Troubles sensoriels

142 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 132 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections sous la rétine ou dans le vitré des deux yeux sous anesthésie, une imagerie rétinienne répétée et des prélèvements sanguins, avant une ponction intracardiaque terminale, pour tester une édition génique CRISPR-Cas9 contre la maladie de Stargardt. Le porteur indique aussi que le projet sert à mettre au point des gestes techniques et à valider les compétences des personnels. Il affirme qu'il est impossible de reconstituer la rétine in vitro.

Objectifs

Parmi les vecteurs viraux, ceux qui dérivent du parvovirus humain Adéno-Associé (AAV) sont aujourd’hui considérés comme les plates-formes les plus performantes pour le traitement par thérapie génique des maladies génétiques. Parmi les différents sérotypes d’AAV connu, le sérotype AAV2/8 avec les ITRs d’AAV2 encapsidés dans la capside d’AAV8 montre une grande efficacité en termes de tropisme et de niveau d’expression dans les photorécepteurs de la rétine. Par ailleurs, les vecteurs AAV pouvant donner lieu à une réponse immunitaire suite à une pré-exposition au virus, nous souhaitons également tester les nanoparticules lipidiques (LNP) afin de délivrer la nucléase Cas9. L’objectif de ce projet repose sur le potentiel d’une stratégie d’édition génique en ciblant l’intégration d’un minigène correctif dans un site de coupure d’ADN double-brin induit par la nucléase Cas9. Ce minigène permet la correction des mutations du gène ABCA4 qui impactent le fonctionnement de la protéine ABCA4, transporteur essentiel pour le métabolisme des rétinoïdes dans les photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. Avec une preuve de concept déjà établie in vitro et avec des résultats préliminaires in vivo, la valeur thérapeutique de cette approche est réalisable. L’utilisation d’une stratégie d’édition génique est en essai clinique pour une autre dystrophie rétinienne et donne l’espoir pour le futur développement de thérapies basées sur CRISPR/Cas9 pour la cécité. Pour cela, les praticiens et concepteurs en recherche sur la cécité doivent acquérir les compétences nécessaires à la réalisation de leurs projets de recherche impliquant des animaux selon la Directive Européenne (arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques). C’est dans ce cadre que nous souhaitons mettre au point les techniques d’injections sous rétinienne et intravitréenne sur le modèle rat. Pour l’étude de certaines pathologies de la rétine et pour des études de recherches fondamentales nous serons amenés à travailler sur le modèle rat avant de pouvoir passer à une plus grosse espèce.

Bénéfices attendus

L’immunogénicité de la protéine Cas9 a été décrite dans quelques études. Il est cependant à noter qu’en transfert de gène, plusieurs facteurs peuvent influencer l’initiation d’une réponse immune ; parmi eux, la dose de vecteur, la nature du transgène ou encore la voie d’administration. Dans cette étude, le but est d’étudier la présence d’une réponse immune après transfert de gène dans l’œil qui est un site décrit comme immunoprivilégié et ce, à une dose cliniquement pertinente. Concernant la détection d’une réponse immune dirigée contre la protéine Cas9, les techniques d’analyse décrites dans la littérature ne sont pas standardisées et aucun kit n’est, à ce jour, commercialisé. Notre étude permettra d’établir un protocole adéquat pour la détection de la réponse immune anti-Cas9. De plus, l’utilisation d’une stratégie d’édition génique est en essai clinique pour une autre dystrophie rétinienne et donne l’espoir pour le futur développement de thérapies basées sur CRISPR/Cas9 pour la cécité. L’évaluation in vivo de notre stratégie d’édition génique nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. En effet, l’utilisation d’un minigène codant plusieurs exons à la fois, si efficace, permettra de corriger une large partie du gène, ce qui sera utile pour de nombreux patients, même avec des mutations différentes. Enfin si notre approche se révèle efficace, elle pourrait être utilisée pour soigner les pathologies liées à d’autres gènes de la famille ABCA.

