Troubles endocriniens

Six tests comportementaux par souris sur trois semaines, dont un labyrinthe en Y et une piscine équipée d'une plateforme de sortie, plus quatre prélèvements sanguins isolés et trois séries de prélèvements étalées sur deux heures : 288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de dix-huit jours reçoivent de l'ovalbumine par voie intrarectale sous anesthésie, puis sont tués par dislocation cervicale une heure après leur réveil. L'objet est de mesurer les effets des additifs des laits infantiles sur l'intestin et le cerveau, avec des résultats destinés à éclairer l'Efsa et l'Anses. Le porteur qualifie ces tests comportementaux de "non invasifs et n'induisant pas de stress", tout en annonçant que certaines souris pourraient développer une inflammation intestinale chronique et un comportement anxieux.

Objectifs

Le lait maternel joue un rôle essentiel dans la croissance des nouveau-nés. Il module entre autres le microbiote intestinal, qui lui-même participe au bon développement du cerveau et de la santé. De nombreux nourrissons sont alimentés avec des laits de substitution en poudre. Ces préparations contiennent des additifs, utilisés notamment pour améliorer leur texture ou leur conservation. Il a déjà été montré que certains de ces additifs peuvent perturber l’équilibre du microbiote intestinal, entraînant une dysbiose et une inflammation intestinale chez l’adulte. En revanche, leurs rôles et leurs conséquences sur le développement du cerveau durant la période néonatale sont peu explorées et leurs effets à plus long terme sur le comportement restent inconnus. Ce projet a pour objectif d'étudier chez l'animal les effets de la consommation durant la période néonatale de laits contenant ces additifs sur l’axe intestin-cerveau à différentes périodes de la vie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. Sur le plan fondamental, ce projet apportera des connaissances nouvelles sur les mécanismes par lesquels l'alimentation agit sur la santé intestinale et le développement cérébral durant la période néonatale, et sur la façon dont les perturbations précoces du microbiote peuvent influencer l’apparition d’inflammation intestinale et le comportement à long terme. Sur le plan appliqué, les résultats viendront éclairer les évaluations des risques sanitaires liés à ces additifs chez les nourrissons. Ils pourront orienter l'optimisation des formulations des laits infantiles et fournir des éléments scientifiques utiles aux instances de réglementation (Autorité européenne de sécurité des aliments (Efsa), agence nationale de sécurité sanitaire (Anses)), dans une perspective de meilleure protection de la santé des nouveau-nés. Enfin, ces travaux contribueront à enrichir les recommandations nutritionnelles destinées aux familles et aux professionnels de santé.

Procédures

Les animaux subiront 4 prélèvements uniques de sang pour une durée inférieure à 1 minute afin de mesurer la gly-cémie. Les animaux subiront 3 prélèvements multiples de sang sur une durée de 2h, chacun de ces prélèvements mul-tiples seront séparés d’au moins une semaine afin de mesure la glycémie lors d’un test de tolérance au glucose. Les animaux adultes seront impliqués dans des tests de comportement non invasifs et n'induisant pas de stress chez l'animal. Les animaux adultes seront au préalable soumis à une phase d’habituation d’une semaine qui n'induira que peu ou pas de stress chez: chaque jour, ils seront exposés à l’expérimentateur et à la salle de comportement pendant une durée de 30 minutes à 1 heure, afin de réduire le stress lié à la manipulation et à l’environnement expérimental. À l’issue de cette période, une série de tests comportementaux sera réalisée pour évaluer différents aspects tels que l’anxiété, la sociabilité, la mémoire et l’hyperactivité. Ces évaluations reposeront sur les paradigmes suivants : • tes de l’anxiété : Les dispositifs expérimentaux combineront des zones ouvertes/éclairées et des zones fermées/protégées. Le temps de présence dans chaque type de zone sera quantifié sur une période de 10 minutes • évaluation de la mémoire : phase d’habituation de 10 minutes durant laquelle l’animal est placé dans une arène contenant des objets, dans un labyrinthe en Y ou dans une piscine équipée d'une plateforme pour permettre à l'animal de sortir de l'eau. Suite à une modification de la configuration (changement d’objets ou d’accessibilité des zones), une phase de test de 10 minutes permettra de mesurer la capacité de reconnaissance ou de spatialisation de l’animal. • évaluation de la sociabilité : mesureront la préférence naturelle de l’animal à interagir ou à passer du temps à proximité d’un congénère plutôt que d’un objet inanimé, sur une durée de 10 minutes Chaque test comprendra une phase d’habituation de 10 minutes à l’arène, suivie d’une phase de test de 10 minutes par animal. La fréquence des tests est limitée à un seul test par jour et par animal au maximum, pour un total d’environ 6 tests par animal répartis sur une période de trois semaines. • animaux jeunes adultes agés de 18 jours subiront une administration intrarectale d’ovalbumine après anesthésie à l’isoflurane. Après 1h de phase de réveil, ils seront mis à mort par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Certaines procédures pourraient induire une inflammation intestinale chronique de bas bruit sans ulcération majeure et qui n’a pas de conséquences visibles sur le phénotype. De plus, certains animaux pourraient développer des dérégulations métaboliques, caractérisées notamment par une augmentation de la masse grasse ainsi que présenter un comportement anxieux. Les tests comportementaux réalisés sur animaux adultes entraineront peu ou pas de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car l’analyse de leurs organes est nécessaire pour répondre à notre hypothèse de travail.

Remplacement

Des modèles in vitro de culture de microbiote intestinal ainsi que des modèles cellulaires permettant de mimer la barrière intestinale existent. Cependant, le recours au modèle murin est indispensable dans le cadre de ce projet afin de comprendre les interactions hôte / microbiote et notamment cerveau/intestin/microbiote en lien avec le développement d’inflammation chronique de bas bruit et de troubles du comportement. Des animaux plus simples tels que la drosophile, C. elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie du développement cérébral et du comportement de ces animaux est très différente de celle des mammifères.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions sera inclus dans chaque groupe. Des études précédentes ont montré que dans le même type de procédure, l’utilisation de 12 souris par condition et par sexe était nécessaire afin d’atteindre des résultats interprétables et garantir l’utilisation de tests statistiques appropriés. Les tests statistiques envisagés dans le cadre de ce projet l’ont été après avis recueilli auprès de biostatisticiens pour des projets similaires. De plus, il s’agit d’une expérience au design longitudinal, ce qui nous permet d’observer le phénotype des souris aux différents stades de développement et donc limiter le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Dans un souci de raffinement, un suivi étroit des animaux et des points limites précoces et adaptés seront mis en place tout au long des expérimentations. Des points limites spécifiques et précoces sont définis pour chaque protocole. Dès l’apparition d’un signe clinique, différentes méthodes de raffinement seront appliquées pour éviter ou minimiser l’inconfort ou la douleur : utilisation de gel de réhydratation, réhydratation sous-cutanée, renforcement de l’enrichissement.

