Troubles endocriniens

Quarante-sept administrations par animal, douze dans l'abdomen et trente-cinq sous la peau, plus vingt et une pesées et quatre prélèvements de sang : 48 souris mâles rendues obèses par une alimentation à 60 % de graisses vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que les injections et les prélèvements sont source de douleurs aiguës, que le jeûne de quatre heures précédant chaque prise de sang induit une sensation de faim, et que l'obésité elle-même gêne les mouvements. Les femelles sont écartées pour ne pas doubler les effectifs, une seconde étude étant prévue chez elles seulement si le composé se montre efficace chez les mâles. Le candidat médicament appartient à un client de l'établissement, et le porteur présente cette étape in vivo comme une étape réglementaire incontournable avant le passage à l'humain.

Objectifs

Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse, en administration seule ou combinée avec un autre composé anti-obésité déjà autorisé sur le marché. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (21 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de placébo ou du candidat médicament par voie intrapéritonéale (12 administration; durée de la mesure : 1 minute); 3) Administrations de placébo ou d'un composé de référence par voie sous-cutanée (35 administrations; durée de la mesure : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (4 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux et sous-cutanés, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre de 12 animaux par groupe a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie intrapéritonéale et sous-cutané seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (2-3 animaux/cage) afin de maintenir leur caractère social. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée (2 visites par jour) et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée (Buprénorphine).

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques.Les animaux seront utilisés au stade adulte de 20 semaines (27 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.

Écartés du circuit commercial parce que l'anesthésique employé n'a pas d'autorisation de mise sur le marché chez le porc, les 27 animaux de ce projet doivent être soit confiés à une association par l'intermédiaire du GRAAL, soit tués par injection létale et éliminés par l'équarrissage. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, quatre biocapteurs à microaiguilles suturés à la peau du dos ou derrière les oreilles, portés de 24 heures à 7 jours en hébergement individuel, un isolement que le porteur reconnaît stressant pour une espèce grégaire. Chaque porc est anesthésié deux fois, dont une jusqu'à quatre heures avec cathéter, prélèvements sanguins répétés et injections provoquant une hyperkaliémie qui expose à un arrêt cardiaque, et peut être réutilisé pour quatre itérations espacées de dix jours. Le dispositif est destiné au suivi des maladies rénales chroniques, mais le porteur indique qu'aucune analyse statistique n'est prévue et que l'effectif correspond à une estimation haute du nombre d'itérations nécessaires pour que le capteur fonctionne.

Objectifs

Les affections rénales chroniques sont des maladies évolutives se traduisant par une importante dégradation de sa qualité de vie. En effet, en phase terminale le patient a besoin de dialyses régulières voire d'une transplantation d’organe. Le suivi des patients comprend des prises de sang régulières pour surveiller l’évolution de la maladie et des prises de sang rapprochées durant les phases de décompensation. Les délais dans la réalisation des analyses puis dans la réception des résultats peuvent conduire à des retards dans l’ajustement de traitement voire à des hospitalisations en urgence. L’analyse en temps réel des concentrations des biomarqueurs permettrait un suivi plus simple, moins contraignant, et une réponse plus rapide aux évolutions des symptômes, avec une prise en charge plus adaptée. Le dispositif testé dans ce projet est un biocapteur portable à placer sur la peau et mesurant en continu 2 biomarqueurs couramment utilisés par les néphrologues : le potassium et le glucose. Ce patch contient un réseau de microaiguilles (

