Troubles endocriniens
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Effets à court terme de six composés à visée thérapeutique en développement chez la souris sauvage soumise à une alimentation enrichie en graisse
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Six candidats médicaments d'un client pharmaceutique sont évalués sur leur capacité à réduire la prise alimentaire et le poids de souris nourries avec une alimentation enrichie en graisses. 78 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Hébergées seules en cage, elles reçoivent quatorze administrations par voie orale, sont pesées treize fois, puis anesthésiées et tuées pour le prélèvement de leur tissu adipeux. Le porteur reconnaît que l'isolement constitue une nuisance, la relativise par le maintien d'un contact visuel et olfactif, et affirme qu'il n'existe "aucune méthode de substitution" permettant d'étudier l'effet d'un composé sur le poids corporel.
Objectifs
L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'une famille de six candidats médicaments de notre client et vise à tester leur efficacité à réduire la prise alimentaire et le poids corporel à court terme chez la souris non obèse mais nourrie avec une alimentation enrichie en graisse. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement subaigu du candidat médicament sur l'appétit et le poids corporel du modèle d'obésité. Les composés les plus efficaces seront alors étudiés sur de plus longues durées, chez la souris obèse.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait, à terme, aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (13 mesures au cours de l’étude ; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou d’un candidat médicament par voie orale (14 administrations ; durée de la mesure : 1 minute); 3) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée : 10 minutes).
Impact sur les animaux
De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements par voie orale pourraient être source de de stress mais ne sont que très peu douloureux lorsque réalisés par des expérimentateurs habitués à ce type de pratique. Enfin, le maintien sous alimentation enrichie en graisse de courte durée (ici 14 jours) pourrait être une source de très léger inconfort pour les animaux du fait du changement d’habitudes alimentaires.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements de tissu adipeux sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.
Remplacement
Bien que le développement des composés testés ait fait l'usage d'approches in vitro dans ces premières étapes, l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques reste une étape obligatoire et règlementaires pour poursuivre le développement des candidats médicaments, notamment dans le but de poursuivre vers ders études cliniques. Par ailleurs, il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel et la prise alimentaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle employé et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non soumis à l'alimentation enrichie en graissees a été réduit à 8 animaux, contre 10 pour les autres groupes expérimentaux, compte tenu de la moindre variabilité des paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement des candidats médicaments, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle pour un des composés testés, une seconde étude sera menée en condition chronique chez les deux genres afin de s'assurer de son efficacité.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie orale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. en utilisant des canules de gavage souples pourvues d'un embout en silicone, prévent ainsi toute lésion potentielle du carrefour aéro-digestif. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée (Buprénorphine).
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J nourris avec une alimentation enrichie en graisses est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte, afin de mimer au mieux la population humaine ciblée par les candidats médicaments.
Gestion d’élevage expérimental par génotypage dans le cadre de la création et le maintien de lignées transgéniques pour la production de protéines recombinantes thérapeutiques dans le lait.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
3 000 lapereaux subissent une biopsie de tissu, répétée une fois à une semaine d'intervalle, pour trier ceux qui portent la modification génétique permettant de produire un médicament dans le lait de lapines. Ils relèvent d'un niveau de souffrance léger, la biopsie provoquant une douleur légère et un stress transitoire à la préhension, sur des animaux âgés de cinq à douze jours. Le remplacement de la biopsie d'oreille par un prélèvement de follicules pileux est à l'étude dans l'établissement, sans être assez avancé pour arrêter les biopsies. Les lapereaux reconnus non transgéniques sont tués au plus tard au sevrage, le porteur invoquant un risque de modification génétique partielle ou non détectable, tandis que les transgéniques sont gardés pour la reproduction et la traite.
Objectifs
Notre objectif est de produire des protéines recombinantes thérapeutiques (protéines produites par une cellule dont le matériel génétique a été modifié par recombinaison génétique) avec l’objectif de soigner des patients ayant des maladies génétiques orphelines létales et nous produisons ces protéines dans le lait de lapines transgéniques. Ce projet a pour objectif de génotyper des lapereaux que nous créons par transgénèse ou par croisements, afin de déterminer ceux qui portent la modification génétique souhaitée.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de connaitre le statut génétique des animaux que nous générons pour notre objectif final : produire des protéines recombinantes pour soigner l’Homme, dans le lait de lapines transgéniques. Ce projet participe donc à la production de protéines médicaments dans le lait de lapines pour soigner des maladies rares humaines.
Procédures
Les lapereaux subiront un prélèvement minime de tissu (1 à 2 fois selon les résultats, à 1 semaine d’intervalle).
Impact sur les animaux
La nuisance attendue sur les animaux est la douleur, légère, due à la biopsie, ainsi qu’un stress léger et transitoire lors de la préhension pour biopsie.
Devenir
Les lapereaux déterminés comme non transgéniques seront euthanasiés, au plus tard au moment du sevrage, car il subsiste toujours un risque de modification génétique partielle ou non détectable dans ces animaux. Les lapereaux transgéniques seront gardés pour être mis en reproduction, pour obtenir du lait des femelles. Leur matériel génétique sera cryoconservé sous forme de sperme ou d'embryons.
Remplacement
La production de protéines recombinantes dans le lait de lapines transgéniques permet de produire des protéines de structure complexe, compatible avec leur utilisation chez l’humain comme médicament. Le médicament que nous avons produit à partir de nos lapines transgéniques est plus efficace et plus sûrs que « concurrents » car il n’est pas dérivé du plasma humain, n’entraine pas une surexposition du corps à de trop fortes concentrations car son élimination est rapide, ne contient pas d’autres protéines que celle souhaitée ni de virus ou protéines potentiellement dangereux. En tant que mammifère, la lapine synthétise des protéines similaires à celles de l’Homme, (en quantité et qualité) ce qui est permet une meilleure efficacité du traitement auprès des patients, ce qui n’est pas le cas des protéines produites par des bactéries ou des levures. Nous travaillons actuellement sur le remplacement de la biopsie d’oreille par le prélèvement de follicules pileux mais nos travaux ne sont pas encore finis. Nous n’avons pas testé à ce stade assez d’échantillons pour pouvoir arrêter les biopsies d’oreilles.
Réduction
Pour l'optimisation de la production des protéines, nous avons mis au point des tests prédictifs d'efficacité de nos vecteurs dans des lignées cellulaires. Nous testons tous les vecteurs de nos cibles génomiques afin de pouvoir présélectionner les plus efficaces avant de passer à la micro-injection dans des embryons au stade 1 cellule. Cela nous permet de diminuer le nombre total d’animaux utilisés et de ne pas faire naître des animaux qui n’ont pas d’intérêt scientifique. Lorsqu’une portée nait, il ne nous est pas possible de réduire le nombre d’animaux à génotyper, car nous sommes dans l’attente d’obtenir un ou des animaux transgéniques. En revanche, nous sommes très attentifs à ne pas créer inutilement des portées à génotyper, préférant garder des animaux transgéniques dont nous n’avons pas besoin sur le moment, plutôt que de générer une nouvelle portée si le besoin apparaissait plus tard. Il s’agit ici d’une gestion raisonnée, mais aucune approche statistique n’est utilisée.