Procédures

Phases 1 et 2 : (i) Injection sous-rétinienne ou intravitréenne : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 à 3 µL injectés dans les 2 yeux des animaux, durée de la chirurgie 30 minutes maximum. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT) : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 fois avant l’injection dans l’œil puis une fois par mois, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée de l’examen 20 minutes maximum. (iii) Imagerie rétinienne (ERG) : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 fois avant l’injection dans l’œil puis avant l’euthanasie de l’animal, soit 2 fois au total. Durée de l’examen 30 minutes maximum. (iv) Prélèvements sanguins (Phase 2) : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. En pré-injection puis toutes les deux semaines post-injection, soit au maximum 7 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. Phase 3 (v) Injection sous cutanée de 50μg de protéine et de l’adjuvant incomplet de Freund : Geste réalisé sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 15 minutes maximum. (vi) Injections en intramusculaire : 1 semaine après l’injection SC. Geste réalisé sous anesthésie générale, 200μL de vecteur en 4 sites d’injection, durée de l’anesthésie 15 minutes maximum. (vii) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. En pré-injection SC, soit une fois. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. (viii) Ponction intracardiaque terminale : Geste réalisé sous anesthésie générale avec renforcement analgésique. Ce prélèvement précèdera l’euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

(i) Injection sous-rétinienne ou intravitréenne : A ce jour, l’administration sous rétinienne de vecteurs AAV chez le rat n’a pas d’effet délétère notable sur la morphologie et la fonction rétinienne ni sur l’état de santé général de l’animal. Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection. Une pommade ophtalmique composée de dexaméthasone et d’oxytétracycline est appliquée à la suite de l’intervention pour minimiser l’irritation de la cornée. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT et ERG) : Aucune douleur n’est attendue lors des examens d’imagerie (non invasifs). En effet, afin que l’animal soit immobilisé, cet examen est fait sous anesthésie générale n’entrainant pas de stress ou de douleur que pourrait entrainer une contention physique de l’animal et permettant ainsi d'assurer une qualité optimale d'acquisition des images. (iii) Prélèvements sanguins : un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. (iv) Injection sous cutanée de protéine et de l’adjuvant incomplet de Freund et injections en intramusculaire : afin de limiter le stress de ces injections et que l’asepsie soit optimale, ces gestes seront réalisés sous anesthésie général de l’animal. Aucune douleur n’est attendue suite à ces injections. (v) Ponction intracardiaque terminale : Une ponction intracardiaque terminale sera réalisée sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera l’euthanasie des animaux. De plus, les anesthésies répétées seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur, la récupération devrait être rapide car les animaux seront soit sous anesthésie gazeuse ou recevront un réversif pour accélérer le réveil et la récupération de l’animal.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.

Remplacement

La rétine est une structure complexe composée de multiples couches de neurones et de cellules nourricières. Il n’est pas possible de reconstituer parfaitement cet organe complexe in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la physiopathologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire, nous utiliserons au maximum des animaux de réforme pour la phase 1. Nous avons calculé nos estimations sur les séances précédentes d’injections sous rétiniennes. D'après une revue des publications d'études similaires ainsi que l’expérience du laboratoire notamment sur la reproductibilité des ERG, 8 animaux par groupe seront suffisants pour réaliser des analyses statistiques pertinentes (comparaison des groupes à l’aide d’un test non paramétrique ‘one-way ANOVA’). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales. Nous ne pouvons pas raisonnablement supposer que les données seront normalement distribuées, par conséquent, nous pensons essentiellement utiliser des tests statistiques de type Mann-Whitney U pour analyser les données générées par l’expérience. Pour réduire le nombre d’animaux au minimum nous avons mis en place des mesures pour limiter la variabilité des données, y compris l’effet de la lumière. La luminosité est normalisée entre toutes les cages (mesurée par luxmètre chaque semaine). La détermination du nombre d’animaux pour l’évaluation de l’immunogénicité de Cas9 a été réalisée par approche statistique et sur la base de l'expérience d'études similaires en thérapie génique des maladies de la vision. Une analyse de puissance été effectuée avec le logiciel R et le package pwr en utilisant l'écart-type que nous observons dans les mesures d’ERG chez nos rats WT. De là, nous avons sélectionné une taille d’échantillon n=8 animaux/lot comme maximum.

