Troubles endocriniens

972 souris vont être utilisées, chacune pouvant passer jusqu'à trois séjours de 96 heures isolée en cage métabolique sur trois mois, à jeun seize heures avant chaque expérimentation. Elles reçoivent quinze administrations par voie orale en un mois, jusqu'à six anesthésies et jusqu'à trois prises de sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Les animaux homozygotes développent l'hypercalcémie recherchée, et le porteur affirme sur la base d'expériences antérieures qu'aucune nuisance n'est attendue, ne retenant comme stress que l'isolement en cage métabolique. Les points limites prévus décrivent pourtant une absence de gain de poids à la puberté, une incapacité à s'alimenter, un poids inférieur de plus de 15 % et des poils hérissés, autant de signes qui déclenchent la mise à mort.

Objectifs

Ce projet de recherche transversale vise à caractériser l'évolution d'une maladie rare, l'hypercalcémie induite par des excès de vitamine D, et de déterminer l'effet d'un nouveau traitement pour cette maladie sans traitement efficace à ce jour. Pour cela nous caractérisons les souris ayant une inactivation homozygote des gènes dont les variants homozygotes (CYP24A1, ou SLC34A1 ou SLC34A3) ont été identifiés chez les patients atteints d'hypercalcémie secondaire à des excès de vitamine D. De plus, les effets de la perte d'un seul allèle seront déterminés pour la 1ère fois dans cette étude.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus dans ce projet permettront d'améliorer le diagnostic et la prise en charge clinique des patients portants des variants homozygotes. De plus, cela permettra de conclure sur l'effet de l'état hétérozygote de ces gènes, la litterature étant très discordante sur ce point. Enfin, les résultats obtenus chez les souris traitées permettront de faciliter les études de toxicité préclinique de notre molécule, et donc accélérer le developpement de ce candidat médicament.

Procédures

isolement pendant la mise en cage métabolique (minimum 96h ; maximum 3*96h sur 3 mois), mise à jeun 16H avant l’expérimentation, administrations IP pour anesthésie (minimum 1, maximum 6 sur 3 mois, 15 sec par administration), administrations per os (15 sur 1 mois, 15 sec par administration), prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés (minimum 1, maximum 3 sur 3 mois, 30 sec par prise). Amendement : Mise à jeun (sans restriction hydrique) la veille des expériences de cages métaboliques afin d’éviter les fluctuations des résultats

Impact sur les animaux

Les animaux homozygotes sont hypercalcémiques, mais d'après nos expériences précedentes, aucune nuisance ni d'effet indésirable ne sont attendus (e.g. pas de perte de poids, pas de difficulté motrice, pas de signe de souffrance). A ce jour, les souris hétérozygotes n'ont pas été décrites comme hypercalcémiques. Durant la collecte des urines, un stress sera lié à l'isolement dans les cages métaboliques. Aucun effet indésirable n'a été observé précedement chez les souris traitées avec notre molécule. Amendement : Mise à jeun (sans restriction hydrique) la veille des expériences de cages métaboliques afin d’éviter les fluctuations des résultats

Devenir

Afin de caractériser l'évolution de la maladie et les effets de notre molécule sur les paramètres biochimiques urinaires et sanguins, l'expression de gènes/protéines et au niveau histologique, tous les animaux seront mis à mort et leurs tissus prélevés et conservés pour des analyses.

Remplacement

L'homéostasie phospho-calcique implique un réseau finement régulé impliquant les glandes parathyroides, l'intestin, les reins et les os. La compléxicité de ce réseau ne permet pas d'étudier les conséquences d'une dysfonction dans des systèmes cellulaires. La souris est un organisme modèle pour l'étude de l'homéostasie calcique, les paramètres biochimiques sanguins et urinaires étant similaires à ceux chez l'Homme.

Réduction

L'expertise du laboratoire dans le phénotypage des souris a permis de déterminer que 12 animaux par groupe (6 males et 6 femelles) est le nombre d'animaux optimale afin d'obtenir des résultats avec une puissance statistique supérieure à 80%. Les tests utilisés seront soit paramétriques soit non paramétriques, dépendant de la normalité des valeurs obtenues. Au maximum, 4 doses seront utilisées. Si la molécule n’est pas efficace à une dose donnée, les doses inférieures ne seront pas testées. Les facteurs comparés seront les paramètres biochimiques urinaires et sanguins et l'expression de gènes/protéines.