Bénéfices attendus

Les résultats du projet pourraient présenter plusieurs bénéfices sur le long terme, sur le plan médical et sur le plan scientifique. Le projet pourrait etre bénéfique aux patients car il s’inscrit dans le cadre du développement d’un instrument destiné à l’amélioration du suivi des affections rénales chroniques. Un meilleur suivi de ces maladies permettra d’améliorer les conditions de vie des patients en les maintenant plus longtemps à des stades précoces de la maladie auxquels sont associés des symptômes et/ou des contraintes médicales mineures. Cela sera permis par un suivi facilité, un traitement plus adapté et ajusté plus rapidement. Additionnellement, le dispositif permet de remplacer les prises de sang comme moyen de suivi de l’évolution de l’état des reins. Ceci présente 3 avantages : - Une diminution des contraintes de déplacement pour le patient, et donc un suivi quotidien simplifié - Une augmentation du nombre de points de mesure permises par le capteur ce qui offre une image plus précise de l’évolution de ces concentrations au cours du temps aidant ainsi les médecins - Les informations étant directement transmises au médecin et au patient, il est possible de réagir plus rapidement pour adapter le traitement médical et/ou le comportement du patient (alimentation notamment) si besoin. Au-delà des bénéfices induits directement par l’utilisation de ce capteur à l’avenir, les résultats de cette étude, ainsi que des prochaines permettront d’ouvrir la voie au développement d’autres capteurs du même type adaptés au diagnostic, au suivi et/ou au traitement d’autres pathologies. D’un point de vue scientifique, un des objectifs de cette étude est de démontrer l’existence d’un lien utilisable pour la mesure en continu entre la kaliémie sanguine et la concentration de potassium dans le fluide interstitiel, où est effectuée la mesure. En effet, si des liens sur des mesures ponctuelles ont déjà été observés, aucun lien de ce type n’a été démontré à ce jour pour des mesures dynamiques et une preuve dans ce sens ouvrirai de nouvelles perspectives dans le domaine de la mesure en continu de la kaliémie dans le fluide interstitiel.

Procédures

Les animaux d'études seront anésthésiés à deux reprises: - Une anéthésie de courte durée (une vigntaine de minutes) pour la pose des biocapteurs (4 capteurs par animal positionnés sur le dos ou derrière les oreilles, suturés à la peau), - Une anésthésie de longue durée (jusqu'à 4h) pour les tests de mesures. Au cours de cette deuxième anésthésie, les animaux seront cathéterisés afin de faciliter l'administration des solutés et les prélèvements sanguins. Une fois les biocapteurs mis en place, les animaux seront hébergés en individuel pour une durée allant de 24h à 7 jours. Cet isolement peut être source de stress chez cette espèce grégaire.

Impact sur les animaux

1 - Le port du capteur peut potentiellement provoquer des effets secondaires chez l’animal, que ce soit dû à une réaction aux aiguilles insérées dans la peau ou bien à l’adhésif utilisé. 2 - Effets secondaires dûs à l’anesthésie (hypotension, hypoxie, réaction anaphylactique). 3 - Effets secondaires liés à l’injection de solution de biomarqueurs : Une hyperkaliémie crée un risque de complication cardiaque pouvant aller jusqu’à l’arrêt cardiaque. 4 - Effets secondaires liés aux prélèvements sanguins

Devenir

Les animaux ayant participés à la procédure expérimentale ne pourront pas retourner dans le circuit commercial car l'anésthésique utilisé n'a pas d'AMM chez le porc. Il y a donc deux issues possibles pour les animaux: 1) Rehabilitation des porcs en passant par Le GRAAL. Ces derniers seront placés dans des Associations ou Refuges avec un contrat spécifiant que l'animal ne pourra en aucun cas entrer dans la chaîne alimentaire. 2) Les animaux seront euthanasiés par injection lethale d'anesthésique jusqu'à l'arrêt cardiaque. Les carcasses seront éliminées par la filière de l'équarrissage.

Remplacement

Des études bibliographiques et des tests de biocompatibilité (notamment de cytotoxicité en culture cellulaire et d’extraction) seront menés en parallèle de cette étude, toutefois ces résultats sont limités et ne remplacent pas une observation in-vivo. De même, des résultats préliminaires ont été obtenus concernant la performance analytique du capteur en conduisant des tests in-vitro. Toutefois, ce résultat ne peut pas etre directement extrapolé pour l’utilisation du capteur in-vivo car l'environnement de mesure de la peau est radicalement différent de celui des tests in-vitro. Ces derniers incluent l’utilisation de solutions prélevées, de peaux d’animal mort ou de peaux artificielles, toutefois, cela n'est pas suffisant. Il est aussi difficile de simuler informatiquement un environnement aussi complexe. En effet l’impédance des tissus, les concentrations des molécules, la répartition des molécules cibles dans l'environnement et la dynamique de ces paramètres ont une influence importante et ne peuvent etre testés qu’in-vivo. Additionnellement, cela permet de tester l’effet de la réaction immunitaire sur l’évolution de la qualité de la mesure dans le temps et notamment une diminution du signal dû à une colonisation de la surface des électrodes de mesure par des cellules immunitaires ou d'autres effets de bio-encrassement.