Raffinement
Les lapins sont surveillés quotidiennement et des points limites précoces sont strictement appliqués. Ils reçoivent des enrichissements dès trois semaines de vie et les parois latérales de leurs cages sont équipées de plexiglas transparent, ce qui leur permet d’interagir. Leurs cages sont aussi équipées de plateforme qui leur permettent de pouvoir se cacher, un de leur comportement naturel. De la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et les bruits environnementaux, et elle est associée à la lumière et la présence des techniciens animaliers. Depuis quelques mois, nous avons abandonné l’identification par tatouage. Tous les lapereaux sont contrôlés au minimum une fois par jour, le matin après le passage de la mère dans le nid pour l’allaitement de sa portée. Nous vérifions si les lapereaux ont bu le lait de leur mère par la présence d’ une poche de lait dans leur abdomen. S’ils n’ont pas bu ou pas assez, nous préparons de l’allaitement artificiel ou leur donnons du lait d’une autre lapine afin de les complémenter. Nous pouvons également faire adopter les lapereaux issus de trop grandes portées par une femelle ayant eu une portée plus petite.
Choix des espèces
Pour la production de protéines recombinantes dans le lait, le lapin a été choisi par notre société car : - courte période de gestation (30 jours), - maturation sexuelle rapide (4 à 5 mois), - important volume de lait produit (jusqu’à 10 litres/an/femelle), - synthèse de protéines complexes et en quantité importantes par la glande mammaire (glycosylation et gamma carboxylation similaires à celles de l’Homme). Les animaux seront utilisés très jeunes : le prélèvement invasif aura lieu entre 5 et 12 jours de vie. Il est impératif de savoir rapidement si un animal est transgénique dans le but de planifier ou non de nouvelles procédures ou des accouplements.
Etude des pathologies liées à l’âge associées à une dérégulation de SHP2-EU1/2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
Mises à jeun six heures, injectées à l'insuline, gavées cinq jours sur sept pendant vingt-huit jours, piquées huit fois à la queue pour mesurer leur glycémie, 1 664 souris enchaînent les épreuves d'un protocole sur le syndrome de Noonan. S'y ajoutent une irradiation, une greffe de moelle osseuse sous anesthésie, 48 heures isolées en cage de calorimétrie, un test de force par traction de la queue et des tests d'équilibre et de démarche. 1 184 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 480 d'un niveau léger, et le porteur prévoit que certaines lignées créées développent des tumeurs, sources de douleur et de perte de poids. Sur ce qu'il advient d'elles, le résumé tient en une ligne, toutes sont tuées, sans un mot sur ce qui est prélevé ni pourquoi.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie du syndrome de Noonan (SN), une maladie génétique relativement fréquente principalement causée par des mutations sur le gène codant la proteine tyrosine phosphatase SHP2, qui causent une trop forte activation de cette protéine. Les patients présentent de multiples atteintes développementales (malformations du cœur, du crâne, du squelette, retard de croissance), mais aussi des troubles communément retrouvés chez l’individu âgé dans la population générale : syndrome métabolique, ostéoporose, cancers du sang, inflammation systémique, faiblesse musculaire. A l’appui de ces observations cliniques, de premières données in vitro révèlent un phénomène de vieillissement accéléré (appelé sénescence) dans des cellules exprimant des formes mutées de SHP2. De même, un modèle de la maladie développé chez la souris, en mutant le gène codant SHP2 pour introduire la mutation responsable de la maladie chez l’Homme, présente ce même vieillissement dans ses tissus dès son plus jeune âge. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de SHP2 associée au SN pourrait provoquer un phénotype de vieillissement précoce dont nous souhaitons élucider les mécanismes, et qu’en miroir, l’inhibition de SHP2 pourrait freiner le développement de maladies liées à l’âge. Les objectifs du projet sont donc - de caractériser un modèle murin du SN du point de vue des pathologies liées à l’âge et de la longévité. - d’identifier les mécanismes responsables de ce phénotype, en explorant le rôle de la sénescence, des cellules du système immunitaires et de certaines hormones, dont on sait déjà qu’elles présentent des anomalies dans le SN. - d’évaluer si l’inhibition de SHP2 permet d’améliorer les pathologies liées à l’âge.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux comprendre la physiopathologie du SN afin de proposer des stratégies thérapeutiques et un suivi adapté aux patients. Au-delà des maladies rares, ce projet pourrait permettre d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le développement des pathologies liées à l’âge.
Procédures
-La mise à jeun des animaux pendant 6h pour normaliser la glycémie. -L’injection d’insuline et la contention associée sont réalisées une fois, durée max 15s. -Le gavage et la contention associée (durée
Impact sur les animaux
-Effets indésirables liées à l’établissement de nouvelles lignées : Certaines lignées générées dans le cadre de ce projet pourraient développer des tumeurs ce qui peut être source de douleur et de perte de poids mais pourra être anticipé par le suivi de l’expression précoce d’un marqueur fluorescent dans les cellules cancéreuses. -La mise à jeun des animaux représente un stress. -L’injection d’insuline et la contention associée sont source d’inconfort et de douleur légère au point d’injection. -Le gavage et la contention associée (durée
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés
Remplacement
Le syndrome de Noonan (SN) est une maladie génétique pour laquelle les patients portent dans toutes leurs cellules une mutation dite « gain-de-fonction » sur le gène codant pour SHP2, c’est-à-dire qui rend la protéine plus active. Les souris modèles de cette maladie développent les principaux symptômes de la maladie et représentent en ce sens le meilleur modèle d’étude de cette pathologie. Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie du SN au regard du développement de pathologies liées à l’âge, ce qui nécessite un modèle intégré permettant une étude à l'échelle de l'organisme entier prenant en compte notamment des échanges hormonaux, du dialogue inter-organe et la contribution de cellules sanguines. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche. Les procédures expérimentales présentées à l’appui de ce projet ne peuvent donc pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Toutefois, des tests in vitro sur cellules en culture ont été préalablement réalisés pour limiter au maximum l'expérimentation sur l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes questions scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant à la fois sur les données bibliographiques et sur des études préliminaires déjà réalisées par le porteur du projet au cours des précédents projets. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène, des groupes de 8 animaux seront nécessaires afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Pour les suivis tout au long de la vie des animaux, 20% d’animaux supplémentaires seront prévus pour pallier des pertes d’animaux en cours de protocole. Dans un souci de réduction, le projet a été designé afin de réaliser plusieurs expériences sur les mêmes groupes dès lors qu’elles ne sont pas susceptibles d’interférer les unes avec les autres. Les tissus et organes prélevés seront collectés afin de pouvoir réaliser différents types d’analyses.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (igloo, frisure, papier) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause de bagarres ou pour certaines expériences). Les cages sont passées en revue quotidiennement et les animaux sont observés en détail au moins 2 fois par semaine pour repérer les blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal, maigreur, problème de dentition), et pesés 1 fois par semaine. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera utilisé en parallèle de ces procédures pour minimiser toute douleur.Les points limites sont: émaciation ou perte de poids > 20% en moins d’une semaine, hypothermie, cumul de signes de souffrance (prostration, poil hirsute, dos rond, perte d'activité, ou tout autre signe clinique jugé par le technicien expérimenté comme indiquant un état de souffrance auquel nous ne serions pas en mesure de remédier dans les 24h) atteignant un scoring >9. Ceux-ci permettront d’écarter précocement les animaux du protocole ou de les mettre à mort immédiatement en fonction de l’intensité des comportements observés et donc du niveau de souffrance.Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience.
Choix des espèces
Les modèles murins utilisés dans ce projet représentent les seuls modèles de mammifères génétiquement modifiés pour reproduire la maladie humaine SN. De plus, les souris représentent un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques, endocriniennes et cardiaques. Pour la caractérisation d’un éventuel phénotype dommageable des lignées, les animaux seront suivis dès la période de croissance (3-8 semaines). Le reste des expériences, s’agissant de suivre des pathologies liées à l’âge, sera réalisé sur des animaux adultes de 3 à 24 mois.
