et tutorés vont limiter le stress au maximum. A noter que tous les animaux ne vont pas forcément subir toutes les procédures dans la liste.

Devenir

Tous les animaux vont avoir au minimum un traitement par le composé à tester et des composés témoins. Ensuite, selon les paramètres à analyser, suite à des prélèvements d’organes, et ou de sang, et ou la mesure de la fonction érectile, les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés par un surdosage en anesthésique.

Remplacement

L’érection survient suite à une interrelation entre le système nerveux (centrale et périphérique) et différents types cellulaires, conduisant à cet afflux de sang au niveau du corps caverneux du pénis. Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant d’évaluer cette fonction et la sélection de candidat médicament efficace dans le traitement de la DE. De plus, la survenue d'une DE est la résultante de la dérégulation de plusieurs mécanismes physiologiques chez les diabétiques et les personnes atteintes d’une hypertension artérielle. Ainsi, la possibilité d’utiliser des souches de rats diabétiques et hypertendus est essentielle afin de sélectionner un candidat médicament efficace contre la DE associé à ces pathologies.

Réduction

Une analyse de puissance statistique a été réalisée afin de réduire au minimum le nombre de rats par groupe. La formule est n=1+2C (s/d)^2 pour calculer la taille du groupe pour des variables continues. D’après notre expérience suite aux expérimentations réalisées précédemment dans le laboratoire, le critère principal a une déviation standard (s) de 0,5. Afin de mettre en évidence un effet significatif, le produit d’intérêt devrait modifier ce critère de 0,75 par rapport au groupe contrôle (d). Avec une puissance (1-β) de 90% et un niveau de significativité (α) de 5%, la constante C correspond à 10.51. Ainsi, en reprenant la formule, le nombre de rats par groupe nécessaire pour l’étude est : n= 1+ 2*10.51*(0.5/0.75)^2 = 10,3. Notre expérience passée nous a permis de fixer la taille du groupe expérimental à n=12 rats afin d’obtenir des données interprétables pour 10 animaux/groupe avec les tests statistiques utilisés car 20% des données sont non interprétables, inhérentes aux difficultés techniques du modèle expérimental.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : - Les rats sont hébergés par 2 animaux par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. - Un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - L’induction de la DE par une lésion du nerf caverneux se fait sous analgésie et anesthésie générale. Un traitement antibiotique est aussi mis en place pour éviter toute complication infectieuse. - L’évaluation de la fonction érectile se fait sous analgésie et anesthésie générale et est sans réveil. A noter que toutes les procédures expérimentales ne seront pas forcément appliquées aux animaux. Les procédures expérimentales appliquées à chaque groupe de rats seront attribuées en fonction de leur pertinence (voir dans la description de chaque procédure) et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et notamment dans le domaine de la médecine sexuelle. L’organisation anatomique des organes participant à l’activité sexuelle ainsi que leur innervation sont comparables chez le rat et l’homme. De plus, les modèles pathophysiologies de diabète et d’hypertension artérielle présentant une dysfonction érectile ont été décrits chez le rat. Les animaux seront utilisés adulte, à partir de 7 semaines d’âge, en effet l’évaluation de la fonction érectile se fait forcément après la maturité sexuelle. Ce choix est justifié par la littérature scientifique.