Réduction

27 animaux maximum seront nécessaires. Cette étape est itérative, chaque itération permet d'optimiser le capteur et l'algorithme de mesure en fonction des résultats de la précédente jusqu'à atteindre un résultat satisfaisant. Le nombre d’itérations, et donc d’animaux nécessaires, dépendra des résultats obtenus durant l’étude. Le nombre d’animaux indiqué correspond donc à une estimation haute du nombre d’itérations qui seront nécessaires pour que le capteur fonctionne correctement et pour valider le résultat. Dans un cas idéal, 1 animal serait suffisant pour optimiser le capteur et 3 pour valider le design et l'algorithme. Chaque animal pourra etre réutilisé pour un maximum de 4 itérations, chacune espacée d’au moins 10 jours. Aucune étude statistique n'est prévue sur cette étude. A ce stade, la performance analytique est établie de manière individuelle pour chaque capteur.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en case individuelle afin d'éviter que les animaux ne s'arrachent les dispositifs entre eux. Néamoins, les animaux pourront maintenir les contacts physiques (groin à groin), olfactifs, visuels et auditifs avec leurs congénères à travers les barrières. Dans chaque case, des objets à manipuler (jouets à mâcher, balles, cordes ou chaînes) seront mis à disposition. De la compote de pomme ou morceaux de fruits seront également mis à disposition. Les enrichissements seront renouvelés chaque semaine. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de vérifier leur état général, la prise alimentaire, la prise de boisson et l’émission de fèces. L’absence de réaction au dispositif sera également contrôlée. Des points-limites adaptés ont été définis afin de limiter et de prendre en charge précocement toute souffrance. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie afin de limiter le stress pour ces protocoles invasifs comprenant notamment la pose d’un cathéter pour une durée de 4 heures, des prélèvements sanguins réguliers ainsi que des injections pouvant provoquer des états d’hyperglycémie et d’hyperkaliémie. Durant les procédures invasives, le niveau des biomarqueurs sanguins seront suivis en temps réel donc le contrôle des paramètres vitaux pourra etre réalisé dès l’apparition des premiers signes alarmants. Les procédures invasives seront espacées d’au moins 10 jours afin de permettre le repos et le rétablissement de l’animal entre deux phases.

Choix des espèces

Pour cette étude, le choix de l’espèce animale s’est porté sur le porc pour plusieurs raisons : - La structure de la peau des porcs est similaire à celle de la peau humaine, elle fournit un environnement adapté pour tester les capacités des capteurs - L’épaisseur de la peau des porcs est similaire à celle de la peau humaine à certains emplacements du corps (oreilles,cou...) - La concentration des analytes cibles dans le sang des porcs est similaire à celle que l’on trouve chez l'homme. Les porcs utilisés seront des porcs juvéniles d’environ 30 kg. A ce stade de développement, les animaux sont facilement manipulables.

Préparer les études réglementaires à venir est la fonction déclarée de ce projet cadre, qui prévoit jusqu'à cinquante études par espèce sur cinq ans, avec trente rats ou cinquante souris par étude. 2 500 souris et 1 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 d'entre eux étant réutilisés ensuite dans d'autres projets, à des fins de formation ou pour constituer des bibliothèques de tissus, les autres étant tués. Un même animal peut subir une vingtaine d'interventions par semaine, dont douze prélèvements de sang, jusqu'à seize heures en cage métabolique et autant de mise à jeun. Le porteur ne nomme aucun des tests comportementaux employés, désignés par les seuls domaines explorés, locomotion, sociabilité, communication, sensoriel, et fonde le recours au rongeur sur une exigence réglementaire, la norme ICH M3(R2).

