Troubles endocriniens

1 895 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée, d'autres gardés pour l'élevage ou adoptés. Des lapines reçoivent des injections hormonales et des transferts d'embryons sous anesthésie, des mâles sont vasectomisés, pour renouveler des lignées transgéniques produisant des protéines thérapeutiques humaines dans leur lait. Le porteur indique que les lapines donneuses de gamètes sont tuées, leurs voies génitales devant être prélevées entières, et affirme que les animaux transgéniques ne présentent aucun phénotype anormal. Le lait des lapines modifiées sert à produire des médicaments.

Objectifs

L’Homme peut être atteint de maladies génétiques, affectant la synthèse par notre corps, de protéines indispensables à la vie. Selon le gène et les modifications de l’ADN, la protéine qui aurait dû être produite peut être absente, ou présente mais non fonctionnelle. L’administration de la protéine manquante sous forme de médicament est alors la meilleure thérapie. Nous avons choisi de produire des protéines recombinantes (car produites par une cellule dont le matériel génétique a été modifié par recombinaison génétique) à partir de la glande mammaire de lapines génétiquement modifiées, pour les récupérer dans le lait lors de la lactation. Les protéines recombinantes seront ensuite purifiées et deviendront des médicaments. Ce dossier présente nos activités de recherche : 1. l'optimisation de la production de protéines recombinantes. En effet, nous voulons améliorer la qualité et l’efficacité des protéines recombinantes produites dans le lait de lapines transgéniques, en modifiant leur génome par transgénèse, dans des embryons au stade une cellule. 2. notre société avait créé des lapines transgéniques produisant dans leur lait, l’inhibiteur C1 estérase recombinant (InhC1), utilisé comme médicament pour soigner les patients souffrant d’angioœdème héréditaire (AOH). Cette maladie génétique rare, causée par le déficit de production de la protéine inhibiteur C1 estérase, se caractérise par la survenue d'œdèmes sous-cutanés et/ou sous-muqueux, entrainant un gonflement localisé des tissus, de fortes douleurs abdominales et des décès (25% des cas) sans traitement approprié. Du fait de l’augmentation de la demande de l’InhC1 pour traiter l’AOH, les tests précliniques en cours pour d’autres pathologies (Covid-19) et pour renouveler les lapines transgéniques de 4ème génération produisant l’InhC1 dans notre animalerie de production, nous avons besoin de régénérer des lapins transgéniques de 2èmes et 3èmes générations à partir de semence transgénique de mâles des 1ères et 2èmes générations. Leur sperme avait été congelé il y a plus de 20 ans et ne parvient plus à féconder des lapines lors d’inséminations artificielles. Pour pallier ce problème, nous devons utiliser l’ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection, plus efficace que la fécondation in vitro) qui permet d’introduire un spermatozoïde dans l’ovule pour le féconder, puis le transférer dans l’utérus de lapines receveuses, pour régénérer des animaux transgéniques InhC1 de 2ème et 3èmes générations.

Bénéfices attendus

Nous avons déjà produit des protéines thérapeutiques pour l'Homme en utilisant des lapines trangéniques, ce qui nous a permis de commercialiser en 2014 un médicament plus efficace que les autres médicaments autorisés pour traiter les crises d’angioedème héréditaire (AOH) : notre protéine recombinante est identique à la protéine humaine et hautement purifiée alors que les produits concurrents sont eux isolés à partir de plasma humain, ne sont pas aussi bien purifiés et ne garantissent pas un médicament aussi sûr . Aujourd'hui, nous souhaitons améliorer la quantité et la qualité des protéines recombinantes produites dans le lait de lapines transgéniques en augmentant le niveau et l'efficacité de la production de la protéine d’intérêt, grâce à des outils de modifications du génome plus efficaces. Cela aura pour effet d’augmenter la durée de vie de la protéine recombinante dans l’organisme du patient et ainsi diminuer le nombre d’injections et la dose à injecter. Ces bénéfices pour l’Homme auront des avantages pour l’animal car produire des protéines recombinantes de meilleure qualité nous permettra de diminuer le nombre d'animaux dont nous aurions eu besoin pour produire ce médicament. Le deuxième bénéfice attendu de ce projet est de régénérer les lignées d'animaux transgéniques produisant notre médicament commercialisé afin de pouvoir soigner le plus de patients possibles, de réaliser de nouvelles études pré-cliniques et cliniques car cette protéine a un grand potentiel thérapeutique pour d'autres maladies comme le Covid-19.