Raffinement

Les études antérieures de notre équipe ont été faites sur d’autres modèles pour des études précliniques. Pour l’étude de certaines pathologies de la rétine et pour des études de recherches fondamentales nous serons amenés à travailler sur le modèle rat avant de pouvoir passer à une plus grosse espèce. Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une euthanasie

Choix des espèces

Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt : la lignée, issue de rats Sprague Dawley, que nous utilisons ici, a été créée par la technologie de CRISPR/Cas9. Cette technologie nous a permis de produire, lors du même projet de transgénèse, des rats « knock-out » pour ABCR4 (ABCR-/-). Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. L'augmentation du niveau de bis-rétinoïdes est mis en évidence dès l'âge de 3 mois et augmente avec l'âge comme le montrent nos résultats préliminaires par HPLC et spectrométrie de masse. Il semble donc pertinent de commencer le traitement entre l'âge de 2 et 3 mois : à cet âge le risque de décollement de la rétine est faible et on se situe dans la fenêtre thérapeutique. Pour l’évaluation de la réponse immunitaire, nous souhaitons évaluer celle-ci sur des animaux ayant un système immunitaire mature, donc sur des rats adultes de 3 mois.

3 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées et subissent des tests comportementaux d'allodynie mécanique, d'aversion à la lumière, d'anxiété et de dépression, certaines une chirurgie stéréotaxique avec implantation d'une lentille intracérébrale reliée à un microscope miniature. Le porteur étudie le rôle du réseau thalamo-cortical et des récepteurs AhR dans la migraine, avec une piste alimentaire et probiotique. Toutes sont tuées par injection de pentobarbital puis dislocation cervicale.

Objectifs

La migraine est la 6ème cause de handicap dans le monde. Elle est associée à une allodynie cutanée et à une photophobie, en plus d’autres maladies concomitantes qui rendent difficile le traitement. La migraine est influencée par les aliments et le microbiote intestinal. Les métabolites dérivés de l’activité bactérienne régulent le fonctionnement cognitif, et son impliqués dans les processus de neurodégénérescence. Dans ce contexte nous nous intéressons au tryptophane (Trp), acide aminé essentiel. Une réduction de son ingestion augmente l’intensité des nausées, de la douleur et de la photophobie pendant la crise migraineuse. Environ 6% du Trp est transformé par le microbiote en dérivés indoles, agonistes endogènes des récepteurs d’aryl d’hydrocarbone (AhR). L’AHR est un facteur de transcription qui participe au contrôle de la neuroinflammation et la neurotoxicité. Son activation via les indoles a des effets protectifs et antiinflammatoires. Cependant, l’implication des indoles et des AhR dans la migraine est très peu connue. Le premier objectif est d’étudier leur rôle dans le déclanchement et/ou la chronicisation de la migraine ainsi que dans la comorbidité avec des troubles sensoriels et affectifs dans un modèle de migraine chez la souris. D’autre part, durant la crise migraineuse le message nociceptif issu des méninges et de la rétine converge au niveau du thalamus puis il est transmis vers les régions corticales. Ce circuit suggère le rôle du thalamus dans l'allodynie et la photophobie au cours de la migraine. Cependant, l’implication des neurones thalamiques et la manière dont ils intègrent l’information demeure une question jamais examinée à ce jour. Le deuxième objectif est d’étudier comment le message nociceptif est traité au niveau thalamique et cortical durant et entre les crises de migraine ainsi que d’évaluer l’implication des indoles et les AhR dans ce circuit neuronal.

Bénéfices attendus

Nous partons de l’hypothèse que les crises répétées de migraine induisent une altération du traitement de l’information somato-sensorielle et visuelle au niveau des noyaux thalamiques et du cortex. Cette altération implique les récepteurs AhR et les métabolites indoles comme principaux agonistes endogènes. Les différentes techniques utilisés dans ce projet permettront de révéler de nouveaux mécanismes moléculaires et de plasticité neuronale jamais abordés dans le cadre de la migraine et les troubles sensoriels associés. Cette étude envisage donc d’apporter des résultats innovants en mettant en évidence le rôle des AhR dans l’initiation et la chronicisation de la migraine ainsi que la vulnérabilité du circuit thalamo-corticale à la neuroinflammation, permettant de trouver des nouvelles cibles thérapeutiques adaptés au patient et centrées sur une approche alimentaire et probiotique à long terme.