75 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie par voie vaginale de trois à quatre heures pour l'implantation d'un filet, matrice biologique ovine ou prothèse synthétique, puis est gardé en vie de deux à six mois avant sa mise à mort et le prélèvement des organes du bassin. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer un non-réveil, des saignements abondants, des infections et des douleurs. Il justifie le recours à la brebis par la proximité anatomique de sa région pelvienne avec celle des femmes et par l'absence d'alternative in vitro reproduisant le système immunitaire.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’apporter des preuves expérimentales qu’un greffon de Matrice extracellulaire Assemblée par des Cellules (MAC) a le potentiel de devenir une solution chirurgicale alternative pertinente au traitement du Prolapsus des Organes Pelviens (POP). Une comparaison avec les traitements chirurgicaux standards actuels (prothèse synthétique ou chirurgie autologue) est donc essentielle. Nous proposons un nouveau paradigme qui repose sur l’utilisation d’un matériau complètement biologique qui n’est ni chimiquement ni autrement dénaturé tel que son ultrastructure, similaire à un tissu natif, soit préservée pour favoriser sa biointégration. Nous souhaitons montrer qu’un filet de MAC ovine peut être implanté avec succès dans un modèle de gros animal pertinent et allogénique. Pour cela, nous souhaitons évaluer le remodelage du filet de MAC, incluant sa stabilité mécanique et la réponse immunitaire (innée et adaptative) de l’hôte, dans la région urogénitale de brebis en comparaison avec une prothèse synthétique (Ex : Restorelle® de Coloplast Corp.). Les brebis seront opérées d’une cure de rectocèle (prolapsus du rectum) par voie vaginale. Une réparation de la paroi vaginale postérieure sera réalisée. Les greffons seront implantés entre le vagin, le péritoine pariétal et le rectum et fixés avec des sutures non résorbables. Notre hypothèse est que le greffon de MAC entraine moins de complications qu’une prothèse synthétique (réponse immunitaire moins importante, pas d’exposition et moins de contraction de la prothèse, etc.) démontrant ainsi la supériorité de ce matériau. Après euthanasie des animaux, les implants seront récupérés et des analyses mécaniques et histologiques à différents temps de suivi (2 et 6 mois) seront effectuées. Les temps de suivi de 2 et 6 mois ont été choisis car ce sont des temps classiquement décrits dans la littérature pour suivre l’évolution de prothèses implantées dans la région urogénitale de brebis permettant la comparaison des résultats obtenus. Cette première expérimentation permettra de montrer le potentiel clinique du greffon de MAC, c’est-à-dire valider si le filet de MAC présente des propriétés mécaniques suffisantes pour traiter le POP dans un modèle de gros animal. En effet, les données récoltées permettront la comparaison directe des greffons de MAC avec un traitement standard du POP en termes de stabilité mécanique, de réponse immunitaire, d’intégration tissulaire et de taux de complications.

Bénéfices attendus

Le Prolapsus des Organes Pelviens (POP), aussi appelé descente d’organe, est un problème médical important pour les femmes. On estime qu'1 femme sur 10 subira une intervention chirurgicale pour traiter un POP au cours de sa vie. Bien que des chirurgies autologues existent, c’est-à-dire qui utilisent les tissus de la patiente pour soutenir l’organe « descendant », elles ont été moins favorisées en raison de la disponibilité et de la commodité des prothèses synthétiques. De plus, ces prothèses synthétiques robustes et rigides permettent d’apporter un soutien mécanique plus durable que les chirurgies autologues (jusqu’à 3x moins de récidive). En revanche, depuis 2019, les prothèses synthétiques implantables par voie vaginale ont été retirées du marché dans de nombreux pays, comme la France, les Etats-Unis…, en raison d’un taux de complications élevé (douleurs, expositions, infections). Il existe donc un besoin médical et sociétal important pour des innovations. Cette étude permettra de sélectionner le procédé de création et de conditionnement des filets de Matrice extracellulaire Assemblée par des Cellules (MAC) les plus adaptés pour produire un greffon de MAC aux caractéristiques cliniques pertinentes pour traiter le POP. Les gains attendus par la nouvelle technologie à long terme sont les suivants : (1) Pour les patientes : cette approche biologique apportera une grande amélioration de leur qualité de vie en limitant les risques de complications et de récidives. (2) Pour la société : la réduction des complications/récidives bénéficiera économiquement au système de santé en évitant les coûts des réopérations.