Raffinement

Afin de minimiser le stress des souris qui seront isolées en cage métabolique, une phase d’habituation de 3 jours précède le test de 24h à proprement dit. Une partie des souris utilisées dans cette étude étant hypercalcémiques, des modalités de suivi de l’état de santé, des critères d’arrêts ainsi que des points limites seront mis en place (i.e. absence de gain de poids à la puberté, incapacité à s’alimenter, poids inférieurs de plus de 15 %, poils hérissés). Si nécessaire, des analgésiques pourraient etre administres selon les recommendations veterinaires. L’expertise du laboratoire sur l’étude des voies de signalisation de la vitamine D chez la souris permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées (i.e. points critiques étroitement surveillés). Afin de limiter le stress des animaux lors des études longitudinales, ces derniers ne seront placés que 3 fois maximum dans les cages métaboliques avec mise à jeun, avec une distance de 28 jours entre 2 prélèvements. Lors des prises de sang, un volume équivalent de sérum physiologique sera administré en sous cutanée. Le jeûne (mise à jeun) avant la récolte d'urine et de sang est nécessaire pour garantir des résultats précis. Il permet d'éviter les fluctuations biochimiques sanguins tel que glycémie, des lipides et des hormones causées par l'alimentation, qui pourraient fausser les analyses. Cela assure une meilleure interprétation des résultats et une reproductibilité.

Choix des espèces

L'homéostasie calcique est finement régulée par de nombreuses hormones dont la vitamine D. De nombreuses études réalisées chez la souris ont mis en évidence les mécanismes finement régulés régulant les niveaux de calcium sériques et urinaires, et leur similitude avec les mécanismes chez l'Homme. De plus, les variants identifiés chez les patients atteints d'hypercalcémie secondaire à des exces de vitamine D induisent également cette pathologie chez la souris. Ainsi, le modèle murin est un modèle pertinent pour cette étude. Après le sevrage (4 semaines) et jusqu'à 12 mois, l'objectif étant de déterminer l'évolution de la maladie. Pour le traitement, cette pathologie étant une maladie affectant les enfants dès leur naissance, les souris seront traitées après le sevrage pendant 1 mois.

Gavage quotidien pendant jusqu'à 84 jours, jusqu'à 84 mesures de glycémie par piqûre du bout de la queue, jusqu'à 84 injections d'insuline et jusqu'à 14 prélèvements sanguins : 690 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le diabète leur est provoqué par une injection pharmacologique, et tous sont tués en fin d'étude après un prélèvement de sang total sous anesthésie. Le porteur liste parmi les effets attendus l'infection et la nécrose de l'extrémité de la queue, liées à la répétition quotidienne des mesures de glycémie et des prises de sang. Les molécules antidiabétiques orales évaluées ne sont désignées que comme des molécules d'intérêt, sans indication de leur nature ni du nombre de composés testés.

Objectifs

Le diabète est une maladie chronique grave qui se déclare lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d’insuline (hormone hypoglycémiante), ou lorsque l’organisme n’est pas capable d’utiliser correctement l’insuline qu’il produit. De nombreux traitement des patients diabétiques consistent en des injections par voie sous-cutanée, douloureuses et inconfortables (Insuline etc…). Ces traitements sont la plupart du temps combiné à des traitements oraux tel que la metformine afin d’avoir des résultats plus ou moins efficace selon les patients. Enfin ces traitements actuels sont souvent associés à des effets secondaires indésirable. L’objectif du projet est de développer et valider de nouvelles molécules orales pour le traitement du diabète. Le projet se déroulera pour chaque molécule d’intérêt en 2 phases : - Validation de la biodisponibilité de nos molécules d’intérêt sur un modèle de rat sain - Si nous validons la biodisponibilité de nos molécules d’intérêt, une étude de bio efficacité serra réalisé sur un modèle de rat diabétique.

Bénéfices attendus

Les médicaments oraux sont souvent perçus comme plus pratiques et moins contraignants à prendre que les injections. Cela améliore ainsi la compliance des patients ce qui est un point fondamentale pour une prise en charge efficace et optimale du patient vivant avec un diabète. De plus, les médicaments oraux sont plus faciles à stocker, à transporter et à administrer dans de nombreux contextes, y compris dans des environnements ruraux ou éloignés où l'accès à des soins médicaux spécialisés peut être limité. Enfin, l’un des bénéfices important que le projet apportera sera la découverte de nouvelles molécules efficaces présentant peu ou pas d’effet secondaire chez le patient atteint de diabète.

