Troubles endocriniens

132 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d’implantation d’un capteur de pression dans l’aorte, un gavage quotidien et deux prélèvements de sang, avant le prélèvement de ses tissus, pour évaluer des associations d’extraits de plantes contre l’hypertension. Le porteur indique qu’une perte de poids suit la chirurgie et qu’un gavage prolongé peut irriter l’œsophage. Il affirme que la pression artérielle ne peut être étudiée que sur un organisme complexe et écarte le recours à un modèle in vitro.

Objectifs

D’après l’OMS 2 milliards de personnes dans le monde sont en surpoids, 650 millions sont obèses et 1 adulte sur 3 est atteint d’hypertension artérielle (HTA). Dans l’hypertension, les vaisseaux sanguins subissent en permanence une pression élevée (pression diastolique ≥90mmHg et pression systolique ≥ 140mmHg), ce qui peut les endommager. Plus l’hypertension est élevée, plus les risques associés sont importants et peuvent entrainer des complications graves (AVC, insuffisance cardiaque, insuffisance rénale, infarctus de myocarde…). L’utilisation d’extraits végétaux en complément des mesures hygiéno-diététiques est une piste sérieuse pour prévenir l’évolution de l’HTA. Certains extraits végétaux issus de la pharmacopée européenne ont déjà montré des effets bénéfiques et protecteurs. L’objectif de ce projet et d’étudier les bénéfices apportés par différentes formulations innovantes d’extraits végétaux sur la prévention du développement de l’HTA dans différents modèles murins et de mieux comprendre les mécanismes d’action mis en jeu dans cette prévention. Chez les rongeurs (rats, souris), il est possible d’induire un état d’hypertension en nourrissant les animaux avec un régime riche en gras et en sel (HF -HS) (mimant les mauvaises habitudes alimentaires impliquées en partie dans le développement de l’hypertension chez l’homme) durant plusieurs semaines. Une hypertension peut également être obtenue en ayant recours à des animaux naturellement hypertendus comme le rat SHR ou en ayant recours à l’administration de composés pharmacologiques. Au cours de ce projet, les animaux seront placés dans un environnement adapté à leurs besoins physiologiques et observés quotidiennement sur la base de critères comportementaux (posture, appétit, interaction avec l’environnement…) et morphologiques (croissance, prise de poids, état général des dents, du poil…) pour prévenir au plus vite de la diminution de leur état de bien-être (raffinement). Les différents tissus obtenus au cours de ce projet seront stockés pour permettre des analyses ultérieures et éviter de devoir recourir à un projet similaire dans le temps. L’ensemble de ces dispositions répond aux principes fondamentaux des 3Rs (réduction, raffinement, remplacement) dans le cadre de l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont d’identifier des nouvelles associations d’extraits végétaux susceptibles d’améliorer la pression artérielle dans un contexte d’hypertension. Ces nouveaux extraits pourraient à terme, aider les personnes souffrant d’hypertension à réguler leur pression artérielle. Ce projet pourrait également permettre d’identifier et de caractériser des mécanismes d’action liés aux effets bénéfiques de ces extraits.

Procédures

Les animaux seront soumis aux actes suivants au cours du projet : - Une implantation d'un capteur de pression artérielle via l'aorte abdominale (chirurgie sous anesthésie générale) d'une durée totale d'environ 45 minutes. - Un gavage quotidien (administration de composés à raison de 8ml/kg) sur la durée de l'étude. L'acte a une durée inférieure à 10 secondes, contention comprise. - 2 prélèvements de sang de 500 µl (début et fin d'étude) compris dans les recommandations du NC3R. L'acte a une durée inférieure à 1 minute, contention comprise.

Impact sur les animaux

Ce projet nécessite de recourir à une chirurgie pour l’implantation d’outil de télémétrie. Comme pour toute chirurgie, un risque de perte dans le temps chirurgical est envisagé. Également, durant les 2 à 3 premiers jours après la chirurgie, une perte de poids est attendue. Cette perte de poids devrait cependant être compensée les jours suivants. Pour les animaux recevant une administration chronique de produit par gavage quotidien, une irritation de l’oesophage peut apparaitre (rare). Cet effet indésirable est réduit par la réalisation de l’acte par du personnel entrainé et qualifié.

Devenir

A la fin de chaque procédure des tissus seront prélevés pour réaliser des analyses complémentaires au laboratoire. Les animaux seront donc euthanasiés.