Procédures

Les animaux vigiles recevront des injections sous-cutanées, intra-musculaires et des injections intraveineuses mais dans ce cas, sous anesthésie locale. Pour la procédure 1, obtention de gamètes femelles, les lapines vigiles reçoivent 2 injections sous-cutanées par jour pendant 2,5 jours, 1 injection intra-veineuse sous anesthésie locale. Cette procédure est prévue pour 1006 femelles. Pour la procédure n°2, vasectomie, 10 mâles subiront une seule chirurgie sous anesthésie générale (30 min). Pour la procédure n°3, transfert d’embryons chez une lapine receveuse, les lapines vigiles reçoivent 1 injection intra-veineuse sous anesthésie locale, 2 injections intramusculaires et 4 injections sous-cutanées (liées à l’anesthésie et aux soins post-opératoires) et une chirurgie sous anesthésie générale (30 min). Cette procédure est prévue pour 440 femelles. - Pour la procédure n°4, Césarienne, les lapines ont une chirurgie sous anesthésie générale (30 min) et reçoivent 2 injections intramusculaires et 4 injections sous-cutanées, liées à l’anesthésie et aux soins post-opératoires. Cette procédure est estimée pour 22 femelles - Pour la procédure n°5, prélèvements de sang, 212 lapins vigiles auront au maximum 2 prélèvements de sang (< 2 min) au cours de leur vie. - Pour la procédure n°6, prélèvement de lait, 205 lapines recevront une injection en intra-veineuse sous anesthésie locale, 1 fois par jour pendant la durée de la lactation, de J3 à J30 après la mise-bas, et ce uniquement les jours de semaine. Elles sont donc traites une fois par jour (10 min) pendant 20 jours environ. Concernant l’euthanasie des animaux, elle se fait majoritairement en intraveineuse mais il peut arriver qu’elle soit réalisée en intracardiaque sur des animaux précédemment anesthésiés (par une injection intramusculaire d’un mélange de kétamine et xilazyne).

Impact sur les animaux

Les lignées d'animaux transgéniques créées et renouvellées ne subiront aucune nuisance ou effet indésirable car les outils de biologie moléculaire que nous utilisons sont de classe 1, c'est à dire, sans effet sur l'Homme, les animaux et l'environnement. Les animaux transgéniques ne présentent aucun phénotype différent des animaux de génotype sauvage, seule la composition du lait produit lors de la lactation de la lapine transgénique est légèrement différente, et n'entraine d'ailleurs aucun trouble de croissance des lapereaux.

Devenir

La procédure obtention de gamètes femelles, est classé légère mais suivie d'une euthanasie car nous ne pouvons pas récupérer les gamètes sans récupérer les tractus génitaux. Cela implique de devoir euthanasier la lapine donneuse de gamètes. Concernant la procédure 2, vasectomie, nous avons besoin des mâles pour qu’ils stimulent l’ovulation des lapines donneuses d’ovocytes, mais sans les féconder, c’est pourquoi les animaux seront gardés en vie après avoir été opérés. Le transfert d’embryon dans une lapine receveuse a pour but de placer des embryons dans l’utérus d’une femelle pour qu’ils puissent se développer et devenir des lapereaux. Les lapines opérées dans le cadre de cette procédure seront gardées en vie pendant quelques mois et nous les utiliserons ensuite soit pour un nouveau transfert soit pour la procédure « obtention de gamètes femelles ». La césarienne, qui ne sera réalisée qu’en cas de difficulté de la lapine à mettre bas, a le même but : nous permettre d’obtenir des lapereaux vivants, qui auront besoin de leur mère pour être nourris et élevés. Les procédures qui consistent à prélever du sang et du lait sur les lapins, ont pour but de nous permettre de déterminer si nous avons atteints nos objectifs. Ces animaux seront laissés en vie après la procédure et remis dans l’élevage.