Analyse de mitochondries des souris déficientes en seipines
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour isoler et caractériser les mitochondries du tissu adipeux de souris privées de seipine, une protéine dont l'absence détruit la graisse corporelle, 384 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit cinq jours de suite une injection de tamoxifène dans le péritoine, qui déclenche la suppression du gène. Le porteur décrit le phénotype obtenu comme très léger, une perte de masse graisseuse sans effet sur le poids total. Toutes sont tuées quinze jours après l'injection, six d'entre elles étant tuées pour chaque préparation de mitochondries, à raison de huit préparations par groupe et pour chacun des quatre paramètres étudiés.
Objectifs
L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que la dysfonction adipocytaire joue un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. Notre équipe s’intéresse à différents facteurs qui contrôlent l’homéostasie de l’adipocyte. Au cours de ces 10 dernières années, nous avons identifié plusieurs cibles moléculaires impliquées dans la bonne santé adipocytaire. Depuis plus de 15 ans, nous nous intéressons au rôle de la seipine, une protéine dont l'absence entraîne la perte du tissu adipeux. Récemment, nous avons montré que la seipine régulait la bonne santé du tissu adipeux via sa localisation dans les points de contact entre deux structures cellulaires, le réticulum endoplasmique (RE) et les mitochondries. Nous avons d'ores et déjà étudié un modèle murin de déficience inductible et adipospécifique qui de la seipine. Ces dernières années, grâce à des analyses in vitro, nous avons montré que la seipine contrôle l'activité des mitochondries, des organites cellulaires impliqués dans la production de l'énergie et la synthèse des lipides. Afin de confirmer la relevance de nos résultats chez l'animal, nous souhaitons isoler les mitochondries de souris déficientes en seipine et les caractériser. De plus en plus d'évidences montrent que les mitochondries jouent un rôle important dans l'homéostasie du tissu adipeux et que leur fonction est altérée dans le tissu adipeux des souris obèses et des patients atteints d'obésité. Notre travail pourrait permettre de mieux comprendre comment les mitochondries contrôlent les propriétés du tissu adipeux et comment la correction de leurs propriétés pourrait améliorer l'état du tissu adipeux des patients vivants avec une obésité.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux définir les déterminants de la bonne santé adipocytaire et dans le futur, de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les souris recoivent une injection intrapéritonéale (durée 20 secondes) pendant 5 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances principales sont liées aux injections par voie intrapéritonéale de tamoxifène qui permettent l'induction de la délétion. Les souris sont mise à mort 15 jours après l'injection, à ce stade le phénotype est très léger et se traduise principalement par une perte de masse graisseuse sans effet sur le poids total et sans altération du métabolisme.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour permettre les analyses biologiques nécessaires pour le projet
Remplacement
Nous avons déjà validé in vitro que la seipine joue un rôle central dans le contrôle des propriétés des mitochondries. Les expériences proposées ici interviennent à un moment où le rationnel est solide. Cependant, une validation in vivo est indispensable car les propriétes du tissu adipeux restent différentes de celles des modèles celulaires disponibles.
Réduction
Le projet nécessite l’utilisation d’un nombre total de 384 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utilisons 6 animaux pour une préparation d'isolement de mitochondries, et pour avoir des données robustes nous avons besoin de 8 préparations par groupe, pour chacun des 4 paramètres étudiés. Nous utiliserons des tests non paramétriques pour tester la valeur statistique de nos données.
Raffinement
Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate. Les souris sont hébergées 5 par cages. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, qui réduisent la douleur. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en termes de points limites gradés et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne (week-end) comprise permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.
Choix des espèces
Nous avons généré et étudié les souris iATSKO. Nous connaissons bien le modèle et nous savons d'ores et déjà que dans le tissu adipeux de ces souris agées de 8 semaines, les mitochondries ont des propriétés altérées. C'est pour cette raison que nous utiliseraons des souris adultes de 8 à 10 semaines, à un stade où la dysfonction mitochondriale est déjà présente.
Développement d’un traitement pour une maladie neurologique associée à une cardiomyopathie par thérapie génique chez les souris (3/3)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
3 892 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir jusqu'à treize tests de force, treize mesures de motricité et treize échocardiographies sous anesthésie gazeuse. Un quart d'entre elles, celles dont le gène est aboli, développent une cardiomyopathie vers huit semaines et meurent vers douze, en perdant du poids et en adoptant une posture anormale à partir de la onzième. Les nouveau-nés reçoivent une injection intraveineuse après immobilisation par hypothermie sur de la glace humide, et les animaux circulent entre trois établissements. Toutes sont tuées pour prélèvements terminaux, le porteur écrivant espérer restaurer la protéine défectueuse avant d'envisager un essai chez l'humain.
Objectifs
Les mutations du gène d’intérêt provoquent une maladie rare affectant le cerveau, le cœur et le foie. Ce type de maladie se manifeste dans les premiers mois de la vie et la majorité des enfants meurent vers l'âge de deux ans. À ce jour, il n'existe aucun traitement pour cette maladie. Le gène d’intérêt code pour une protéine essentielle pour la production d'énergie dans nos cellules. L’objectif général de ce projet est de développer un traitement pour la maladie causée par des mutations du gène d’intérêt par thérapie génique chez les souris. En particulier, nous allons développer des vecteurs thérapeutiques pour transporter la version normale du gène d'intérêt humain dans le corps des souris malades. L’expression de la version normale du gène d'intérêt peut réparer les dommages causés par la mutation du gène d'intérêt. En injectant ces vecteurs thérapeutiques dans les souris malades, nous espérons restaurer la fonction de la protéine défectueuse dans les organes touchés. Ce projet est multi-site et sera réalisé sur 3 établissements.
Bénéfices attendus
À ce jour, les maladies causées par des mutations du gènes d’intérêt ne disposent toujours pas de traitement curatif permettant de les guérir ou de contrôler leur évolution. Le projet permettra de développer et d'évaluer l'efficacité thérapeutique de notre approche chez la souris. Une fois que nous aurons prouvé que notre approche de thérapie génique fonctionne sur les souris malades, nous pourrons envisager de la tester sur des êtres humains dans le cadre d'essais cliniques.
Procédures
L'élevage des animaux transgéniques se fera dans l'établissement 1 avec biospsie de la queue sur animaux vigiles (1 fois par souris). Dans l'établissement 2 seront réalisées les -Injection par voie intraveineuse dans la veine caudale (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris ), -les tests destinés à évaluer le force (5 min par souris ; 13 fois maximum par souris) -Injection par voie intraveineuse dans la veine temporale (30 secondes par souris; 1 fois maximum par souris) - injection en IV sur souriceaux immobilisés par hypothermie (en contact avec de la glace humide) (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris). Les études par imagerie non invasive et test comportementauxseront réalisées dans l'établissement 3 : -mesure de la motricité dans un milieu ouvert (10 min par souris ; 13 fois maximum par souris), échographie non invasive sous anesthésie gazeuse (20 min par souris; 13 fois maximum par souris).
Impact sur les animaux
Les souris où l’expression du gène d’intérêt est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée) développeront une cardiomyopathie autour 8 semaines, et mourront à 12 semaines. À partir de 11 semaines, ces souris peuvent commencer à perdre du poids et avoir une mobilité réduite avec une posture anormale. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant la contention dans un tube en plastique spécial et l’injection, le stress pendant les tests comportementaux, l’échocardiographie et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort, pour prélèvements terminaux.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle animal est nécessaire et indispensable dans notre étude car nous devons tester l'efficacité des vecteurs thérapeutiques dans la prévention de la maladie. De plus, en testant l'efficacité thérapeutique chez les souris, qui développent normalement la maladie, nous avons la possibilité de voir si la maladie est prévenue ou si elle est retardée. En outre, l'utilisation de modèles de souris est nécessaire parce que les vecteurs thérapeutiques peuvent exprimer la version normale du gène d’intérêt de différentes manières dans les tissus et les cellules en culture..