Choix des espèces

Cette étude privilégie la souris comme modèle de référence pour analyser l'impact des additifs alimentaires sur le microbiote intestinal et le développement cérébral néonatal. Ce choix se justifie par la capacité à suivre précisément les interactions microbiote-système immunitaire dès la naissance grâce à des outils d'analyse avancés. Bien que simplifiée, la physiologie mu-rine offre une pertinence conceptuelle et souvent directe pour comprendre les mécanismes chez le nouveau-né humain. En pratique, la souris est indispensable : sa reproduction rapide permet d'obtenir de grandes portées pour suivre les effets à long terme d'une exposition nutritionnelle précoce, de la nais-sance à l'âge adulte. De plus, c'est l'espèce la mieux maîtrisée pour évaluer les fonctions co-gnitives et comportementales en milieu contrôlé. Ces avantages combinés garantissent une efficacité optimale dans la recherche tout en assurant une représentation physiologique fiable des processus biologiques humains. Le premier groupe sera suivi jusqu’à l’âge du sevrage, soit environ trois semaines. Cette période constitue la phase d’exposition aux additifs ; c’est également une fenêtre de développement où le microbiote intestinal et le cerveau sont particulièrement sensibles à l’environnement nutritionnel. Le second groupe sera suivi jusqu’au 18ème jour de vie. Cette période constitue la phase d’exposition aux additifs ; c’est également une fenêtre de développement où le microbiote intestinal et le système immunitaire sont modulés par l’environnement nutritionnel. Le troisième groupe sera maintenu dans les mêmes conditions jusqu’à l’âge adulte, l’exposition aux additifs étant limitée à la seule période néonatale. Ce suivi longitudinal permettra de vérifier si les éventuelles perturbations observées chez le jeune animal perdurent et influencent le comportement et l’état général à long terme. L’utilisation de ces deux stades est indispensable à la démarche scientifique : la période néonatale représente le moment critique de l’exposition alimentaire, tandis que l’évaluation à l’âge adulte est nécessaire pour mesurer l’existence d’effets différés.

Les souris employées ici portent une mutation qui permet de tuer sélectivement leurs propres cellules du foie par injection, et un système immunitaire délibérément détruit, deux conditions qui rendent possible la greffe d'hépatocytes humains. 8 800 d'entre elles vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à huit injections du composé qui tue leurs hépatocytes, une greffe de cellules par la veine porte, jusqu'à deux puçages sous anesthésie et des prélèvements sanguins répétés, le porteur signalant un risque hémorragique accru, une anémie possible et une gêne du transit intestinal. L'effectif ne repose sur aucun calcul statistique, le porteur l'établissant d'après les études des années antérieures et "en accord avec le plan commercial". 8 600 souris sont tuées, 200 réutilisées dans d'autres projets, dont une formation interne aux gestes techniques sur souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales (e.g. hépatites), le cancer du foie ou des maladies métaboliques telles que la MASH (Metabolic dysfunction-Associated Steato Hepatitis), ou encore de traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines (greffe d’hépatocytes). Dans certains cas, l’humanisation du système immunitaire, en complément d’un foie humanisé, est essentielle pour étudier des processus physiopathologiques complexes, notamment dans le cadre de maladies métaboliques (par exemple, la MASH) ou d’infections virales (comme la dengue). Pour répondre de manière optimale aux objectifs scientifiques et aux questions posées, une double humanisation des souris, incluant à la fois le foie et le système immunitaire, pourra être mise en œuvre. Les cellules hépatiques humaines, et le cas échéant les cellules immunitaires humanisées, pourront ensuite être utilisées pour des études ciblées, comme l’infection par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire fidèlement le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable, bien caractérisée sur le plan génétique. Une souche de souris au foie non humanisé sera utilisée. Elle présenten une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins par injection. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas d’insuffisance hépatique. Par ailleurs, étant fortement immunodéprimée, elle est également permissive, après myéloablation, à la greffe des cellules souches hématopoïétiques ou cellules immunitaires humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Lorsque nécessaire, il sera également possible d’humaniser simultanément les compartiments hépatique et immunitaire. Cette double humanisation constitue un avantage majeur, car elle permet de modéliser de manière plus fidèle les interactions complexes entre le foie et le système immunitaire humain, en particulier dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. Par ailleurs, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus spécifiques à l’humain, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, mieux caractérisée sur le plan génétique, et plus acceptable sur le plan éthique que l’utilisation de primates non-humains. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée offrent également des opportunités pour explorer les mécanismes d’insuffisance hépatique et développer des thérapies adaptées à cette pathologie. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’étudier les réponses immunitaires humaines dans des contextes complexes, tels que les traitements antiviraux ou les pathologies impliquant des mécanismes immunitaires.

Procédures

En fonction des besoins expérimentaux, les souris pourront recevoir, sous anesthésie générale, une puce classique et/ou une puce permettant la mesure de la température corporelle. En cas de perte ou de non-fonctionnement de leur puce électronique, elles pourront recevoir une nouvelle puce avec au maximum deux puçages pendant leur durée de vie. Des prélèvements sanguins seront réalisés avec ou sans anesthésies. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Un maximum de 8 injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches et permettant au moment de la greffe de réduire la présence des macrophages murins présent dans le foie et empêchant les hépatocytes humains de s’implanter. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. À l’issue des études, les animaux non intégrés aux essais précliniques seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par : -identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -injections : douleur abdominale transitoire, et pour l’agent myéloablatif effets hématologiques possibles -actes chirurgicaux : douleur, risque hémorragique, risque anesthésique, défaut de cicatrisation -traitements et prélèvements sanguins : douleur, hématome ou lésion au point d’injection, anémie en cas de prélèvements répétés -injection d’hépatocytes via la veine porte : gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant, risque hémorragique accru -imagerie sous anesthésie : hypothermie, déshydratation, sécheresse oculaire (gel ophtalmique en prévention).

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Dans le cadre d’une réutilisation et afin d’affiner le protocole, les animaux issus des procédures « Humanisation du foie des souris via injection splénique d’hépatocytes » et « Humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte » pourront être utilisés dans la procédure « Mise au point d’un modèle de double humanisation : foie + système immunitaire » de ce même projet.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de 5 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de l’implantation d’un patch contenant des hépatocytes humaines, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes de cette procédure, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins par injection. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas d’insuffisance hépatique. Par ailleurs, cette souche étant fortement immunodéprimée, elle est également permissive, après myéloablation, à la greffe des cellules souches hématopoïétiques ou cellules immunitaires humaines. De plus, cette souche et ses dérivés présentent une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins par injection. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 12 semaines. Il a été néanmoins décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non. L'insuffisance hépatique pourra être induite chez la souris immunodéficiente par exemple par une ou plusieurs injection(s) causant la mort des hépatocytes murins, permettant ainsi d’étudier l’effet d’un implant contenant des hépatocytes.

Une grille de score décide de l'arrêt de l'expérience ou de la mise à mort quand les points limites sont atteints. 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le sang et différents tissus. Pucées sous anesthésie à leur arrivée, transportées vers un second établissement, elles reçoivent une injection par jour cinq jours sur sept pendant dix semaines, jeûnent douze heures avant un test de tolérance au sucre, courent sur tapis roulant et subissent un prélèvement de sang à la queue suivi de cinq gouttes espacées sur quatre heures. Le régime gras qui leur est imposé doit produire une obésité et un diabète, pour tester des molécules censées limiter la prise de poids chez l'être humain.

