Troubles sensoriels

Tester deux formulations de gel cicatrisant à deux doses mobilise 40 souris hairless, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie de 6 mm est découpée sur toute l'épaisseur de la peau du flanc gauche de chaque souris sous anesthésie générale, puis traitée et pansée tous les deux jours sous anesthésie jusqu'à cicatrisation complète. Chaque souris reste seule en cage transparente pendant toute l'étude, pour éviter qu'elles ne s'arrachent mutuellement leurs pansements. Le porteur prévoit la mise à mort de celles qui perdent plus de 20 % de leur poids maximal ou 15 % entre deux pesées, comme de celles qui présentent cachexie, vocalises ou convulsions.

Objectifs

L’objectif de notre projet est d’évaluer les effets de 2 nouvelles formulations sous forme liquide formant un gel, administrées par application cutanée locale (voie topique) à 2 doses, sur le processus de cicatrisation sur un modèle de plaies cutanées induites par excision cutanée complète chez la souris. Une plaie cutanée sera réalisée sur le flanc gauche de chaque souris. Les 2 nouvelles formulations seront appliquées tous les 2 jours directement sur les plaies cutanées induites jusqu’à cicatrisation complète de celles-ci. Après cicatrisation complète de leur plaie cutanée, les souris seront euthanasiées avant réalisation d’un prélèvement cutané pour la réalisation d’analyses biologiques.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité sur la cicatrisation de 2 nouvelles formulations en cours de développement, formulations ayant montré des effets bénéfiques sur la prolifération cellulaire in vitro. L’évaluation se fera par des observations tous les 2 jours des plaies cutanées avec scorage de différents paramètres, la mesure de leur surface, la détermination du temps nécessaire à la cicatrisation complète, et après cicatrisation complète, par des analyses biologiques de prélèvements cutanés effectués au large de la région d’induction des plaies cutanées. Les données issues de ce projet sont d’un intérêt majeur pour déterminer les effets biologiques sur le processus cicatriciel de ces 2 nouvelles formulations in vivo dans un modèle préclinique avant d’envisager des études cliniques chez l’Homme avec l’une et/ou l’autre des 2 formulations testées.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction des plaies cutanées. Sous anesthésie générale, une plaie cutanée de 6 mm de diamètre sur toute l’épaisseur de la peau sera effectuée sur le flanc gauche de chacune des 40 souris nécessaires à la réalisation de ce projet. Un traitement analgésique des souris sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures après. La chirurgie sera réalisée en 5 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les plaies cutanées seront traitées immédiatement après leur induction puis tous les 2 jours jusqu’à cicatrisation complète. Les plaies cutanées seront protégées par un pansement de couverture changé tous les 2 jours sous anesthésie générale et seront observées et scorées lors de chaque change effectué. Chaque retrait du pansement de couverture, observation et traitement des plaies cutanées et mise en place d’un nouveau pansement de couverture seront réalisés en moins de 10 minutes pour chaque souris. Un suivi quotidien des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des souris en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement de couverture permettant le maintien des traitements appliqués au contact des plaies cutanées et la protection de celles-ci.

Impact sur les animaux

L’induction des plaies cutanées peut engendrer une douleur au cours des premières heures suivant celle-ci. La répétition des anesthésies même de courte durée (moins de 10 minutes), nécessaires afin d’enlever délicatement le pansement de couverture pour observer, photographier puis traiter les plaies cutanées avant de mettre en place un nouveau pansement de couverture, induiront une nuisance pour les souris. D’autre part, un stress dû à la limitation des interactions sociales directes pourra être induit par l’hébergement en cage individuelle transparente des souris, rendu nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement de couverture permettant le maintien des traitements appliqués au contact des plaies cutanées et la protection de celles-ci.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure expérimentale permettant l’induction des plaies cutanées puis le traitement et le suivi de celles-ci jusqu’à leur cicatrisation complète, les souris seront euthanasiées. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la zone d’induction des plaies cutanées pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser les effets des traitements effectués sur la régénération du tissu cutané.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro (culture de cellules cutanées) ou ex vivo (explants cutanés) qui ne pourraient pas être maintenus dans un état physiologique pendant une durée prolongée, au moins 2 semaines selon notre expérience du modèle de plaie cutanée utilisé. D’autre part, le processus cicatriciel met en jeu des mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de nouveaux vaisseaux sanguins fonctionnels…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé par un calcul de puissance statistique effectué à l’aide d’un logiciel adapté. Selon ce test de puissance statistique, il est ainsi nécessaire de n’utiliser que 8 animaux avec 1 plaie cutanée par animal (soit 8 plaies cutanées) par groupe expérimental pour mettre en évidence des différences significatives.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celles-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré tous les 2 jours à chaque renouvellement de pansement, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint ou de 15% entre 2 pesées est observée, ou si des signes de toxicité des traitements, d’infection des plaies cutanées ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les souris seront placées individuellement dans des cages de taille adaptée dans une animalerie maintenue en cycle de lumière inversé afin d’observer leur comportement avant et après traitement pendant leur phase active. Cela permet de respecter leur horloge biologique (chronobiologie) et d’évaluer l’influence des traitements sur leur activité (chronopharmacologie). Des morceaux de papier absorbants et de papier kraft seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière effectué 2 fois par semaine.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire des plaies cutanées représentatives des plaies à traiter chez l’Homme, et la souris Hairless est un modèle très utilisé et largement décrit dans la littérature scientifique pour les études dans le domaine de la Dermatologie et plus spécifiquement sur la cicatrisation. De plus, elle présente une structure de la peau relativement proche de celle de l’Homme permettant ainsi une bonne transposition des résultats obtenus. Les animaux seront de jeunes souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur la cicatrisation (généralement 6 à 8 semaines), et de souris utilisées lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats très intéressants.