Objectifs

Ce projet ne comporte qu’une seule procédure, au sein de laquelle seront réalisées des études exploratoires multidisciplinaires dans un modèle rongeur. Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'Homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire, etc.) ou de carcinogénicité observée dans des études précédentes, d'établir la pertinence de certains effets observés chez le rongeur en comparaison avec l’Homme (ex : effets sur le système immunitaire, recherche de biomarqueurs, effets sur le comportement), avec pour but d'assurer la santé des patients humains (composés pharmaceutiques) et/ou la sécurité des personnes exposées (produits chimiques). Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée chez le rongeur, ou pour démontrer la validité de nouvelles techniques d'investigations. Il est prévu d'utiliser en moyenne 30 rats, ou 50 souris par étude, et de réaliser jusqu'à 50 études par espèce sur la durée du projet (5 ans).

Bénéfices attendus

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier. De plus ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, et aussi de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires. Ces études permettent d’obtenir une meilleure connaissance du composé et du modèle animal, pour une meilleure conception/design des études réglementaires à suivre, que ce soit du point de vue du choix des doses, mais aussi dans le choix des voies d’administrations, du nombre d’animaux, etc. D’un point de vue éthique, une réduction du nombre d’animaux dans les études futures est potentiellement possible, et la douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables sera minimisée au maximum. L’utilisation de tests neurocomportementaux dans le cadre de ce projet permet une approche par des méthodes non invasives, dans le cadre des 3Rs (Raffinement).

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi par injection intramusculaire, voies sous- cutanée ou intraveineuse, etc.) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études varie entre 1 jour et 1 an. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils d’urines et /ou de feces sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Pour les tests de comportements, ils sont toujours faits après une administration unique par test, les tests sont non invasifs, avec manipulation et contraintes limitées des animaux et observation par suivi video (domaines explorés : locomotion, sociabilité, communication, sensoriel), d’une durée maximale d’une heure ; un seul test est réalisé par jour maximum et dans la limite de 3 dans la même semaine d’examen, sur une durée d’étude de 3 mois maximum. Dans tous les cas où l’hébergement individuel est requis , les animaux restent en contacts visuels, auditifs et olfactifs avec les autres animaux en hébergement individuel ou non.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques du composé testé (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire). - à l’hébergement individuel (rare) en cas de nécessité absolue

Devenir

Si l’état de santé des animaux le nécessite, l’avis et/ou l’intervention d’un vétérinaire seront requis, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable. Chaque fois que cela sera envisageable (ex : animaux contrôles), les animaux seront réutilisés dans d’autres projets, ou à des fins de formation, ou pour réaliser des bibliothèques de tissus.

Remplacement

Les explorations dans ce projet s'appuient parfois/souvent sur des études vitro préalables, mais ne peuvent pas être menées in vitro. Il n’existe pas toujours de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Il n'existe pas de méthodes alternatives à l'heure actuelle qui permettent de remplacer les tests neurocomportementaux prévus dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, etc En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel, consommation de nourriture et/ou d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés, etc.), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène, etc.) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme les administrations intramusculaires et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout hébergement individuel d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.

Choix des espèces

Au-delà des aspects opérationnels (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent utilisé car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou parfois plus sensible à certaines classes de produits) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’homme (exemple paramètres immunologiques). Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs dont notamment : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique, ou incompatibilité avec une autre espèce animale, par exemple. Les animaux ont en général 5 à 12 semaines d’âge en début de traitement pour assurer une administration pendant la phase de croissance. Dans certains modes d'administration, (voie dermale, souris) les animaux pourront être plus âgés de quelques semaines pour répondre à des conditions expérimentales particulières (ex : pour avoir un poids plus élevé, ou un âge en adéquation avec la maturité sexuelle) ou pour des raisons scientifiques (ex : maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.