Remplacement

L’aspect hémodynamique de la pression artérielle et la complexité des mécanismes qui la régule ne peuvent être évalués qu’en ayant recours à des un organisme complexe présentant des similitudes avec L’Homme. Les rongeurs sont des modèles adaptés d’études ne peuvent pas se substituer à un modèle in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à son minimum pour permettre de répondre à la question scientifique tout en préservant la bonne puissance statistique. L’utilisation de la technique de télémétrie pour l’évaluation de la pression artérielle correspond au gold standard et permet de réduire la variabilité de mesures rencontrées dans d’autres techniques (exemple tail cuff). La diminution de cette variabilité permet de réduire davantage le nombre d'animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées, et conformes aux besoins de l’espèce avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et avec un enrichissement du milieu (matériel de nidification + tube en plexiglas rouge). Les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale et la douleur sera prise en charge par l’utilisation d’analgésique (kétoprohène). Le recours à la télémétrie pour l’évaluation de la pression artérielle constitue un gold standard et permet d’enregistrer la pression artérielle en continu sans avoir recours à la manipulation de l’animal (pas de contention, diminution du stress…)

Choix des espèces

La souris C57BL/6 est une lignée polyvalente largement utilisée dans la recherche sur le métabolisme et la nutrition. Cette lignée lorsqu’elle est soumise à un régime DIO développe une obésité au cours du temps. Cet état d’obésité peut être accompagné d’HTA en ajoutant un composé pharmacologique comme le L-Name dans l’eau de boisson. Le rat SHR est naturellement hypertendu et est également un modèle de choix pour l’étude de l’HTA. Les 2 modèles utilisés dans ce projet sont complémentaires et adaptés à nos objectifs. Le rat SHR dérive du rat Wistar, ce dernier sert de référence ne développant pas d’hypertension. En se basant sur nos précédents projets, les animaux utilisés seront âgés de 8 - 12 semaines à l’initiation du traitement / chirurgie ce qui correspond à un état de jeunes adultes (maturité du système immunitaire et sexuel). Pour les rats SHR la PA progresse au cours du temps et il est préférable d'utiliser des animaux jeunes pour observés un ralentissement du developpement de l'hypertention.

60 souris génétiquement modifiées, rendues obèses et diabétiques, vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Hébergées seules pendant 78 jours, elles reçoivent un régime gras, un gavage quotidien pendant huit semaines, des mises à jeun répétées et des tests de tolérance au glucose et à l’insuline, avant une ponction cardiaque terminale, pour évaluer un composé anti-obésité pour le compte d’un laboratoire client. Le porteur situe la finalité du côté d’un dossier d’autorisation de mise sur le marché. Il affirme qu’aucune méthode de substitution ne permet d’étudier l’effet d’un composé sur le poids et le métabolisme et conclut au recours à la souris.

Objectifs

L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement d'un composé d'intérêt thérapeutique, destinés à l’amélioration des troubles métaboliques, notamment l'obésité. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré que ce composé induit une perte de poids corporel associée à une diminution de prise alimentaire chez des souris obèses. L’objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l’impact à plus long terme de ce composé sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris génétiquement modifiées obèses et diabétiques.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre l'obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une pesée trois fois par semaine sur une durée de 11 semaines - une administration orale quotidienne pendant 8 semaines - une mise à jeun de 4h pour un prélèvement sanguin à partir de la veine caudale (2 fois ; durée du prélèvement : 1-2 min) - une analyse de la composition corporelle de l'animal vigile (3 fois ; durée de la mesure : 1-2 min). - un test oral de tolérance au glucose (OGTT) (1 fois ; durée totale de l’OGTT : 16h) [Mise à jeun pendant 12-14h, Prélèvements sanguins (6 fois sur 2h ; 5min/prélèvement), Administration orale (durée : 1 min)] - un test de tolérance à l'insuline (ITT) (1 fois ; durée totale de l’ITT : 8h) [Mise à jeun pendant 6h, Prélèvements sanguins (6 fois sur 2h ; 5min/prélèvement), Injection intrapéritonéale (durée : 1 min)]

