Troubles endocriniens

Une hypoglycémie confirmée sur deux prélèvements successifs entraîne la mise à mort immédiate de la souris. 6 048 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une modification génétique qui augmente le risque de tumeurs neuroendocrines, reçoivent une injection de tamoxifène, jusqu'à deux prélèvements sanguins et jusqu'à trois injections d'anti-inflammatoires en cas de douleur, avant une anesthésie terminale. Les mises à mort s'échelonnent à 3, 6, 12, 18 et 24 mois de vie pour prélever les organes, et l'effectif de 6 048 animaux repose sur une probabilité de phénotype tumoral estimée d'après la littérature, le porteur indiquant qu'il le réduira si l'effet observé dépasse son estimation.

Objectifs

La néoplasie endocrinienne multiple de type 1 (NEM1) est une maladie rare prédisposant à la survenue de plusieurs tumeurs du système endocrinien. Elle est due à des mutations du gène MEN1, codant pour la ménine. Notre hypothèse est que l’inactivation de Men1 dans des cellules dérivées de la crête neurale (CCN) favorise la tumorigénèse dans les sites endocriniens avoisinants. Notre objectif est de développer, de caractériser et de comparer les phénotypes tumoraux et hypophysaires de modèles murins présentant une inactivation du gène Men1 dans ces CCN à différents moments de leur différenciation pré- et post-natale, afin de déterminer le rôle de la crête neurale dans le développement des tumeurs hypophysaires. L’étude des autres lésions de la NEM1 dans nos modèles murins permettra de mieux connaître le rôle des CCN dans la tumorigénèse des patients.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet qu’il augmente nos connaissances sur le rôle des cellules dérivées de la crête neurale dans le développement tumoral hypophysaire, pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans ces tumeurs. Nous pensons que ce travail nous permettra de mettre en évidence des facteurs juxtacrines ou paracrines impliqués dans la prolifération et l’hypersécrétion hypophysaire. L’étude des autres lésions de la NEM1 dans nos modèles murins permettra de mieux connaître le rôle des CCN dans la tumorigénèse des patients. Ce travail original permettra de mieux comprendre l’expression et les conséquences des déficiences de la ménine et plus généralement la tumorigénèse hypophysaire, afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques translationnelles et actionnables.

Procédures

Les animaux seront soumis à: - Une modification génétique augmentant le risque d'apparition de tumeur neuro endocrinienne - Une injection unique intrapéritonéale de tamoxifène - Des potentiels prélèvements sanguins pour suivi de la glycémie (maximum 2/souris) - Des potentiels injections sous cutanées d'anti inflammatoires en cas de douleur (maximum 3 injections/souris)- Une anesthésie générale profonde terminale pour laquelle deux injections seront réalisées (une en sous cutanée et une intrapéritonéale)

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les individus seront susceptibles de développer des anomalies du système endocrine et neuroendocrine :( (adénome hypophysaire, hyperparathyroïdie primaire, tumeur neuroendocrine digestive (dont insulinome), tumeur surrénalienne, tumeurs testiculaires). Le risque de développer ces tumeurs chez les lignées que nous étudierons ne peut pas être prédit car seule une faible proportion des cellules de chaque souris portera la mutation. Les tumeurs liées à une déficience du gène Men1 sont le plus souvent bénignes et de croissance lente et donc peu susceptibles d’entraîner une souffrance, d’altération de l’état général ou de symptômes liés à la compression ou la mort des individus par des phénomènes de compression. Les animaux issus des certains croisements recevront une injection unique de tamoxifène, qui en dehors de l'inconfort lié à la contention et à l'injection, ne devrait pas induire d'effet indésirable.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Notre projet consiste en l’étude du rôle du microenvironnement dans la tumorigénèse hypophysaire et en particulier, du rôle des cellules dérivées de la crête neurale dans cette tumorigénèse, par leur rôle de soutien et leurs effets paracrines. Ces interactions ne peuvent être reproduites en culture cellulaire. Le modèle murin est le modèle de choix pour étudier ces mécanismes puisque : 1) Ce modèle a été validé dans la littérature 2) L’étude du phénotype endocrinien des individus n’est pas possible chez la drosophile et le zébrafish

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans cette procédure, nous avons choisi une approche statistique pour réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet. Notre critère de jugement principal est un critère qualitatif : l’objectivation d’un phénotype tumoral hypophysaire. Nous avons estimé la probabilité d’observer ce phénotype en nous basant sur la littérature concernant les souris Men1 mutées hétérozygotes dans toutes les cellules. Néanmoins, si l’effet observé était plus fort que celui estimé nous réduirons le nombre de souris engagées dans chaque groupe.