Procédures

Procédure 1 : [1] injection intrapéritonéale (i.p.) soit d’ISDN soit du véhicule (2 fois/jour sur 3 jours consécutifs) suivie d’une injection i.p. du traitement pharmacologique (1-2 fois/jour sur 3 jours consécutifs selon le protocole expérimental) ; [2] mesure de l’allodynie en réponse à une stimulation mécanique non nociceptive (une fois par jour, pendant 3 h, sur 2 jours consécutifs) ; [3] mesure de l’aversion à la lumière (10 min, une seule fois) ; [4] mesure du comportement anxieux (une fois par jour, pendant 10 min, sur 3 jours consécutifs) ; [5] mesure du comportement dépressif (pendant 15 min, une seule fois) ; [6] injection i.p. de pentobarbital sodique pour la mise à mort de l’animal (une seule fois). Procédure 2 : [1] injection i.p. soit d’ISDN soit du véhicule (2 fois/jour sur 3 jours consécutifs) suivie d’une injection i.p. du traitement pharmacologique (1-2 fois/jour sur 3 jours consécutifs selon le protocole expérimental) ; [2] injection i.p. de pentobarbital sodique (une seule fois). Procédure 3 : [1] injection i.p. soit d’ISDN soit du véhicule (2 fois/jour sur 3 jours consécutifs) ; [2] anesthésie avec isofluorane (environ 20 min, une seule fois) ; [3] chirurgie stéréotaxique (environ 20 min, une seule fois) ; [4] injection i.p. de pentobarbital sodique (une seule fois). Procédure 4 : [1] injection i.p. soit d’ISDN soit du véhicule (2 fois/jour sur 3 jours consécutifs) ; [2] anesthésie avec isofluorane (environ 20 min, 2 fois avec 1-2 semaines d’intervalle) ; [3] : chirurgie stéréotaxique (environ 20 min, 2 fois avec 1-2 semaines d’intervalle) ; [4] : installation du microscope miniature sur le support crânien fixé dans l’intervention précédente (une fois par jour, pendant 1-3 jours par semaine, durant 2 mois ; chaque session dure 10-30 min) ; [5] mesure de l’allodynie (une fois par jour, pendant 10-30 min) ; [6] mesure de l’aversion à la lumière (une fois par jour, pendant 10 min) ; [7] injection i.p. de pentobarbital sodique (une seule fois).

Impact sur les animaux

D’une part, les animaux soumis à une restriction/implémentation de Trp risquent de présenter une altération du régime alimentaire qui peut impliquer des perturbations de leur comportement et bien-être. Les études préliminaires avec le régime carencé en Trp indiquent une perte non significative du poids lors des premiers jours mais qui ne s’aggrave pas avec la suite du protocole. Les animaux n’ont pas présenté d’altérations de l’agressivité, le cycle du sommeil ni du stress, parmi d’autres évaluations. D’une autre part, certains animaux vont suivre une chirurgie d’implantation d’une lentille microendoscopique au niveau cérébral, qui sera ponctuellement connectée à un système miniature de microscopie au moment de l’expérience. La douleur occasionnée pour cette procédure sera prévenue et/ou traitée avec des antalgiques. Quelle que soit l’expérience réalisée, une évaluation de l’état physique de chaque souris sera effectuée chaque jour et avant chaque manipulation, afin de détecter le plus rapidement possible tout signe traduisant le mal-être de l’animal. Dans le cas où l’animal montre des signes cliniques, soit il pourra être soigné sans compromettre les résultats, soit nous procèderons à la mise à mort dans le cas échéant. En plus, des points limites spécifiques pour chaque procédure seront mises en place.

Devenir

À la fin de chaque procédure ou expérience, les animaux seront euthanasiés avec une injection intrapéritonéale (i.p.) de pentobarbital sodique (dose supérieure à 150 mg/kg). Afin de confirmer la mort, nous réaliserons une dislocation cervicale.