Objectifs

En 2020, environ 8,5 millions de personnes en France sont touchées par l’obésité, dont 1 million avec une obésité très sévère. Cela représente 17 % de la population. Ce qui inquiète particulièrement, c’est l’augmentation rapide de l’obésité chez les jeunes adultes (18-24 ans). Si cette tendance continue, on risque de voir apparaitre de plus en plus de maladies graves liées à l’obésité. Nos recherches portent sur une protéine, connue pour avoir plusieurs fonctions selon l’endroit où elle se trouve dans la cellule. Elle influence notamment le métabolisme des graisses et des acides aminés. De plus, nous avons montré sur des cultures de cellules qu’en bloquant l’action de cette protéine, on empêche les cellules de stocker la graisse. Ainsi, nous travaillons avec des petites molécules, dérivées d’un composé connu pour détruire spécifiquement la version de notre protéine active in vitro mais dont les propriétés chimiques ne permettent pas d’envisager d’études cliniques directement chez l’humain. Ainsi, ces nouvelles molécules sont conçues pour être plus efficaces, avec une meilleure solubilité et moins de toxicité. Après leur validation in vitro, et afin d’évaluer l’amélioration de leurs propriétés pharmaco biologiques, ces molécules seront testées dans des modèles murins d’obésité dans le but de limiter la prise de poids et in fine de réduire le risque de complications associées à l’obésité chez l’Homme. En résumé, notre projet vise à explorer une nouvelle piste thérapeutique contre l’obésité, en ciblant un acteur clé du stockage des graisses dans les cellules.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’efficacité d’un dégradeur d’une protéine spécifique dans la lutte contre l’obésité et les syndromes métaboliques associés. En inhibant cette protéine chez des animaux obèses ou chez des animaux ayant un régime riche en graisse, nous espérons limiter la prise de poids et montrer son rôle clé dans le stockage et l’utilisation des graisses. L’objectif est d’emmener vers l’utilisation de ces dégradeurs spécifiques comme potentielle thérapie dans la lutte contre l’obésité humaine.

Procédures

A leur arrivée, tous les animaux subiront une implantation de puce (avec une injection d’analgésique et une anesthésie volatile) utile pour leurs identifications et leurs pesées. Toute la durée de la procédure, tous les animaux seront pesés 1 fois par semaine. Cette mesure prend moins de 30 sec et sera réalisée sur animaux vigiles. En fin d’expérimentation ces animaux subiront une incision cutanée afin de leur retirer la puce (avec une injection d’analgésique et une anesthésie volatile) en vue d’analyses métaboliques. Tous les animaux seront traités avec 1 injection par jour (piqure 2 secondes) 5 jours sur 7, pendant 10 semaines. Tous les animaux vigiles auront une administration orale d'une solution de glucose (volume et sonde respectant les recommandations / 5 secondes), un prélèvement de sang à la queue (volume et voie respectant les recommandations/ 30 secondes) puis 5 prélèvements d’une goutte de sang espacés sur 4 heures (10 secondes par prélèvement). Une pesée de tous les animaux et une mesure de la composition corporelle seront réalisées pour obtenir le taux de masse maigre (muscle), de masse grasse et d'eau dans le corps de la souris. Ces mesures prennent moins de 2 minutes par souris et sont réalisées sur les animaux vigiles à la fin de chaque procédure. Ces animaux seront aussi soumis à des tests de motricité et de force (3 fois 5 minutes et 3 fois 10 secondes / deux sessions pour tous les animaux) ainsi que des tests de course.

Impact sur les animaux

Les injections répétées peuvent parfois provoquer des hématomes sous la peau. De plus, l’administration de certains traitements par voie orale (à l’aide d’une sonde spécialisée) peut irriter la gorge. Les animaux pourront ressentir un stress léger dû à la manipulation pendant l’administration du traitement, tests non invasifs (analyse de la composition du corps ou des tests de motricité. Un stress un peu plus important est possible lors d’une mise en cage individuelle de moins de 48 heures, nécessaire pour mesurer leur respiration. Pour un test sur la tolérance au sucre, un jeûne de 12 heures peut entraîner une légère perte de poids et l’administration de sucre par la bouche, peut aussi être une source de stress. Pendant un test sur tapis roulant, certains effets indésirables comme de la fatigue ou, très rarement, une blessure à la patte peut survenir. Les animaux sont cependant surveillés pendant cet exercice. Un régime alimentaire riche en gras peut conduire à des troubles similaires à ceux que l’on observe dans des maladies humaines comme l’obésité, le diabète ou une mauvaise réponse à l’insuline. Certains animaux génétiquement modifiés obèses développent ces troubles spontanément dès l’âge de 4 à 5 semaines.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés selon la méthode recommandée pour limiter la souffrance des animaux. Nous prélèverons le sang et différents tissus afin de mener notre étude et analyser les dérégulations métaboliques et l’avancement de l’obésité.

Remplacement

Dans notre laboratoire, nous menons aussi des expériences en utilisant des cellules en culture, plus précisément des cellules qui peuvent devenir des cellules graisseuses. Ces études ont montré que notre protéine d’intérêt joue un rôle important dans la formation et la composition de ces cellules graisseuses. Mais l’obésité est un problème complexe, impliquant plusieurs composantes du corps et l’étudier seulement sur des cellules in vitro ne permet pas de comprendre toutes les interactions qui se produisent entre différents organes et différents types cellulaires. En effet, l’obésité est une maladie métabolique systémique, c’est pourquoi il est nécessaire de faire des expériences sur des animaux, à l’échelle d’un organisme complet. Ces tests sont essentiels si nous voulons, à terme, développer un traitement contre l’obésité. Pour progresser vers des applications chez l’humain, les tests chez l’animal restent donc indispensables.

Réduction

Nos résultats expérimentaux obtenus sur des cellules nous permettent d’anticiper certains résultats et ainsi diminuer le nombre de conditions expérimentales in vivo. Le nombre d’animaux prévu dans le cadre de ce projet a été défini comme le nombre minimal nécessaire pour valider ces approches in vitro et tester l’ensemble de nos molécules pour mettre en évidence le meilleur candidat en vue d’une application chez l’Homme.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les mêmes membres du personnel. Nous ajouterons dans les cages des briques de peuplier pour éviter les problèmes de malocclusion (absence d’usure des dents à croissance continue) à cause de la nourriture enrichie en graisse qui est très friable. De plus, les animaux seront pesés une fois par semaine. Tout animal présentant des difficultés à se nourrir ou à s’abreuver sera assisté par le dépôt dans la cage d’un gel lui évitant d’aller chercher en hauteur nourriture ou boisson. Nous avons défini préalablement une grille de score en fonction de laquelle nous procéderons à l’arrêt des expérimentations ou à l’euthanasie de l’animal en cas d’atteinte des points limites. Pour le transport de courte durée (inférieure à 10 minutes), les animaux seront placés au dernier moment, en groupes, dans des boites de transport avec litière, nourriture, hydratation et enrichissement de la cage d'origine. La boite sera ensuite placée dans un suremballage afin de limiter le mouvement pendant le transport. Les véhicules utilisés seront climatisés ou chauffés en fonction de la température extérieure. Dès leur arrivée dans le deuxième établissement les souris seront remises en cage d’hébergement. Pour l'implantation et le retrait de la puce d'identification les animaux recevront préalablement une injection d’analgésique et une anesthésie volatile. Dès qu’ils seront endormis, ils seront mis sur tapis chauffant pour éviter le refroidissement. Les animaux seront préalablement habitués à tous les tests de motricité et de course en étant simplement placés sur l’appareil, d’abord sans mouvement, puis à vitesse réduite. De plus, des points limites ont été établis permettant d’éviter l'épuisement et la blessure.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, disposant d’un génome proche de l’homme. De plus, de nombreux modèles génétiquement modifiés pour les études de l’obésité ont été générés et utilisés dans la recherche scientifique. L’expérimentation sur ces modèles, déjà établis, nous permettra de voir l’efficacité du traitement et de comprendre au mieux l’impact de celui-ci à l’échelle d’un organisme entier. Nous choisirons des souris jeunes sevrées (c’est-à-dire environ 6-8 semaines de vie). Pour notre projet, il est important d’avoir de jeune souris pour suivre au plus tôt le développement de la pathologie (obésité/diabète). Cela nous permettra aussi d’observer au mieux le temps de l’apparition des syndromes métaboliques associées à l’obésité. Nous suivrons le poids des animaux une fois par semaine dès l’âge de 8 semaines jusqu’à l’âge de 23 semaines pour 624 animaux et 33 semaines pour 576 animaux, âge auquel la différence de poids entre animaux traités ou non traités devrait être observable.