Procédures

Le diabète sera induit par injection pharmacologique réalisée sur animal vigile (1 injection/animal, durée une minute). Des molécules seront administrés aux rats (sains ou diabétiques) par voie orale (gavage 1 fois par jour sur maximum 84 jours, acte de 30 secondes par rat).Tout au long de l’étude, la glycémie sera mesurée sur animal vigile à l’aide d’un glucomètre à l'aide d'une micro goutte de sang obtenue par piqûre de l'extrémité de la queue (durée de quelques secondes) afin d’évaluer l’efficacité de nos molécules (84 fois/animal maximum). De plus, les animaux diabétiques recevront au maximum 84 injections d’insulines si la glycémie reste élevée après traitement (durée quelques secondes). Enfin, afin d’évaluer l’efficacité de notre traitement, au maximum 14 prélèvements sanguins seront réalisées par animal sur l’ensemble de l’étude (1 minute par prélèvement). En fin de procédure, le sang totale des rats sera prélevé sous anesthésie, analgésie profonde.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont : • Peur de courte durée en lien avec le gavage quotidien et les prises de sang au cours du suivi. • Douleur légère de courte durée de l’incision de la pointe de la queue pour le prélèvement sanguin. • Détérioration (infection ; nécrose) de l’extrémité de la queue en lien avec les mesures glycémiques quotidienne et les prises de sang • Saignement post incision de la queue • Douleur légère de courte durée en lien avec l’injection d'une molécule induisant le diabète • Perte de poids en lien avec l’induction du diabète • Hyperglycémie en lien avec le développement du diabète au cours de l’étude • Répétition des interventions durant toute la durée de l’étude (mesure de glycémie, gavage, prise de sang).

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.

Remplacement

Nous souhaitons évaluer l’efficacité de nos traitement oraux dans le cadre du diabète. Or, Il est largement démontré aujourd’hui que la régulation glycémique et la physiopathologie du diabète font intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, pour valider l’efficacité de notre traitement anti diabétique, il ne suffit pas de s’intéresser uniquement à les cellule insuline isolée, mais il est impératif de l’évaluer dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présent (pancréas, foie muscle….). Le recours à une étude in vivo est alors indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. Le nombre d’animaux total nécessaire pour obtenir des résultats statistiques a été déterminé en utilisant un logiciel adapté. De plus, que ce soit avant les tests sur l’animal (étude in vitro de toxicité…) et après l’étude de bio disponibilité (PE1), le nombre de groupes (et donc le nombre total d’animaux) sera réévalué afin de ne tester que les concentrations présentant un intérêt thérapeutique. Par conséquent au maximum cette étude nécessitera 690 rats. Enfin, la réalisation de ces procédures par du personnel formé et habitué à ces manipulations, et la standardisation du protocole, garantiront une bonne reproductibilité et une réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Afin de réduire au maximum le stress, les rats seront maintenus en groupe sociaux tout en respectant la règlementation en vigueur concernant le nombre de rat par cage. Le raffinement intervient également au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress, ainsi qu’à l’aide de bâtons en bois qui leur permettent de reproduire leur comportement naturel de rongeurs. Afin de limiter au maximum le stress lors du suivi, une habituation à la manipulation et au gavage est réalisée 2x/semaine pendant la période de quarantaine. Le bien-être des animaux sera pris en compte durant l’ensemble de l’étude avec un suivi journalier de ceux-ci avec une surveillance accrue après administration oral de nos molécules. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés voir la mise à mort en cas d’atteinte de points limites. Les animaux diabétiques recevront une insulinothérapie en fonction de leur glycémie. Les posologies appliquées seront celles couramment utilisée au laboratoire et validée par notre vétérinaire référent. Le cas échant, la cétonémie sera mesurée afin d’ajuster les doses d’insuline à injecter. Enfin, les prélèvements terminaux sont réalisés sous anesthésie et analgésie profonde.