Une hypercalcémie provoquée par administration d'hormone parathyroïdienne, une chirurgie de trente minutes sous anesthésie générale pour implanter un dispositif, un jeûne allant jusqu'à vingt heures la veille, un prélèvement de sang par jour pendant cinquante jours au maximum et jusqu'à cinq séjours de vingt-quatre heures en cage à métabolisme : 16 macaques cynomolgus vont être soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que l'hypercalcémie peut entraîner fatigue, tremblements, faiblesse musculaire, vomissements, douleurs abdominales et troubles de la mémoire, et que les effets indésirables des candidats-médicaments ne sont pas prévisibles au démarrage. Il affirme que l'animal reste un "passage obligatoire" avant toute administration à l'homme, et que le macaque a remplacé le chien dans ces programmes. Les 16 macaques survivront au projet et seront réutilisés dans d'autres protocoles si le vétérinaire l'autorise, pour une gravité légère, modérée ou sans réveil.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer les effets de candidat-médicament sur la régulation de l’hypercalcémie liée à des troubles parathyroïdiens. En effet, l'hormone parathyroïdienne est principalement impliquée dans le métabolisme du calcium de l'organisme et dans la régulation de la calcémie. Chez l’homme ce trouble d’hypercalcémie hormono-dépendante peut avoir plusieurs origines : 1/un hyperparathyroïdisme primaire associé à une production excessive d’hormone parathyroïdienne (PTH) par les glandes parathyroïdes du fait de la présence d’un adénome ou de l’hypertrophie d’une glande, 2/une hypercalcémie humorale maligne, provoquée par la production par une tumeur d’un peptide mimant les effets biologiques de la PTH, la PTH-related protein (PTHrP). Les symptômes d’une hypercalcémie prolongée et sévère peuvent être entre autres une fatigue sévère, des douleurs et fragilisations osseuses ou des défaillances rénales. Chez l’homme, dans le cas d’un hyperparathyroidisme primaire, les traitements sont le plus souvent chirurgicaux mais tous les patients ne sont pas éligibles à la chirurgie, et dans le cas d’une hypercalcémie humorale maligne, les traitements sont généralement symptomatiques.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter l'hypercalcémie, une pathologie humaine touchant 2 millions de patients uniquement pour l'hyperparathyroidie primaire en Europe et aux Etats-Unis dont 20% des patients qui ne sont non éligibles à la chirurgie ou qui sont en récidive post chirurgie, soit près de 380 000-400 000 patients. Du fait de la cible thérapeutique, ces nouveaux médicaments pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental d'hypercalcémie.

Procédures

Dans ce projet, les animaux subiront une intervention chirurgicale (30 min) pour implanter un dispoditif médical, sous anesthésie générale, selon un protocole chirurgical et analgésique maitrisé accompagné d'un suivi postopératoire adapté. Les animaux seront mis à jeun la veille de la chirurgie (maximum 20h). Les différents candidats médicaments seront administrés par voie sous-cutanée (2 min) et différents prélèvements sanguins (2 min) seront réalisés (1 fois par jour pendant 50 jours maximum). Pour le recueil urinaire, les animaux seront placés en cage à métabolisme sur une durée maximale 24h (5 fois maximum sur 50 jours).

Impact sur les animaux

Une hypercalcémie légère à modérée telle qu'attendue dans ce projet peut entrainer des symptômes aspécifiques tels que la fatigue, tremblement, faiblesse musculaire, constipation, nausées, vomissements, douleurs abdominales, perte de l’appétit ou encore un dysfonctionnement cognitif (troubles de la mémoire par exemple). L'hypocalcémie susceptible d'être induite par le candidat médicament pourra entrainer les mêmes symptômes qu'une hypercalcémie légère. Dans tous les cas, les niveaux de calcémie seront régulés soit par la modulation des doses de PTH/PTHrP, soit par un supplément d'apport en calcium dans la nourriture. Les animaux de ce projet pourront subir une contrainte liée à la privation de nourriture avant la chirurgie, une contrainte liée à l'hébergement individuel en cage à métabolisme pour la collecte d’urine et à l’hébergement individuel suite à la chirurgie pour la récupération post chirurgie, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration des candidats médicaments, de l'anesthésie et des prélèvements sanguins. Les effets indésirables potentiels du/des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Une analyse sera engagée avant toute étude afin d'anticiper les effets indésirables potentiels qui pourraient émerger en fonction de la nature du produit à tester. Ils feront l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux le cas échéant et mettre en place les traitements nécessaires à leur prise en charge.