Injectées dans l'abdomen à répétition, soumises à des frottis vaginaux et à des prises de sang hebdomadaires, 120 rattes Wistar subissent une stimulation ovarienne destinée à tester un anticorps censé augmenter le nombre d'ovocytes récoltés. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, et toutes les rattes seront tuées pour des prélèvements d'organes destinés à des analyses morphologiques, histologiques et endocriniennes. Le porteur signale un risque de passage de liquide vers la cavité abdominale, suivi par dosage de l'hématocrite, et un point limite fixé à 15 % de perte de poids qui déclenche la mise à mort. Il écrit par ailleurs que "La stimulation ovarienne est une procédure courante sans effets secondaires rapportés".

Objectifs

L’objectif du projet est d’améliorer la réponse à la stimulation ovarienne. En effet, les échecs de procréation in vitro sont souvent dus à une mauvaise réponse des patientes à la stimulation ovarienne lors de leur prise en charge en assistance médicale à la procréation. L'hormone anti-Müllérienne est un des principaux régulateur des différentes étapes de la folliculogénèse. C'est pourquoi, nous avons développé un anticorps bloquant anti AMH et nous avons montré qu’un traitement avec cet anticorps est capable d’induire une ovulation chez des rattes anovulantes. Nous prévoyons maintenant de tester si cet anticorps pourrait augmenter le nombre d’ovocytes récoltés après une stimulation ovarienne chez des rates Wistar ovulantes.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d'améliorer la prise en charge des patientes répondant mal à la stimulation ovarienne en procréation médicalement assistée. Actuellement, en cas de mauvaise réponse à la stimulation ovarienne, les doses de gonadotropines sont augmentées ainsi que le nombre de stimulations ovariennes mais souvent sans qu'une amélioration du nombre d’ovocytes récoltés soit observée. La seule alternative pour ces patientes est alors le don ovocytes.

Procédures

Les animaux subiront au maximum un prélèvement de sang par semaine d’un volume inférieur à 5 % du volume sanguin total soit 2 à 4 prélèvements en fonction du protocole. Les animaux seront traités par des injections intra-péritonéale d’anticorps. Nous privilégions cette voie d'administration car nos tests précédent avec des injections en sous cutanée donnaient de moins bons résultats. Ce type de traitement avec des injections répétées d’anticorps anti-AMH a déjà été réalisé sur une durée plus longue (1 mois) sans effet secondaire. La stimulation ovarienne est une procédure courante sans effets secondaires rapportés.

Impact sur les animaux

Pour le suivi du cycle ovarien par la méthode des frottis vaginaux ainsi que pour l'injection intra péritonéale et les prélèvements sanguins, les femelles sont préalablement habituées à la contention par les expérimentateurs habilités. Pour les prélèvements sanguins, le volume de sang prélevé à chaque prise de sang (2 maximum, 1 par semaine) sera toujours en dessous du volume maximal autorisé (5% du volume sanguin total).

Devenir

Toutes les procédures conduiront à la mort des animaux afin d'effectuer les prélèvements d'organes nécessaires aux analyses morphologiques, histologiques, endocriniennes ...

Remplacement

Sur le plan scientifique, il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico. L’anticorps anti-AMH utilisé dans ce projet est une IgG de rat, développée et validée dans cette espèce, notamment dans des modèles de dysfonction ovarienne. De plus, le fait que le rat ait une réponse plus modérée que la souris à la stimulation ovarienne en fait un meilleur modèle pour mettre en évidence une augmentation du nombre d'ovocyte après stimulation ovarienne comme nous l'avons déjà observé. L’utilisation de rattes permet ainsi de s’appuyer sur des données préexistantes robustes concernant sa spécificité, son efficacité et sa tolérance. De plus, la nature homologue de cet anticorps garantit une compatibilité optimale avec l’espèce étudiée et limite le risque de réponse immunitaire anti-anticorps lors d’administrations répétées. À l’inverse, son utilisation chez la souris pourrait induire une réponse immune dirigée contre cet anticorps hétérologue, ainsi qu’une incertitude quant à sa capacité à reconnaître et bloquer efficacement sa cible. Enfin, un changement d’espèce nécessiterait des études préalables de validation, impliquant l’utilisation d’animaux supplémentaires, ce qui serait contraire au principe de Réduction. La voie intrapéritonéale a été retenue sur la base de données expérimentales préalables issues de notre équipe, ayant montré une meilleure efficacité de l’anticorps anti-AMH par rapport à la voie sous-cutanée. L’utilisation de la voie sous-cutanée entraînerait ainsi une diminution de l’efficacité du traitement et une variabilité accrue des réponses, nécessitant une augmentation du nombre d’animaux pour atteindre une puissance statistique suffisante, ce qui irait à l’encontre du principe de Réduction. La voie intra-veineuse n'a jamais été testée car la majorité de nos protocoles incluent des injections répétées. Il faudrait tester cette nouvelle voie d'injection ce qui augmenterait le nombre d'animaux et irait à l’encontre du principe de Réduction. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, dans le respect des bonnes pratiques (choix du matériel adapté, volumes conformes aux recommandations, contention appropriée). Une surveillance clinique régulière des animaux sera assurée afin de détecter précocement tout signe d’inconfort, conformément au principe de Raffinement.