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies neurologique et sur des méthodes et analyses statistiques. Pour réduire le nombre total de souris, nous testerons d'abord l'efficacité de 4 vecteurs thérapeutiques sur une partie des souris. Seul le meilleur vecteur sera utilisé après dans les études suivantes. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.
Raffinement
Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie et lors de l'injection du vecteur thérapeutique, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante et l'aiguille pour l'injection sera la plus fine possible. Concernant l'injection chez les souriceaux nouveau-nés, nous prendrons des mesures pour minimiser leur stress : l'éloignement temporaire de la mère et la préservation de la litière de la cage maternelle. En outre les injections des nouveau-nés seront effectuées sous anesthésie par hypothermie induite par la stimulation du petit sur de la glace humide pendant 30-60 secondes. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiés tout en réduisant les vibrations et le bruit. En plus l'échographie et les tests comportementaux ne sont effectués que 7 jours après l'arrivée des souris pour permettre leur acclimatation.
Choix des espèces
Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement plus proches des humains. De plus, afin de tester l'efficacité du traitement pour le développement de la thérapie génique, l'utilisation de mammifères est indispensable et les souris représentent un bon modèle. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge. Pour l'injection, nous utiliserons des nouveau-nés et souris juvéniles. Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris juvéniles et adultes
Etude de l’effet de la longueur de la chaine carbonée des acides gras sur la lipémie postprandiale
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Améliorer l'image nutritionnelle des matières grasses laitières, et par là encourager leur consommation : 18 hamsters dorés vont être utilisés dans ce but, dans des procédures déclarées de souffrance légère, puis proposés à l'adoption ou inclus dans un autre protocole. Chacun jeûne douze heures avant d'être gavé à l'huile par sonde, une fois par semaine pendant trois semaines. Sous anesthésie gazeuse, jusqu'à 10 % de leur volume sanguin leur est prélevé chaque semaine, en six ponctions étalées sur six heures lors du premier cycle, trois lors du second. Le porteur revendique une réduction de plus de moitié des effectifs grâce à cette réutilisation des mêmes individus, et annonce comme bénéfice une meilleure qualité nutritionnelle des produits laitiers, qui "encouragerait davantage leur consommation".
Objectifs
L’ingestion d’un repas riche en graisse provoque une augmentation excessive des lipides dans le sang. Cette augmentation du taux de lipides dans le sang est connue comme étant un facteur de risque de développer des maladies cardiovasculaires. Dans cette étude, nous allons vérifier si le remplacement d’une partie des lipides alimentaires par des acides gras qui ont une structure particulière (dits acides gras à chaînes courte et moyenne) entraînerait une moindre augmentation du taux de lipides après un repas et serait donc favorable à une meilleure santé cardiovasculaire. Nous prévoyons donc d’administrer ces lipides laitiers par voie orale à des hamsters, d’analyser les différents taux de lipides dans le sang pendant les 6h qui suivent l’administration et de comparer les résultats avec ceux obtenus après l’administration chez ce même groupe de hamsters de lipides laitiers standard ou de l’huile de palme (acides gras connus pour leur effet délétère). Ces expériences seront réalisées sur deux lots d'animaux et les expérimentations sur chaque lot sont appelées par la suite cycle 1 d'expérimentation et cycle 2 d'expérimentation.
Bénéfices attendus
Il est attendu une diminution des taux de lipides dans le sang après l’ingestion des lipides laitiers riches en acides gras à chaînes moyennes et courtes comparé aux lipides laitiers standard ou encore à l’huile de palme. Trois paramètres seront étudiés : l’évolution du taux de lipides pendant 6 heures après l’administration, taux cholestérol estérifié dans les HDL (bon cholestérol) et les LDL (mauvais cholestérol) et la mesure d’activité d’un transporteur de lipide (CETP). Les produits laitiers sont une source importante de protéines et de calcium, et leur consommation fait partie intégrante des habitudes alimentaires en France. La modification de leurs lipides pour les rendre moins susceptibles d’induire des maladies cardiovasculaires constituerait une amélioration significative de leur qualité nutritionnelle, et encouragerait davantage leur consommation.
Procédures
- Mise à jeun (12h) avant chaque gavage à l'huile à l'aide d'une sonde souple. - Gavages une fois par semaine pendant 3 semaines. - Prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse :
Impact sur les animaux
Gavage => nuisances en lien = stress de courte durée lié à la contention. Prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés => nuisances en lien = stress lié à l'anesthésie
Devenir
Les animaux peuvent être inclus dans la mesure du possible dans un autre protocole. Autrement, ils seront proposés à l'adoption (placement).
Remplacement
La lipémie postprandiale est le résultat de plusieurs processus physiologiques impliquant la digestion, l'absorption, l'hydrolyse et la captation tissulaire. Son évaluation exige donc une expérimentation in vivo. Il n'existe aucune méthode alternative (in silico ou in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques impliqués dans la réponse postprandiale.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés dans cette étude, nous avons prévu la réutilisation des animaux, dans chacun des 2 cycles, avec des périodes de wash-out de minimum une semaine. En effet dans notre étude nous avons trois groupes correspondant chacun à une fraction lipidique. En théorie, il aurait fallu 54 animaux, au total, pour avoir 9 animaux/groupe/cycle d'expérience, alors que nous prévoyons seulement 18 hamsters pour la totalité de l'étude, soit une réduction de plus de 50%.
Raffinement
L'hébergement respecte les recommandations en vigueur chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (mise à disposition de carrés de coton, des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). Un suivi régulier des animaux est assuré par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). Les protocoles expérimentaux pour chaque procédure sont optimisés afin d’obtenir le maximum d’informations et des résultats fiables. Les procédures utilisées étant de sévérité légère, nous utilisons des points limites adaptés qui consistent essentiellement à surveiller le poids des animaux, un animal ayant perdu du poids ne sera pas utilisé après la période de wash-out. Les points limites retenus pour la procédure expérimentale de ce projet seront déterminés lors du suivi quotidien des animaux. Une mauvaise hygiène, un repliement sur soi, une diminution de l’activité, une diminution de la prise alimentaire (boisson et nourriture), une perte de poids (>10%) représentent des critères d’observation traduisant la présence d’une souffrance. En cas de souffrance, l’animal est mis en observation pour d’éventuels soins. Si la souffrance, pour des raisons inconnues, persiste, l’animal est euthanasié.
Choix des espèces
Le hamster syrien doré est un animal qui présente de nombreuses similitudes en ce qui concerne le métabolisme des lipides. Il présente une gestion de l'absorption des lipides ainsi qu'une répartition de cholestérol présence du bon et du mauvais cholestérol) similaires à ce qu'on retrouve chez l'homme. Nous avons fait le choix d'utiliser des hamsters adultes (âgés de plus de 8 semaines, environ 100g) ce qui nous permet de réaliser les différents prélèvements dans de bonnes conditions.
Production et élevage de modèles pathologiques rongeurs induits par une alimentation spécifique.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 5000
Rendus obèses et diabétiques par un régime riche en matières grasses avant même le début de toute expérience, 10 000 souris et 5 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le protocole tient à peu de chose, une pesée pour tous et un ou deux prélèvements sanguins pour moins d'un pour cent d'entre eux, le reste étant les signes cliniques que l'alimentation installe. Le porteur décrit un service, ces 15 000 rongeurs étant produits en fonction des "besoins stricts de chaque scientifique" et expédiés à qui les commande. Ceux qui ne partent pas sont tués, un animal "non standard" ne pouvant pas passer d'un projet à un autre si les spécifications diffèrent.