Une trentaine d'études d'efficacité sur des candidats médicaments contre l'eczéma : 1 150 souris et 1 150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le dos rasé, ils reçoivent un extrait d'acariens appliqué ou injecté dans la peau jusqu'à neuf fois en trois semaines, puis le produit à tester tous les jours. Pour mesurer le grattage, chaque animal est isolé jusqu'à cinq heures dans une enceinte, et jusqu'à sept prises de sang sont pratiquées en trois semaines, la dernière suivie d'une mise à mort sans réveil. Le porteur justifie le recours aux rongeurs par l'impossibilité de faire apparaître un comportement de grattage in vitro, et annonce des traitements "sans effets secondaires majeurs" pour les patients.

Objectifs

La dermatite atopique, ou eczéma atopique, est une maladie inflammatoire chronique de la peau, fréquente chez les nourrissons et les enfants, qui se caractérise par des démangeaisons, une sécheresse de la peau, un érythème et une peau épaisse causés par une perturbation immunitaire, des défauts génétiques et des facteurs environnementaux. En médecine humaine, on estime jusqu'à 20 % des personnes souffrant de dermatite atopique . La sècheresse de la peau, son irritabilité et son hyperréactivité s'expliquent par une diminution des graisses à la surface cutanée. Les patients dits atopiques sont génétiquement prédisposés (terrain familial). Leur système immunitaire est très réactif et leur peau présente une anomalie de perméabilité. Les allergènes environnementaux (poussières, pollens…), normalement bien tolérés, vont alors pouvoir pénétrer plus profondément dans l'épiderme et stimuler de façon excessive le système de défense immunitaire. En particulier, une altération de la barrière cutanée entraîne une sensibilité élevée aux allergènes aériens atopiques, y compris les acariens . Les acariens constituent un vecteur non seulement de protéines allergènes, mais aussi d'adjuvants microbiens qui peuvent tous deux conduire à l'allergie. Dans la dermatite atopique, les lésions liées au grattage (conséquences des démangeaisons), peuvent être responsables de surinfection bactérienne (ex : staphylocoque doré) ou virale (ex : virus de l'herpès) dont les conséquences sur l’état général peuvent être plus ou moins importantes. Le projet concerne des tests d'évaluation de réactions cutanées, de comportements de grattage chez le rongeur. Le modèle de dermatite atopique (induit par des extraits d’acarien) décrit dans ce projet cible l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Le modèle est mis en place et utilisé afin de tester l'efficacité de médicaments à lutter contre les conséquences directes ou aggravantes (comportement de grattage) de l’allergie aux acariens.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l'évaluation de nouveaux traitements nécessaires pour améliorer la prise en charge et la qualité de vie des patients, car les traitements actuels présentent des effets secondaires qui peuvent être importants. Par exemple, même si les corticoïdes, appliqués par voie topique ou orale, sont fréquemment utilisés pour traiter de nombreuses affections cutanées, ces derniers ne restaurent pas la barrière que constitue l’épiderme. Leur utilisation est de plus fréquemment accompagnée d’une immunosuppression, ce qui a pour conséquence de prolonger leur utilisation à des doses fortes entrainant ainsi de nombreux effets secondaires (atrophie de la peau, augmentation du risque d’infection). Pour ces raisons, de nouveaux traitements, sans effets secondaires majeurs, sont en développement.

