Troubles urogénitaux

18 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le ventre de chaque animal est divisé en quatre zones où sont implantées des prothèses résorbables et une prothèse de référence, suivies quatre mois, puis une seconde chirurgie retire les implants avant la mise à mort. Le porteur justifie ces opérations par la mise au point d'une prothèse contre le prolapsus génital féminin, bénéfice renvoyé à une avancée future. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de s'affranchir de l'animal et que le modèle animal reste la seule possibilité.

Objectifs

L'objectif est de mettre au point une prothèse pour traiter de façon chirurgical, le prolapsus génital chez la femme (déscente d'organe). Il existait des prothèses qui pouvaient se poser par voie vaginale, qui étaient non résorbables, mais elles ont été retirées du marché en raison de complication entrainant des douleurs et des réinterventions. Nous souhaitons donc créer et tester une prothèse dont les propriétés mécaniques sont contrôlées dans le temps afin de fournir le soutien nécessaire aux tissus natifs le temps de la cicatrisation des tissus environnants pour le traitement du prolapsus génital de la femme. Les verrous technologiques que souhaite lever notre projet sont les suivants : conception et réalisation d'implants résorbables aux propriétés de dégradation contrôlées, maîtrise de l'évolution in vivo des comportements mécaniques des implants, et finalement le développement d'une prothèse qui serait résorbable tout en assurant un bon maintien.

Bénéfices attendus

Nous attendons comme bénéfices une avancée vers l'amélioration de la prise en charge du prolapsus génital de la femme, qui touche une femme sur 3 en France et qui a des conséquence en terme de qualité de vie.

Procédures

Les animaux se verront implantés des prothèses. Le ventre de chaque animal sera séparé en 4 zones. Nous sélectionnerons 2 prothèses résorbables en fonction de leurs caractéristiques mécaniques en laboratoire. 9 lapins seront implantés sur 2 zones un des nouveaux matériaus et sur les deux autres zones une prothèse de référence non résorbables. Les 9 autres lapins seront implantés sur 2 zones l'autre nouveaux matériaus et sur les deux autres zones une prothèse de référence non résorbables. Les lapins seront suivis pendant 4 mois, puis les prothèses seront prélévées pour pouvoir étudier leurs propriétés mécaniques résiduelles 4 mois après la pose. Lors de l'explantation, les lapins seront mis à mort car les conséquences de la chirurgie ne seront pas compatibles avec une bonne qualité de vie. Chaque lapin aura une première intervention qui consiste en l'implantation des prothèses d'environ 30 min, puis il y aura un suivi de 4 mois et enfin une deuxième intervention, l'explantation d'environ 30 min avec mise à mort.

Impact sur les animaux

L'étude, étant donné que nous allons implanté des prothèses à l'animal, pourrait entrainer un inconfort et de la douleur en post-opératoire. Il y a également un risque d'infection et de trouble de la cicatrisation.

Devenir

Suite à l'implantation les animaux seront suivis pendant 4 mois avec surveillance quotidienne de leur bien être de de leur santé afin de repérer les points limites et de pouvoir idnentifier les signes de douleur pour les soulager. Le raffinement sera également adapté. Avant l'explantation, les animaux seront tous mis à mort, car l'explantation des prothèses a des conséquences très lourdes pour l'animal et ne sont pas compatibles avec le maintien en vie. Les souffrances seraient trop importantes

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro ou informatique, nous permettant de nous affranchir de l'expérimentation sur animaux. En effet, de trop nombreux facteurs complexes intervenant dans la cicatrisation ne peuvent être reproduits en in-vitro ou par simulateur, c'est pourquoi la seule possibilité pour cette étude est le modèle in-vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit à la plus petite quantité possible pour obtenir des résultats significatifs. De plus, afin de limiter le nombre de lapin au strict minimum, chaque lapin sera son propre témoin car il lui sera implanté à la fois le matériau à l'essai et à la fois le matérau témoin. L’abdomen de chaque lapin sera divisé en 4 zones, 2 zones auront une prothèse à l’étude et les deux autres servira de témoin avec une prothèse non résorbable.

