Troubles endocriniens

Tester pour le compte d'un laboratoire pharmaceutique client l'efficacité d'un composé anti-obésité : 40 souris mâles rendues obèses par un régime gras vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reste isolée en cage individuelle pendant 49 jours à 30 degrés, reçoit 35 administrations orales, subit 9 prélèvements sanguins, 13 pesées et des jeûnes de 4 à 8 heures. Le porteur reconnaît que l'isolement constitue une nuisance pour une espèce sociale, et que les traitements par voie orale comme les prises de sang sont "source de douleurs aiguës et de stress". Il indique que le composé a déjà été étudié sur des modèles sans animaux, et présente l'étape sur l'animal entier comme une exigence réglementaire "incontournable" avant une première étude chez l'humain.

Objectifs

Le présent projet sera mené pour le compte d'un laboratoire pharmaceutique client qui développe des thérapies de première classe pour traiter les causes sous-jacentes du dysfonctionnement organique chez les patients atteints de troubles métaboliques graves, notamment l'obésité et le diabète, en ciblant les voies fondamentales du métabolisme énergétique. Parmi ses thérapies en développement, notre client a développé le composé X qui a été développé afin d'augmenter les dépenses énergétiques et d'améliorer la santé métabolique et cardiovasculaire des patients souffrant d'obésité et de troubles métaboliques associés. L'étude faisant l'objet de la présente demande visera à tester l'efficacité du composé X chez un modèle de souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse. Compte tenu du mécanisme d'action du composé X qui conduit à une activation des dépenses énergétiques, les souris seront hébergées en thermoneutralité. La thermoneutralité correspond, pour la souris, à une température de 30 degrés à laquelle l'animal n'a pas besoin de dépenser d'énergie pour lutter contre le chaud ou contre le froid. Il s'agit d'une des conditions les plus favorable à l'observation d'un effet du composé X.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (13 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou du candidat médicament par voie orale (35 administration; durée : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée : 2 minutes); 4) Prélèvements sanguins (9 prélèvements; durée du prélèvement : 1 à 5 minutes selon le mode de prélèvement); 5) Administration d'une charge orale de glucose (1 administration, durée : 1 min); 6) Anesthésie préalablement à l'euthanasie (1 anesthésie, Durée,15 min); 6) Un hébergement individuel en cage standard (49 jours pour tous les animaux).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle, qui est nécessaire du fait du besoin de mesurer la prise alimentaire individuelle des animaux, constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements par voie orale, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins et celle de 8h préalable au test oral de glucose, bien que réalisés en phase diurne, pourront induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultérieures (imagerie, histologie, dosage de protéines impliquées dans les dépenses énergétiques...)

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode alternative n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire, les dépenses énergétiques et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées sur des modèles n'utilisant pas l'animal dans les premières phases de son développement, l'étude sur l'animal entier reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de première étude sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 8 animaux, contre 10 pour les groupes expérimentaux constitués de souris obèses, compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité des paramètres étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par gavage seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 17 semaines (24 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.

1 980 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à vingt-deux injections dans l'abdomen, douze prélèvements de sang à la queue et douze semaines de régime enrichi en graisses. S'y ajoutent une biopsie de la queue, deux jeûnes de six et seize heures, un gavage, une injection dans le sinus rétro-orbitaire et une perfusion intracardiaque sous opioïde, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont mises à mort à l'issue pour prélever les organes. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, mettre en lumière le rôle du système nerveux dans la fonction du pancréas.

Objectifs

Le pancréas est central dans la régulation de la glycémie. Il produit les hormones permettant de réguler la glycémie. Comme tous les tissus, le pancréas est relié au cerveau par le système nerveux périphérique. Cependant, son rôle dans la fonction du pancréas n’est pas bien connu. Dans ce projet nous proposons d’étudier la contribution du réseau nerveux dupancréas, et notamment dans la sécrétion des hormones régulant la glycémie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en lumière le rôle du système nerveux dans la fonction du pancréas.

Procédures

1 biopsie de queue (10s), 1 régime riche en gras (12 semaines), 9 à 22 injections intra-peritonéales (20s), 1 injection sous-cutanée (10s), 2 jeun (6h et 16h), 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 injection intra-veineuse (5s), 1 chirurgie sans réveil (10min), 1 gavage (1min).