Remplacement

La production de protéines recombinantes dans le lait de lapines transgéniques est le principe fondateur de notre société et n’est pas remplaçable. Concernant le projet de renouvellement, nous avons essayé d’inséminer des lapines avec de la semence décongelée de mâles transgéniques InhC1 de 1ères et 2èmes générations mais avec un succès très limité. Le stock de paillettes de semence s’épuisant, il est nécessaire de trouver une alternative : l’ICSI (injection intracytoplasmique de sperme) .

Réduction

Pour l'optimisation de la production des protéines, nous mettons au point des tests prédictifs d'efficacité de nos vecteurs dans des lignées cellulaires. Nous souhaitons à terme, pouvoir tester tous les vecteurs de nos cibles génomiques afin de pouvoir pré-sélectionner les plus efficaces avant de passer à la micro-injection dans des embryons au stade 1 cellule et ainsi diminuer le nombre total d’animaux utilisés pour ce projet. Pendant cette mise au point, nous testons l’efficacité de nouveaux outils d’ingéniérie génétique en laissant en culture des embryons micro-injectés, jusqu’à ce qu’ils aient 5 jours (stable morulae/blastocyste) et nous réalisons ensuite leur génotypage pour vérifier l’efficacité des outils choisis . Cela nous permet de diminuer le nombre d’animaux utilisées pour un transfert d’embryon, de ne pas faire naître des animaux qui n’ont pas d’intérêt scientifique. Une fois les nouveaux outils validés, nous réitérons l’expérience en transférant cette fois les embryons micro-injectés dans des lapines dites receveuses. Les cibles génétiques sélectionnées concernent soit la production des protéines récombinantes soit l’amelioration de glycosylation de ces protéines récombinants. Les lapines reçoivent un traitement de super-ovulation qui, en moyenne, double le nombre d’ovocytes émis lors de l’ovulation (passe de 15 à 30, en moyenne), ce qui permet de diminuer par deux le nombre de lapines à utiliser. Après transfert, gestation et/ou lactation, les femelles receveuses d’embryons sont ré-utilisées en tant que femelles donneuses d’ovocytes ou d’embryons. L’optimisation de l’utilisation des lapines nous permet de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés réaliser la procédure « obtention de gamètes femelles ».

Raffinement

Les lapins reçoivent des enrichissements dès trois semaines de vie, et les parois latérales de leurs cages sont équipées de plexiglas transparent, ce qui leur permet d’interagir. Leurs cages sont aussi équipées de plateforme qui leur permettent de mettre en œuvre leur comportement naturel de se cacher. De la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et les bruits environnementaux. Les gestes invasifs associés aux procédures sont faits sous anesthésie locale et/ou générale et les animaux recoivent des anti-inflammatoires locaux et généraux après chaque intervention. Notre protocole post-opératoire est mis en œuvre pour assurer le plus de confort et le moins de douleur à l’animal par l’application de produits cicatrisants et désinfectants en spray (pour ne pas toucher la zone potentiellement douloureuse), par l'injection d’anti-inflammatoire les 3 jours suivants l’opération, par la pose d’une collerette pour éviter que l’animal ne mange ses points de suture, pendant 10 jours environ après l’opération. La quantité d'aliment est augmentée pour que la lapine puisse accéder à sa nourriture facilement.

Choix des espèces

Le lapin (de souche New Zealand White) a été choisi pour : sa courte période de gestation (32-33 jours), sa maturation sexuelle rapide (4 à 5 mois), le volume de lait produit (jusqu’à 10 litres/an/femelle), la synthèse de protéines complexes (glycosylation et gamma carboxylation). Les lapines sont utilisées dès qu'elles ont atteint la maturité sexuelle, à 4 mois : Elles peuvent être utilisées comme receveuse d'embryons, par réimplantation chirurgicale d'embryons. Elles peuvent être super-ovulées et accouplées (ou non) avec des mâles pour être fécondées et être donneuses de gamètes. Les mâles sont utilisés comme reproducteurs à partir de 5 mois, lorsqu’ils ont atteint la maturité sexuelle, pour générer une descendance.

1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de vecteurs de thérapie génique puis des prélèvements de sang répétés sous anesthésie, certaines souris modèles de la maladie de Pompe développant une faiblesse musculaire évaluée par un test de force, pour optimiser le ciblage tissulaire de ces vecteurs. Le porteur signale une douleur possible à l'injection et un risque de cannibalisme chez les nouveau-nées. Toutes les souris sont tuées par dislocation cervicale pour analyser la distribution des vecteurs dans les organes.