Procédures

Les animaux seront rasés au niveau du dos. 2-3 fois par semaines et pendant environ 3 semaines (soit en 9 occasions maximum), un extrait d’acariens est appliqué ou injecté au niveau de la peau. Cette procédure ne dure que quelques minutes et est réalisée sous anesthésie gazeuse si nécessaire. Les administrations d’éléments d’essai pourront être réalisées tous les jours pendant la durée de l’étude (environ 1 minute par administration). Avant la première application de l’extrait d’acariens, puis à différents jours jusqu'au lendemain de la dernière application, l’épaisseur des oreilles est mesurée et la peau est observée. Cette procédure ne dure que quelques minutes et est réalisée sous anesthésie gazeuse si nécessaire. Les animaux sont placés individuellement dans une enceinte pour évaluer le comportement de grattage, généralement en une occasion et pendant 5 heures maximum. Les jours qui précédent cette évaluation, une ou plusieurs phases d’habituation à l’enceinte d’environ 1 heure sont mises en place. Des prélèvements de sang pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse, procédure d’une durée de quelques minutes (7 prélèvements maximum en 3 semaines). Si le prélèvement est effectué en fin d’étude, les animaux sont immédiatement euthanasiés (sans retour à l’état conscient).

Impact sur les animaux

Les phases d’induction de l’anesthésie et de réveil (nécessaires pour la réalisation des administrations, des prélèvements sanguins et des évaluations le cas échéant), tout comme les phases de contentions nécessaires aux administrations substances (produit test) ou d’isolement (évaluation du comportement de grattage, généralement 2 à 5 heures) peuvent être source de stress ou d’inconfort pour l’animal. Des démangeaisons pourraient apparaitre au niveau du site d'application des extraits d'acariens.

Devenir

Dans la procédure, les animaux sont euthanasiés, les prélèvements de peau/oreilles et de sang (pour analyses) ne permettant pas le réveil et le maintien en vie.

Remplacement

Dans le cadre du développement des médicaments testés, des tests in vitro, ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité de l’environnement biologique, du système endocrinien et immunologique chez l’Homme, ou l’apparition d’un comportement de grattage. De même, il n'est pas possible de prédire les effets secondaires des substances utilisées. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Selon les données de la littérature, il est estimé qu’un effectif de 8-10 animaux en standard par groupe (nombre d'animaux et groupes variables, selon l’objectif de l’étude) sera nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Une étude comprendra en général 4 groupes et une trentaine d'études sont anticipées. L'analyse statistique prévue repose sur des tests paramétriques adaptés aux objectifs de l'étude. Par ailleurs, des prélèvements terminaux (tissus, organes, sang) peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.

Raffinement

Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères.... En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux ou attendus ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation faite par du personnel formé inclut une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration, l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions… Une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à postériori la catégorie si nécessaire. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données.

Choix des espèces

Aujourd’hui encore, les rongeurs (souris et rats) demeurent essentiels pour étudier la dermatite atopique, comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogenèse de cette affection cutanée et étudier l'efficacité de nouveaux traitements. Tous les animaux seront utilisés après 4 semaines de développement (après sevrage) que ce soient des rats ou des souris conformément à la bibliographie scientifique.

Cinq lapins reçoivent dans l'œil, à quatre reprises, un laser dont l'éclairement dépasse d'un facteur dix la limite fixée par la norme ISO, avec une lame de verre posée sur la cornée. Ces séances de quarante-cinq minutes se déroulent sous anesthésie générale et relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce des ulcères de l'épithélium cornéen, des lésions de l'endothélium et une cataracte par effet thermique comme atteintes possibles, et précise que l'étude est faite "justement" pour en constater la survenue. Tous les lapins sont tués pour histologie oculaire, leurs os et leur cochlée partant à d'autres équipes, afin qu'une startup française puisse déposer un dossier d'autorisation pour son appareil.

Objectifs

Une startup française a développé une technologie de tomographie à cohérence optique (OCT) nommée LC-OCT permettant d'effectuer des images proche de l'histologie classique ou des images du type confocale. Ces observations peuvent être compilées sous forme de stack permettant une reconstruction 3D du tissu en haute définition. Cette technologie est un excellent outil de diagnostic dermatologique et pourrait apporter les mêmes avantages en ophtalmologie, surtout dans le domaine des tissus de la surface oculaire. L'utilisation de cet OCT sur l'oeil pour des observations ne doit pas avoir d'effets indésirables sur les tissus de l'oeil. Des calculs de normes portent à penser que la rétine ne subira aucun dommage lors de l'imagerie de la cornée. La présente étude propose ainsi d'évaluer la safety sur les tissus oculaires de cette nouvelle technologie d'OCT lors de l'imagerie de la cornée. Sera étudiée, à court terme, l'apparition d'œdème cornéen, de cataracte et de modifications rétiniennes.

Bénéfices attendus

Le projet permettrait de connaître la sécurité de cette nouvelle technologie d'OCT comme outil de diagnostic clinique des atteintes des tissus de la surface oculaire proche d'une étude histologique. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise développant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique (si les résultats ne montrent pas d'effets délétères) et in fine la rédaction de dossiers pour autorisation par les instances de santé. Si des atteintes rétiniennes venaient à être observées, des atteintes de la vision sont possibles et par conséquent un éventuel stress pouvant se traduire par une perte ou prise de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin) comme des selles liquides.