Choix des espèces

Le rat est la principale espèce utilisée dans les études sur le diabète car les rats diabétiques partagent des caractéristiques similaires à la physiopathologie du diabète chez l’Homme. De plus, notre laboratoire possède une grande expertise sur la sensibilité à la molécule induisant le diabète chez le rat, du pourcentage de réussite d’induction du diabète et son suivi. Enfin, le volume de sang pouvant être récolté nous permet de réaliser l’ensemble de nos dosages biologiques/biochimiques. Les rats pour cette étude seront âgés de 8 semaines, coïncidant avec un poids d'environ 200g. C’est à ce poids que le protocole d’induction du diabète présente le meilleur taux de succès avec un risque de mortalité faible.

Pour calculer des marges de sécurité avant la première administration de médicaments à des êtres humains, 720 souris, 840 rats et 800 lapins vont être utilisés dans 65 études, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent les composés par voie orale, intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse, sur des durées allant d'un jour à six mois, avec prélèvements de sang, de tissus, de fèces, d'urine, de salive et de larmes. Des mises à mort intermédiaires sont prévues pour prélever les tissus aux différents temps de l'étude. Le porteur écrit à deux reprises que ce projet est "indispensable" à la première administration chez l'humain, sans que la nature des composés testés soit précisée.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer les propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques d'un ou plusieurs composés pharmaceutiques après administration unique ou répétée chez des rongeurs ou des lagomorphes. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme, conformément aux lignes directrices ICH S3 M2 et ICH S3 (TK).

Bénéfices attendus

L'ensemble des études du projet vise à identifier un profil métabolique, pharmacocinétique, pharmacodynamique de biodistribution permettant le calcul de marge de sécurité chez l'Homme en gardant à l'esprit en permanence le ratio bénéfice/risque du produit concerné pour la santé humaine. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme.

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi intramusculaire, sous- cutanée ou intraveineuse…) de façon journalière (voire plusieurs fois/j) hebdomadaire, ou de manière plus espacée (ex: toutes les 2 semaines, mensuel), avec le(s) produit(s) d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure dans le cas de perfusion intraveineuse. La durée des études peut être courte (1j) ou longue [1 semaine, 2 semaines, 1, 3, ou 6 mois]. Des prélèvements sanguins, tissulaires, de fèces, urinaires ou/et de fluides corporels (salive, larmes) seront réalisés au cours du temps et analysés afin de déterminer les niveaux du ou des composés administrés, de leurs métabolites ou d’autres marqueurs pharmacologiques pour permettre l’analyse pharmacocinétique, pharmacodynamique et de biodistribution. D’autres prélèvements sanguins ou urinaires sont également possibles pour bilan urinaire, hémato-biochimique ou hormonal par exemple. L’ensemble de ces prélèvements sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/contrainte pour l'animal). Les animaux seront examinés quotidiennement afin de déceler tout signe clinique. Les consommations alimentaire et/ou hydrique pourront être suivies. Des examens ophtalmologiques, échographiques, radiologiques, comportementaux peuvent être réalisés. Le poids corporel sera mesuré à différents temps au cours du projet. Les animaux seront euthanasiés à la fin du projet et un examen microscopique sera réalisé sur les tissus collectés si nécessaire. La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1h/animal/jour (en considérant par ex. 1 journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant par exemple 1 administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h) pour les rongeurs. Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage (en cas d’agressivité ou de soins individuels par exemple).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures [prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle (uniquement pour les rongeurs)] et/ou aux effets systémiques (exemples : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés. Un hébergement en individuel (rare), avec contacts olfactifs, visuels et sonores préservés et enrichissements additionnels, peut être requis (ex. pour suivre la consommation alimentaire individuelle ou pour des études par voie dermale).