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéale : douleur légère due à la piqure. -Injection intra veineuse rétro-orbitale : gêne, douleur légère au point d'injection. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment de l'injection. -Injection sous- cutanée : douleur légère due à la piqure. -Obésité : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Biopsie de queue : douleur modérée.-Gavage : contention soutenue et introduction de la sonde.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure pour permettre le prélèvement des organes d'intérêt.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier le rôle du système nerveux du pancréas en condition normale et de stress glycémique, tels que l'obésité et la mise à jeun. Le pancréas répond à la prise et la perte de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Une étude pilote avec des petits nombres d’animaux a été inclue pour mettre en place des protocoles adaptés et réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères. Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’opioïdes et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours (souriceaux) et 22 semaines (adultes).

Un client pharmaceutique fait tester son candidat médicament anti-obésité à un stade précoce de développement. 48 souris mâles rendues obèses par un régime dont 60 % des calories viennent des graisses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit 95 administrations sous-cutanées et 19 injections intrapéritonéales, subit 45 pesées, cinq prélèvements sanguins précédés d'un jeûne de quatre heures et deux séjours de 72 heures en mesure de dépenses énergétiques, le tout en cage individuelle. L'étude est limitée aux mâles pour ne pas doubler les effectifs, une seconde étude sur des femelles n'étant envisagée que si une efficacité est observée chez les mâles.

Objectifs

Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse, en administration seule ou combinée avec un autre composé anti-obésité déjà autorisé sur le marché. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament seul sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité. Dans le cadre des administrations combinées avec le sémaglutide, l'objectif est d'observer un additivité des effets et, ainsi, une amélioration des effets de la combinaison comparativement au sémaglutide seul.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (45 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou du candidat médicament par voie intrapéritonéale (19 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Administrations de véhicule ou de composé de référence par voie sous-cutanée (95 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (5 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Mesures de dépenses énergétiques (2 sessions de mesures de 72h); 7) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux et sous-cutanés, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 8 animaux, contre 10 pour les groupes expérimentaux constitués de souris obèses, compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie intrapéritonéale et sous-cutané seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 20 semaines (35 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.

900 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, chacune passant trois heures immobilisée dans un tube de contention pour un test de tolérance au glucose et 72 heures isolée en cage de calorimétrie, série de tests répétée jusqu'à trois fois sur les 20 à 30 semaines du protocole. Elles reçoivent un gavage de sucrose, des injections d'insuline, cinq gouttes de sang prélevées à la queue par test, et un régime enrichi en graisses et en sucre qui les fait grossir et provoque des lésions cutanées d'hypertoilettage. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour analyser leurs organes. Le porteur renvoie à "plus long terme" le développement de médicaments contre le diabète et l'obésité, pour un projet qui compare des groupes de neuf animaux par gène étudié, à raison de cinq gènes par an pendant cinq ans.

Objectifs

Le but de ce projet est d'étudier le rôle de gènes potentiellement impliqués dans la régulation du métabolisme chez les mammifères. Chaque projet se focalisera sur un gène d'interêt disposant d'éléments de la littérature justifiant son analyse dans un modèle physiologique complet. Afin de déterminer ce rôle, nous disposons du modèle Souris qui permet des modifications génétiques capables d'annuler la présence de ce gène chez l'animal. En retirant le gène de l'organisme, nous pouvons ainsi étudier comment les réponses à différentes variables métaboliques sont impactées. Ainsi, nous souhaitons comparer des souris contrôles à des souris génétiquement modifiées pour un gène, en présence ou non d'un régime enrichi en graisses et/ou en sucre, selon les mécanismes d'actions supposés du gène ciblé. Le facteur sexe pourra aussi être étudié, selon le gène cible. La mise en place d'une obésité ou d'une affection du foie liée à ce régime enrichi sera suivie par différentes analyses au cours du temps, et les données générées permettront de déterminer l'impact de la modification génétique dans ce cadre. Pour chaque gène analysé, nous prévoyons de comparer des groupes de 9 animaux pour chaque condition, soit 36 animaux par gène étudié. Durant la durée de ce projet, nous anticipons 5 études par année, soit un total de 36 animaux * 5 projets * 5 ans, soit 900 souris au maximum. Chaque projet contiendra 4 groupes expérimentaux de 9 animaux : Deux schémas expérimentaux sont ainsi possibles : 1) étude de l'effet de la diète, en se focalisant sur un seul genre male ou femelle controle avec une diète classique / controle avec une diète enrichie / animal mutant avec diète classique / animal mutant avec une diète enrichie 2) étude de l'effet du genre : controle male avec une diète enrichie / controle femelle avec une diète enrichie / animal mutant male avec une diète enrichie / animal mutant femelle avec une diète enrichie. Dans certaines études, une analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de progresser dans la connaissance que nous avons sur les gènes étudiés, en recherche préclinique. Les données générées nous permettront de mettre en évidence des pistes thérapeutiques potentielles qui seront utilisées pour le développement de nouveaux candidats médicaments dans le cadre des pathologies liées à la régulation de la glycémie (diabete) et de l'obésité ainsi qu'aux comorbidités cardiaques. A plus long terme, ces données pourront permettre le développement de médicament chez l'Homme.