Procédures

Une intervention chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée sur les animaux. Les brebis seront opérées d’une cure de rectocèle (prolapsus du rectum) par voie vaginale. Une réparation de la paroi vaginale postérieure sera réalisée. Nous prévoyons un temps d’intervention d’environ 3 à 4h sur chaque animal. Les brebis seront donc opérées 1 par 1 sur chaque demi-journée pendant 12 jours (non consécutifs). Chaque brebis recevra une condition expérimentale : un filet de matrice extracellulaire assemblée par des cellules ou une prothèse synthétique. Après réveil, les animaux seront gardés en vie sur des périodes différentes : 2 à 6 mois. Dans le cas où l’une des brebis ne se réveillerait pas suite à l’intervention, nous prévoyons un animal supplémentaire pour remplacer l’animal décédé (pour chaque lot). Aucun prélèvement n'est prévu.

Impact sur les animaux

Le transport et la chirurgie peuvent générer de l'angoisse. Les brebis seront transportées dans un véhicule adapté par deux afin de limiter l’isolement social. La durée du trajet est limitée (45 minutes maximum). Des risques de complications au cours de la chirurgie ou en post-opératoire peuvent être attendus comme : non-réveil de l'animal du fait de l'anesthésie, saignements (abondants), infections, constipations, douleur, souffrance et angoisse. La durée de ces nuisances ou effets indésirable sera réduite au maximum pour n’être que passagère en portant une attention particulière aux brebis tout au long du projet.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort (sauf les animaux supplémentaires prévus en cas de décès d’un animal à la suite de l’anesthésie et qui n’auraient donc pas été implantés) à l'issue de la procédure, les organes du bassin seront prélevés à des fins d'analyses histologiques.

Remplacement

Bien qu’un modèle humain puisse être largement étudié in vitro, son étude in vivo à long terme chez l’animal reste limitée. À ce jour, aucun système de modélisation ne peut suppléer à l'utilisation d'un modèle animal étant donné la complexité du système immunitaire. Des modèles animaux immunosupprimés, notamment souris ou rats, ne peuvent pas mimer l’anatomie ni la physiologie humaine car ils sont trop petits. Ces modèles permettent d’évaluer la prothèse implantée dans la région abdominale uniquement. Ainsi, le recours au modèle de gros animal permettra d’évaluer, à long terme, la réponse immunitaire innée de l’hôte combinée à la réponse immunitaire adaptative (indisponible chez les animaux immunosupprimés) dans un contexte de greffe allogénique et une région anatomique pertinente simulant les conditions cliniques.

Réduction

Au total, 75 brebis sont nécessaires (3 lots de 25 brebis). Chaque animal recevra un filet de Matrice extracellulaire Assemblée par des Cellules (MAC) ou une prothèse synthétique. Nos objectifs sont de démontrer l'implantabilité et l'intégration supérieure des greffons de MAC dans la paroi vaginale en comparaison avec une prothèse synthétique sur la base d'une observation directe (exposition et contraction de la prothèse) et d’une évaluation histologique du remodelage et de la réponse immunitaire (innée et adaptative). Nous souhaitons également montrer que les greffons de MAC possèdent des propriétés mécaniques suffisantes pour traiter le prolapsus des organes pelviens dans un modèle de gros animal (pas de récidive). Ces expérimentations sont conçues pour avoir recours à un nombre minimal d’animaux permettant l’obtention de résultats exploitables sur le plan statistique. D’après la littérature, nous avons sélectionné 6 brebis par groupe et par temps de suivi pour montrer une différence significative entre le filet de MAC et la prothèse synthétique standard, principalement au niveau des complications liées à l’implant (exposition et contraction de la prothèse) et de la réponse immunitaire. En effet, nous estimons la probabilité d’exposition prothétique avec une prothèse synthétique standard à environ 33%, 100% de cas de contraction de l’ordre de 30 à 50% pour les prothèses synthétiques avec, autour, des marqueurs de la réaction à corps étranger (cellules géantes à corps étranger). Nous attendons des résultats similaires. En revanche, nous n’attendons pas d’exposition avec le filet de MAC, ni de marqueurs de la réaction à corps étranger et moins de contraction du filet, ce qui démontrerait une grande supériorité de ce matériau. Selon la variabilité observée avec les premiers animaux, nous pourrons répéter l’expérience pour ajouter des animaux à l’étude. Ces expérimentations seront potentiellement effectuées jusqu’à 3 fois afin de confirmer certains résultats, de tester des conditions de production des greffons de MAC supplémentaires, ou ajouter une condition expérimentale (Ex : chirurgie autologue). Concernant l’analyse statistique, nous comparerons les résultats pour les échantillons non appariés avec le test t de Student.