Raffinement

Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage, afin de réduire la douleur et le stress des animaux (prélèvement par poinçonnage à l'oreille). L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton ou de batônnets à ronger. La manipulation des animaux ne sera faite que par des personnes compétentes et sensibilisées à la manipulation à faible stress des rongeurs. Certains des modèles que nous allons utiliser n’ont pas été caractérisé d’un point de vue phénotypique. Nous allons donc procéder à des observations poussées des animaux et identifier, de la manière la plus précoce, l’apparition de signe de souffrance ou de détresse. Les tumeurs liées à une déficience du gène MEN1 sont le plus souvent bénignes et donc peu susceptibles d’entraîner la mort des individus par des phénomènes de compression ou d’envahissement métastatique. Pour certaines tumeurs extra hypophysaires, en particulier les insulinomes, l’hypersécrétion hormonale pourrait induire une hypoglycémie, que nous surveillerons par glycémie capillaire si des signes cliniques (tremblements, faiblesses musculaires) venaient à apparaître. En cas d’hypoglycémie, une supplémentation par une eau enrichie type DietGel ou un régime hyperénergétique seront mis en place. En cas d’hypoglycémie objectivée sur deux prélèvements successifs, la souris sera euthanasiée immédiatement. Les points limites seront revus régulièrement en discussion avec la Structure chargée du Bien Etre Animal (SBEA)

Choix des espèces

L’anatomie et la fonction de l’hypophyse et du système endocrinienne des souris et des hommes sont proches, les orthologues impliqués dans la tumorigénèse également. Les souris génétiquement modifiées sont des modèles reconnus d’étude de la tumorigénèse du système endocrine et de ses causes génétiques. Les animaux seront mis à mort à 3 mois de vie puis à 6 mois, 12 mois, 18 mois et 24 mois. Trois et six mois correspondent à des stades matures (post pubertaire) et donc pleinement fonctionnels de l’hypophyse auxquels nous pensons pouvoir mettre en évidence des différences biologiques reflets des interactions paracrines prétumorales entre CCN et cellules hypophysaires sécrétantes. Douze mois, 18 mois et 24 mois correspondent aux stades auxquels un phénotype tumoral peut être observé d’après la littérature concernant le phénotype des souris Men1+/-.

800 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à cinq gavages, subir dix-huit prélèvements sanguins et cinq mises à jeun, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent des mélanges d'antibiotiques pendant quelques jours à deux mois, pour que leur flore intestinale soit détruite, puis passent jusqu'à quatre tests métaboliques comportant chacun six heures de jeûne et quatre prises de sang. Le porteur écrit que ce protocole produit "a priori peu d'effets indésirables", tout en listant déshydratation, perte de poids et diarrhées. Toutes sont tuées pour que leurs cellules intestinales productrices d'hormones soient triées, au service d'une question posée en termes de santé humaine, l'obésité et les maladies inflammatoires de l'intestin.

Objectifs

Les intestins sont un organe majeur pour la santé car ils sont à l’interface entre alimentation, les bactéries intestinales et l’organisme. L’intestin permet notamment la digestion et l’absorption des aliments, tout en faisant barrière aux microbes et aux toxines. L’intestin produit également des hormones qui régulent les fonctions de différents organes, modulant ainsi par exemple le comportement alimentaire, la régulation énergétique ou les fonctions intestinales (transit intestinal, digestion…) elles-mêmes. Ces hormones sont produites par des cellules intestinales spécifiques, appelées cellules entéroendocrines (EECs). Ces cellules libèrent les hormones en réponse à des modifications de leur environnement. Des modifications des fonctions intestinales et notamment des hormones intestinales sont associées à différentes maladies telles l’obésité ou des maladies digestives. Ces maladies sont également associées à une modification des bactéries intestinales. Il a été montré que la déplétion complète du microbiote intestinal induit une modification importante des EECs et une augmentation des niveaux circulant de certaines hormones. Notre travail de recherche vise à mieux caractériser comment les bactéries de l’intestin influent sur les hormones intestinales et les cellules qui les produisent. Dans ce projet, nous modulerons le microbiote intestinal par l’action d’antibiotiques, mesurerons le niveau des hormones et analyserons précisément ces cellules grâce à l’utilisation de souris exprimant une fluorescence associée à ces cellules et permettant de les isoler. Nous chercherons notamment à identifier quelles sont les bactéries ou leurs produits responsables des modifications observées des EECs, ainsi qu’aux conséquences fonctionnelles des niveaux élevés de certaines hormones intestinales.