Procédures

Les animaux seront soumis à de l'imagerie ophtalmologique contact et sans contact avec l'oeil sous sédation et l'animal sous anesthésie général. Ces imageries de suivi seront faites 4 fois. La durée de chaque observation de suivi dure environ 45 minutes. L'imagerie avec la nouvelle technologie OCT durera 5 minutes.

Impact sur les animaux

L'éclairement du laser du LC OCT est de 820 mW/cm² au niveau de la cornée, 0.02 W/cm² au niveau de la rétine. En prenant en compte la norme ISO 15004-2, il a été déterminé que cela dépassait d'un facteur 10 la limitation en éclairement au niveau de la cornée, mais pour l'éclairement de la rétine la puissance est très inférieure à la limitation (inférieur à la limite d'éclairement d'un facteur 35). Au vu de ces données il est attendu aucun problème sur la rétine de l'animal, mais il est possible qu'une atteinte des tissus cornéens soit à prévoir (ulcères épithéliaux, lésions de la couche endothéliale). De plus, le système de mesure se fait en contact avec la cornée via une lame de verre. Il est donc possible, là aussi, que nous ayons des atteintes du tissu cornéen. Cette étude est justement faite pour se rendre compte de la présence de ces atteintes avec des paramètres de laser au-dessus de la norme. Le cristallin pourrait aussi être atteint par effet thermique (cataracte).

Devenir

En fin de procédure les animaux seront mis à mort pour étude histologique des tissus oculaires. D'autres équipes de recherche récupéreront les os et la cochlée des animaux.

Remplacement

Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois cet LC-OCT chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de ses composants, ainsi que la réponse à un passage d'un laser potentiellement néfaste pour les tissus oculaire. L'effet cataractogène peut se déclarer 1 à 2 semaines après le passage du laser.

Réduction

Tout d'abord nous utilisons l'oeil gauche de chaque animal comme oeil contrôle réduisant de moitié le nombre d'animaux nécessaire. Ensuite, Compte tenu de la faible variabilité interindividuelle habituellement observée dans les études ophtalmologiques utilisant l'imagerie non invasive, ainsi que de notre objectif de comparer, par suivi clinique et histologie post-mortem, l'état des tissus oculaires des yeux contrôles (OG) et des yeux analysés (OD) pour chaque animal à l'aide d'une échelle de graduation semi-quantitative, et afin d'obtenir un échantillonnage suffisant pour effectuer une analyse statistique avec des tests de rangs non paramétriques (OG vs OD), nous avons déterminé qu'un minimum de 5 animaux est nécessaire pour tirer des conclusions valables. En effet, avec moins de 5 lapins, les tests statistiques perdent de leur pertinence, tandis qu'un nombre supérieur à 5 semble excessif.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant toute manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (sédation pendant les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie de suivi in vivo se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Seul l'observation avec l'OCT en contact avec l'oeil. Toutes les observations se feront sous anesthésie générale et l'OCT sera effectué sous AG + anesthésie locale. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale.

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que l'observation soit représentatif de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).

272 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir jusqu'à huit enregistrements de trente minutes en cylindre et douze épreuves de toucher léger de la peau, à raison de cinq par jour. La peau rasée sous anesthésie, chacune reçoit une injection d'une substance qui déclenche chez l'humain des démangeaisons persistantes, une partie d'entre elles recevant une semaine plus tôt un colorant destiné à marquer les cellules exposées. Le porteur annonce des démangeaisons d'intensité faible à modérée durant moins de deux secondes chacune, réparties sur vingt à trente minutes, et une douleur transitoire au point d'injection. Sur les 272, 232 seront tuées pour prélèvements ou parce que l'exposition à la substance interdit selon lui toute réutilisation, 20 seront réutilisées dans d'autres expériences et 20 placées.

Objectifs

Le projet vise à étudier une substance qui induit chez l’homme des démangeaisons persistantes par l’activation de nerfs de la peau. Sur la base de nos expériences précédentes menées sur des cellules, ce projet a 2 objectifs : 1) Etudier la capacité de la substance à induire des démangeaisons chez la souris suite à une administration locale au niveau de la peau, 2) Débuter l’étude des mécanismes impliqués par l’analyse de prélèvements post-mortem (peau et cellules des nerfs).

Bénéfices attendus

Actuellement, il n'existe aucun traitement spécifique des démangeaisons induites chez l’homme par la substance étudiée. Mieux connaître leurs mécanismes permettra à terme de développer des traitements spécifiques pour les soulager. Les bénéfices de ce projet en termes d’avancées scientifiques et thérapeutiques pourraient aussi s’étendre aux démangeaisons présentes dans d’autres maladies (eczéma, psoriasis).