Impact sur les animaux

Les animaux seront hébergés individuellement sur l’ensemble de l’étude (78 jours). De par leur caractère social, ce type d’hébergement les prive de leur liberté d’expression d’un comportement normal de leur espèce. Le régime alimentaire riche en gras (71 jours) et l’obésité induite peuvent conduire à un inconfort sur les animaux. Les interventions ci-après peuvent constituer une source de stress sur l’animal. Le poids corporel [1 min] sera mesuré sur l’ensemble de l’étude, deux fois par semaine. De J22 à J28, l’ensemble des animaux recevront quotidiennement une administration orale [1 min] de véhicule afin de les habituer à cette voie d’administration. A J26, J50 et J70, une mesure de la composition corporelle sera mesurée sur animal vigile (durée de la mesure : 1-2min). A J26 et J50, à l’issue de l’analyse, les souris seront mises à jeun (atteinte à l’absence de faim) pendant 4h, et auront un prélèvement sanguin [5 min] pour mesurer leur glycémie et récupérer du plasma. A partir de J29, les animaux recevront une administration quotidienne [1-2 min] per os de leur composé d'intérêt ; ceci impliquerait potentiellement une perte de poids. A J58, les animaux seront mis à jeun toute la nuit (atteinte à l’absence de faim) et un test de tolérance au glucose [2h30] sera réalisée. Ceci consiste à mesurer la glycémie 30 min avant, et immédiatement avant (0 min) administration per os du glucose [1 min] puis 5 min, 20 min, 60 min, 90 min et 120 min après administration du glucose. Du plasma sera également récupéré pour mesurer l’insulinémie sera mesurée immédiatement avant (0 min) puis 20 et 60 minutes après administration du glucose. A J65, les animaux seront mis à jeun 6h (atteinte à l’absence de faim) et un test de tolérance à l’insuline sera réalisé [2h]. Ceci consiste à mesurer la glycémie immédiatement avant (0min) l'injection intrapéritonéale d'insuline [1 min] puis 15, 30, 45, 60 et 120min après administration de l'insuline. A J71, les souris seront mises à jeun pendant 4h (atteinte à l’absence de faim), pour mesurer leur glycémie [1min]. Après une anesthésie à l'aide d'un mélange kétamine/xylazine pouvant créer un inconfort, un prélèvement par ponction cardiaque sera réalisé. Une deuxième méthode de mise à mort par dislocation cervicale aura lieu pour s'assurer de la mort de l'animal. Ainsi, la durée de l’anesthésie avant sacrifice durera environ 15min.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements post-mortem sont nécessaires à l'étude afin de réaliser des analyses histologiques et biochimiques sur les tissus.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel, prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire, composition corporelle, glycémie à jeun, test de tolérance au glucose par voie orale, test de tolérance à l’insuline, poids des différents organes, analyses sur plasma.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisément l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dôme en carton et de briquettes en bois. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. A la fin du protocole, après une anesthésie à l'aide d'un mélange d'anesthésique/analgésique, un prélèvement sanguin par ponction cardiaque sera réalisé. Une deuxième méthode de mise à mort par dislocation cervicale aura lieu pour s'assurer de la mort de l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourris avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

Douze porcs miniatures vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur rend le pancréas partiellement défaillant par une substance toxique et un régime hypercalorique pour induire un diabète de type 2, puis on implante par chirurgie un dispositif thérapeutique ou un placebo, avec plusieurs sessions d'imagerie sous anesthésie sur près de deux ans. Le porteur indique que la pathologie "affectera de façon importante les animaux contrôle" ne recevant pas de traitement, et que les animaux sont tués avant que le diabète n'atteigne le stade clinique. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèles non-animaux" utilisables et justifie le porc par sa taille, adaptée à l'imagerie et à la chirurgie prévue chez l'humain.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie qui touche plus de 265 millions de personnes dans le monde. De nouveaux traitements existent mais leur efficacité est entachée par de nombreux effets indésirables. Le projet vise à rétablir la sensibilité des récepteurs à un peptide digestif situés dans un très court segment de la veine qui draine l'ensemble des organes abdominaux par l’intermédiaire d’un dispositif médical adapté délivrant une molécule bioactive. La dihydro-testostérone permet de restaurer la densité de ces récepteurs à un niveau proche de celui existant chez l’animal sain. Ce composé peut être inséré dans une matrice moléculaire permettant une libération. Dans ce cadre, la dose administrée localement est égale au 1/100 de la dose utilisée dans le cadre de l’hypogonadie chez l’homme. Le but de l’expérience est d’évaluer sur le long cours l’efficacité du dispositif sur un modèle préclinique ayant tout à la fois une insulino-résistance et une réduction de la capacité sécrétoire en insuline du pancréas i.e. un diabète de type 2 déclaré cliniquement. Elle est formatée pour constituer l’étape préclinique permettant le passage à une étude de phase I chez le patient humain. Le modèle utilisé sera celui d’un porc miniature rendu insulino-résistant par l’ingestion d’un régime en excès calorique et contenant une proportion anormalement élevée en graisses et en glucide rapidement absorbable. Une destruction partielle des cellules ß pancréatiques sera couplée à l’état précédent pour assurer une réduction de la capacité sécrétoire en insuline. Cette destruction sera réalisée par l’administration d'une substance toxique pour les cellules pancréatiques qui secrétent l'insuline. La dose sera calibrée pour que l’hyperglycémie soit limitée de façon à ne pas atteindre des stades pathologiques dangereux pour l'animal sur la durée de l'expérience.