Bénéfices attendus

Le rôle de l’intestin et en particulier des hormones intestinales pour la santé de l’homme apparait comme étant très important, en particulier dans l’obésité ou les maladies inflammatoires de l’intestin, qui touchent plus de 650 millions d’individus à travers le monde. Un lien entre microbes et les cellules produisant les hormones intestinales a déjà été établi. Cette étude nous permettra d’identifier plus précisément comment certains produits microbiens ou certaines bactéries modulent les fonctions des EECs et quelles sont les conséquences sur la physiologie de l’hôte. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant de trier cette population cellulaire rare, et mesurerons les niveaux d’hormones après différentes stimulations. Cela nous permettra d’identifier comment ces cellules sont régulées dans différents contextes microbiens et d’en déduire les produits microbiens qui régulent ces cellules. Compte tenu des fonctions importantes de ces hormones pour la santé, ce projet permettra de proposer de nouvelles voies modulant leurs niveaux et ainsi agir sur les fonctions quelles régulent, notamment dans le cas de maladies où ces fonctions sont altérées.

Procédures

Les 800 animaux recevront des mélanges d’antibiotiques dans leur eau de boisson pendant quelques jours à deux mois. Toutes les expérimentations seront réalisées sur animaux vigiles. Les animaux seront pesés deux fois par semaine, et leur consommation alimentaire mesurée en parallèle. Au maximum quatre tests métaboliques seront réalisés sur tous les animaux. Chaque test comporte une phase de jeûne (6h), quatre prélèvements sanguins au maximum, et un gavage ou une injection d’un stimulus d’intérêt Certains animaux recevront une injection préalable à l’administration du stimulus. La durée d’un test métabolique n’excède pas deux heures entre la première prise de sang et la dernière et chaque prélèvement de sang en lui-même n’excède pas trente secondes. Un gavage supplémentaire au moment de la mise à mort (entre 10 minutes et une heure avant l’euthanasie) sera également réalisé sur des animaux mis à jeun pendant 2 à 6 heures pour la mesure du transit intestinal. Des prélèvements de sang seront réalisés lors de la mise à mort, avant le gavage et au moment de la mise à mort. Lors des mesures de transit, certains animaux recevront également une injection préalable pour étudier le rôle des hormones. Au total, les 800 animaux pourront recevoir jusqu’à 5 gavages, être prélevés pour leur sang 18 fois et mis à jeun 5 fois, en recevant les traitements antibiotiques pendant un maximum de deux mois.

Impact sur les animaux

Ce protocole produit a priori peu d’effets indésirables sur les animaux : la consommation des antibiotiques dans l’eau de boisson a déjà été pratiquée à de nombreuses reprises sans impact sur la santé et le comportement des animaux. Les effets indésirables des antibiotiques peuvent être une déshydratation, une perte de poids ou l’apparition de diarrhées. Les injections, gavages et prélèvement de sang peuvent induire une légère douleur et un stress du fait de la contention. Les jeûnes peuvent conduire à une perte de poids réduite, rattrapée les jours suivants. Les stimuli administrés n’ont pas d’effet indésirable connu chez les animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récolter leurs tissus pour l’isolement des cellules produisant les hormones intestinales par tri cellulaire. Les fonctions des cellules pourront alors être analysées par différentes techniques

Remplacement

L’utilisation de souris pour cette expérimentation est nécessaire par l’impossibilité d’étudier in vitro ou de modéliser l’interaction entre les bactéries et l’intestin du fait de l’absence de modèles pour cultiver un microbiote complexe en contact direct avec un épithélium intestinal dans des conditions physiologiques. De plus, il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’étudier l’ensemble des EECs.