Procédures

1) Rasage de la future zone d’injection, réalisé 1 fois sous anesthésie, éventuellement renouvelé 1 fois, durée maximale de 5 minutes. 2) Injection de la substance étudiée (1 fois) ou d’une substance contrôle (1 ou 2 fois espacées de 3 jours), durée maximale de 30 secondes. Sur les animaux destinés à obtenir des prélèvements : 3) Injection préalable, 1 semaine avant, d’1 substance permettant de colorer les cellules exposées.

Impact sur les animaux

1) Stress de faible intensité lors de l’anesthésie générale (durée < 5 min, réalisée 1 fois). 2) Stress et inconfort lors des manipulations et de l’injection (durée < 5 min, réalisées 1 fois ou 2 fois espacées de 3 ou 7 jours). 3) Stress lors de l’enregistrement des démangeaisons spontanées dans un cylindre (durée 30 min ; réalisé 1 à 8 fois, maximum 1 fois/jour). 4) Stress lors des mesures répétées des démangeaisons induites par le toucher léger dans une cage ouverte (réalisées 1 à 12 fois, maximum 5 fois/jour, durée < 7 min). 5) Démangeaisons spontanées localisées, d’intensité faible à modérée, intermittentes, d’une durée < 2 secondes chacune, réparties pendant 20-30 minutes suivant l’injection réalisée 1 fois. 6) Démangeaisons localisées induites par à un toucher léger, d’intensité faible, d’une durée < 1-2 secondes uniquement en réponse au toucher léger appliqué 10 fois en 7 min. Épreuve réalisée 1 à 12 fois au total, maximum 5 fois/jour. 7) Douleur d’intensité faible localisée au point d’injection et très transitoire (5 premières minutes suivant l’injection réalisée 1 fois).

Devenir

En fin de procédure, il est prévu la mise à mort de tous les animaux destinés à des prélèvements post-mortem de tissus à des fins d'analyses (histologiques et fonctionnelles : 132 animaux de la procédure 3) ou qui auront été exposés à la substance étudiée, ce qui interdit leur réutilisation, replacement ou adoption (100 animaux de la procédure 2), soit au total 232 animaux. Les 40 autres (4 de la procédure 1 + 36 de la procédure 2) seront ré-utilisés (20 animaux) ou placés (20 animaux).

Remplacement

Depuis plus de 10 ans, nous étudions les effets de la substance sur des modèles cellulaires. Nous avons montré l’implication de plusieurs mécanismes qui, cependant, peuvent aussi être à l’origine d’autres sensations que les démangeaisons, que nos modèles cellulaires ne permettent pas de distinguer. Nous continuerons à utiliser ces modèles cellulaires pour cette étude mais nous ne pouvons donc pas nous passer de l’expérimentation animale pour étudier les démangeaisons induites et leurs mécanismes. Un 2ème aspect est l’implication de multiples types cellulaires dans les démangeaisons. Ces cellules ne peuvent pas être rassemblées dans un modèle cellulaire. Nous ne pouvons pas nous passer de l’expérimentation animale pour prendre en compte l’ensemble de ces types cellulaires.

Réduction

L’ensemble du projet a été conçu en vue de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés sans compromettre les objectifs ou l’analyse statistique des résultats. Notre démarche de réduction se base tout d’abord sur les résultats de nos travaux précédents sur modèles cellulaires, et se poursuivra sur ceux qui seront obtenus lors de ce projet, pour ne réaliser que les expériences les plus pertinentes scientifiquement. Étant donnée la variabilité́ des démangeaisons induites par la substance, nous prévoyons 20 animaux/groupe pour garantir des résultats robustes. Cependant, nous réaliserons toujours une 1ère série d’expériences sur 12 souris (minimum pour que des résultats se dessinent) suivie de son analyse, et ne complèterons que si nécessaire d’après ces 1ers résultats. Le nombre d’animaux prévu est un maximum qui sera réduit autant que possible en pratique.

Raffinement

Les responsables du projet mettront en œuvre des mesures pour assurer et maintenir le bien-être de chacun des animaux : enrichissement des cages, habituation des animaux aux manipulations et aux tests, renforcement positif, points limites et stratégie d’analgésie.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée comme modèle d’étude des démangeaisons. Le développement des nerfs impliqués dans les démangeaisons évolue chez la jeune souris jusqu’à l’âge de 3-4 semaines. Leur état de développement est stable à partir de l’âge de 5 semaines. Les souris âgées ne sont pas appropriées du fait de modifications physiologiques dues à l’âge. Nous utiliserons des animaux adultes âgés de 8 à 16 semaines.