Objectifs

Ce projet de recherche a pour but de développer des outils de thérapie génique pour améliorer les traitements de maladies rares. La thérapie génique est un outil de plus en plus utilisé pour le traitement d’un grand panel de pathologies génétiques (maladies hépatiques, musculaires, neurologiques, etc.), il est donc important de cibler spécifiquement les tissus touchés par telles ou telles pathologies. Néanmoins, certaines difficultés restent à être surmontées et d’autres points peuvent être améliorés. L'objectif de ce projet est d'optimiser un vecteur de thérapie génique, l'AAV (virus adéno-associé), afin de le rendre plus efficace et plus spécifique pour l'organe à traiter dans le cadre de la maladie. Pour cela, nous allons travailler sur deux éléments du vecteur : la capside, la partie externe du vecteur responsable du ciblage des organes, et le promoteur, un élément qui permet l'expression du gène thérapeutique (le transgène) dans l'organe à traiter. Ce projet utilisera des souris saines pour sélectionner les meilleures capsides et promoteurs, qui seront ensuite validés sur des souris adultes et juvéniles atteintes de la maladie de Pompe pour tester leur efficacité thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier les meilleurs vecteurs AAV pour cibler de manière spécifique les organes couramment touchés par les maladies génétiques : le foie, les muscles et le système nerveux central. Le développement de vecteurs optimisés pour le(s) organe(s) cible(s) permettra de réduire la dose de vecteur nécessaire pour atteindre l'effet thérapeutique et ainsi diminuer le risque d'effets indésirables du traitement (e.g. la réponse immunitaire contre le vecteur).

Procédures

L’injection intraveineuse des vecteurs dans la veine caudale pour les souris adulte ou dans la veine temporale pour les souris juvénile sera effectuée une seule fois au début de l'étude. Le prélèvement de sang sur les souris adultes sera réalisé sous anesthésie au niveau de la veine faciale à 1, 4, 7, 15, 30, 45 et 60 jours post-injection et après une fois par mois. Les souris juvéniles seront prélevées une fois par mois. Un test d’évaluation fonctionnel (grip test) sera réalisé sur les souris atteintes de la maladie de Pompe à 3 mois et 6 mois post-injection afin de vérifier l'efficacité du vecteur.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir une douleur instantanée due à l'injection du vecteur. Le stress de la manipulation peut durer jusqu'à 30 secondes. La prise de sang sera réalisée sous anesthésie, la souris ne ressentira donc aucune douleur, mais la manipulation (environ 1 minute) pourra être un facteur de stress. Les souris modèle de la pathologie de Pompe pouvaient développer le phénotype pathologique progressive (faiblesse musculaire) au cours des derniers mois de l'étude. Un risque de cannibalisme pourrait être observé chez les souris nouveau-nées.

Devenir

Tous les animaux sains utilisés pour la sélection des meilleures capsides et promoteurs seront euthanasiés par dislocation cervicale à la fin des procédures expérimentales afin de prélever des organes et analyser la biodistribution et l'efficacité des vecteurs dans les différents tissus. Toutes les souris atteintes de la maladie de Pompe utilisées pour tester l'efficacité thérapeutique des meilleures combinaisons capside-promoteur seront euthanasiées par dislocation cervicale à la fin des procédures expérimentales afin de prélever des organes et analyser la biodistribution et l'efficacité des vecteurs dans les différents tissus. Une procédure d'élevage de souris atteintes de la maladie de la Pompe est prévue dans cette étude, les souris de cette procédure seront utilisées dans les procédures expérimentales.