Réduction

Dans ce projet, nous utiliserons des groupes de 8 animaux de même sexe. Ce nombre a été évalué comme suffisant par l’analyse statistique des variations de chaque variable au sein d’un groupe lors de projets précédents La rareté des cellules entéroendocrines nécessitant l’utilisation de tissus entiers pour chaque application. Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles car l’effet sexe est inconnu. Des analyses statistiques permettront d’étudier l’effet sexe sur la déplétion du microbiote.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, d'un abri en propylène rouge, et d’un support suspendu et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et seront hébergés à plusieurs par cage pour éviter l'isolement. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Une grille de décision (points limites) est établie.Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux. Les animaux seront habitués à être manipulés avant et pendant toute la durée de l’expérimentation afin de diminuer leur stress lors de la contention et les prélèvements.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont issues d’une lignée génétiquement modifiée pour exprimer une protéine fluorescente dans toutes les cellules entéroendocrines. Cette lignée est un modèle particulièrement utile pour l’étude des cellules entéroendocrines, permettant de les trier ou de les distinguer facilement lors de l’analyse des tissus. L’étude portant sur les cellules entéroendocrines matures, des souris adultes (8 à 12 semaines au démarrage du protocole) seront utilisées. Les hormones intestinales et le système digestif de la souris étant très proche de celui de l’Humain, l’utilisation du modèle souris apporte des connaissances généralisables pour la santé humaine.

Vingt rats subissent l'ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes sous anesthésie, dix un simulacre d'opération, puis tous sont transportés trois heures par la route jusqu'au site d'expérimentation. 30 rats vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent l'implantation d'une minipompe sous la peau, cinq séjours de deux jours en cage à métabolisme, quinze injections dans l'abdomen et cinq ponctions de la veine de la queue, pour savoir si des excès de calcium répétés abîment le rein. Le porteur énumère lui-même les atteintes attendues, douleur opératoire, hémorragie, infection de plaie, hypocalcémie, insuffisance thyroïdienne, angoisse en cage à métabolisme et douleur à chaque piqûre.

Objectifs

L’hypoparathyroïdie est une maladie endocrine rare et complexe, caractérisée par une concentration basse ou indétectable d’hormone parathyroïdienne (PTH) entrainant une hypocalcémie et une hyperphosphatémie lorsqu’elle n’est pas traitée. Le traitement conventionnel est une association de métabolite de la vitamine D et de sels de calcium. Un effet secondaire habituel de ce traitement est une hypercalciurie ainsi que des épisodes d’hypercalcémie. Les 2 sont dus à une augmentation de l’absorption intestinale de calcium et à une diminution de la réabsorption tubulaire rénale de calcium, due à l’absence de PTH. L’hypoparathyroïdie et/ou le traitement conventionnel sont associés à une augmentation de la morbidité rénale, sous forme d’une lithiase rénale et/ou d’un néphrocalcinose et/ou d’une insuffisance rénale. Selon les séries, la prévalence de l’insuffisance rénale s’étend de 14 à 41 pour cent, dans tous les cas beaucoup plus élevée que dans la population générale. Epidémiologiquement, le risque d’insuffisance rénale est associé au nombre d’évènements hypercalcémiques et à la durée de la maladie. L'objectif du projet est de déterminer expérimentalement s'il existe un lien de causalité entre la survenue d'épisodes répétés d'hypercalcémie et la survenue d'une insuffisance rénale, et, si oui, d'en déterminer le mécanisme.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif principal de déterminer l'éventuel lien de causalité entre épisodes répétés d'hypercalcémie, induite par un surdosage thérapeutique (fréquent en médecine humaine) et la survenue d'une dégradation de la fonction renale, une des principales morbidités observées au cours du suivi des patient.es avec hypoparathyroïdie. La démonstration du lien de causalité aurait 2 conséquences -

Procédures

Voici la liste des interventions réalisées chez les animaux. Une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes (ou un simulacre) est réalisée, sous anesthésie générale et analgésie (30 minutes, 1 fois). Les animaux sont transporté du site d'élevage (où a lieu la chirurgie) au site d'expérimentation, par transport routier agréé (3 heures, 1 fois). Un traitement par hormone thyroïdienne dans l'eau de boisson est apporté aux animaux ayant subi une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes pendant 71 jours. Une minipompe sous cutanée est implantée sous anesthésie générale et analgésie (5 minutes, 1 fois). Les animaux subissent une acclimatation à l'hébergement en cage à métabolisme pour habituation (animal vigile, 3 jours, 1 fois). Dix animaux reçoivent un régime riche en calcium (animal vigile, 3 jours, 5 fois). Les animaux reçoivent une injection intrapéritonéale quotidienne (animal vigile (1 minute par injection), 3 jours de suite, 5 fois). Les animaux sont hébergés en cage à métabolisme pour recueil d’urine (animal vigile, 2 jours, 5 fois). Un prélèvement sanguin par ponction de la veine de la queue est réalisé chez les animaux (animal vigile, 1 minute, 5 fois); le volume prélevé est conforme aux recommandations. Une euthanasie est pratiquée chez les animaux sous anesthésie générale et analgésie par une méthode réglementaire (10 minutes, 1 fois).