Raffinement

Les animaux auront une période d’acclimatation de 10 jours. L'ensemble des procédures sera réalisé par du personnel formé. La douleur sera traitée de manière efficace par la mise en place d'une anesthésie et analgésie adaptée au cours de la chirurgie mais également tout au long du processus de cicatrisation afin de diminuer au maximum la souffrance des animaux. Ils seront suivis quotidiennement afin de détecter tout signe de souffrance liée au protocole.

Choix des espèces

Le lapin est l'espèce animale retenue pour l'étude de la prothèse dégradable au cours du temps. Ce modèle est fréquemment utilisé dans la littérature, notamment pour l'étude et le développement de prothèses destinées à la cure de hernie. Les animaux seront à un stade adultes car ses prothèses sont destinés à des adultes ayant terminés leur croissance

10 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de deux heures durant laquelle son urètre est sectionné puis reconstruit avec de la veine de cordon ombilical humain, un mini-drain étant laissé en place, suivie d'une endoscopie trois semaines plus tard. Le porteur indique des atteintes possibles de la fonction sexuelle et une rétention urinaire post-opératoire. Il affirme que le projet requiert le système urinaire et immunitaire et ne peut recourir à des méthodes alternatives, malgré une validation préalable sur cadavres.

Objectifs

Les sténoses urétrales correspondent à un segment rétréci de l’urètre, canal qui permet l’évacuation de l’urine vers l’extérieur. C'est une maladie fréquente ( 229-627 patients sur 100 000). Elles se manifestent principalement par des difficulté à vidanger la vessie entièrement et engendrer des infections urinaires et même être responsable d’insuffisance rénale. Pour corriger la sténose de l’urètre, il faut reconstruire l’urètre par chirurgie. Seule un prélèvement de la muqueuse de la bouche à ce jour permet de corriger corriger la sténose. Mais cette technique demande souvent plusieurs intervention chirurgicales et le prélèvement ed la muqueuse de la bouche fait souffrir. Le cordon ombilical est composé d’une veine et de deux artères. Ces vaisseaux qui ont entre autre été utilisés pour la régénération nerveuse, pourrait aussi être utilisés pour reconstruire l’urêtre rétréci. L’objectif de ce projet est donc de remplacer la muqueuse de la bouche par de la veine pour reconstruire l’urètre. Pour cela, des lapins seront opérés, leur urêtre coupés puis reconstruits.

Bénéfices attendus

Actuellement, pour réparer la sténose de l’urêtre, il faut la plupart du temps deux interventions chirurgicales espacées de 3 mois. De plus, le fait de prélever de la muqueuse de la bouche n’est pas sans problème (douleurs, saignements, difficultés alimentaires, troubles de la salivation et du goût, difficulté à articuler). Si la veine du cordon ombilical permet de reconstruire l’urêtre, cette reconstruction pourra être réalisée en une fois. Cette technique pourra être utilisée dans d’autres maladies.

Procédures

La chirurgie sous anesthésie générale et antidouleur va s’étendre sur environ 2 heures pendant lesquelles l’animal, après préparation (tonte, désinfection, mise en place du monitoring) va subir une incision d’environ 2-3 cm. Son urêtre sera externalisé, l’extrémité sera coupée (1.5 cm). Une autre incision sera effectuée plus haut dans le sens de la longueur et sera réparée avec soit l’extrémité coupée, soit avec du vaisseaude la veine de cordon ombilical. Un mini-drain sera laissé en place pour maintenir le canal ouvert. L’urêtre sera reconnecté sur l’exterieur et l’incision de la peau sera suturée. 3 semaines plus tard l’animal subira une endoscopie de l’urêtre pour observer la cicatrisation sous sédation (30 min). Les lapins seront sortis de leur cage pour être pesés 2 fois par semaine. 3 semaines plus tard l’animal sera sédaté et mis à mort (10 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances/effets indésirable sur l’animal sont principalement marquées par : * nuisances liées à la chirurgie : - douleur possible au niveau de la zone chirurgicale - rétention urinaire post-opératoire possible - atteinte de sa fonction sexuelle * nuisances liées au suivi : - gêne liée à la présence du mini-drain - endoscopie prévues à 3 semaines (contention, anesthésie) - pesée deux fois par semaine (stress).