Bénéfices attendus

Le but de l’expérience est d’évaluer sur le long cours l’efficacité du dispositif proposé par la société PalTech sur un modèle préclinique ayant tout à la fois une insulino-résistance et une réduction de la capacité sécrétoire en insuline du pancréas i.e. un diabète de type 2 déclaré cliniquement. Elle est formatée pour constituer l’étape préclinique permettant le passage à une étude de phase I chez le patient humain. Les bénéfices à court terme sont ceux associé à la possibilité de lancer la phase humaine du programme. Les bénéfices à long terme sont directement associés à la mise en place d'une thérapeutique alternative au traitement du diabéte de type 2. La cible choisie permettra de réduire les effets secondaires potentiellement mortels ou conduisant à l'arret du traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure comprenant diverses étapes durant la durée du projet. Les animaux seront implantés avec une chambre sous cutanée pour permettre un accès veineux de longue durée durant une anesthésie chirugicale. Durant la même anesthésie une dose d'un produit toxique pour le pancréas sera administré. Sept semaines après, les mêmes animaux subiront une seconde anesthésie chirugicale pour recevoir le dispositif thérapeutique expérimental (ou un placebo). Le geste chirurgical sera guidé par une image hybride moléculaire localisant la zone à traiter et réalisée sous anesthésie une semaine auparavant. Dix-huit semaines après, les animaux seront testés pour de multiples paramétres afin de caractériser l'étendu du diabéte qui restera à une phase préclinique. Ces tests seront principalement réalisés chez l'animal anesthésié durant des sessions d'imagerie positronique associées à une imagerie scannographique. Ils comprendront l'évaluation de la densité des récepteurs à un peptide digestif (4 heures), une mesure du métabolisme du glucose (4 heures) et une mesure de la fonction rénale (3 heures). Chacune de ces mesures sera réalisée sous anesthésie avec au minimum une semaine entre chaque session. Une mesure des changements du glucose dans le sang après le repas sera également réalisée (1 heure). Une seconde session, identique, sera réalisée 12 semaines au moins après la première. A l'issue de cette seconde session, et alors que le diabéte est toujours dans une phase préclinique, les animaux seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables induit par la protocole sont de trois natures. 1. Le programme nécessite la création d’un diabète de type 2 avec le développement de pathologies macro et micro vasculaires. A minima, la pathologie affectera de façon importante les animaux contrôle ne recevant pas de thérapeutique. 2. Mise en place de la thérapeutique - Celle-ci est réalisée sous laparoscopie, une procédure connue pour limiter toutes les conséquences néfastes post-opératoires et qui sera celle utilisée chez l’homme. De plus, l’insertion d’un dispositif à libération continue évite toute interaction régulière de type piqure ou drogage. 3. Evaluation de l’état pathologique - les effets indésirables sont ceux de l'anesthésie sachant que (1) les produits utilisés pour chaque session d'imagerie n'induisent aucune réaction indésirables et (2) la dose totale de radiation engagée reste dans le domaine du diagnostic médical.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés avant le passage des symptomes du diabéte au stade clinique, c'est à dire avec des conséquences directement visibles sur la santé des individus.

Remplacement

Ce projet réalisera de nouvelles recherches pour lesquelles l'information n'est pas déjà disponible dans la littérature. Bien que le remplacement par des alternatives non animales telles que les lignées cellulaires soit un atout inestimable pour la recherche, les lignées cellulaires ne peuvent pas reproduire la physiologie intégrative complexe présente chez un animal modèle, qui s’apparente étroitement à l'homme. En raison du haut niveau de complexité des systèmes étudiés, de leur intégration complexe et des conséquences multiples de leurs dérèglement, il existe trop d'inconnues pour créer des modèles fiables générés par ordinateur. Ainsi, il n'y a pas de modèles non-animaux qui peuvent être utilisés pour ces études. Le choix du modèle porcin se justifie par rapport à l’utilisation d’une procédure d’implantation ceolioscopique qui sera celle utilisée chez l’homme et qui se peut être effectuée techniquement sur un animal de plus petite taille. Pour les mêmes raisons de taille, la résolution spatiale obtenue par l’utilisation du modèle porcin, du fait des limitations techniques (taille des capteurs de la machine d'imagerie moléculaire) et physiques (longueur du parcours du positron avant son annihilation) fait qu’un modèle de grande taille est recherché.