Raffinement

Tout au long de l’expérimentation, une attention particulière visant à réduire douleurs, souffrance et angoisse chez les brebis sera apportée. La douleur, la souffrance et l’angoisse seront réduites par une prémédication et seront gérées par une anesthésie générale durant toute la procédure chirurgicale. Les paramètres vitaux seront suivis pendant l’intégralité de la chirurgie. Un protocole d’analgésie post opératoire prédéfini est réalisé pour chaque animal. En dehors de cette période, les animaux seront gérés par l’unité d’hébergement et de stabulation de l'établissement utilisateur (EU). Les animaux seront suivis dans des locaux agréés, avec du personnel dédié et expérimenté, et les périodes d’isolement limités au strict minimum nécessaire afin de réduire l’angoisse. Un suivi quotidien sera réalisé. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie pré, per et post- opératoire par admission d’antalgiques. Cependant, l’animal sera rapidement euthanasié (Pentobarbital sodique en IV pour l'euthanasie indiqué dans le paragraphe 3.3.3., soit 80 mg/kg) si : - le rythme cardiaque est >150 bpm ou 41°C ou < 32°C - une hémorragie importante est constatée. Les points limites identifiés se situent principalement au niveau de la phase longitudinale, lors de l’hébergement. • Perte d’appétit, anorexie • Altération du comportement, grincements de dents excessifs • Apathie, abattement • Position anormale ou prostration • Locomotion ou déplacements anormaux • Difficulté respiratoire • Auscultation et/ou examen cardiaque anormaux • Décubitus prolongé ou isolement • Hypovigilance ou hypervigilance anormale Si les premiers animaux présentent une défaillance des fonctions vitales dans les heures ou premiers jours qui suivent l’intervention, le protocole sera interrompu. Si l’état de santé d’un animal est concerné par l’un des points cités ci-dessus ainsi que par toute autre observation jugée anormale, un examen vétérinaire approfondi est réalisé et le responsable du projet est contacté par l’EU assurant l’hébergement pour définir la conduite à tenir (prescription d’un traitement médical adapté, examens complémentaires, etc.). Si l’état de santé est préoccupant, le vétérinaire de l’EU assurant l’hébergement et le responsable du projet décideront de l’euthanasie.

Choix des espèces

Le modèle ovin montre de grandes similitudes anatomiques avec l’humain au niveau de sa région pelvienne. De plus, il s’agit d’un modèle de prolapsus des organes pelviens bien établi dans la littérature. Par ailleurs, les cellules ovines sont les seules cellules qui ont permis d’obtenir des feuillets de Matrice extracellulaire Assemblée par des Cellules (MAC) similaires à ceux produits par les cellules humaines, en comparaison avec d’autres modèles animaux comme le chien et le cochon. L’espèce a donc été sélectionnée pour permettre l’étude de la réaction immunitaire et le remodelage des greffons de MAC par les cellules de l’hôte, implantés en tant qu’allogreffes. Nous souhaitons réaliser une cure du prolapsus. Pour que les brebis aient une descente d’organe, nous sélectionnerons des brebis âgées (≥ 5 ans) et grandes multipares (≥ 3 mises bas).