Devenir

En parallèle des prélèvements sanguins, réalisés au cours de l’étude, l’évaluation de la pharmacocinétique, de la pharmacodynamie et de la biodistribution, peut nécessiter des euthanasies intermédiaires afin d’effectuer des prélèvements tissulaires et/ou une analyse histopathologique selon les différents temps de prélèvements définis dans l’étude. Ceci pour permettre l'évaluation de l'exposition du composé ou des composés dans le tissu cible, et /ou pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus, respectivement. A ce titre tous les animaux de ce projet seront euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

L'évaluation pharmacocinétique, pharmacodynamique et de la biodistribution d'un composé ou de plusieurs composés administrés dans un organisme complet ne peut pas être réalisée qu'avec des études in vitro, car il n'existe pas d'alternative complète in vitro pour ce type d'évaluation en raison de la complexité d'un organisme vivant. Seule l’observation sur un organisme vivant dans son ensemble permet d’évaluer les différentes phases d’absorption, de métabolisme, de distribution et d’élimination du/des composé(s), de définir les relations et/ou interactions entre ces différentes phases et de pouvoir déterminer l’exposition du/des composé(s) administré(s) dans l’organisme.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude et du nombre de doses testées. En effet, des animaux des deux sexes seront utilisés uniquement pour permettre l'évaluation de l'effet du sexe sur les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques et sur la biodistribution. Par ailleurs, il peut y avoir une comparaison avec des composés de référence, un criblage de plusieurs produits, etc. Mais le nombre d’animaux par groupe correspondra au minimum permettant une analyse statistique fiable, conformément aux recommandations des lignes directrices. Ce projet permettra de réaliser 65 études, 35 chez le rat; 10 chez la souris et 20 chez le lapin, avec un nombre d'animaux déterminé à minima afin d'obtenir des résultats robustes et fiables permettant d'atteindre tous les objectifs de l'étude en procédant à toutes les analyses nécessaires.

Raffinement

En général, les doses utilisées sont des doses pharmacologiques, faibles et similaires à celles utilisées chez l'Homme. L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité, etc. Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et/ou au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés par des soins (ex : antibiotique/anti- inflammatoire), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des prélèvements sanguins seront effectués selon les bonnes pratiques vétérinaires de fréquence et de volume. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie locale ou générale pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, par ex : les administrations intramusculaires et intra-articulaires. Les rongeurs et les lapins sont hébergés en groupe dans la majorité des situations. Cependant, soit en raison d'incompatibilités sociales observées parfois chez le lapin ou les souris mâles, soit dans certaines situations expérimentales rares (rongeur uniquement) un hébergement individuel peut être nécessaire. Il devra être dûment argumenté (ex : voie d’administration dermale, bilans d'élimination en collectant les urines et fèces). Le cas échéant, des enrichissements supplémentaires seront proposés et le contact visuel et olfactif sera maintenu.

Choix des espèces

Les espèces rat, souris et lapin sont des espèces de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) et sont couramment utilisées pour l'évaluation pharmacocinétique, pharmacodynamique et de la biodistribution et acceptées par les autorités. Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs : résultats déjà existants (essais préliminaires in vitro et in vivo), voie d'administration choisie, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique. De façon standard, les rats, souris et lapins seront âgés de 6 à 10 semaines, 6 à 8 semaines et 3 à 4 mois, respectivement, correspondant à un niveau « jeune adulte » de croissance et de développement nécessaire et suffisant pour conduire les expérimentations. Toutefois, ce projet pourra être effectué avec des animaux juvéniles ou avec des animaux plus âgés (> 1 an) en fonction de l’objectif de l’évaluation et de manière à ce que l’état physiologique de l’animal permette une réponse non équivoque des systèmes analysés après traitement avec le(s) composé(s) et ainsi permettre une évaluation adéquate des paramètres ciblés. Les animaux ne doivent pas être gravides.

7 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à six injections dans l'abdomen, dix sous la peau, une injection quotidienne au pousse-seringue pendant vingt-huit jours, des chirurgies intracrâniennes, la pose de canules et de pompes osmotiques, un isolement d'une semaine, jusqu'à dix-huit semaines de régime obésogène, trois jeûnes et la coupure de la pointe de la queue pour les prises de sang. Le porteur signale que le régime gras provoque des problèmes de dents, que les chirurgies exposent à l'hypothermie et à des troubles cardiorespiratoires, et que l'enrichissement est retiré pendant l'isolement pour ne pas gêner les lasers qui mesurent l'activité locomotrice. Il écrit que chaque souris sera mise à mort à la fin de chaque procédure "dans le respect des 3R", les tissus de la moitié d'entre elles allant aux analyses moléculaires, ceux de l'autre moitié aux analyses histologiques.