Réduction

Le projet comporte trois protocoles expérimentaux distincts visant à évaluer l’effet du schéma d’administration de l’anticorps anti-AMH sur la réponse à la stimulation ovarienne (1, 3 ou 4 injections). Chaque protocole comprend deux groupes (IgG témoin vs anticorps anti-AMH), avec un effectif de 20 animaux par groupe (soit 40 animaux par protocole).Les effectifs ont été déterminés sur la base de nos données préalables et de la variabilité observée dans ce modèle de ratte, déjà caractérisé dans notre équipe. Ces données permettent d’estimer de manière fiable le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences biologiquement pertinentes, tout en garantissant une puissance statistique suffisante. La taille des groupes a ainsi été définie de manière à éviter à la fois un sous-dimensionnement (conduisant à des résultats non conclusifs et à la répétition des expériences) et un surdimensionnement (utilisation excessive d’animaux), conformément au principe de Réduction. Les trois protocoles correspondent à des schémas d’administration distincts et complémentaires, nécessaires pour répondre à la question scientifique posée. Leur dissociation permet d’éviter l’introduction de facteurs de confusion expérimentaux. Par ailleurs, plusieurs paramètres biologiques seront analysés chez les mêmes animaux, permettant de maximiser les données obtenues par individu. Les conditions expérimentales seront standardisées afin de limiter la variabilité interindividuelle et ainsi optimiser les effectifs requis. Les analyses statistiques seront adaptées à la distribution des données (tests paramétriques ou non paramétriques), afin d’optimiser la détection des différences entre groupes sans augmentation du nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la manipulation en amont des procédures expérimentales afin de réduire le stress lié aux interventions. Les prélèvements sanguins seront réalisés dans le respect des recommandations en vigueur, en limitant les volumes à moins de 5 % du volume sanguin total et en espaçant suffisamment les prélèvements afin d’éviter toute altération de l’état général des animaux. Les injections intrapéritonéales, susceptibles d’induire une gêne locale, seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, avec du matériel adapté et dans des conditions de contention maîtrisées, afin de minimiser la douleur et le stress. Un suivi clinique quotidien des animaux sera réalisé afin de détecter précocement tout signe d’inconfort ou de douleur (altération de l’état général, prostration, poils hirsutes, irritation au point d’injection, perte de poids). En cas d’apparition de tels signes, les animaux feront l’objet d’une surveillance renforcée et, si nécessaire, de mesures correctives telles que l’adaptation des conditions d’hébergement ou une réduction des manipulations. En cas de signes cliniques persistants, les animaux pourront être retirés du protocole expérimental et exclus de l’analyse, afin de préserver leur bien-être. Un point limite sera appliqué en cas de perte de poids supérieure à 15 % du poids initial, conduisant à la mise à mort de l’animal afin d’éviter toute souffrance prolongée. Par ailleurs, des administrations répétées d’anticorps par voie intrapéritonéale (toutes les 48 h pendant 15 jours) ont déjà été réalisées dans notre équipe sans impact observable sur le bien-être des rattes. Afin de renforcer le suivi du raffinement, des dosages de marqueurs biologiques seront réalisés avant et après traitement, incluant notamment des paramètres de tolérance générale (ALAT, ASAT pour la fonction hépatique). Un hématocrite sera également mesuré en fin de protocole. En effet, dans le contexte de stimulation ovarienne, une réponse excessive au traitement peut entraîner une augmentation de la perméabilité vasculaire, à l’origine d’un passage de liquide vers la cavité abdominale (ascite). Ce phénomène peut être associée à une altération de l’état général des animaux. L’élévation de l’hématocrite constitue ainsi un indicateur indirect de cette situation. En cas d'anomalies biologiques, les animaux concernés feront l'objet d'une surveillance renforcée, et pourront être retirés du protocole ou mis à mort.

Choix des espèces

La rate Wistar est un modèle validé pour l’étude de la physiologie de la reproduction et de la stimulation ovarienne. Son cycle œstral court (4–5 jours), bien caractérisé et reproductible, permet une analyse fine des mécanismes hormonaux et folliculaires. Les profils endocriniens présentent des similitudes fonctionnelles avec ceux observés chez l’humain, conférant à ce modèle une bonne pertinence biologique. À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire de manière intégrée les interactions entre l’axe hypothalamo-hypophyso-ovarien et l’environnement systémique nécessaires à l’étude de la réponse à une stimulation hormonale. L’anticorps anti-AMH utilisé a été développé et validé chez le rat. Son utilisation chez la souris exposerait à un risque de réponse immunitaire et nécessiterait des études de validation supplémentaires, impliquant l’utilisation d’animaux additionnels, ce qui serait contraire au principe de Réduction. Femelles adultes de 2 à 4 mois, correspondant au début de l’âge adulte lorsque le stock d’ovocyte est encore important.

Injectées une fois par jour pendant dix jours, contenues à chaque administration, pesées deux fois par semaine, 6 780 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Viennent ensuite les tests moteurs, poutre, rotarod jusqu'à 40 tours par minute et agrippement, puis l'open field pendant trente minutes et cinq minutes de nage forcée, chacun précédé d'une nouvelle injection. Sept jours d'hébergement individuel en cage calorimétrique, sans enrichissement, closent le protocole avant la mise à mort et le prélèvement des organes. Le porteur écrit que le nombre de souris "est réduit à son minimum" et le rattache à la littérature et à sa propre expérience, sans donner de calcul pour ces 6 780 individus.

Objectifs

La perte d’appétit, pouvant aller jusqu’à l’anorexie, est un problème fréquent dans de nombreuses situations de maladie ou après des épisodes de stress physique ou psychologique importants. Elle peut entraîner une perte de poids, une fatigue marquée et une dégradation de l’état général, rendant le rétablissement plus difficile. Ce phénomène constitue aujourd’hui un enjeu important pour la santé. Le projet vise à étudier l’effet de différentes substances capables d’agir sur ces mécanismes biologiques de faim, afin de mieux comprendre comment l’appétit et l’équilibre énergétique peuvent être influencés. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer à l’identification de nouvelles pistes pour limiter la perte d’appétit et améliorer l’état nutritionnel dans des situations de maladie sévère.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à améliorer notre connaissance des mécanismes biologiques impliqués dans la régulation de la prise alimentaire, du poids corporel et du métabolisme énergétique. Il permettra d’identifier et de comparer des substances susceptibles de moduler ces paramètres, et de sélectionner les candidats présentant les profils d’efficacité et de tolérance les plus favorables.

Procédures

Injections (10 max par souris; 1 fois par jour pendant 10 jours; durée

Impact sur les animaux

Administrations (injections et contention quotidienne) : peuvent provoquer une douleur légère au point d’injection et un stress transitoire lié à la manipulation, sans chirurgie ni anesthésie générale. Variations de prise alimentaire induites par les composés : peuvent entraîner des fluctuations du poids corporel (jusqu’à une perte de poids significative) avec possible altération transitoire de l’état général (baisse d’activité, pelage altéré, posture inhabituelle). Tests locomoteurs, moteurs et comportementaux : peuvent induire un stress aigu et transitoire lié à l’environnement nouveau et à l’effort demandé. Calorimétrie indirecte : l’hébergement individuel et l’absence d’enrichissement pendant l’enregistrement peuvent générer une gêne/anxiété transitoire liée à l’isolement.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Pour étudier de manière intégrée la prise alimentaire, le poids corporel, le comportement et le métabolisme énergétique, un modèle souris est indispensable. La souris est le modèle le plus pertinent pour cette étude, car elle présente des similitudes avec la physiologie humaine et constitue une référence largement utilisée dans les travaux sur la régulation métabolique.