Procédures

Durant ce protocole, des cohortes de 36 animaux suivront une série de protocoles qui viseront à déterminer l'effet d'un régime enrichi sur les fonctions métaboliques. Pour cela, nous effectuerons un test de tolérance au glucose, dans lequel l'animal reçoit un gavage de sucrose suivi de 5 prélevement d'une goutte de sang à la queue afin de suivre sa glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes) ; tout comme peut le faire l'homme en cas de diabète. Un test de sensibilité à l'insuline sera aussi effectué, assez similaire au précédent mais avec une injection intrapéritonéale d'insuline entrainant une réduction de la glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes). Ce test permet de vérifier si un diabète de type I ou type II est installé chez l'animal. Ces deux tests durent environ 3 heures durant lesquelles l'animal est placé dans un tube de contension afin de prélever des gouttes de sang à plusieurs temps (5 gouttes sur la durée du test). Un test de calorimétrie permet de vérifier la consommation en oxygène des animaux et nécessite d'isoler les souris durant 72h, ce qui peut être un stress d'isolement. Néanmoins, elles retrouvent ensuite leurs groupes sociaux. Enfin, des prélevements sanguins seront effectués pour suivre l'évolution des paramètres biochimiques. Ces prélevements se font en quelques minutes. Là encore, nous définissons des volumes réduits pour éviter un impact sur le bien-être des animaux. Et une durée de récupération d'au moins deux semaines est appliquée après un prélevement sanguin. L'ensemble des ces procédures expérimentales pourront être répétées au maximum trois fois durant la durée du protocole durant les 20 à 30 semaines de durée du protocole, en espacant chaque geste pour éviter un stress cumulatif et donc un effet négatif sur l'animal. Dans certaines études, une analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités. Cette évaluation cardiaque pourra être effectuée deux fois au maximum et implique une anesthésie gazeuse de 30 minutes environ. L'ensemble du protocole sera réalisé environ 5 fois par an sur des lignées différentes durant une période de 5 ans (soit un total maximal théorique de 900 animaux) Amendement: Pour tester la fuite vasculaire une l'injection en intra-veineuse d'un colorant, sous anestésie gazeuse terminale, sera réalisée. Amendement 2: 2 injections intrapéritonéales.

Impact sur les animaux

Durant ce projet, les animaux subiront des prélevements sanguins, des mesures de la glycémie et de la sensibilité à l'insuline. Dans ce cadre, ils seront immobilisés durant quelques heures et prelevés de gouttes de sang. Durant la mesure de calorimétrie, les animaux seront isolés durant 72h ce qui peut créer un stress temporaire d'isolement. Les animaux prendront du poids du fait du régime enrichi, ce régime peut apporter aussi des lésions cutanées qui sont liées à un hypertoilettage des animaux. Ces lésions sont traitées localement et se résolvent rapidement. Si la fonction cardiaque est évaluée, les animaux seront anesthésiés durant environ 30 minutes et de fines électrodes seront piquées en surface de la peau des pattes pour obtenir le signal électrique. Amendement 2: une anesthésie peut induire un inconfort lors du reveil des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour collecter des tissus qui seront analysés histologiquement afin de déterminer l'impact de ce régime et de la mutation sur les organes.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification génétique d'un gène sur des fonctions métaboliques complexes. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (homéostasie glucidique et lipidique et fonction cardiaque). Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Le modèle Souris nous permet d'accéder à une première approche de ces phénomènes physiologiques complexes afin de comprendre comment ceux-ci se transposent chez l'Homme. Par ailleurs, il permet des modifications génétiques ce qui facilite la compréhension du rôle des différents gènes que nous prévoyons d'étudier.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 9 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données paramétriques (poids, glycémie, paramètres sanguins, consommation d'oxygène, paramètres cardiaques) qui seront analysées à l'aide d'analyses de variances à deux facteurs, répétées pour les mesures ayant lieu dans le temps (suivi du poids ou de la glycémie). Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seul cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Durant les prélevements sanguins, nous réaliserons des injections de sérum physiologique tiède afin de compenser la perte hydrique. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Par ailleurs, nous nous efforcerons de fournir les meilleurs conditions d'hébergement possible avec la présence d'un enrichissement. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Durant l'ensemble des procédures, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être. Le cas échéant, une couverture pharmacologique pourra être employée, et adpatée en accord avec notre vétérinaire (analgésie, antiseptiques..)