Impact sur les animaux

Tous les animaux subissent une chirurgie cervicale : il s’agit d’une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes (thyroparathyroïdectomie) chez 20 d’entre eux et d’un simulacre chez 10 d’entre eux. La plaie opératoire peut être à l’origine de douleurs ou d’inconfort, la thyroparathyroïdectomie cause une hypocalcémie et une insuffisance thyroïdienne. La chirurgie peut être cause d’hémorragie et d’infection de plaie. Tous les animaux sont transportés du site de l’éleveur au site d’expérimentation par transport routier, ce qui peut induire un stress. Les animaux de tous les groupes subissent une chirurgie sous anesthésie pour implantation de la pompe sous-cutanée : la plaie opératoire peut être à l’origine de douleurs ou d’inconfort. Par ailleurs, la chirurgie peut être cause d’hémorragie et d’infection de plaie. Tous les animaux sont hébergés périodiquement en cage à métabolisme : cet hébergement peut être à l’origine d’une perte de poids transitoire, toujours inférieure dans notre expérience à 10 pour cent du poids initial, d’angoisse et d’intolérance à l'hébergement en cage à métabolisme. Des injections intrapéritonéales de calcitriol ou de placebo, et d’anesthésiques sont réalisées chez les animaux, causant une douleur au point d'injection. Des ponctions veineuses sont réalisées de manière itérative chez tous les animaux : ces ponctions causent une douleur et peuvent causer une hémorragie.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés selon une méthode réglementaire, avant le prélèvement de tissus pour analyse moléculaires (ARNm et protéines)

Remplacement

La complexité des mécanismes contrôlant la valeur de calcium dans le sang et la fonction rénale est telle que le remplacement n'est pas possible puisqu'il s'agit d'étudier les conséquences des épisodes d'hypercalcémie sur un organisme entier, avec toute sa complexité et ses capacités d'adaptation. Il n'y a pas d'alternative à cette étude, les modèles cellulaires existant ne permettant pas de rendre compte de la complexité du fonctionnement de l'organisme intact.

Réduction

Trente (30) animaux seront utilisés dans cette étude. Le nombre d’animaux par groupe est déterminé de façon à assurer des observations fiables et utilisables. Les mesures réalisées dans la domaine de l'homéostasie tiennent compte de l'état de l'art de manière à avoir la meilleure performance des mesures réalisées et réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux par groupe a été calculé en tenant compte de la variabilité des paramètres d’intérêt en fonction des conditions expérimentales; les nombres d'animaux nécessaires ont été déterminés en s’appuyant sur un calcul de puissance ; les comparaisons des résultats entre les groupes se feront grâce à des tests statistiques validés.

Raffinement

Toutes les procédures le nécessitant seront réalisées sous anesthésie. Par procédure le nécessitant, est définie toute procédure générant une douleur ou une souffrance supérieure à une piqure transcutanée par une aiguille. L’anesthésie est encadrée par une analgésie lors de l’implantation des pompes ; après la chirurgie, l’analgésie est maintenue systématiquement pendant 48 heures. Dans la mesure du possible, en fonction des contraintes des procédures, les animaux bénéficient d’un environnement enrichi (l’environnement est enrichi par des tunnels en carton et/ou des abris en plastique, et des boules de ouate) et leur souffrance est prise en compte et atténuée au maximum. Lorsqu'un hébergement en cage à métabolisme est nécessaire, les animaux sont préalablement acclimatés à cet environnement, et la durée d'hébergement est réduite au strict nécessaire. Des soins peuvent être mis en place en fonction des signes de souffrance observées (soins médicamenteux, raffinement des conditions d’hébergements, et des techniques de chirurgie etc…). Des points limites ont été définis et les animaux font l'objet d'une surveillance au cours des différentes procédures exposées dans la demande

Choix des espèces

L'espèce étudiée est le rat chez qui l’homéostasie du calcium est proche de celle de l’humain et chez qui la thyroparathyroïdectomie est techniquement réalisable. La stade de développement est celui du jeune adulte, ce qui correspond à l’âge auquel sont souvent réalisées les thyroparathyroïdectomies chez l’humain.