Réduction

Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Le nombre de souris a été déterminé en accord avec les données de la littérature et d’après notre propre expérience des différents modèles présentés. De plus, afin de réduire le nombre d'animaux, des premiers tests ont été effectués in vitro.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur et aux bonnes pratiques de l’établissement utilisateur. Ils sont maintenus en cages collectives de même sexe, avec un accès ad libitum à une alimentation standard et à l’eau, en dehors des contraintes strictement nécessaires à certaines procédures expérimentales. L’environnement est systématiquement enrichi par la mise à disposition de matériaux de nidification et d’abris, favorisant l’expression des comportements naturels et contribuant à la réduction du stress. Une période d’acclimatation est respectée avant toute intervention expérimentale. Un suivi clinique régulier est assuré tout au long des procédures, permettant une détection précoce de toute altération de l’état général. Les critères surveillés incluent le comportement, l’activité spontanée, l’aspect du pelage, la posture, la mobilité et la respiration. Des points limites précoces et prédictifs, spécifiques à chaque procédure, ont été définis et appliqués de manière stricte afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de référence pour l’étude de la régulation de la prise alimentaire et du métabolisme énergétique, en raison des similitudes fonctionnelles avec la physiologie humaine et de la sensibilité de la souche C57BL/6 aux variations nutritionnelles. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines d’âge. À ce stade, ils ont atteint la maturité physiologique et métabolique, garantissant la robustesse des mesures expérimentales et limitant l’impact de la croissance sur l’interprétation des résultats.

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont implantées sous anesthésie, les composés testés sont administrés une à deux fois par jour pendant quatre semaines, et chaque souris passe 40 heures seule en cage sans enrichissement pour la mesure de la dépense énergétique. La force musculaire est évaluée par un test d'agrippement sur grille, la composition corporelle par imagerie. L'objectif immédiat reste de vérifier qu'une méthode d'induction de la cachexie par greffe tumorale est reproductible et laisse les souris survivre jusqu'aux mesures, le porteur affirmant que le recours à des animaux non-humains est "indispensable" parce que la cachexie met en jeu des interactions que l'in vitro et l'in silico ne reproduisent pas intégralement.

Objectifs

La cachexie cancéreuse est une complication fréquente des cancers avancés. Elle se caractérise par une perte progressive et importante de poids, notamment de masse musculaire et de masse grasse. Cette perte s’accompagne souvent d’une diminution de l’appétit, d’une baisse de la force musculaire et d’une augmentation des besoins énergétiques de l’organisme. À l’heure actuelle, il existe très peu de traitements efficaces et aucun médicament n’est approuvé en Europe pour traiter spécifiquement cette pathologie. L’objectif principal de ce projet est de mettre en place et de caractériser un modèle expérimental de cachexie cancéreuse chez la souris, obtenu par l’implantation de cellules tumorales. Ce modèle permettra de vérifier qu’il est fiable, reproductible et qu’il induit une cachexie suffisamment marquée tout en permettant aux animaux de survivre jusqu’aux différents moments de mesure prévus dans l’étude. Un second objectif est de vérifier que ce modèle permet bien d’évaluer l’efficacité de traitements contre la cachexie. Pour cela, nous testerons un médicament qui agit sur un récepteur qui est connu pour stimuler l’appétit et améliorer la masse musculaire dans certains contextes de cachexie. Ce projet vise donc à développer un modèle préclinique robuste et pertinent permettant d’étudier les différents aspects métaboliques, fonctionnels et biologiques de la cachexie cancéreuse ; d’évaluer de nouveaux candidats thérapeutiques ciblant cette pathologie ; et de développer une expertise scientifique et technologique dans le domaine de la cachexie cancéreuse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer et valider un modèle murin de cachexie cancéreuse intégrant des paramètres fonctionnels, métaboliques et biologiques, ce qui représente un enjeu majeur en recherche préclinique. Les bénéfices scientifiques attendus incluent une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de la cachexie, l’identification de paramètres robustes et reproductibles de suivi de la maladie, la validation d’un modèle pertinent pour le criblage de nouvelles approches thérapeutiques. À moyen et long terme, ce modèle contribuera au développement de traitements innovants destinés à améliorer la qualité de vie et le pronostic des patients atteints de cancer. Les connaissances générées pourront également être transposées à d’autres pathologies associées à la cachexie.

Procédures

Les cellules sont implantées sur animal anesthésié. L’injection dure environ 2 à 5 minutes. Le volume tumoral (longueur et largeur) sera mesuré 3 fois par semaine (2 min sur animal vigile). Les composés à tester seront administrés une à deux fois par jour par toutes les voies possibles, pendant 4 semaines maximum. L’administration dure environ 1 minute sur animal vigile. 2 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre les paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements visant à quantifier des paramètres biologiques, les animaux pourront être mis à jeun pour une durée de 2h maximum avant le prélèvement. Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en fin de période de traitement. Pour mesurer la force musculaire, nous testerons l’agrippement sur grille en début et fin d’étude (2 minutes sur animal vigile) La composition corporelle sera mesurée en début et fin d’étude sous imagerie, cela dure moins de 2 minutes sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Les animaux sont susceptibles de présenter des effets indésirables liés à l’implantation tumorale (douleur transitoire, inflammation locale ou risque d’infection au site d’incision, à la progression tumorale (risque de nécrose, possible qu’ils ressentent une faible gêne lors de la locomotion suite à l’encombrement de la tumeur), au développement de la cachexie (perte de poids, diminution de la masse musculaire et grasse, anorexie ou déshydratation). Un stress de l’animal peut être provoqué par les manipulation répétées (pesées, mesures fonctionnelles, administrations de traitement). Les prélèvements sanguins peuvent créer une lésion au niveau du site de prélèvements. Les traitements peuvent créer des lésions au niveau du site d'injection. Les mises à jeun (2h) lors de prélèvement de sang, peuvent être une source de stress pour l’animal. Les mesures de dépenses énergétiques nécessitent un isolement pendant 40 heures (16 heures d’acclimatation puis 24 heures de mesure). Cela peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de projet pour prélever les organes d'intérêt.

Remplacement

Le recours à l’animal est indispensable dans ce projet car la cachexie est un syndrome systémique (cela signifie qui implique des interactions complexes entre différents paramètres: la tumeur, le métabolisme énergétique, les systèmes musculaires, immunitaires et hormonaux). Cela ne peut être reproduit intégralement par des modèles in vitro ou in silico. Un système de tissu musculaire squelettique ex vivo challengé par du milieu conditionné de cellules tumorales est décrit dans la littérature mais ne permet pas de répondre à l’ensemble des objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Plusieurs mesures ont été mises en place afin de réduire le nombre d’animaux utilisés : - utilisation d’un design expérimental optimisé avec groupes témoins mutualisés, - collecte de multiples paramètres sur un même animal (fonctionnels, métaboliques, biologiques), - réalisation d’une phase pilote permettant d’éviter la répétition inutile d’études non optimales, - recours à des techniques non invasives. Ces mesures garantissent une utilisation raisonnée du nombre minimal d’animaux nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques.