Objectifs
Dans le but d’étudier certaines maladies, il peut être nécessaire d’induire une modification de métabolisme et/ou de paramètres physiologiques en modifiant le régime alimentaire des animaux. Par exemple, une alimentation riche en matières grasses a été liée à un grand nombre de maladies, dont l'obésité, les maladies métaboliques et inflammatoires. Ce projet vise à produire des modèles animaux pathologiques avec des modifications physiologiques induites par l’alimentation dans le but de répondre aux attentes des chercheurs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont le développement pour la communauté scientifique d’un modèle diabétique/d’obésité permettant de mieux comprendre et étudier ces phénomènes pathologiques qui touchent à la fois l’humain et l’animal, et de chercher des traitements à ces maladies et leurs comorbidités.
Procédures
Microprélèvements (moins de 1% des animaux, durée du geste : environ 1 minute), prise de sang (moins de 1% des animaux, durée du geste : environ 2min), pesée (100% des animaux, durée du geste : environ 30 secondes par souris et 1 minute par rat). Un animal subira 1 seule pesée et au maximum deux prélevements sanguins pendant l’étude.
Impact sur les animaux
Signes cliniques associés à l’obésité et au phénotype diabétique, stress et douleur associés aux prélèvements sanguins, stress associé à la pesée, stress associé à la contention.
Devenir
Les animaux sont mis à mort car il s’agit d’animaux non standards, suivant un protocole de nourissage et de prise de poids spécifiques aux attentes des scientifiques. On ne peut pas réutiliser les animaux d’un projet pour un autre projet à moins que les spécifications soient identiques ou les animaux sont expédiés chez le scientifique.
Remplacement
Ces modèles pathologiques sont issus de mécanismes complexes avec des processus de régulation impliquant l’ensemble de l’organisme. Ils permettent d’observer les conséquences des pathologies dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques et qui ne peuvent être remplacés par aucune méthode alternative.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et à prendre les deux sexes. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle, ce nombre étant basé sur les taux de réussite connus et attendus des modèles. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal afin d’adapter les traitements et de diminuer la morbidité et mortalité éventuelle.
Raffinement
Les animaux ont accès à de l’enrichissement dans leurs cages (mouchoirs et frisure de carton). Les animaux sont manipulés avec des méthodes à faible stress (manipulation par le corps). Afin de limiter le stress lors des prises de sang, dès que possible, les microprélèvements sont favorisés au lieu de prise de sang. Des points limites spécifiques et précoces ont été définis et seront appliqués.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des espèces très utilisées en recherche. Ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables. Ce sont les espèces qui permettent à la communauté scientifique de réaliser un certain nombre d'études en recherche et développement grâce aux données historiques et à leur connaissance de ces modèles animaux. Stade adulte compte tenu que l’aliment est donné aux animaux après sevrage (généralement à 6 semaines), comme le demande le modèle pathologique.
Production et élevage de modèle rongeur d’obésité (rat ZDF)
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Maladies animales
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
Produits en permanence sur le site d'un éleveur et vendus à la communauté scientifique, 10 000 rats ZDF vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont obèses et diabétiques par construction, l'accouplement retenu étant consanguin, frère-sœur, entre mâles obèses et femelles non obèses, les femelles obèses ne produisant pas de lait. Ceux qui ne partent pas chez un chercheur sont tués, le porteur indiquant qu'ils portent un phénotype dommageable et ne peuvent pas être proposés à l'adoption. Les procédures se limitent à des microprélèvements sanguins jusqu'à deux fois par semaine, quatre prises de sang et une pesée hebdomadaire, auxquels s'ajoutent les signes cliniques de l'obésité et du diabète. Le porteur affirme qu'aucun modèle "alternatif inerte systémique complet" n'existe encore pour remplacer l'animal vivant.
Objectifs
Le projet a pour but de développer et fournir à la communauté scientifique des modèles animaux avec une modification du métabolisme et/ou physiologique induite par la modification du régime alimentaire (aliment riche en matière grasse). Le modèle est un modèle de rat diabétique et obèse nourri avec une alimentation spécifique, produit de façon permanente sur le site.
Bénéfices attendus
Mise à disposition pour la communauté scientifique d’un modèle diabétique/d’obésité permettant de mieux comprendre et étudier ces phénomènes pathologiques qui touchent à la fois l’humain et l’animal, et de chercher des traitements à ces maladies et leurs comorbidités.
Procédures
Micro prélèvements (durée : 1 minute, fréquence : deux fois par semaine au maximum), prise de sang (durée 2 minutes, fréquence : 4 fois, à minimum trois semaines d’intervalle), pesée (durée : 30 secondes, fréquence : une fois par semaine)
Impact sur les animaux
Signes cliniques associés à l’obésité et au phénotype diabétique, stress et douleur associés aux prélèvements sanguins à la queue, stress associé à la pesée, stress associé à la contention.
Devenir
Mise à mort ou expéditions chez le scientifique. Les animaux non expédiés chez le scientifique seront mis à mort car présentant un phénotype dommageable et ils ne peuvent pas être proposés à l’adoption.
Remplacement
L’étude de la pathologie du diabète et de l’obésité, et la recherche de traitements nécessite encore à ce jour l’utilisation de modèles in vivo, des modèles alternatifs inertes systémiques complets n’existant pas encore à ce jour.
Réduction
Suite à l’analyse de nos statistiques de production et d’envoi d’animaux à la communauté scientifique, il a été décidé de réduire le niveau de nos colonies et de réduire le nombre de reproducteur de 20%. En choisissant le schéma d’accouplement consanguin (frère-soeur) mâle obèses (homozygotes pour le gène d’intérêt) avec femelles non-obèses (hétérozygotes pour le gène d’intérêt), nous optimisons le nombre d’animaux portant le phénotype d’intérêt au sein de la portée en réduisant les animaux réformés n’ayant pas le bon génotype. L’accouplement homozygote par homozygote n’est pas possible car les femelles homozygotes ne produisent pas de lait. De plus, certains scientifiques ont besoin d’animaux témoins non-obèses (de génotype hétérozygote).
Raffinement
Les animaux ont accès à de l’enrichissement dans leurs cages (mouchoirs et frisure de carton). Les animaux sont manipulés avec des méthodes à faible stress (manipulation par le corps). Dès que possible, les microprélèvements sont favorisés au lieu de prise de sang. Des points limites spécifiques et précoces ont été définis et seront appliqués.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des espèces très utilisées en recherche. Ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables. Ce sont les espèces qui permettent à la communauté scientifique de réaliser un certain nombre d'études en recherche et développement grâce aux données historiques et à leur connaissance de ces modèles animaux. Les animaux seront utilisés à partir de 5 semaines car c’est à partir de cet âge que le phénotype diabétique/obèse commence à s’exprimer.
Développement de modèles de souris pour l’étude de maladies neurologiques et cardiaques 2/3
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
4 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à six échocardiographies sous anesthésie gazeuse, six injections intrapéritonéales, des tests de force et de course sur tapis roulant, et une biopsie pour génotypage. Le projet fabrique deux lignées de maladies mitochondriales : dans la première, un quart des souriceaux de chaque portée développe une cardiomyopathie avec perte de poids et posture anormale, dans la seconde, un quart développe une maladie neurologique et est tué le jour de sa naissance. Le porteur justifie l'effectif par ses travaux antérieurs et des méthodes statistiques, sans détailler le calcul qui mène à 4 420 souris pour produire et décrire deux modèles.