Porteuses d'une mutation qui reproduit le syndrome NARP, ces souris présentent un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et un défaut musculaire attendus. 313 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux de sang et d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang et d'urine à un, deux, quatre et six mois, des tests de force musculaire, de coordination et d'endurance sur tapis de course, rotarod et grip test, ainsi que des IRM et des échocardiographies sous anesthésie. Une grille de score commande la suite : entre 6 et 7, un antidouleur puis la mise à mort si rien ne s'améliore en vingt-quatre heures, entre 8 et 9, la mise à mort immédiate.

Objectifs

Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.

Procédures

Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes cités. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.

Quinze semaines d'un régime gras rendent 288 souris obèses, diabétiques et porteuses d'un foie chargé de graisse, avant sept prélèvements de sang en deux heures le jour du test au glucose. Elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées à l'issue. Le porteur ne décrit comme douleurs que celles des piqûres de la queue et des prélèvements à la veine sous-mandibulaire, qualifiées de légères, l'obésité, le diabète et la stéatose induits restant rangés au titre des perturbations métaboliques attendues. La mise à mort finale sert à récolter le sang et les organes pour identifier les protéines associées à la protéine p85 dans la voie de l'insuline.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie métabolique caractérisée par une concentration élevée de sucre (hyperglycémie) dans le sang. Le nombre de cas est en constante augmentation, en parallèle avec l’augmentation des cas d’obésité. Les patients diabétiques développent fréquemment des maladies chroniques du foie, notamment caractérisées par une accumulation de graisses dans le foie (stéatose). L'hyperglycémie, qui définit le diabète de type 2, est liée à l'action inadéquate de l'insuline. L'insuline est libérée par le pancréas suite à l'ingestion d'un repas. Elle agit avec d’autres protéines en cascade afin de faire entrer le sucre dans les cellules et maintenir sa concentration correcte dans le sang. Parmi les protéines de cette cascade, on retrouve notamment une protéine appelée p85. Afin de mieux comprendre les mécanismes liés au développement d'un diabète et d'accumulation de graisses dans le foie, nous souhaitons identifier les protéines qui participent au maintien de la concentration correcte de sucre dans le sang chez des souris mâles et femelles obèses. Pour cela, nous utiliserons des souris transgéniques afin d'identifier les protéines qui sont associées à la protéine p85. Ces souris seront nourries avec un régime gras induisant une obésité, un diabète de type 2 et une stéatose chez l'animal. Les études cliniques et précliniques indiquent des différences majeures liées au sexe dans la voie de l'insuline, ainsi nous utiliserons des souris des 2 sexes. A la fin de l'expérience, différents organes seront prélevés afin de purifier la protéine d'intérêt et d'identifier les protéines auxquelles elle est associée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de la voie de l'insuline dans les pathologies du diabète de type 2 et du foie gras (stéatose hépatique). La purification spécifique des protéines d'intérêt de la voie de l'insuline permettra d'identifier et de comparer leurs interactions avec d'autres protéines chez des souris saines et des souris obèses. Les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.

Procédures

Les animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou un régime obésogène riche en graisses pendant 15 semaines. Les animaux seront pesés toutes les semaines. Un prélèvement d’une seule goutte de sang à la queue sera réalisée 1 fois toutes les 2 semaines (petite piqûre de la veine caudale avec une lancette de 1 mm). Ce prélèvement ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. Les animaux recevront une fois une solution de glucose par gavage et une fois de l'insuline par injection intrapéritonéale. Le gavage et l'injection prennent chacun moins de 30 secondes et seront espacés au minimum d'une semaine. Le même jour, des prélèvements d’une seule goutte de sang seront réalisés à la queue toutes les 15 min minutes sur une durée de 2h pour étudier, soit 7 prélèvements prenant moins de 5 secondes chacun. Un prélèvement intermédiaire de sang, prenant environ 15 secondes, pourra aussi être réalisé (1 fois 100 μl), espacé au minimum d’une semaine avec les autres prélèvements. Juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire.