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever l’urêtre et d’effectuer des analyses histologiques pour vérifier la cicatrisation.

Remplacement

D’après les travaux antérieurs, les vaisseaux issus de cordons ombilicaux humains sont tolérés chez le lapin et le rat. Il reste donc à étudier la cicatrisation dans le cadre de la reconstruction de l’urètre. Bien que la technique ait été validée sur cadavres d’autres projets en amont, le projet nécessite le système urinaire et le système immunitaire et ne peut donc pas être réalisé avec des méthodes alternatives à l’expérimentation animale.

Réduction

Des études préliminaires sur cadavres issus d’autres projets ont déjà permis de valider la procédure chirurgicale sans utiliser de lapins vivants dédiés à cet objectif. La procédure sera réalisée séquentiellement en débutant d’abord par la chirurgie d’un animal qui sera greffé avec de l’urêtre afin de valider le modèle. Dans cette première étape, aucune statistique ne sera effectuée. Un effectif maximal de 4 animaux par groupe est prévu dans l’objectif d’obtenir 3 procédures réussies. 2 animaux de faisabilité sont prévus dans le groupe témoin afin d’effectuer les mises au point non réalisables sur cadavres ce qui porte à 6 animaux maximum pour ce groupe témoin. Par ailleurs, le nombre d’animaux a été réduit grâce à l’utilisation de l’endoscopie (et de biopsie), ce qui permettra d’évaluer la qualité de la prise de la greffe dans le temps chez le même lapin.

Raffinement

La technique chirurgicale a été élaborée et sera effectuée par des chirurgiens d’un service d’urologie. Pendant l’anesthésie l’animal recevra une perfusion d’un anti-douleur fort. Il sera réchauffé. L’animal recevra une combinaison de deux anesthésiques locaux (rapide et longue action) au moment des sutures qui permet de compléter l’action de l’antidouleur au réveil. Ainsi l’animal ne sentira aucune douleur pendant le réveil, ce qui réduira son stress post chirurgie. A réception, l’hébergement par deux sera testés. Si les animaux sont incompatibles, ils bénéficieront de temps dans un espace de « jeux » plus grand que leur cage comportant cabane, tunnel, hamac.. L’état des animaux est évalué par l’observation de leur état physique (ouverture des yeux, orientation des oreilles) et la quantité d’aliment consommée.

Choix des espèces

Le lapin est l’animal le plus petit permettant de réaliser la reconstruction de l’urètre. L’intérêt de l’urètre du lapin est son calibre proche de celui de l’homme, un trajet droit, la survenue d’érections qui permettra de tester l’élasticité du tissu. D’un point de vue technique, la chirurgie est facile à réaliser dans de bonnes conditions chez le lapin. Une endoscopie de contrôle est facile à réaliser. Les lapins seront choisis par l’éleveur en fonction de leur taille. Nous demanderons des animaux adultes de grande taille afin que l’urêtre soit le plus long possible.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée par injection de cellules cancéreuses, 80 d’entre elles recevant en plus un médicament, la tumeur pouvant atteindre deux centimètres cubes et gêner leurs déplacements avant leur mise à mort pour prélèvement, afin de valider le rôle d’un ARN non codant dans le carcinome rénal. Le porteur indique que des métastases pulmonaires peuvent se former et provoquer une perte de poids et d’appétit. Il affirme que les cultures in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes de la formation tumorale et compte ouvrir une collaboration avec l’industrie pharmaceutique.