Remplacement

Notre projet étudie l’effet de la dérégulation du métabolisme du Trp et ses dérivés indoles sur les récepteurs AhR au niveau du réseau thalamo-cortical dans le cadre de la migraine. Aucune méthode alternative ne permet de remplacer les protocoles et procédures décrits ci-dessous. Il est nécessaire de réaliser cette étude chez l’animal in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique.

Réduction

Dans le cas de l’évaluation comportementale, l’expérience préalable de notre laboratoire nous permet de réduire le nombre d'animaux par groupe à 10 (compte tenu aussi du fait qu’environ 20% des animaux ne sont pas sensibles à l'ISDN, et que certains animaux ne répondent pas au traitement administré). Dans le cas de l’évaluation immunohistochimique suite au marquage du réseau neuronal, nous allons réduire à 5 animaux par groupe expérimental. Dans les études de RT-PCR et de quantification par HPLC des niveaux plasmatiques et cérébrales de Trp et ses métabolites, nous allons extraire les échantillons de tissu des mêmes animaux afin de réduire au maximum le nombre de souris. Cela nous permettra de réaliser une corrélation entre l’expression génique et le taux des molécules étudiées. Quelle que soit la procédure à réaliser, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin de tirer des conclusions statistiquement fiables et pertinentes avec un pouvoir d’analyse d’au moins 70%. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique (test t de Student pour une comparaison entre deux groupes ; ANOVA suivie d’un test de comparaison multiples, tel que le test de Dunnet ou le test de Tukey, pour des comparaisons de plus de 3 groupes). Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques (test de Wilcoxon pour des comparaisons entre mesures répétées précédentes d’un même groupe ; test U de Mann-Whitney pour des comparaisons entre deux groupes indépendants ; test de Kruskal-Wallis pour des comparaisons entre plus de trois groupes). La significativité sera définie pour une valeur de p≤0,05.

Raffinement

Afin d’assurer le bienêtre et le confort des animaux, les souris seront surveillées et manipulées tous les jours par l’expérimentateur et les personnes compétentes. Elles ne seront jamais isolées dans leur cage, et auront un environnement enrichi (des rouleaux en carton et des bandes de papier pour réaliser leur nid). Une évaluation de l’état physique de l’animal sera réalisée avant chaque manipulation expérimentale pour détecter toute lésion, signe clinique ou comportemental traduisant l’inconfort, le stress, ou une maladie (liés ou non à l’étude). Un tableau d'évaluation avec les critères suivants permettra d'objectiver la décision : dégradation de l’état physique, manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur (perte de plus de 15% du poids) ou obésité, et présence de tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue). Dans le cas où l’animal montre au moins un de ces signes cliniques, soit il pourra être soigné (administration des antalgiques contra la douleur, désinfection des blessures, réhydratation par administration de saline sous-cutané, etc.) sans compromettre les résultats et il sera gardé dans l'étude, soit il ne peut pas être soigné, alors sa manipulation sera arrêtée et nous procèderons à la mise à mort dans le cas échéant. Dans le cas où l’animal présente trois ou plus des signes cliniques, il sera sacrifié. Des points limites (précisés ci-dessous) seront mis en place pour chaque procédure

Choix des espèces

Puisque ce projet est la suite d’une étude en cours de réalisation actuellement, nous continuons à utiliser le même modèle animal. Sur le plan génétique, la souris est très similaire à l’homme et permet l’extrapolation et comparaison des résultats obtenus au laboratoire avec les études cliniques (dans la mesure du possible). De plus, elle possède des nombreux atouts pour l’élevage en laboratoire : une descendance nombreuse, un développement rapide et une taille réduite. D’ailleurs, la souris est idéale en raison de la disponibilité des knockouts génétiquement modifiés dont les souris AhR-/- que nous allons utiliser. Nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes (5-12 semaines d’âge) car l'étude n’a pas pour objectif de travailler sur les jeunes (système nerveux en cours de développement) ou chez l'animal âgé.