Remplacement

Afin de limiter au maximum le nombre de souris utilisé, nous avons réalisé un premier tri parmi notre liste des capsides et des promoteurs grâce à l'utilisation de culture cellulaire. Ces premiers tests nous ont permis de mettre en évidence 80 capsides et 50 promoteurs intéressants. Néanmoins, nous devons approfondir ces résultats en mesurant l’efficacité de ces traitements sur un organisme entier, pouvant réagir contre ce traitement (réponse immunitaire) et également mesurer sont efficacité de traitement d'une maladie.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera le minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. Pour le garantir, nous avons établi une approche statistique autour du paramètre d’intérêt commun mesurable dans toutes les procédures : l’expression de notre transgène. Nous utiliserons 6 souris/groupe pour nous donner la possibilité de détecter une augmentation significative du transgène. De plus, nous allons prioriser l'utilisation d'animaux sains (798 souris) lors de la sélection de nos meilleurs candidats. Les souris souffrant de la maladie de Pompe seront utilisées en dernier recours, afin de valider nos meilleurs candidats (252 souris).

Raffinement

Nous allons tout mettre en œuvre pour maximiser le bien-être des animaux (limitation du nombre de souris par cage, enrichissement des cages, limiter le stress lors de la manipulation des animaux, etc.). Chaque geste expérimental réalisé sur les animaux (injections et prise de sang) sera réalisé par du personnel formé, la mise en place d'anesthésies et des mesures de récupération (surveillance accrue des souris, utilisation de plaque chauffante jusqu'au réveil, etc.) seront utilisées lors de des prises de sang. Le prélèvement de sang sera réalisé au niveau de la veine faciale sur des souris préalablement anesthésiées afin de diminuer leur stress. L’injection intraveineuse des vecteurs dans la veine caudale sera réalisée après avoir favorisé la dilatation des veines (sous une source de chaleur) pour un maximum d’efficacité et de rapidité d’intervention sur l’animal, pour limiter le temps de passage en boîte de contention nécessaire à l’injection dans la queue.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux disponibles pour la maladie de Pompe (bovins, chats, moutons et caille), la souris Gaa-/- [B6;129-Gaatm1Rabn/J] est l'espèce animale la plus facile à produire. Elle reproduit la maladie de Pompe, car elle ne montre aucune activité enzymatique de GAA (dans le sang et dans les tissus), elle présente une accumulation de glycogène dans tous les tissus et l'activité locomotrice des souris est altérée. De plus, nous disposons déjà de ce modèle dans notre animalerie et nous disposons de toutes les techniques pour mesurer la réversion du phénotype liée à la pathologie. La maladie de Pompe est une maladie liée à une accumulation de glycogène dans différents tissus (foie, muscles, système nerveux central, etc.). Les outils développés ont pour but d’augmenter l’efficacité du traitement déjà disponible afin de réduire la dose de vecteur injecté. 1) Certaines souris seront injectées à l’âge adulte (4 mois) ; âge où les premiers symptômes de la maladie de Pompe apparaissent pour la colonie de souris Gaa-/-. Cette approche permettra de tester si notre stratégie permet de traiter la pathologie sur les organes matures. 2) D’autres souris seront injectées à la naissance (0-2 jours). Cette approche permettra de déterminer si notre stratégie perdure dans le temps malgré la croissance des souris et des différents tissus, notamment le foie. Les souris saines utilisés pour la sélection des meilleures capsides et promoteurs seront injectées à 6 semaines, âge pour lequel la souris est considérée comme adulte.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Rendues obèses par un régime gras et hébergées seules, elles reçoivent chaque jour un composé par gavage, des pesées, des prélèvements de sang à la queue et un test de tolérance au glucose précédé de plusieurs heures de jeûne. Le porteur précise que l'étude est menée pour le compte d'un "client" en vue d'un dossier d'autorisation de mise sur le marché, et que le diabète sévère et le traitement peuvent entraîner une perte de poids. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur le poids et le métabolisme.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Dans ce contexte, notre client souhaite évaluer l'effet des nouveaux composés sur les symptômes liés à l'obésité chez les souris obèses (induites par une alimentation enrichie en graisses). Dans ce contexte, notre entreprise mènera, au nom de notre client, une étude in vivo visant à évaluer les effets des composés clients sur la prise alimentaire, le poids corporel et le métabolisme du glucose chez les souris obèses (induites par une alimentation enrichie en graisses). L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement de composés d'intérêt thérapeutique, destinés à l’amélioration des troubles métaboliques, notamment l'obésité. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré que ces composés induisent une perte de poids corporel associée à une diminution de prise alimentaire chez des souris obèses. L’objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l’impact à plus long terme de ces composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris soumises à une alimentation enrichie en graisses (HFD; 60% de l'énergie fournie par les lipides).