Objectifs
Les maladies dues à un défaut de production d’énergie, sont de maladies génétiques très rares et incurables. Ces maladies peuvent se manifester à tout âge et peuvent affecter plusieurs types d'organes en même temps. Les mutations du notre gènes d’intérêt n 1 et 2, codant des protéines essentielles pour la production d'énergie dans nos cellules, provoquent des maladies affectant le cerveau et le coeur. Comme ces maladies affectent les cellules qui ne se divisent pas, la culture cellulaire ne peut pas aider à comprendre comment le dysfonctionnement mitochondrial affecte le fonctionnement des organes affectés et le développement de la maladie. Ainsi, un modèle animal doit être utilisé pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces maladies. Nous avons décidé d'utiliser les souris comme modèle parce que les souris sont plus proches de l’humain et la physiologie mitochondriale chez l’homme et la souris sont très similaires. Nos objectifs sont les suivants : - Création et étude d'un modèle de souris pour l'étude du développement des maladies associées au gène d’intérêt 1 et 2. La création de ces deux modèles animaux et la compréhension du développement de la maladie mitochondriale sont des étapes nécessaires à la mise au point d'un traitement efficace.
Bénéfices attendus
Ce projet fournira des modèles murins pour les maladies mitochondriales et permettra de découvrir leurs mécanismes pathologiques. Ces deux points sont des étapes essentielles pour le développement d'un traitement pour ces maladies encore incurables.
Procédures
-échocardiographie (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -anesthésie gazeuse (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -injection intra-péritonéale (1 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -grip-test (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -treadmill (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris); biopsie pour génotypage: (1 min par souris; 1 fois par souris )
Impact sur les animaux
Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 1 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront une cardiomyopathie..À partir de 9 semaines, ces souris peuvent commencer à perdre du poids et avoir une mobilité réduite avec une posture anormale. Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 2 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront maladie neurologique et seront mis à mort le premier jour de vie. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant le test comportementaux, pendant l’échocardiographie, pendant l’injection intra péritonéal et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour l'analyse moléculaire, histologique et biochimique des tissus
Remplacement
L’objectif de notre projet est d’étudier la pathophysiologie des maladies mitochondriales. Pour cette raison l’utilisation d’un modèle animal est nécessaire. La préparation des cultures cellulaires primaires, pour l'étude du rôle moléculaire des protéines codées par notre gènes d’intérêt, aide à réduire le nombre d'animaux utilisés mais ils ne peuvent malheureusement pas remplacer l'utilisation du modèle animal.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies mitochondriales et sur de méthodes et analyses statistiques. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.Nous utiliserons des méthodes statistiques comme des tests t de Student et Anova en fonction des groupes d’animaux comparés.
Raffinement
Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiées tout en réduisant les vibrations et le bruit.
Choix des espèces
Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement proches des humains. La physiologie mitochondriale et la tissu-spécificité des fonctions mitochondriales chez l’homme et la souris sont très similaires. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge (embryons, nouveau-nés, souris juvéniles et juvéniles adultes). Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris âgées de 3 semaines et plus.
Etude de l’impact du polymorphisme N363S du gène NR3C1 codant le Récepteur Glucocorticoïde sur le rétrocontrôle négatif de l’axe corticotrope par les glucocorticoïdes exogènes
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
Opérées sous anesthésie générale pour recevoir un dispositif de perfusion porté cinq semaines, une partie des 282 souris de ce projet subit des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les autres reçoivent une injection sous anesthésie locale, et le porteur prévoit de réutiliser certains animaux dans une seconde procédure avant de les tuer pour analyser leur sang et leurs organes. Le projet porte sur une mutation du récepteur des glucocorticoïdes que portent 2 à 4 % des humains, et cherche à savoir si elle aggrave le risque d'insuffisance corticotrope après un traitement prolongé aux corticoïdes. Un test comportemental d'évaluation du stress de cinq minutes est annoncé, répété deux fois dans la vie de chaque souris, sans que le porteur précise lequel.
Objectifs
Les hormones glucocorticoïdes sont sécrétées par la glande surrénale. Elles sont sécrétées pour permettre à l’organisme de s’adapter en cas de stress et de diminuer la réponse inflammatoire. C’est pourquoi les glucocorticoïdes sont largement utilisés comme traitement. Ils sont utilisés notamment dans le traitement des maladies inflammatoires, des allergies, de l’asthme ou de nombreux cancers. Les glucocorticoïdes n’agissent pas seulement sur la réponse inflammatoire mais sur de nombreux autres organes. C’est pourquoi, lorsqu’il y a un déséquilibre, ils peuvent entrainer des effets secondaires. Lors d’un traitement prolongé par glucocorticoïdes, il n’y a plus de production par l’organisme de glucocorticoïdes. Lorsqu’on arrête le traitement, la production de glucocorticoïdes par l’organisme ne reprend pas chez 40% des patients. Cela entraine un manque de glucocorticoïdes qui peut entrainer des complications graves et s’appelle l’insuffisance corticotrope. Pour le moment, il est difficile de prédire chez quels patients surviendra cet effet secondaire. C’est pourquoi nous essayons de mieux comprendre cette maladie pour améliorer la prise en charge des patients. Les glucocorticoïdes agissent par l’intermédiaire du récepteur glucocorticoïde. Chez 2% de la population mondiale, il existe une mutation de ce récepteur qui entraine une augmentation de l’effet des corticoïdes et donc, théoriquement, une augmentation du risque de complications. Pour étudier si cette mutation augmente le risque d’insuffisance corticotrope, l’utilisation de modèles cellulaires est insuffisante. En effet, ils ne permettent pas de reproduire la complexité de la sécrétion de glucocorticoïdes ainsi que les différents niveaux de régulation. Aussi, il est nécessaire de générer un modèle murin afin d’évaluer les différents acteurs impliqués dans la régulation de l’axe corticotrope. Ce modèle murin permettra d’étudier l’effet de la mutation sur la sécrétion de glucocorticoïdes et d’évaluer si elle constitue un facteur de risque d’insuffisance corticotrope.
Bénéfices attendus
La variabilité inter-individuelle dans la sensibilité aux corticoïdes est un enjeu important en médecine, en effet on considère que près de 2% de la population mondiale reçoit un traitement par glucocorticoïdes exogène. La mise en évidence du variant N363S, retrouvé chez 2-4% de la population, comme facteur de risque pourrait permettre d’adapter de façon personnalisée leur prescription afin de limiter la survenue d’effets indésirables.
Procédures
Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée génétiquement modifiée, les animaux seront soumis à un test comportemental d’évaluation du stress, d’une durée de 5 minutes, 2 fois au cours de leur vie. Nous évaluerons également la préférence au sucre grace à un test d'une durée de 2 jours. Une partie des souris adultes recevront une injection après anesthésie locale. D’autres souris seront opérées par anesthésie générale pour mise en place d’un système de délivrance de traitement par perfusion pour une durée de 5 semaines. Ce dispositif permet de ne faire qu’un geste chirurgical, sans avoir à faire plusieurs injections. De plus, les souris seront soumises 5 semaines plus tard à un test comportemental d’évaluation du stress, d’une durée de 5 minutes.
Impact sur les animaux
La modification génétique des animaux ne devrait pas entrainer de souffrance spécifique puisqu’il n’existe pas chez l’être humain de pathologie liée à cette mutation. Cependant, les personnes ayant cette mutation ont tendance à avoir plus de troubles métaboliques et à être plus à risque d’obésité, ces aspects seront donc recherchés et pris en charge le cas échéant chez les animaux génétiquement modifiés. Les nuisances des procédures proposées sont faibles à modérées pour les animaux. L’injection de traitement peut entrainer une douleur au niveau du point d’injection et la pose d’un dispositif sous cutané peut entrainer des douleurs. Ces douleurs sont prévisibles et prises en charge par l’anesthésie.
Devenir
Dès que possible, les animaux seront utilisés dans plusieurs procédures, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire. Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures quand cela sera nécéssaire pour permettre les analyses de sang et des organes post-mortem.