Impact sur les animaux

Les animaux nourris avec les régimes gras deviendront obèses et présenteront des perturbations métaboliques associées à l’obésité telles que le développement d’un diabète (concentration élevée de sucre dans le sang) et d'une stéatose (accumulation de graisses dans le foie). Les prélèvements sanguins (intermédiaire et final) à la veine submandibulaire et les injections de glucose (OGTT) et d’insuline (ITT) peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention et une légère douleur. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang (pour la mesure de la glycémie) peut entraîner une légère douleur.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation de l’animal entier car les pathologies étudiées sont complexes et ne peuvent pas être mimées avec fidélité en culture cellulaire. En effet, dans ces pathologies, plusieurs organes de l'organisme communiquent entre eux. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible d'étudier une version modifiée d'une protéine d'intérêt.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue de l'animal avant la piqûre permettant de prélever une goutte de sang. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

48 souris rendues obèses par un régime gras vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant 26 pesées, 12 injections dans l'abdomen, 39 injections sous la peau, cinq prises de sang et deux séjours de 96 heures en cage de mesure. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et les souris sont hébergées seules pendant toute l'étude, ce que le porteur reconnaît comme une nuisance pour une espèce sociale. Un jeûne de quatre heures précède chaque prise de sang, et l'obésité elle-même réduit leur capacité de mouvement. L'étude est menée pour un client, à un stade précoce du développement d'un candidat médicament anti-obésité, avec la perspective déclarée d'une mise sur le marché.

Objectifs

Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse, en administration seule ou combinée avec un autre composé anti-obésité déjà autorisé sur le marché. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament sur l'appétit, les dépense énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieures molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (26 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou du candidat médicament par voie intrapéritonéale (12 administration; durée de la mesure : 1 minute); 3) Administrations de véhicule ou de sémaglutide par voie sous-cutanée (39 administrations; durée de la mesure : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (5 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Mesures de dépenses énergétiques (2 sessions de mesures de 96h); 7) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux et sous-cutanés, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 8 animaux, contre 10 pour les groupes expérimentaux constitués de souris obèses, compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genres.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie intrapéritonéale et sous-cutané seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourris avec une alimentation enrichie en graisses (45% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 20 semaines (28 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.

12 050 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chaque rat subissant jusqu'à onze prélèvements sanguins et chaque souris jusqu'à sept. Les composés sont administrés une à deux fois par jour pendant sept jours au maximum, par voie orale, intraveineuse, sous-cutanée ou intrapéritonéale, et jusqu'à quatre prélèvements par ponction rétro-orbitale ou submandibulaire sont pratiqués sous anesthésie gazeuse. Une partie des animaux arrive déjà cathétérisée, d'autres reçoivent une pompe osmotique implantée, et la collecte des excreta impose un séjour en cage à métabolisme dont le porteur reconnaît qu'il induit un stress. Le bénéfice mis en avant est de "réduire le nombre d'animaux utilisés en pharmacologie", pour un projet qui en mobilise lui-même 12 050.

Objectifs

L’objectif du projet est la mesure des paramètres pharmacocinétiques chez le rat et la souris. Les caractéristiques pharmacocinétiques sont les premières données générées in vivo après que les tests in vitro aient été concluants. Ils vont permettre de décrire les différentes phases que va subir le composé quand il entre dans l’organisme du rongeur par différentes voies. Les informations obtenues impactent la progression des produits dans le projet, le design par les chimistes d’analogues ayant des meilleures propriétés pharmacocinétiques, ou les protocoles d’études de pharmacologie in vivo (choix de la dose, de la voie d’administration, et de la fréquence d’administration (une fois ou deux fois par jour).

Bénéfices attendus

La connaissance des propriétés pharmacocinétiques d’un produit chez l’animal avant le design des études de pharmacologie permet d’utiliser le meilleur traitement (dose, voie d’administration) et participe à réduire le nombre d’animaux utilisés en pharmacologie. Ces études permettront un lien avec les prévisions faites à partir des modèles in vitro. Ce lien entre données in vivo et données in vitro est critique pour prédire la pharmacocinétique chez l’homme, où seulement des données in vitro sont disponibles aux stades précoces de la recherche. Les données fournies permettront la sélection de meilleurs candidats pour les tests précliniques. Toutes les données obtenues sur les produits d’un projet permettront aux chimistes de concevoir des molécules ayant des propriétés pharmacocinétiques optimisées donc de réduire le nombre d’animaux utilisés avant d’obtenir un candidat médicament.