Raffinement

Avant l’implantation des cellules tumorales, les animaux seront manipulés pour les habituer progressivement aux gestes de pesée, prélèvement, administration de traitement. L’implantation de cellules tumorales est réalisée sous couverture analgésique adaptée. Les animaux sont sur tapis chauffant de l’endormissement jusqu’au réveil. Après implantation tumorales, les animaux seront remis en collectif et l’état physique des animaux monitoré et scoré 1 fois par jour tout le long du projet. En cas de déshydratation, une injection de soluté de réhydratation est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Dans le cas d’apparition de nécrose ou tout autres atteintes des points limites, l’animal est mis à mort. Les points limites sont définis de manière conservatrice afin d’éviter toute souffrance excessive. En cas d’apparition de plaies au cours de l’étude, des soins seront réalisés jusqu’à l’apparition des croûtes. Parce qu’elle est stressante et peut induire une perte de poids, la procédure impliquant l’isolement de l'animal pendant plusieurs heures se fait la veille de la mise à mort. Une acclimation de 16h la veille à 7h30 le sera réalisée avant le début des mesures.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme espèce animale pertinente pour ce projet en raison de sa large utilisation et de sa validation dans les modèles précliniques de cancer et de cachexie. Ce modèle reproduit de manière robuste les principales caractéristiques de la cachexie cancéreuse observée chez l’Homme, incluant la perte de masse musculaire et grasse, l’anorexie, l’altération fonctionnelle et les modifications métaboliques. La taille de l’animal permet également la réalisation de mesures répétées in vivo (composition corporelle, tests fonctionnels, calorimétrie indirecte) avec un niveau de stress limité. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 semaines (jeunes adultes), afin d’étudier la cachexie cancéreuse sur un organisme mature tout en évitant les effets liés au vieillissement, tels que la sarcopénie, susceptibles de constituer un facteur de confusion.

Le protocole est mené pour le compte d'un laboratoire pharmaceutique client, dont la direction scientifique a validé la justification du projet, afin de trier des molécules candidates avant d'éventuels essais chez l'humain. 81 rats rendus obèses et diabétiques par une alimentation enrichie en graisses vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est hébergé seul, pesé 23 fois, traité 10 fois et piqué 16 fois pour des prélèvements de sang, le porteur précisant que le rat a été préféré à la souris à cause du nombre de prélèvements et des volumes sanguins voulus. L'intérêt affiché est d'optimiser la recherche et développement du client et de limiter la suite du développement aux molécules les plus prometteuses, la mise à mort finale servant des analyses pharmacocinétiques et des prélèvements d'organes.

Objectifs

Le présent projet sera mené pour le compte d’un laboratoire pharmaceutique dans le cadre d’une recherche privée. Le présent projet vise à explorer le profil pharmacologique du médicament X administrées chez le rat rendu obèse et diabétique par une alimentation enrichie en graisses, dans le but d'optimiser leur développement. La justification scientifique du projet a en outre été validée par la direction scientifique et par les chefs de projet de la société cliente.

Bénéfices attendus

Si les résultats obtenus sont positifs, les formulations du médicament X pourront entrer en phase d'étude clinique et être ensuite autorisé à être mis sur le marché en tant que traitements anti-obésité et anti-diabétiques, et dont la posologie serait bien moins contraignante pour les patients traités que le médicament actuel. Par ailleurs, un meilleur contrôle de la biodistribution du médicament X pourrait également améliorer l'efficacité des traitements actuels.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (23 mesures au cours de l'étude ; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration des composés (10 administrations ; durée : 1 minute); 3) Prélèvements sanguins pour mesure de la glycémie (2 prélèvements ; durée du prélèvement : 1 minute) ; 4) Prélèvements sanguins pour analyses pharmacocinétiques (14 prélèvements ; durée du prélèvement : 1 minute) 5) Anesthésie générale avant mise à mort (durée : 5 minutes).

Impact sur les animaux

L'hébergement en cage individuelle sera source de stress du fait d'un isolement partiel des animaux qui garderont néanmoins des contacts visuels et olfactifs. Les mesures de poids corporel, les administrations des traitements et les prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations des traitements et les prélèvement d'une goutte de sang à la pointe de la queue occasionneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. Enfin, le caractère obèse des rats sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

A l'issue de l'étude, l'ensemble des animaux sera mis à mort pour des analyses pharmacocinétiques et/ou des prélèvements d'organes.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et la glycémie dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de rat obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 16 ou 17 animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les mesures de poids corporel, les administrations des traitements et les prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. L'administration des traitements sera réalisée par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation d'une semaine sera prévue afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages glycémiques (une seule goutte de sang prélevée en bout de queue). Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le rat a été préféré à la souris compte tenu du nombre de prélèvements et des volumes sanguins nécessaires à l'étude. La même étude sur la souris aurait nécessité de limiter drastiquement le nombre de prélèvements par animal, ce qui aurait eu pour conséquence d'augmenter considérablement les effectifs de l'étude. Par ailleurs à ce stade, les études sur animaux non rongeurs n'ont pas été envisagées par soucis de Remplacement (Règle des 3Rs). Il nous apparait que les études sur les mammifères non murins devraient être limitées aux études règlementaires sur des leads (molécules actives) déjà sélectionnés. Or dans le cas présent il s'agit d'une étude de sélection de leads, permettant d'optimiser la R&D du client et de limiter le développement ultérieur aux leads présentant les meilleurs propriétés pharmacocinétiques.

Trente-cinq administrations et trente-deux pesées par animal, en cage individuelle: 60 souris rendues obèses par un régime dont 60 % des calories viennent des graisses sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Les témoins voient leur ration calorique quotidienne strictement alignée sur celle des souris traitées, afin de savoir si la perte de poids obtenue avec le composé X vient de la seule baisse de la prise alimentaire. Le porteur signale que l'obésité elle-même réduit la capacité de mouvement des souris, et que les prélèvements de sang causent des douleurs légères et du stress. L'étude est commandée par un client dont le porteur reprend l'objectif, faire aboutir la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Objectifs

Depuis 1975, la prévalence de l’obésité mondiale a presque triplé, atteignant plus de 650 millions d’adultes obèses en 2016 selon l’Organisation mondiale de la Santé (OMS). L’obésité constitue aujourd’hui un enjeu majeur de santé publique, pour lequel de nombreuses approches thérapeutiques, interventions chirurgicales et dispositifs médicaux sont en cours de développement ou d’évaluation. Le présent projet s’inscrit dans la continuité d’une étude préliminaire menée par notre client, ayant démontré que le composé X induit, chez la souris rendue obèse par un régime enrichi en graisses, une diminution significative de la prise alimentaire associée à une réduction du poids corporel. Cet effet a été observé dans un contexte d’administration chronique. Afin de préciser la nature des effets observés, notre client souhaite déterminer si la perte de poids induite par le composé X résulte exclusivement de la diminution de la prise alimentaire ou si d’autres mécanismes métaboliques intrinsèques contribuent à cet effet. Pour répondre à cette question, nous avons conçu une étude de type pair-feeding. Le composé X sera administré à un groupe d’animaux afin de caractériser la réduction spontanée de la prise alimentaire induite par le traitement. En parallèle, des groupes témoins recevant le véhicule auront leur ration calorique quotidienne strictement ajustée à celle des animaux traités. Si la perte de poids observée s’avère comparable entre les deux groupes, il sera alors possible de conclure que l’effet du composé X sur le poids corporel est principalement imputable à la seule réduction de la prise alimentaire. En revanche, toute différence supplémentaire en faveur du groupe traité suggérerait l’existence d’un effet métabolique propre, indépendant de la restriction calorique.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (32 mesures au cours de l'étude ; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration des traitements (35 administrations ; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (3 mesures ; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Prélèvements sanguins (3 prélèvements ; durée du prélèvement : 5 minutes); 5) Anesthésie générale avant mise à mort et prélèvement d'organes (durée : 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. L'administration des traitements sera source de stress. Par ailleurs les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de stress. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après mise à mort pour analyses ultérieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 12 animaux par groupe pour les souris obèses a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de tunnels, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation sera prévue une semaine avant la phase de traitement afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Avant la mesure de la composition corporelle, les animaux seront habitués à être installés dans le tube de couleur rouge permettant de réduire le stress des animaux au cours de la mesure. Les animaux seront habitués par deux fois aux systèmes de contention pour les prélèvements sanguins avant de pratiquer ces procédures. Les prélèvements sanguins seront limités au volume minimum nécessaire aux analyses pharmacocinétiques et une crème analgésiante sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'anti-douleur en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (avec 60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 18 semaines à réception. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de 12 semaines de régime enrichi en graisses chez le fournisseur.