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre l'obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - obésité des animaux de part leur phénotype - un hébergement individuel sur toute l'étude - une administration orale quotidienne à partir de D-11 - une pesée quotidienne de D-18 à D-1 - un prélèvement sanguin à la queue à D-3 et D29 - une prise alimentaire et une pesée trois fois par semaine à partir de D1 - une mise à jeûn de 4h - un test oral de tolérance au glucose (OGTT) à D28 [Mise à jeun pendant 8h, Prélèvements sanguins (1 goutte) 30min avant et à 0, 5, 20 et 60min aprés administration du glucose] De plus, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance.

Impact sur les animaux

La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire implique l'hébergement individuel des animaux. Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance. D'autre part, des prélèvements sanguins à D-3 et D29, une administration quotidienne per os à partir de D-11, un test de tolérance au glucose (avec une mise à jeun de 8h), une mise à jeûn de 4h avant euthanasie sont prévus.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire (Gain de poids en g/Prise alimentaire cumulée en g), test de tolérance au glucose (glycémie et aire sous la courbe), glycémie à jeun, insulinémie, HOMA-IR et HOMA-b (résistance à l'insuline et fonction des cellules b du pancréas) et les poids des différents organes.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisemment l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserverons des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos et de matériels de nidification. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Afin d'éviter toute angoisse ou souffrance des animaux, lors de l'euthanasie, les animaux seront préalablement anesthésiés (Procédure 1 : Euthasol en surdose/Procédure 2 : mélange de kétamine/xylazine) avant la dislocation cervicale.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

1366 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 1128 femelles reçoivent un traitement hormonal par deux injections pour produire des embryons, 178 autres subissent une chirurgie de réimplantation au niveau de l'oviducte et 60 mâles une vasectomie, l'ensemble servant à fabriquer de nouvelles lignées génétiquement modifiées à la demande d'équipes de recherche. Les mâles vasectomisés sont tués six à douze mois après l'opération, les femelles au moment du sevrage des portées. Le porteur affirme que seul un "organisme intégré" permet d'étudier les interactions entre cellules et tissus et présente ces souris transgéniques comme des "modèles indispensables".

Objectifs

Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste à développer de nouvelles lignées de souris transgéniques pour permettre aux chercheurs d’avoir les outils les plus adaptés à leurs études. La première étape de ce projet est de vérifier que cette lignée de souris transgéniques n’est pas disponible dans une banque internationale ou dans un laboratoire académique. En cas d’indisponibilité, le modèle de souris transgénique est alors créé dans notre service par transgénèse aléatoire ou par la technologie CRISPR/Cas9.

Bénéfices attendus

Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour le développement de thérapies innovantes (Bradley et al., 2012, Meehan et al., 2017).

Procédures

Pour obtenir un grand nombre d’embryons, les 1128 femelles donneuses reçoivent un traitement hormonal qui consiste en 2 injections intra-péritonéales à 48h d’intervalle. Ces injections sont réalisées sur animal vigile. Les embryons sont ensuite manipulés génétiquement puis réimplantés dans 178 femelles receveuses (=mères porteuses) au niveau de l’oviducte qui est un conduit reliant l'ovaire à l’utérus, Ces femelles receveuses sont produites en accouplant des femelles avec des males vasectomisés c’est-à-dire rendus stériles. Pour obtenir ces mâles vasectomisés, 60 males subissent une chirurgie qui consiste à couper les canaux qui permettent aux spermatozoïdes de sortir du testicule. La réimplantation et la vasectomie requièrent une chirurgie qui est réalisée sous une anesthésie générale induite par une injection intra-péritonéale d’un complexe anesthésique. L’anesthésie de ces 238 animaux (178 femelles receveuses + 60 mâles vasectomisés) dure en moyenne 20 minutes. Une prise en charge de la douleur est systématiquement effectuée par une injection intra-péritonéale d’un anti-inflammatoire non stéroïdien Pour une récupération de meilleure qualité après l’anesthésie et la chirurgie, une injection sous cutanée d’une solution de réhydratation est réalisée sur les animaux opérés. Pour éviter l’hypothermie, le réveil se fait sur un tapis chauffant. Un apport de graines de tournesol et d’une nourriture enrichie en matières grasses permet d’augmenter les bien-être des femelles opérées. Il favorise ainsi un meilleur développement des gestations et une lactation de meilleure qualité pour la prise en charge des nouveaux nés L’ensemble de ces approches technologiques permettent de générer des modèles de souris transgéniques pour l’étude de mécanismes impliqués dans le développement embryonnaire, le cancer ou dans des maladies immunitaires, par les équipes de recherche.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont : 1- ceux liés à l’injection intrapéritonéale d’hormone. La durée des effets indésirables est limitée au moment de l’injection. 2- ceux liés à des petites chirurgies abdominales. La durée des effets n’excédera pas 24 heures.