Procédures

Administration des composés à tester, par voie intraveineuse, orale, sous-cutanée ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour jusqu’à 7 jours : durée quelques secondes (ou quelques minutes de perfusion) à chaque administration, sur animaux vigiles sauf dosages IV (anesthésie isoflurane). Prélèvement sanguin, 7 fois maximum pour la souris et 11 fois maximum chez le rat pendant l’étude, durée quelques secondes sur animaux vigiles si prélèvements en veine caudale, saphène ou submentale. Les prélèvements en veine submandibulaire ou rétro-orbital (maximum 4 sur la durée de l’étude) sont effectués sous anesthésie isoflurane. Pose de pompes osmotiques sous anesthésie Isoflurane chez la souris : 15 min par animal avant le début de l’étude.

Impact sur les animaux

Au cours des études de ce projet, les composés sont en général testés pour la première fois sur l’animal entier. Tous les signes cliniques sont donc surveillés et enregistrés. Au cours des administrations ou prélèvements, les animaux seront manipulés avec douceur afin de leur éviter le stress de la manipulation. L’injection IV peut provoquer un inconfort passager de 30 secondes qui sera limité par l’anesthésie gazeuse légère de la souris. La toxicité cellulaire des composés est évaluée en amont des études in vivo et seuls les composés ne présentant pas de toxicité à la dose administrée en vivo seront testés chez l’animal. Dans ce contexte, nous n’attendons pas de réaction important lors de l’administration de nos composés en in vivo. Des points limites ont été établis, permettant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. La pharmacocinétique nécessite le prélèvement de petites quantités de sang à des intervalles répétés ce qui peut générer du stress et de l’inconfort. La pharmacocinétique nécessite le prélèvement de petites quantités de sang à des intervalles répétés. Le volume de sang prélevé et le nombre de prélèvements sera adapté en fonction du poids des animaux inclus dans l’étude. La collecte des excreta implique de mettre les animaux en cage à métabolisme, ce qui induira un stress pour ces animaux.

Devenir

A la fin de nos études, tous les animaux sont mis à mort de façon ethique. Pour des raisons éthiques, les animaux cathétérisés ne peuvent pas être réutilisés dans nos procédures pendant plus d’une semaine après réception. Pour les animaux non cathétérisés, nous prélevons des organes à la fin de nos administration afin d'évaluer la concentration des nos composés dans les tissus. De plus, nous pourrions observer des risques pour la validité des résultats car les animaux, réutilisés après la periode de réccuperation, seront décalés en poids, en âge et en physiologie par rapport à ceux utilisés dans les modèles de pharmacologie, donc moins prédictifs.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle fiable in vitro permettant de prédire de manière exacte et approfondie le comportement pharmacocinétique d’un produit chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques d’un composé et établir des corrélations in vivo/in vitro qui permettront d’avoir une prévision fiable des propriétés pharmacocinétiques chez l’homme.

Réduction

Les composés testés in vivo ont été sélectionnés sur la base de leurs propriétés in vitro. Un grand nombre de composés synthétisés sont donc éliminés sur la base des résultats des tests in vitro et ne sont pas évalués in vivo. Nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux qui permet d’obtenir des résultats avec une variabilité acceptable pour l’objectif de l’étude. Ainsi dans le premier test d’un nouveau composé en pharmacocinétique, 2 animaux sont utilisés pour la voie intraveineuse et 3 animaux pour la voie extravasculaire pour décrire la pharmacocinétique des produits. Une étude pharmacocinétique est réalisée par prélèvements multiples, qui permet aussi une réduction du nombre des animaux impliqués dans les études. Des mélanges de produits peuvent être administrés pour sélectionner les meilleurs produits en réduisant le nombre d’animaux nécessaires à l’étude (exemple : 3 produits administrés en mélange à 2 animaux au lieu de 3 fois 2 animaux si les composés sont administrés séparément).

Raffinement

A l’arrivée des animaux : Contrôler que le dispositif des animaux cathétérisés est bien mis en place et qu’il n’y a pas de lésion particulière. Si c’est le cas, mis à mort sur avis du vétérinaire. Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi dès leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton et feuilles de cellulose). Cet enrichissement sera adapté pour les animaux cathétérisés (pas de maison, risque de dommages au cathéter). Afin de minimiser l'inconfort du au procédures, les animaux pourront recevoir une analgésie adaptée. Pour favoriser la vasodilatation de la veine caudale au moment des prélèvements, les souris pourront être placées quelques minutes dans une thermocage. Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière. Si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera euthanasié de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. Lors de la mise à mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane (induction 4% et maintien de 2%).

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat qui sont les espèces utilisées pour les modèles précliniques de notre établissement. Les rats et les souris utilisés dans ce projet seront des adultes afin que leur métabolisme soit mature.