Objectifs

Les hormones permettent à nos organes de communiquer entre eux et jouent ainsi un rôle essentiel au bon fonctionnement et au maintien de nos fonctions physiologiques, notamment celles régulées par le cerveau. Tout comme l’homme, la souris possède des récepteurs aux hormones dans des régions cérébrales essentielles dans la régulation du métabolisme énergétique. La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour la mise en place de stratégie thérapeutique contre les troubles du métabolisme comme l’obésité. Notre objectif est de comprendre: 1- le nouveau rôle de récepteurs aux hormones dans la régulation du métabolisme énergétique dans un contexte physiologique et pathologique, 2- tester des nouvelles stratégies thérapeutiques dans la prise en charge de des troubles métaboliques comme l’obésité. Ces deux axes de recherche seront étudiés dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les maladies métaboliques tel que l’obésité. De plus, il permettrait de comprend le nouveau rôle, au niveau du cerveau, de récepteurs dans l'intégration des signaux de satiété ou d'appétit venant de la périphérie.

Procédures

Injections intrapéritonéales (6 max par souris; durée

Impact sur les animaux

Les nuisances en lien avec les chirurgies sont 1) pendant les chirurgies, une hypothermie et des problèmes cardiorespiratoires, ainsi que du stress et un déssèchement des yeux 2) en post-chirurgie, des douleurs post-opératoires minorées par des antalgiques ainsi que du stress. Le régime riche en graisse va entrainer une prise du poids au fur et à mesure des semaines, les souris vont devenir un peu moins actives et développer des problèmes de dents à cause de croquettes plus souples que les croquettes standards. Lors des tests métaboliques, les animaux n’auront plus accès à la nourriture pendant plusieurs heures, ils pourront subir une gêne due à la sensation de faim. Le gavage peut entrainer du stress dû à la contention et à la sonde de gavage. La coupure de la pointe de la queue lors de ces mêmes tests entraine une douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure pour prélèvements sanguins. Concernant l’isolement pour la mesure de paramètres métaboliques: l'isolement pendant une semaine chez la souris peut créer du stress. La mesure de composition corporelle nécessite une anesthésie qui peut également engendrer un stress chez la souris, la dose de rayons X nécessaire est faible et non-chronique et n’entraine donc pas de nuisance.

Devenir

Chaque souris sera mise à mort à la fin de chaque procédure, dans le respect des 3R. Une moitié sera dédié à l’étude moléculaire de différents tissus (hypothalamus, tronc cérébral, foie, pancréas, tissu adipeux). La seconde moitié sera dédié à l’étude histologique des mêmes tissus.

Remplacement

Pour réaliser les tests de métabolisme systémique et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables. De plus, pour réaliser les tests de comportements, il n'existe pas d'alternatives à l'utilisation d'animaux décrit actuellement dans la littérature. Des premiers tests ont été effectués in vitro, pour sélectionner les molécules candidates les plus prometteuses comme antagoniste des récepteurs parathyroïdiens, ainsi que les concentrations de toutes les molécules qui seront utilisés pour transposer in vivo. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés (t test si 2 conditions / ANOVA si plus de 2 conditions).

Réduction

Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Le nombre de souris a été déterminé en accord avec les données de la littérature et d’après notre propre expérience des différents modèles présentés. De plus, afin de réduire le nombre d'animaux, des premiers tests ont été effectués in vitro.

Raffinement

Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Les souris seront sous surveillance journalière de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi, en dehors des phases d’isolement. L’enrichissement se limite à la litière lors des phases d’isolement, pour éviter l’interaction avec les lasers qui détectent l’activité locomotrice des souris. Pour limiter les nuisances/effets indésirables des injection intrapéritonéales, nous utiliserons une aiguille fine. Pour le gavage, nous utiliserons une sonde souple pour limiter les nuisances. De plus, une anesthésie profonde sera réalisée à chaque acte chirurgicale pour limiter la douleur et un analgésique sera également utilisé en pré- et post-opératoire.

Choix des espèces

La souris est un des modèles les plus appropriés pour l'étude de l'obésité. Les souris sont faciles à manipuler. Dans cette étude, certaines souris entreront en suivi (régime spécifique ou standard) à l’âge de 11 semaines. En effet, à 11 semaines les souris, en plus d'avoir passé la maturité sexuelle seront plus robuste et auront atteint un poids qui va leur permettre de subir la prise de poids inévitable due au régime sans que cela n’impacte trop leur organisme.