Devenir

Les animaux seront généralement réutilisés pour d'autres projets si l'état général des animaux (attesté par le vétérinaire) le permet. Le projet suivant sera de gravité sans réveil, léger ou modéré.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le Primate non humain car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer l'efficacité d’une nouvelle molécule. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le primate non humain est une des espèces non rongeur adaptée à ce type de modèle d’étude et n'est utilisé que si les autres espèces non rongeurs ne sont pas appropriées, pour des différences de métabolisme par exemple.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 4 / par groupe. L’analyse statistique faite sera adpaté au modèle. Une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • La mise au point de procédures rigoureuses, • La formation du personnel, • Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales, • La mise en groupe des animaux, • La mise en place de jouets dans les cages.

Choix des espèces

Le primate non humain a été démontré selon les critères de l’EMA (Europeen Medicines Agency) comme étant l'espèce animale non-rongeur la plus pertinente dans une approche translationnelle par rapport à l'homme pour le développement de traitement de régulation des troubles de la calcémie liés à une hypo ou hypersécrétion de PTH. Des tests ont été réalisés chez le chien et il a été démontré que chez cette espèce, l’effet de la PTH sur le calcium est différent de chez l'homme. En effet, il a été démontré que le singe est moins sensible aux variations de calcémie produites par la PTH, et donc moins sujet au phénomène de toxicité rénale qui est importante chez le chien. Le singe a donc remplacé le chien dans les programmes de développement de traitements visant à corriger les troubles de la calcémie liés à la parathormone. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Quinze jours d'acclimatation, deux prélèvements sanguins hebdomadaires, puis l'implantation sous la peau d'une pompe sous anesthésie générale, une heure d'intervention : 8 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La pompe diffuse une hormone qui fait monter leur taux de calcium sanguin, avec pour effets attendus apathie, diarrhées et augmentation du volume urinaire, avant l'injection de l'anticorps censé faire redescendre ce taux, dont un surdosage provoquerait contractions musculaires, faiblesse, tétanie et convulsions. Chaque jour à partir de l'implantation, un prélèvement sanguin est réalisé sur animal vigile, la contention durant cinq à dix minutes. La pompe est ensuite retirée sous anesthésie et les huit macaques sont gardés en vie, décision que le porteur présente comme une manière de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer l'effet pharmacodynamique et de définir la pharmacocinétique d’un anticorps monoclonal humanisé ciblant le recepteur PTH1R (récepteur à la parathormone) sur deux modèles différents d’hypercalcémie provoquée chez le primate : 1) un modèle d‘hyperparathyroïdie primaire (HPP), induit par la perfusion de parathormone (PTH), une hormone impliquée dans la régulation du calcium 2) un modèle d’hypercalcémie humoral maligne (HHM) induit par une perfusion de peptide lié à la parathormone (PTHrP), une hormone également impliquée dans la régulation du calcium L’augmentation provoquée de la PTH (dans le premier modèle) ou de la PTHrP (dans le second modèle) va induire une augmentation du taux de calcium sanguin. Le but de l’anticorps ciblant le récepteurs PTH1R est de faire diminuer ce taux de calcium dans les deux modèles (modèle HPP et HHM). Le projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement d’un candidat médicament. Des prélèvements sanguins répétés seront réalisés avant et après l’administration de l’anticorps. Différents paramètres physiologiques pertinents seront également relevés (température corporelle, poids). L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de rechercher une dose toxique. C’est pourquoi, toutes les doses utilisées dans ce projet sont, a priori, efficaces pharmacologiquement mais non toxiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont à terme la validation et la mise sur le marché d’un traitement permettant d’agir sur l’hypercalcémie lié à des pathologies comme la HPP (hyperparathyroïdie primaire) et HHM (hypercalcémie humorale maligne). Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de réduire le nombre d’animaux mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Avant tout acte et dans le but de diminuer leur stress, les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation de minimum 15 jours. Les animaux recevront deux administrations par voie sous cutané de l’élément à tester. Après les administrations, les prélèvements de sang et un suivi des paramètres physiologiques (poids et/ou température corporelle) seront réalisés à intervalles de temps définis afin d'étudier l’évolution du taux de calcium et la pharmacocinétique de l’élément testé (temps contention compris entre 5 et 10 minutes en moyenne). Des mesures basales de ces données seront réalisées pour les comparer avec celles obtenues post-administration dans le but de détecter toute variation physiologique après administration du candidat médicament. Les volumes prélevés et administrés aux animaux tout au long du projet ainsi que les temps de repos accordés entre ces différents actes respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Les administrations de l’anticorps et les prélèvements de sang seront moins traumatisants pour les animaux qu'une anesthésie et seront donc réalisés sur animal vigile. Les prélèvements sanguins dureront ponction moins de 5 minutes en moyenne. En amont de la pose de la pompe, deux prélèvements quotidien seront réalisés une fois par semaine. A partir de l'implantation de la pompe, un prélèvement sera fait quotidiennement. La pompe permettant l’administration des hormones sera implantée en sous-cutané. Pour le confort et pour le bien-être des animaux, cet acte sera réalisé sous anesthésie générale (anesthésie chimique fixe).L'intervention durera environ une heure. Les animaux devront être mis à jeun avant la réalisation l’implantation (moins de 16h). Les animaux seront gardé en vie à la fin de la procédure ce qui implique l'explantation de la pompe. Cette prodédure ce dérulera de la même façon que l'implantation (anesthésie générale chimique). Cette intervention durera envrion 30 minutes. Enfin les animaux seront récompensés à la fin de toute manipulation.