Remplacement
Les corticoïdes agissent sur l’ensemble de l’organisme et sont sous le contrôle de l’axe corticotrope, composé de plusieurs niveaux, comprenant une partie du cerveau, la glande hypophyse et la glande surrénale. Leurs effets sont très finement contrôlés car un excès de corticoïdes entraine des complications métaboliques, psychiatriques et cardiovasculaires et un manque de corticoïdes entraine le décès. Pour permettre cet équilibre, leur sécrétion est contrôlée à différents niveaux, qui est difficile d’étudier de façon dissociée. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à un modèle vivant permettant de reproduire le dialogue entre les différents organes impliqués. L’utilisation de modèles cellulaires in vitro est compliqué, d’une part car il existe un seul modèle de cellules corticotropes immortalisées hypophysaires, issu de cellules tumorales ne réagissant pas forcément de la même façon que des cellules saines aux corticoïdes. D’autre part, car la culture cellulaire ne permet pas de rendre compte de la dynamique de l’axe corticotrope au cours du temps.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un calcul de puissance afin d'inclure uniquement le nombre d'animaux nécéssaire pour répondre à la question posée dans chaque procédure. Le nombre minimal d’animaux a été choisi pour l’ensemble des procédures. Dès que possible, les animaux seront utilisés dans deux procédures pour permettre la réduction du nombre d'animaux nécéssaires.
Raffinement
Les conditions d’élevage et d’hébergement seront appropriées pour réduire la douleur, la souffrance, l’angoisse ou les dommages durables que pourraient ressentir les animaux : cages adaptées à l’animal et à sa taille en maintenant les animaux par deux minimums dans chaque cage, et par enrichissement du milieu par copeaux de bois/tunnel en carton et cabanes. * Souris : 5 animaux par cage au maximum (nombre susceptible de varier en fonction de la taille des animaux) - Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et les responsables du projet afin de ne pas méconnaître les points limites. - Les mesures des animaux (poids, taille) seront couplés afin de réaliser l’analyse de plusieurs paramètres pour limiter au maximum le stress des animaux. - Une anesthésie générale ou locale de courte durée sera réalisé pour chaque procédure entrainant une douleur.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des souris, en effet, les souris sont souvent utilisées dans la recherche car les manipulations génétiques sont bien connues et maitrisées dans cette espèce. De plus, la séquence du gène chez la souris est très proche de celle de l’être humain, ce qui permettra d’extrapoler les données obtenues. Les souris étudiées seront des souris adultes, car les effets attendus de la mutation s’expriment à l’âge adulte.
Cibler la prise de poids, l’obésité et ses syndrômes métaboliques associés
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Les souris qui perdent 20 % de leur poids initial sont tuées. 1 280 souris vont être utilisées dans ce projet sur l'obésité, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour mesurer leur masse graisseuse. Engraissées par un régime riche en lipides ou en sucres, elles reçoivent trois injections abdominales par semaine ou un gavage, sont pesées trois fois par semaine et saignées tous les trois mois. Le porteur indique que la molécule injectée peut provoquer une perte de poids importante, ce qui place les souris traitées entre l'obésité induite et le seuil de mise à mort, l'objectif final étant de porter une nouvelle thérapie amaigrissante vers la clinique.
Objectifs
En 2020, 8,5 millions de personnes souffrent d’obésité, dont 1 million de personnes en obésité massive soit 17% de la population nationale. De plus, l’obésité, chez les plus jeunes, montre des chiffres inquiétants, puisque l’on observe la plus forte progression des cas d’obésité chez les 18-24 ans. En effet, cette tranche d’âge est passée de 5,4% en 2012 à 9,2% en 2020. Chez les enfants, les observations sont elles aussi alarmantes puisque 34% des enfants de 2-7 ans et 21% des adolescents de 8-17 ans sont en situation de surpoids ou d’obésité. La situation actuelle est inquiétante pour l’avenir car cette augmentation de l’obésité chez les plus jeunes va conduire à une augmentation des pathologies liées à l’obésité telles que les maladies cardio-vasculaires, le diabète et les cancers. L’obésité reste aujourd’hui un problème de santé public important. La finalité du projet et son bien-fondé visent à comprendre le rôle et la fonction de notre protéine d’intérêt dans l’obésité et ses pathologies associées, afin de proposer une nouvelle thérapie pour leur prise en charge. Ce projet repose sur des observations que le laboratoire a obtenu sur cellules ainsi que sur des publications internationales. L’essence même de la question posée implique l’utilisation d’un organisme vivant tel que la souris, afin d’illustrer au plus proche de l’homme sa compléxité métabolique, sans solutions alternatives satisfaisantes.
Bénéfices attendus
Ce projet, à court terme, permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents au développement de l’obésité et des syndromes métaboliques associés. En étudiant, plus particulièrement le rôle et la fonction de notre protéine d’intérêt tout au long de la prise de poids. L’utilisation de souris non modifiées génétiquement mâles et femelles, permettra de modéliser au plus proche de l’humain le métabolisme lors d’un régime riche en lipides ou en sucres. Ces souris seront traitées avec un médicament permettant la disparition de cette protéine. Ceci nous permettra de voir si l’élimination de cette protéine induit une diminution de la prise de poids de nos souris et in fine de prévenir/traiter l’obésité et ses syndrômes métaboliques associés chez le rongeur. De plus, les souris prédisposées génétiquement à une prise de poids accélérée (obésité) ou à un développement de diabète de type 2 permettront de valider l’impact de la dégradation de notre protéine d’intérêt sur un syndrome métabolique établi génétiquement. A la fin du projet, l’objectif est de transférer une nouvelle thérapie vers la clinique afin de mieux répondre aux problématiques de santé publique que constituent que l’obésité et les pathologies associées comme le diabète de type 2.
Procédures
Nous serons ammenés à effectuer un prélévement sanguin tous les 3 mois afin de tester leur glycémie (80uL total de sang prélevé, 1min par souris contention comprise). Les animaux seront aussi soumis à des injections de médicaments dans le bas du ventre (5secondes par souris, contention comprise) ou gavage (10 secondes par souris, contention comprises). Pour pouvoir effectuer ces injections les animaux seront contentionnés de façon adéquat par le personnel.
Impact sur les animaux
Lors du traitement des animaux par un personnel qualifié, l’injection intra-péritonéale à répétition peut entrainer l’apparition occasionnelle d’hématomes sous-cutanés. Pour ces injections nous privilégierons le côté droit de l’animal. Lors de ces injections, il y aura une contention de l’animal (trois fois par semaine) ce qui peut conduire à un stress modéré pour les animaux. La drogue injectée peut également provoquer une perte de poids importante chez les animaux qu’il faudra surveiller attentivement grâce à des pesées tri-hebdomadaires. Lors du traitement par gavage, nous vérifierons l'abdomen des souris afin qu'il n'y ai aucune contraction de celui-ci pouvant être lié à une réaction du produit administré.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en respectant les règles de bien-être animal. Cela afin d’étudier au niveau moléculaire et anatomiques (diminution de la masse graisseuse, etc ) les effets de notre traitement.
Remplacement
Dans le laboratoire, nous avons déjà réalisé in vitro, sur des cellules pré-adipocytaire, les expériences permettant de montrer la nécessité de notre protéine d’intérêt dans la différenciation adipocytaire et son impact sur le métabolisme. Cependant les cellules pré-adipocytaires ne permettent pas d’appréhender la complexité métabolique d’un organisme entier, c’est pourquoi, il est important de réaliser ces procédures expérimentales sur l’animal. Notre objectif in fine, étant de présenter en clinique une nouvelle thérapie contre l’obésité et ses pathologies associées tel que le diabète, l’utilisation des animaux et notamment les souris est indispensable au déroulement de notre projet.