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement de modèles d'intérêt porteurs de modifications génétiques sur les gènes d'intérêt. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 6 semaines. A ce stade, ils ont déjà une régulation métabolique qui est mise en place.

60 souris vont être privées de nourriture pendant vingt-quatre heures, puis tuées pour qu'on prélève leurs îlots pancréatiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le jeûne fait baisser leur activité, leur température corporelle et leur poids. L'objet est de séquencer les noyaux de leurs cellules pancréatiques pour repérer les gènes dont l'expression change avec le jeûne, dix souris étant utilisées par point de séquençage. Le porteur écrit à deux reprises qu'un jeûne de vingt-quatre heures ne met "en aucun cas" en danger des souris en bonne santé, pour des procédures qu'il déclare lui-même de gravité modérée.

Objectifs

Le maintien de la balance énergétique dépend de l'équilibre entre les apports et les dépenses énergétiques. Il existe des systèmes de régulation de la prise alimentaire qui permettent un équilibre entre les apports énergétiques, les dépenses et le maintien du poids corporel. Une dérégulation de ce système peut conduire à l'obésité et aux maladies métaboliques qui lui sont associées, comme le diabète. Au laboratoire, nous étudions le développement de l'obésité et ses altérations métaboliques. Dans cette nouvelle étude, nous nous proposons d'analyser la réponse des tissus actifs en réponse au jeûne. Le jeûne est connu pour induire des changements significatifs dans l'expression génique des tissus tels que le cerveau, le pancréas, le foie, les muscles et le tissu adipeux, qui jouent un rôle crucial dans la régulation énergétique et métabolique. Notre objectif est de caractériser ces changements au niveau moléculaire pour mieux comprendre les mécanismes par lesquels le jeûne influence la balance énergétique et le métabolisme global. En utilisant des technologies de nouvelle génération, nous chercherons à identifier les gènes dont l'expression est modifiée par le jeûne et à élucider les voies de signalisation impliquées. Les résultats de cette recherche pourraient fournir des informations précieuses pour le développement de stratégies thérapeutiques visant à améliorer la santé métabolique et à prévenir les maladies associées à une dérégulation de l'équilibre énergétique telles que l'obésité et le diabète.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette recherche pourraient fournir des informations précieuses pour améliorer la santé métabolique et prévenir les maladies associées à une dérégulation de l'équilibre énergétique. Bénéfices attendus pour ce projet : nous pourrons identifier de nouvelles cibles potentielles pour des interventions thérapeutiques visant à traiter ou prévenir les maladies métaboliques telles que l'obésité et le diabète.

Procédures

60 animaux seront mis à jeûn durant 24H.

Impact sur les animaux

Un jeûne prolongé de 24H sera nécéssaire avant le prélèvement des tissus des souris. Ce jeûne va entrainer de nombreux effets, notamment metaboliques, sur le systeme digestif, immunitaire, etc, mais ne met en aucun cas en danger les animaux. Un jeûne de 24H pour une souris en bonne santé tel que dans notre cas peut entrainer une baisse de son activité, de sa température corporelle et une légère perte de poids.

Devenir

Après la période de jeûne de 24H qui ne met pas en danger les animaux, les animaux seront euthanasiés et une préparation d'îlots pancréatiques sera faite afin de recueillir les noyaux des cellules, et de les séquencer. Il en sera de même pour les animaux contrôle qui n'auront pas jeûné.