Impact sur les animaux

L’induction d’une hypercalcémie peut provoquer des symptômes associés à cette biochimie. On pourrait observer une apathie (baisse d’énergie globale), des diarrhées ou encore une polyurie (augmentation du volume urinaire). A la suite de l’injection de l’anticorps, il pourrait y avoir une hypocalcémie. En effet, l’effet attendu de ce traitement est une diminution du taux de calcium. Une dose trop élevée lors des administrations de l’anticorps pourrait induire des effets indésirables. Les signes cliniques classiquement observés lors d’une hypocalcémie sévère sont : agitation, contractions musculaires faciales ou généralisées, faiblesses, anorexie, tétanie et convulsions. La réalisation de prélèvements sanguins pourra également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction. L'anesthésie générale des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié : 1) à la mise à jeun, qui peut engendrer un stress léger. La durée de cette mise à jeun sera inférieure à 16h. 2) à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...); 3) au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...).

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de l'étude dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques. Cette décision sera prise par un vétérinaire en consultation avec la SBEA (Structure en charge du Bien Etre Animal)

Remplacement

Cette étude de pharmacocinétique / pharmacodynamique chez l’animal est indispensable au développement d’une nouvelle molécule pharmaceutique. En effet, celle-ci permet de déterminer la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de la molécule testée. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet et pour obtenir des résultats interprétables et transportable à l’homme. Pour ce projet 2 lots de 4 animaux (un lot HPP et un lot HHM) seront utilisés. Comme le protocole le permet, les animaux seront gardés en vie à l’issue de l’étude dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques (cette décision sera validée par un vétérinaire en consultation avec la SBEA (Structure en charge du Bien Être Animal)).

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l'espèce (ex : température, hygrométrie, intensité lumineuse, cycle d'éclairage, renouvellement d'air). En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend: 1) Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel (perchoirs, barres transversales, grillages...) ; 2) De la litière pour leur permettre de fourrager; 3) Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent; 4) Des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; 5) De la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation de 15 jours minimum sera mise en place avant le début de l’étude pour permettre aux animaux de se familiariser avec leur environnement. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (contention, prise de sang, de température rectale). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur (à l’aide d’une grille d'évaluation de l'état clinique des animaux). De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable.

Choix des espèces

Le candidat médicament étudié dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le macaque cynomolgus (macaca fascicularis) a été retenu dans le cadre de ce projet. Cette espèce de primates non humains (PNH) partage de nombreuses similitudes avec l'Homme, notamment en termes de leurs principales caractéristiques physiologiques. La régulation du calcium par la PTH est connue pour être nettement différente chez les rongeurs et les chiens par rapport à l'homme, rendant ainsi les données obtenues chez ces espèces difficiles à interpréter en ce qui concerne la physiologie humaine. En comparaison, la molécule testée a déjà été testé sur des macaques cynomolgus et a montré un effet pharmacologique prolongé, confirmant ainsi la pertinence de cette espèce. Des jeunes adultes seront utilisés dans ce projet. En effet, à ce stade développement, les animaux disposent d’un système hormonale mature. De plus ce stade de développement a déjà été utilisé pour des études de pharmacodynamique.