Réduction
Nos resultats expérimentaux obtenus sur des cellules nous permettent d’anticiper certains résultats et ainsi diminuer le nombre de conditions expérimentales sur animal vivant. Le nombre d’animaux prévu dans le cadre de ce projet a été défini en prenant en compte les tests statistiques. Sur cette base, nous avons estimé à 1280 animaux, le nombre d’animaux nécessaires pour l’ensemble de notre projet
Raffinement
L’hébergement se fera à raison de 5 animaux par cage, sur un fonds de litière et enrichissement en briques de peuplier ou carrés de cellulose pour favoriser la confection de nids. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les membres du personnel et à heures fixes afin de limiter le stress. Ils seront pesés trois fois par semaine. Tout animal présentant des difficultés à se nourrir ou à s’abreuver sera assisté par le dépôt dans la cage d’un gel lui évitant d’aller chercher en hauteur nourriture ou boisson. Une perte de masse corporelle constituera un indicateur de toxicité et sera considérée comme un point limite conduisant à l’euthanasie de l’animal lorsqu’elle sera égale ou supérieure à 20% du poids initial. Les injections IP seront réalisées par du personnel formé en préviliégiant le coté droit de l’animal . Une attention particulière sera portée aux points suivants afin de limiter la souffrance et la détresse des animaux : - Une absence d’hydratation ou de prise de nourriture afin d’anticiper une perte de poids excédant 20 % du poids initial - Une gêne dans la locomotion - D’autres signes de douleur tels que l’isolement des autres animaux, les yeux fermés ou creux, le dos voûté - Un saignement ou autre perte de liquide physiologique - Un changement du rythme respiratoire - Tout autre comportement anormal de l’animal tel que la prostration ou la vocalise lors de la préhension. - Lors du traitement par gavage, nous vérifierons l'abdomen des souris afin qu'il n'y ai aucune contraction de celui-ci pouvant être lié à une réaction du produit administré.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour notre projet, disposant d’un système génétique et métabolique proche de l’homme. De plus, de nombreux modèles génétiquements modifiés pour les études de l’obésité ont été générés et utilisés dans la recherche scientifique. L’expérimentation sur ces modèles, déjà établis, nous permettra de voir l’efficacité du traitement et de comprendre au mieux l’impact de celui-ci sur un organisme entier. Nous choisirons des souris jeunes sevrées (c’est-à-dire environ 4 semaines de vie). Pour notre projet, il est important d’avoir de jeunes souris afin de suivre au plus tôt le développement de la pathologie (obésité/diabéte) mais aussi d’observer au mieux le temps de l’apparition des symdromes métaboliques associées à l’obésité.
Développement d’un traitement pour une maladie neurologique associée à une cardiomyopathie par thérapie génique chez les souris (2/3)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Pour tester des vecteurs de thérapie génique contre une maladie mitochondriale qui tue la plupart des enfants atteints avant deux ans, 3 892 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse des tissus. Les nouveau-nés sont anesthésiés par contact avec de la glace humide pendant trente à soixante secondes, puis injectés dans la veine temporale. Chaque souris peut subir jusqu'à treize échocardiographies sous anesthésie, treize open field et treize grip tests, et un quart d'entre elles, celles chez qui le gène est éteint, développe une cardiomyopathie fatale accompagnée de perte de poids, de difficultés de mouvement et d'une posture anormale. Les trois quarts restants naissent sans la mutation et sont tués comme les autres, l'effectif de 3 892 n'étant justifié que par référence à des travaux antérieurs.
Objectifs
Les mutations du gène d’intérêt provoquent une maladie rare affectant le cerveau, le coeur et le foie. Ce type de maladie se manifeste dans les premiers mois de la vie et la majorité des enfants meurent vers l'âge de deux ans. À ce jour, il n'existe aucun traitement pour cette maladie. Le gène d’intérêt code pour une protéine essentielle pour la production d'énergie dans nos cellules. L’objectif général de ce projet est de développer un traitement pour la maladie causée par des mutations du gène d’intérêt par thérapie génique chez les souris. En particulier, nous allons développer des vecteurs thérapeutiques pour transporter la version normale du gène d'intérêt humain dans le corps des souris malades. L’expression de la version normale du gène d'intérêt peut réparer les dommages causés par la mutation du gène d'intérêt. En injectant ces vecteurs thérapeutiques dans les souris malades, nous espérons restaurer la fonction de la protéine défectueuse dans les organes touchés.
Bénéfices attendus
À ce jour, les maladies causées par des mutations du gènes d’intérêt ne disposent toujours pas de traitement curatif permettant de les guérir ou de contrôler leur évolution. Le projet permettra de développer et d'évaluer l'efficacité thérapeutique de notre approche chez la souris. Une fois que nous aurons prouvé que notre approche de thérapie génique fonctionne sur les souris malades, nous pourrons envisager de la tester sur des êtres humains dans le cadre d'essais cliniques.
Procédures
-Injection par voie intraveineuse dans la veine caudale (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris ) - échocardiographie (20 min par souris; 13 fois maximum par souris) -anesthésie gazeuse (20 min par souris; 13 fois maximum par souris) -open field test (10 min par souris ; 13 fois maximum par souris) -grip test (5 min par souris ; 13 fois maximum par souris) -Injection par voie intraveineuse dans la veine temporale (30 secondes par souris; 1 fois maximum par souris) - anesthésie par hypothermie (en contact avec de la glace humide) (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris) -biopsie par genotypage (1 min par souris; 1 fois par souris)
Impact sur les animaux
Les souris où l’expression du gène d’intérêt est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée) développeront une cardiomyopathie fatale. En plus de la maladie cardiaque, ces souris peuvent présenter une perte de poids, des difficultés de mouvement et adopter une posture anormale. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant la contention dans un tube en plastique spécial et l’injection, le stress pendant les tests comportementaux, l’échocardiographie et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour l'analyse des tissus.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle animal est nécessaire et indispensable dans notre étude car nous devons tester l'efficacité des vecteurs thérapeutiques dans la prévention de la maladie. De plus, en testant l'efficacité thérapeutique chez les souris, qui développent normalement la maladie, nous avons la possibilité de voir si la maladie est prévenue ou si elle est retardée. En outre, l'utilisation de modèles de souris est nécessaire parce que les vecteurs thérapeutiques peuvent exprimer la version normale du gène d’intérêt de différentes manières dans les tissus et les cellules en culture..
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies neurologique et sur des méthodes et analyses statistiques. Pour réduire le nombre total de souris, nous testerons d'abord l'efficacité de 4 vecteurs thérapeutiques sur une partie des souris. Seul le meilleur vecteur sera utilisé après dans les études suivantes. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.
Raffinement
Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie et lors de l'injection du vecteur thérapeutique, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante et l'aiguille pour l'injection sera la plus fine possible. Concernant l'injection chez les souriceaux nouveau-nés, nous prendrons des mesures pour minimiser leur stress : l'éloignement temporaire de la mère et la préservation de la litière de la cage maternelle. En outre les injections des nouveau-nés seront effectuées sous anesthésie par hypothermie induite par la stimulation du petit sur de la glace humide pendant 30-60 secondes. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiés tout en réduisant les vibrations et le bruit. En plus l'échographie et les tests comportementaux ne sont effectués que 7 jours après l'arrivée des souris pour permettre leur acclimatation.
Choix des espèces
Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement plus proches des humains. De plus, afin de tester l'efficacité du traitement pour le développement de la thérapie génique, l'utilisation de mammifères est indispensable et les souris représentent un bon modèle. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge. Pour l'injection, nous utiliserons des nouveau-nés et souris juvéniles. Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris juvéniles et adultes