Remplacement

La régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris. Les modèles in vitro ou d'organismes inférieurs ne permettent pas de reproduire l'intégralité de ces interactions physiologiques complexes. Ainsi, l'utilisation de la souris est essentielle pour obtenir des résultats pertinents et transposables aux mécanismes chez les mammifères, y compris les humains. Nous utiliserons des tissus de souris afin de réaliser des séquençages spécifiques. Cette approche permet d'obtenir des données détaillées sur l'expression génétique à l'échelle cellulaire.

Réduction

Nous utiliserons un total de 60 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Une préparation d'îlots pancréatiques provenant d'une souris permet de recueillir environ 30 000 noyaux. Étant donné que 300 000 noyaux sont nécessaires pour réaliser un point de séquençage, 10 souris seront nécessaires pour chaque point de séquençage. Nous prévoyons de réaliser 6 expériences indépendantes, nécessitant ainsi un total de 60 souris. Cette approche nous permet de maximiser les informations obtenues tout en minimisant le nombre total d'animaux utilisés, en conformité avec les principes de réduction. Nous déterminerons si la distribution des échantillons suit une loi normale. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés pour déterminer le nombre optimal d'animaux à utiliser et pour analyser les données obtenues.

Raffinement

Les cages seront étiquetées pour cette procédure et les animaux seront surveillés par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort, cependant un jeûne de 24H ne met en aucun cas en danger des souris en bonne santé. Les animaux conservent leurs congénères et leurs conditions d'hébergement avec accès à l'eau de boisson et un carré de chanvre est mis à leur disposition permettant la fabrication d'un nid utile pour préserver leur température corporelle, pendant ces 24H.

Choix des espèces

Pour étudier le métabolisme, la souris est le modèle animal de référence. Ce choix est justifié par plusieurs raisons : Similitudes physiologiques et génétiques avec l'humain : La souris partage de nombreuses similitudes physiologiques et génétiques avec l'humain, ce qui permet de transposer plus facilement les résultats obtenus chez la souris aux humains. Cela est particulièrement pertinent pour les études sur le métabolisme et les maladies métaboliques telles que l'obésité et le diabète. Historique de recherche étendu : Il existe une vaste base de données et une longue histoire d'utilisation des souris dans la recherche biomédicale, fournissant un contexte riche et des outils bien développés pour l'analyse des résultats. Les souris sont donc bien caractérisées en termes de biologie et de réponses métaboliques, facilitant les comparaisons et l'interprétation des données. Les souris seront utilisées à l'âge de 10 semaines pour plusieurs raisons importantes: À l'âge de 10 semaines, les souris ont atteint un stade de développement où leur physiologie, y compris leur métabolisme, est généralement stable. Cela permet de minimiser les variations dues à la croissance et au développement, assurant ainsi une plus grande cohérence des résultats expérimentaux. L'utilisation de souris âgées de 10 semaines offre une combinaison optimale de maturité physiologique, de stabilité métabolique, de standardisation des conditions expérimentales et de comparabilité avec la littérature existante, ce qui en fait un choix approprié pour notre étude sur les mécanismes métaboliques en réponse au jeûne.

7 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une administration du composé et trois prélèvements sanguins. Les prélèvements se font par ponction de la veine caudale et par ponction sous la mandibule, et les composés sont administrés par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse ou par gavage, avec les risques que le porteur énumère lui-même : perforation d'organes internes, œdèmes, hématomes, perforation de l'œsophage, passage du liquide dans les poumons. L'objet reste en amont de tout traitement, il s'agit de mesurer comment cinq variantes d'une protéine antidiabétique se répartissent dans le corps selon la dose et la voie d'administration. Le porteur affirme par ailleurs que trois animaux par condition suffisent, sans que le passage de ce chiffre à 7 560 souris soit détaillé.