Les souris utilisées appartiennent à des lignées dont la rétine dégénère rapidement, l'une perdant sa réponse électrophysiologique dès quatre mois. 540 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une injection sous la rétine, qui peut provoquer un décollement rétinien, une opacification de la cornée ou des saignements dans l'œil, puis passe des séances d'électrorétinographie et de tomographie sous anesthésie à six âges différents, une partie subissant en plus un test de réflexe optomoteur de trois fois vingt minutes à cinq âges et un test clair-obscur. La mise à mort sert à prélever les rétines pour des marquages histologiques et des analyses transcriptomiques, l'ensemble visant à documenter une thérapie génique avant un éventuel essai clinique.

Objectifs

Plus de 200 gènes sont actuellement associés à la cécité congénitale. Bien que la thérapie génique ait été proposée pour un grand nombre de ces gènes, cette approche présente des limites. Nous avons la preuve que l'introduction d'une copie saine d'un gène spécifique impliqué dans le développement des photorécepteurs (cellules de détection de la lumière dans l'œil) peut retarder la perte de vision. Pour explorer plus avant cet effet thérapeutique, nous utiliserons deux modèles murins différents de cécité congénitale causée par des mutations dans différents gènes. Notre objectif est d'établir l'effet thérapeutique et d'élucider les mécanismes à l'origine de cet effet.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, peu de thérapies sont proposées aux patients atteints de rétinopathies. La plupart permettent uniquement de ralentir la dégénérescence. Certaines, plus efficaces, sont uniquement proposées en fonction de votre mutation. Nous réalisons ce projet afin de développer une thérapie génique efficace pour de rétinopathies. Nous espérons par ce projet démontrer l’efficacité de notre traitement sur plusieurs modèles animaux, qui serviront de preuves de concept, ou d’études précliniques, nécessaires à réaliser en amont d’essais chez les patients. Le but est de poursuivre vers un essai clinique.

Procédures

Toutes les souris recevront une injection sous rétinienneous. Par la suite, les animaux seront soumise a ERG (mesure non invasive de la réponse électrique de la rétine à un stimulus lumineux) et un OCT (visualisation non invasive de la rétine en coupe chez la souris) sur les deux yeux (environ 20/30 minutes) à 6 âges diffeérents. Une autre partie des souris passeront un test de reflexe optomoteur (3 x 20 minutes espacés d’1 heure minimum) à 5 âges diffeérents. Ce test permet de quantifier les reflexes oculaires de la souris et se fait donc sur animal vigil. Elles pourront également réaliser un test comportemental appelé clair/obscur (5 minutes), ou la souris est filmée en train d’explorer une boite soit noire soit éclairée.

Impact sur les animaux

Les anesthésies répétées peuvent être dommageables pour les souris, mais elles sont espacées de 14 jours minimum. L’injection sous rétinienne peuvent provoquer un décollement rétinien qui se résorbe en 48h. Une opacification de la cornée peut être observée malgré l’ajout systématique de gel ophtalmique. Si une cataracte apparait néanmoins, elle se résorbe normalement d’elle-même rapidement. Si les animaux présentent des saignements anormaux dans l’œil lors de l’injection ou avant leur réveil.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, afin de récupérer les rétines et réaliser des marquages immunologiques sur les coupes histologiques, ou analyser les effets de notre traitement au niveau transcriptomique et protéique.

Remplacement

Le projet visant la validation d’une stratégie thérapeutique pour le traitement de maladies rétiniennes, une validation de ces approches in vivo est un prérequis des agences réglementaires avant la mise en place d’essais cliniques. Il est également fondamental de travailler sur des modèles animaux présentant des pathologies comparables à celles développées chez l’Homme. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie également par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de neurones dont les interactions sont cruciales pour générer un signal visuel correct. Dans ce contexte il est essentiel de travailler in vivo car les processus de mort cellulaire, de neuroprotection, ou de réparation sont totalement dépendants de l’environnement cellulaire. Pour ces différentes raisons, des méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

L'étude préclinique s'étendra sur une période de deux ans et a pour but d'évaluer l'efficacité d'une nouvelle approche thérapeutique pour une maladie ophtalmique. Cette thérapie sera expérimentée sur deux lignées de modèles animaux. L'objectif est de confirmer l'efficacité du traitement sur un vaste panel de patients et de comprendre son mode d'action. La première phase de l'étude consistera à identifier la dose optimale à administrer à chaque modèle animal. Par la suite, une comparaison de l'efficacité du traitement sera effectuée. Seuls les animaux ayant reçu la dose la plus efficace seront soumis aux étapes ultérieures. L'objectif de cette étude est d'obtenir entre 7 et 10 yeux par traitement, afin de garantir des résultats statistiquement pertinents. Ce chiffre a été établi sur la base de données scientifiques. Seuls les animaux ayant été correctement injectés dans au moins un œil seront pris en compte dans l'analyse. Il est également possible que le nombre de modèles animaux soit réduit en fonction des résultats obtenus. Si, après un certain temps, le traitement s'avère inefficace, l'étude sera interrompue.