Objectifs

Le carcinome rénal à cellules claires (CRCC) est un cancer agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies, les patients diagnostiqués au stade métastatique ont toujours un mauvais pronostic. Il est donc urgent de trouver de nouvelles cibles pour les tests de diagnostic précoce et pour les traitements de la maladie métastatique. Ce projet vise à démontrer que l'expression d'un ARN long non codant in vivo altère la formation de carcinome des cellules rénales et la progression de métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant être testés dans des essais précliniques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation d'une cible pour le traitement du carcinome rénal à cellules claires. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant faire l'objet d'essais précliniques, dans l'objectif final d'identifier de nouveaux traitements pour le carcinome rénal à cellules claires chez l'homme.

Procédures

Toutes les souris seront injectées avec des cellules tumorales (104). L'injection se fait sous anesthésie gazeuse et dure une dizaine de secondes. Les souris de l'étude expérimentale (80) subiront en plus l'administration de médicament 3 fois à 3 jours d'intervalle. Ce traitement supplémentaire est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales va provoquer la croissance d'une tumeur primaire à l'endroit de l'injection et potentiellement la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Cette tumeur primaire devrait apparataitre à partir de 5 jours suivant injection et croitre assez rapidement. La temps d'atteinte du point limite du volume de 2cm3 est estimé à moins de 3 semaines. Les métastases ne seront pas visibiles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés. Lors des expériences précédentes d'injection de cellules tumorales dans le laboratoire, les souris ont du être sacrifiées du fait de la taille de la tumeur primaire et non d'effets dus aux métastases.

Devenir

Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l'injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Les tumeurs et métastases seront prélevées à des fins d'histologie pour étudier les marqueurs de cancer et la composition des tumeurs ainsi que pour d'autres analyses : séquençage d'ARNs, quantification protéique afin d'évaluer le résultat des différents traitements.

Remplacement

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance d'un ARN non codant dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis.

Réduction

L'étude se fera en deux étapes : * la première procédure constitut l'étude-pilote de la tumorigénicité des modèles cellulaires utilisés (12 souris par lignée cellulaire, donc 24 souris). * Si l'étude pilote est concluante (les lignées injectées vont entraîner une croissance tumorale), elle sera suivie de la seconde procédure : l'étude expériementale visant à étudier l'effet du médicament sur la croissance tumorale : 80 souris injectées avec les lignées modifiées pour la surexpression de l'ARN non codant et traitées ensuite soit avec le véhicule, soit avec le médicament. Ce nombre représente le nombre minimal de souris pour obtenir un résultat significatif d’un point de vue statistique en tenant compte de l’éventualité de mort précoce. Le nombre total de souris expérimentales sera de 104. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides).

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale, ce qui confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance évidente, les souris seront sacrifiées.

Choix des espèces

In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d'information requis. L'utilisation du modèle de xénogreffe chez la souris ne peut être remplacée par d'autres méthodes expérimentales, il est fiable et facile à manipuler et déjà largement utilisé. De plus, les données que nous produirons à partir de nos tumeurs (cinétique tumorale, séquençage d'ARN, quantifications de protéines) seront comparées à celles collectées par notre laboratoire et nos collaborateurs dans des modèles similaires pour d'autres études. Pour cette expérience d’injection de lignées cellulaires murines sur des souris immunocompétentes, nous ferons correspondre la souche d'origine des lignées cellulaires avec celle des souris réceptrices. Nous utiliserons des souris jeunes adultes de 6 semaines. Le médicament à tester étant un inhibiteur des points de contrôle immunitaires, il convient que sa cible, la population de lymphocytes T, soit à son meilleur stade de développement. A 6 semaines, les souris présentent un système immunitaire développé et fonctionnel, que ne présentent pas des souris plus jeunes. Après cet âge, certaines sous-populations de cellules immunitaires ainsi que la fonction immunitaire globale commence à décliner : la diminution des lymphocytes T naïfs, l'augmentation des lymphocytes T à mémoire dont la fonctionnalité est réduite et la diminution de la diversité de la reconnaissance des antigènes par les lymphocytes T entraînent l'immunosénescence.