Objectifs

Notre recherche porte sur le diabète de type 1 (DT1), une maladie caractérisée par la destruction des cellules du pancréas qui produisent de l'insuline. Cela entraîne des hyperglycémies chroniques pouvant provoquer de graves complications vasculaires. Nous avons identifié une protéine capable de régénérer ces cellules et développé cinq variantes de cette protéine, que nous avons testées sur des souris diabétiques. Nos résultats préliminaires montrent que ces protéines peuvent stimuler la prolifération des cellules productrices d'insuline, ce qui pourrait en faire des traitements prometteurs pour le DT1. Pour développer un médicament antidiabétique, nous souhaitons analyser le comportement de ces nouvelles protéines dans le corps (pharmacocinétique) afin de déterminer la meilleure dose et la meilleure méthode d'administration. Chaque variante de la protéine étant unique, nous devons tester différentes combinaisons de méthodes et de doses pour comprendre leur fonctionnement. Nous testerons donc cinq concentrations différentes avec quatre méthodes d'administration (intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse et orale) sur trois modèles de souris : des souris saines pour garantir des résultats représentatifs des réponses physiologiques normales ; des souris diabétiques pour évaluer l'efficacité des composés dans le contexte du DT1 ; et des souris génétiquement modifiées pour mieux simuler les humains. Notre approche sera séquentielle et hiérarchisée : si l'une des protéines candidates montre de bons résultats avec une méthode et une dose spécifiques, nous pourrons écarter les autres options, réduisant ainsi le nombre de souris nécessaires. Au total, nous prévoyons d'utiliser 7 560 souris pour ce projet, tout en respectant strictement les principes des 3R : Remplacement (l'étude du diabète nécessite l'utilisation d'animaux, car cette maladie ne peut pas être entièrement reproduite en laboratoire), Réduction (nous utiliserons le minimum d'animaux nécessaires et ajusterons les expériences selon les résultats), et Raffinement (une grille de score évaluera la souffrance et le stress des animaux, avec des seuils adaptés).

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude seront essentiels pour déterminer la dose et la voie d’administration qui assurent la meilleure exposition du composé antidiabétique dans les tissus et le sang. Ces données guideront les conditions expérimentales des futures études sur l'efficacité à long terme et la pharmacodynamique du composé candidat. En combinant ces études complémentaires, nous maximiserons les chances de succès dans le développement thérapeutique pour le diabète de type 1 (DT1).

Procédures

Trois prélèvements sanguins seront effectués sur chaque animal, selon les modalités suivantes : deux prélèvements seront réalisés par ponction de la veine caudale (l'un au début de la procédure et l'autre à la fin; durée de l'intervention : 30 secondes) ; et un prélèvement sera effectué par ponction submandibulaire (soit à 0 min, avant administration du composé, soit à 30 min, 60 min, 120 min, 24 h, ou 48 h après l’administration ; durée de l'intervention : 1 minute). Une injection ou une administration du composé sera effectuée sur chaque animal (durée pour les injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intraveineuses et orales : entre 30 secondes et 1 minute).

Impact sur les animaux

Une partie des souris utilisées dans cette étude constitue un modèle classique pour l'étude du diabète de type 1 (DT1), présentant généralement une hyperglycémie modérée. Le prélèvement submandibulaire, réalisé en prélevant du sang sous la mandibule avec une aiguille ou une lancette, peut provoquer du stress et un inconfort local. Il y a également un risque de formation d'œdème autour du site de ponction et d'infection si les conditions d'asepsie ne sont pas rigoureusement respectées. La ponction de la veine caudale, qui implique l'extraction de sang de la veine située dans la queue, peut entraîner une douleur ou un inconfort, avec un risque d'infection si le site n'est pas correctement aseptisé. L'administration par voie orale (ou gavage) peut causer du stress et de l'inconfort, avec des risques de perforation ou de blessure de l'œsophage, ainsi que d'aspiration du liquide dans les poumons, entraînant des difficultés respiratoires si la sonde n'est pas correctement insérée. Les injections intrapéritonéales (IP), sous-cutanées (SC) et intraveineuses (IV) peuvent entraîner des risques d'inconfort et de douleur au site d'injection. Pour les injections IP, il existe également un risque de perforation des organes internes. Concernant les injections SC, les risques incluent la formation d'œdèmes ou d'hématomes si l'injection est trop rapide. Pour les injections IV, les risques comprennent des saignements et des dommages veineux. Dans tous les cas, des infections peuvent survenir au site d'injection si les conditions d'asepsie ne sont pas strictement respectées.

Devenir

À la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre des analyses post-mortem.