Raffinement

Durant l’injection sous-rétinienne, une anesthésie locale sera effectuée en plus de l’anesthésie générale. Une goutte de gel oculaire hydratant sera déposée sur l’œil des animaux pour préserver la cornée. Les animaux seront ensuite surveillés jusqu’au réveil. Afin de prévenir une éventuelle douleur, les animaux recevront un anti-inflammatoire suite à l’opération. Ils seront observés quotidiennement pour surveiller l’apparition éventuelle d’infection oculaire. Une grille de score adaptée est utilisée pour apprécier l’état des animaux, ce système comprend des points limites précoces qui permettent de détecter les premiers symptômes de douleur ou d’inconforme et d'intervenir rapidement.

Choix des espèces

La thérapie génique que nous souhaitons développer nécessite d’être validée in vivo avant d’être testée chez l’homme. Afin d’être le plus proche des pathologies humaines que nous souhaitons traiter, et ainsi évaluer les bénéfices/risques de notre approche thérapeutique, nous prévoyons d’utiliser des souris comme modèle d’étude. L’existence de lignées de souris atteintes naturellement ou non de dégénérescence rétinienne en fait un excellent organisme modèle pour notre projet. Nos modèles sont bien établis en recherche ophtalmologique. Chaque modèle est différent, et les temps choisis pour les injections correspondent aux contraintes imposées par la dégénérescence rétinienne. Comme nous connaissons les modèles animaux que nous allons utiliser, nous pouvons définir le temps auquel il est plus pertinent d’injecter nos AAV, ainsi que les temps auxquels il faudra réaliser les expériences. Les rétines des souris utilisées dégénèrent très rapidement. Nous injectons donc à 14 jours aprés naissance et regarderont 21 jours plus tard les effets de l'injection. Les souris d'une autre lignée présentent une faible réponse électrophysiologique (ERG) dès l'âge de 4 mois, c'est pourquoi nous réaliserons les injections 30 jours après la naissance et examinerons l'efficacité de ces injections 30 jours plus tard. Nous observerons ensuite les effets de notre traitement entre 3 semaines et 1 an après injection.

1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 900 d'entre elles reçoivent pendant douze semaines un régime gras destiné à provoquer un diabète de type 2, les 108 autres étant diabétiques par modification génétique, puis chacune subit sous anesthésie l'ouverture d'une plaie dans la peau du dos, avec un dispositif de recueil implanté autour et un suivi de quinze à vingt jours. Le porteur signale que le régime gras rend souvent les souris agressives envers leurs congénères et que la plaie devient douloureuse quand l'animal doit s'étirer. Sur le remplacement, il décrit des tests sur cellules ayant servi à présélectionner les traitements, sans indiquer ce qui empêche d'aller plus loin sans animaux.

Objectifs

De nos jours, la cicatrisation des patients diabétiques et des sujets agés demeure un enjeu social et économique crucial. De précédents travaux ont démontré un retard dans la vitesse de cicatrisation chez différents modèles murins diabétiques, causé par un état inflammatoire persistant. Aucune stratégie thérapeutique n’a encore permis d’apporter de véritables solutions efficaces, dans l’amélioration de la vitesse de cicatrisation chez le patient diabétique de type 2. La compréhension de la dérégulation des mécanismes cellulaires et moléculaires du processus cicatriciel chez le diabétique représente donc un enjeu essentiel pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le dispositif placé sur le dos de l'animal permet de récolter in situ la totalité de l’exsudat présent sur la plaie. Cette méthode de prélèvement préserve l’intégrité morphologique et fonctionnelle de différentes populations cellulaires et de différents médiateurs contenus dans l’exsudat, permettant de suivre l’évolution de la phase inflammatoire et de sa résolution. Notre dispositif nous donne ainsi une vraie « image de la plaie » et de son environnement. Ce dispositif permet l’administration de solutions à travers un septum directement sur la plaie et plus particulièrement de nouveaux principes actifs pouvant agir sur la vitesse de cicatrisation. Ainsi, les avancées récentes sur la compréhension de la dérégulation de la cicatrisation chez les patients diabétiques, notamment sur l’implication des macrophages, et notre savoir-faire sur ces cellules, ouvrent de nouvelles perspectives quant aux stratégies expérimentales à développer. L’exploitation de nos résultats de recherche et l’utilisation de notre dispositif expérimental innovant rendent possibles : i) le test de nouvelles molécules par application topique et; ii) la caractérisation des populations cellulaires présentes aux différentes étapes de ce processus (phase inflammatoire, phase de résolution, phase de réparation) sur un même animal, et iii) l’étude de nouveaux mécanismes d’actions favorisant la cicatrisation chez le patient diabétique en déterminant des cibles thérapeutiques(animaux génétiquement modifiés, administration de cellules pro-resolutives ).