Devenir

Vasectomie : Les mâles sont conservés pendant la période de leur plus forte activité sexuelle et seront euthanasiés 6-12 mois après leur vasectomie (selon leur aptitude d’accouplement scorée). Après 8 accouplements sans bouchon vaginal, le mâle est euthanasié. Superovulation des femelles donneuses Les femelles superovulées qui présentent un bouchon vaginal sont euthanasiées pour la récupération des embryons Toutes les femelles sans bouchon vaginal sont réutilisées pour une deuxième injection d’hormones, 2-3 semaines plus tard. Réimplantation d’embryons L’ensemble des femelles réimplantées sont euthanasiées au moment du sevrage des naissances.

Remplacement

Les chercheurs effectuent un travail préliminaire grâce à l’utilisation de des bases de données (études in silico ) et des modèles in-vitro ( culture de cellules , organoïdes…) . En revanche, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche)

Réduction

Les nouveaux outils technologiques tel que l’électroporation combinée à des nucléases toujours plus performantes et des ARN guides commerciaux plus stables (IDT ; Synthego) ont permis de diminuer par un facteur 2 le nombre de séances nécessaires à l’obtention de modèles Knock-Out et de petits Knock-In. Le nombre de naissance a été augmenté en changeant notre approche pour la réimplantation. Une réimplantation bilatérale sur une femelle unique est désormais effectuée en routine (Mahabir E et al 2018) Pour les grands Knock-In, un test d’efficacité de coupure des ARN guides est effectué sur un test in-vitro. Une analyse sur blastocyste unique est réalisée et permet d’éviter d’avoir recours à des femelles réimplantées et des naissances. À la suite de ces tests, une séquence d’ARN guide est choisie. Le plasmide donneur sera alors élaboré en fonction des résultats de ce test. L’expérimentation in-vivo (Injection des embryons avec mélange contenant le plasmide donneur / ARN guides / Cas9) sera alors réalisée avec réimplantation des femelles pseudogestantes.

Raffinement

L’ensemble des procédures nécessitant de la chirurgie se fait sous anesthésie générale. Injection IP d’un mélange Xylazine (7.5mg/kg), kétamine (40 mg/kg) et flunitrazépam (0.5 mg/kg) dans du NaCl 0.9%, à raison de 50 μL pour 10g. Ce mélange permet une anesthésie assez longue et profonde ce qui permet de réaliser l’opération dans de bonnes conditions pour l’animal. L’effet analgésique de la Xylazine est utilisé pour soulager la douleur. En complément à la Xylazine, une injection de Rimadyl est effectuée pour une meilleure prise en charge de la douleur. A la fin de l’intervention avant de refermer la paroi musculaire, du Carprofène (Rimadyl) est administré dans la cavité abdominale à raison de 1mg/ml dans NaCl 0.9% à raison de 100µl pour 20g de souris.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée (superovulation efficace et embryons faciles à injecter) Nous n’utilisons que des souris adultes car nous les utilisons pour leur fonction reproductrice. En fond mixte B6D2 (C57BL6 x DBA/2), les femelles donneuses ont 8 semaines ce qui permet une quantité et une qualité optimale des embryons. En revanche pour un fond pur C57BL6/J ou N, les femelles ont 4 semaines pour l’obtention d’un plus grand nombre d’embryons avec une qualité correcte. Nous utilisons femelles pseudogestantes NMRI entre 8 et 24 semaines. Les mâles stériles NMRI (vasectomisés) utilisés pour les accouplements ont entre 2 mois et 12 mois.