Remplacement

Dans notre étude, les composés développés présentent des caractéristiques pharmacocinétiques uniques qui ne peuvent être correctement évaluées que dans des systèmes biologiques complexes, comme ceux des souris. L'étude in vivo est indispensable pour déterminer avec précision comment ces molécules sont absorbées, distribuées, métabolisées et éliminées dans l'organisme, car ces processus ne peuvent pas être simulés de manière fiable par des méthodes in vitro ou par modélisation informatique.

Réduction

Nous utiliserons un nombre minimal d'animaux pour nos expériences. Des tests statistiques sur des échantillons préliminaires ont montré que trois animaux par condition suffisent pour obtenir des résultats exploitables sans nécessiter de répétition supplémentaire. Certaines souris peuvent ne pas développer d’hyperglycémie, mais elles ne seront pas écartées, car elles présentent une infiltration lymphocytaire significative, un indicateur préclinique important du diabète de type 1 (DT1). Ainsi, notre étude inclura les souris diabétiques et prédiabétiques pour obtenir des données complètes et fiables sur la pharmacocinétique de nos composés. Enfin, pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous adopterons une approche séquentielle et hiérarchisée. Si un composé montre un profil d’exposition optimal avec une voie d’administration spécifique et une concentration donnée, les autres conditions expérimentales pourront être écartées. Nous ajusterons les expériences en fonction des résultats obtenus, conformément aux principes de réduction des 3R.

Raffinement

La glycémie sera mesurée par prélèvement d'une goutte de sang de la veine caudale. Avant l'incision, une crème analgésique contenant de la lidocaïne sera appliquée sur le bout de la queue pour une anesthésie locale. La ponction sera effectuée rapidement et avec précision pour minimiser le stress, et une légère pression sera appliquée pour arrêter le saignement et prévenir les hématomes. Le prélèvement submandibulaire sera réalisé par un opérateur expérimenté pour garantir rapidité et précision, réduisant ainsi l'inconfort. Des lancettes ou aiguilles stériles seront utilisées pour minimiser le risque d'infection ou d'œdème. Après le prélèvement, une légère pression sera appliquée pour arrêter le saignement. Pour les injections intrapéritonéales (IP), sous-cutanées (SC) et intraveineuses (IV), une désinfection locale sera effectuée avant et après chaque injection pour réduire le risque d'infection. Des aiguilles de petit calibre seront utilisées pour diminuer la douleur et les traumatismes tissulaires. Avant une injection IV, la queue de la souris sera réchauffée dans de l’eau tiède pour dilater les vaisseaux sanguins, facilitant l'injection et réduisant les tentatives. Les volumes administrés seront limités afin d'éviter tout inconfort. Pour l'administration orale (ou gavage), des sondes d’alimentation appropriées seront utilisées pour minimiser le risque de perforation de l’œsophage ou de blessures internes. Les animaux seront surveillés pour tout signe de détresse ou difficulté respiratoire. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi et en groupes sociaux, dans des portoirs ventilés. Ils auront accès à de l'eau stérilisée et des aliments irradiés pour minimiser les risques de contamination. Durant toute la procédure, les animaux seront surveillés à l’aide d'une grille de score pour évaluer et objectiver les éventuelles souffrances, avec des points limites précoces et des mesures correctives adaptées.

Choix des espèces

Une partie des souris utilisées dans cette étude constitue un modèle classique pour l’étude du diabète de type 1 (DT1), car elles développent spontanément la maladie par des mécanismes similaires à ceux observés chez l'humain. Leur phénotype et les étapes de progression du DT1 sont bien documentés, ce qui permet de mener des études précises et reproductibles. Dans notre recherche, ces souris sont essentielles pour évaluer l’efficacité de nos composés dans le contexte du DT1. Une autre partie des souris de cette étude est dite "humanisée" ; elles ont été modifiées génétiquement pour exprimer un gène humain, ce qui permet de mieux prédire les réponses humaines aux composés étudiés. Des souris non modifiées seront également utilisées afin d’obtenir des données fiables sur le comportement des composés dans un contexte physiologique normal. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 20 semaines pour examiner comment les différents composés se comportent dans le corps. Cet âge correspond à la période adulte, où leur métabolisme est stabilisé, garantissant ainsi des réactions plus prévisibles aux traitements. À ce stade, les souris ont un métabolisme bien développé, ce qui nous permettra d’obtenir des résultats plus fiables et applicables, tout en réduisant les variations liées à la croissance ou au sevrage.