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime gras afin d’induire un diabète de type 2 pendant 12 semaines (900 souris). Les animaux diabétiques soumis au régime gras (900) ou génétiquement diabétiques (108) subiront ensuite une procédure chirurgicale sous anesthésie permettant de créer une lésion cutanée dorsale et un dispositif non invasif sera implanté sur le pourtour de la plaie (1008 souris). La durée de l’anesthésie et de l’intervention est de 10min par animal. Les animaux seront suivis pendant 15-20 jours (observations de leur état général et suivi de la fermeture de la plaie par photographie). Les traitements cicatrisants seront administrés soit par injection intrapéritonéale (durée de quelques secondes), soit dans l’eau de boisson ad libitum ou par gavage (durée de quelques secondes), ou directement sur la plaie (durée de quelques secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux soumis à un régime gras afin d’induire un diabète de type 2 présentent très souvent un comportement agressif vis-à-vis de leurs congénères. La formation de la plaie peut induire de la douleur et l’animal peut modifier son comportement en réduisant ces mouvements. Le traitement par voie topique commencera 3 jours post-lésion. Il sera appliqué une fois par jour jusqu’à la cicatrisation complète. Ce mode d’administration sera privilégié car le dispositif facilite le traitement topique et ne génère aucune souffrance à l’animal. Pour le traitement par gavage ou dans l’eau de boisson peuvent altérer la prise hydrique.

Devenir

A l’issue du régime hyperlipidique et du suivi de la plaie, les animaux seront sacrifiés afin de prélever les tissus cicatriciels à différents temps post-lésion.

Remplacement

Nous testerons plusieurs types de traitements par voie topique et par voie orale qui sont susceptibles de pouvoir améliorer la cicatrisation chez les patients diabétiques. Ces traitements, auront été présélectionnées via des résultats préliminaires réalisés en amont de ces études. Ces études sont basées sur des tests in vitro qui permettent d’appréhender les effets potentiels des traitements sur les processus cicatriciels (contraction, migration et prolifération cellulaires, différenciation…). Les cellules pro-résolutives auront également été sélectionnées en amont grâce à des tests in vitro au laboratoire (cellules myéloides et mesenchymateuses).

Réduction

Les résultats actuels ont permis de valider, en fonction des différents et nombreux paramètres à évaluer, qu’un nombre de 9 souris par lot est nécessaire afin d’acquérir des données suffisantes et permettre d’effectuer des tests statistiques fiables. L’expérience et les données déjà acquises sur des souris contrôles nous permettrons de comparer la fiabilité de nos données et d’éviter l’utilisation inutile d’animaux (éviter le double emploi).

Raffinement

Au cours du régime gras, les animaux seront pesés 1x/semaine. Au cours du processus de cicatrisation, une surveillance journalière sera effectuée afin de suivre le poids par une pesée mais aussi le comportement des animaux. La perte de poids (20% maximum), le changement de posture (recroquevillée, tremblement...), la modification d’activité (isolement, difficulté respiratoire) et l’aspect des poils sont des signes de douleurs qui seront des critères d’arrêt de l’étude. Bien que le dispositif n’entrave pas le mouvement des animaux, la plaie peut être douloureuse lorsque l’animal doit s’étirer. Suite à la création de la lésion cutanée pratiquée sous anesthésie sur le dos des animaux, des biberons avec embouts longs, ainsi que des croquettes humidifiées permettront de faciliter l’hydratation et la prise de nourriture de ces souris. Ces aménagements permettront de limiter les déplacements et les redressements des animaux pour se nourrir. L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures sur l’état de santé global des animaux.

Choix des espèces

Les souris représentent le modèle préclinique idéal. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés. Cette approche permettra d'étudier des mécanismes moléculairesafin de définir des cibles thérapeutiques. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. De plus, le modèle de souris diabétique mime la physiopathilogie du diabète observée chez l'homme avec une inflammation chronique à bas bruit altérant les mécanismes de cicatrisations. Le diabète de type 2 est essentiellement observé à l’âge adulte. Des souris présentant un état diabétique spontané et une obésité caractéristique du diabète de type 2, comme rencontré chez l’homme, seront utilisées entre 7 et 12 semaines. Le modèle du diabète de type 2 sera induit chez des souris mâles âgées de 6-7 semaines (stade adulte) par un régime riche en graisses (régime diabétogène) pendant 12 semaines minimum. L’âge influençant la cicatrisation, les expérimentations pourront être effectuées sur des animaux âgées entre 12-20 mois.