Opérés deux à trois fois sous anesthésie générale, jusqu'à quatre heures par intervention, avec ablation du pancréas puis greffe d'îlots producteurs d'insuline, 180 miniporcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un cathéter reste posé pendant tout le protocole, qui dure de un à trois mois. Le porteur attend en post-opératoire des douleurs, une perte de poids, une baisse d'appétit, une mobilité réduite, de la confusion et des stéréotypies, ces comportements répétitifs qui signalent la détresse. Tous les animaux sont tués à l'issue, les biopsies terminales étant, écrit-il, incompatibles avec leur survie.

Objectifs

Le diabète de type 1 touche environ 8,4 millions de personnes dans le monde. Cette maladie apparaît lorsque le système immunitaire détruit les cellules du pancréas qui produisent l’insuline, une hormone indispensable pour réguler le taux de sucre dans le sang. Les personnes atteintes doivent donc s’injecter de l’insuline chaque jour pour survivre. La greffe d’îlots pancréatiques, qui consiste à transplanter les cellules productrices d’insuline provenant d’un donneur, est une approche prometteuse. Chez certains patients, elle permet de mieux contrôler la glycémie et parfois de réduire, voire d’éviter, les injections quotidiennes d’insuline. Cependant, cette technique présente encore des limites importantes. Une grande partie des cellules greffées disparaît rapidement après la transplantation. Cela est en partie lié à l’endroit où elles sont implantées dans le corps. Actuellement, les cellules sont généralement injectées dans le foie. Bien que cette méthode soit la référence actuelle, elle peut entraîner une inflammation locale et ne permet pas toujours un suivi facile du greffon. Il est donc essentiel de trouver de nouveaux sites d’implantation qui permettraient aux cellules greffées de mieux survivre et fonctionner. De plus, l’environnement immédiat autour des cellules transplantées joue un rôle crucial dans leur survie. L’utilisation de supports biologiques, appelés matrices ou biomatériaux, pourrait aider à protéger les cellules et à améliorer leur maintien après la greffe. Dans ce contexte, notre projet vise à comparer différents endroits du corps pour implanter ces cellules, ainsi que différents supports biologiques, afin d’identifier les meilleures combinaisons possibles pour améliorer la réussite de la greffe et restaurer durablement la production d’insuline. Ces essais seront comparés au site de greffe standart, utilisé à ce jour, la greffe d'îlots pancréatiques intraportale.

Bénéfices attendus

À court et moyen terme, ce projet donnera lieu à des publications scientifiques internationales, permettant de partager les résultats avec la communauté médicale et de faire avancer la recherche. À moyen et long terme, l’objectif est d’améliorer la greffe de cellules productrices d’insuline en identifiant les meilleurs endroits pour les implanter et les meilleurs supports pour les protéger. Cela pourrait permettre aux cellules greffées de survivre plus longtemps et de fonctionner plus efficacement. En trouvant des solutions alternatives au site actuellement utilisé dans le foie, il serait possible de réduire certains risques, comme la formation de caillots sanguins. À plus long terme, ces avancées pourraient aussi limiter, voire éviter, l’utilisation de traitements anti-rejet lourds. L’objectif final est d’améliorer la qualité de vie et la sécurité des patients atteints de diabète de type 1.

Procédures

Les animaux seront opérés 2 à 3 fois selon leur groupe; sous anesthésie générale (environ 1 à 4h selon la procédure). Ils auront un test de tolérance au glucose par voie intraveineuse (IVGTT) et un repas test pré opératoire. Le cathéter sera préalablement posé et laissé pour toute la durée du protocole. Les animaux recevront également une laparotomie afin de réaliser une pancréatectomie puis une greffe. Toutes les procédures seront réalisées pour influger le moins de douleur possible à l'animal (analgésie et anesthésie générale). L'euthanasie sera réalisée sous anesthésie générale (animal endormi). La durée du protocole est de 1 à 3 mois selon les groupes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables post opératoires attendus sont les suivants : douleur, perte de poids, diminution de l’appétit, mobilité réduite, confusion, stéréotypies. Ces effets pourront survenir pendant toute la durée du protocole mais sont particulièrement attendus en période post opératoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure (1 à 3 mois). En effet, la réalisation de biopsies terminales n'est pas compatible avec la survie de l'animal.

Remplacement

Le recours au modèle animal est nécessaire pour évaluer la survie et la fonctionnalité d’îlots pancréatiques transplantés dans différents sites du corps, ainsi que l’effet de matrices biologiques ou de dispositifs d’encapsulation. Ces phénomènes impliquent des interactions complexes entre inflammation, vascularisation et régulation du taux de sucre dans le sang, qui ne peuvent pas être reproduites par des modèles cellulaires ou des méthodes alternatives. Les tests métaboliques dynamiques (comme le test de tolérance au glucose) nécessitent un organisme vivant. Le miniporc a été choisi en raison de sa proximité physiologique avec l’être humain. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet de répondre aux objectifs du projet sans utiliser d’animaux.

Réduction

Nous utiliserons un nombre minimum d’animaux pour notre étude pré-clinique (avant une potentielle étude chez l’Homme). Il est difficile d’établir un nombre précis d’individus nécessaires mais des calculs statistiques de nombre d’individus nécessaires par des logiciels prévus à cet effet nous ont permis d’estimer au plus près le nombre d’animaux nécessaires sans devoir prévoir une « marge » trop importante. Cette marge a été réduite au minimum par les calculs de puissance statistique. Grâce à ces estimations, nous pourrons réduire encore le nombre d’animaux utilisés en cours de protocole si l’effet attendu est atteint avec un plus petit nombre d’animaux.

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place pour limiter la douleur et le stress des animaux. Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale avec surveillance continue, et un traitement antidouleur est administré avant et après les opérations. La pose d’un cathéter veineux central permet d’éviter des ponctions répétées lors des tests métaboliques et réduit ainsi les manipulations. Lorsque cela est possible, les greffes au niveau de l’estomac et du côlon sont réalisées par endoscopie afin de limiter l’invasivité. Lors du bloc terminal, la dernière intervention, le test métabolique final et l’euthanasie sont effectués sous anesthésie continue afin d’éviter tout réveil et toute douleur inutile. Des critères d’arrêt anticipé sont également prévus en cas de complication ou d’altération de l’état général. Ces mesures visent à garantir le bien-être des animaux tout en assurant la qualité scientifique de l’étude.

Choix des espèces

Le porc a un régime alimentaire omnivore et une anatomie et un métabolisme digestif semblables à l'Homme. Contrairement aux porcs juvéniles, dont le métabolisme et la croissance rapide peuvent biaiser les résultats, l’utilisation de miniporcs adultes permet d’obtenir des données plus transposables à l’Homme. Nous utiliserons des miniporcs adultes de 50kg à 70 kg.