Réduction

Ce projet a été conçu pour utiliser le nombre minimum d'animaux, tout en garantissant l'obtention de résultats scientifiquement pertinents et l'atteinte des objectifs de l'étude. Des calculs statistiques ont été effectués sur la base des résultats d'études similaires dans ce domaine. Le nombre requis de porcs nécessaires pour cette étude est réduit en enregistrant autant de paramètres que possible à partir d'un seul animal, sans compromettre le bien-être des animaux.

Raffinement

Les animaux seront manipulés de manière appropriée et à minima un soigneur interagira avec eux en fournissant des éléments d’enrichissement de l’environnement.Plusieurs principes ont présidés à la mise en place des mesures - Toutes les mesures pouvant faire l’objet d’une mesure non invasive par l’utilisation de l’imagerie sont prioritaires - Les mesures n’impliquant pas une imagerie mais pouvant être réalisées sous anesthésie sont réalisées dans ce contexte - Les mesures pouvant être réalisées au cours de la même anesthésie sont toutes groupées durant la même anesthésie - Les mesures sanguines ne pouvant pas être réalisées sous anesthésie ou pour lesquelles l’anesthésie n’est pas indispensable sont effectuées au moyen d’un accès veineux permanent sous cutané (port veineux). - Des dispositifs alternatifs radiofréquence aux mesures sanguines sont utilisés lorsque la pertinence de ceux ci est notable (risque d’hypoglycémie). Une interaction positive quotidienne avec les animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Afin de préserver le bien-être, les animaux seront surveillés et notés fréquemment à l'aide de feuilles de pointage du bien-être animal pour s'assurer qu'aucun animal ne dépasse un niveau de détresse strictement prédéterminé, et des critères d'évaluation sans cruauté seront mis en œuvre immédiatement si un animal subit des effets indésirables inattendus. Les possibilités d'affiner la procédure seront continuellement explorées et mises en œuvre dans la mesure du possible pendant la durée de vie du projet. Des revues de littérature régulières seront effectuées pendant toute la durée du projet pour s'assurer que les procédures utilisées sont aussi raffinées que possible et restent conformes aux recommandations de bonnes pratiques.

Choix des espèces

Le porc s’impose comme un modèle privilégié pour les études en nutrition. En contexte nutritionnel délétère, le miniporc adulte développe une obésité similaire à la pathologie humaine et sous exprime un capteur sensible à un peptide digestif renseignant le cerveau sur l'arrivée de glucose au niveau portal. De plus, plusieurs solutions de destruction partielle des cellules bêta ont été proposées chez le porc en croissance et chez le porc miniature adulte. Le choix du modèle porcin se justifie également par rapport à l’utilisation d’une procédure d’implantation ceolioscopique qui sera celle utilisée chez l’homme et qui ne peut être effectuée techniquement sur un animal de plus petite taille. Pour les mêmes raisons de taille, la résolution spatiale obtenue par l’utilisation du modèle porcin, du fait des limitations techniques (taille des capteurs la machine d'imagerie moléculaire) et physiques (longueur du parcours du positron avant son annihilation) fait qu’un modèle de grande taille est recherché. Les animaux seront des adultes bien apr!s que leur croissance ait atteint un plateau i.e. > 3 ans. Ceci se justife par le fait que la condition visée par notre solution thérapeutique est celle du diabéte de type 2 chez l'adulte et que ce dernier se développe préférentiellemetn après 45 ans

2 cochons vont être utilisés, tous deux tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie abdominale de deux heures pour implanter des capteurs de glucose, puis deux séances sous anesthésie où lui sont injectées des doses de glucose et prélevés au total 120 ml de sang. Le porteur décrit une prise en charge de la douleur par morphinique et anti-inflammatoires, les cochons étant tués en fin de protocole. Il affirme qu'il est impossible de reproduire artificiellement l'implantation d'un tel capteur et retient le porc pour sa taille proche de celle de l'humain.

Objectifs

Le projet s’inscrit dans la prise en charge innovante du diabete de type 1, visant une restauration d'un taux normal de glucose dans le sang (glycémie) par une administration d’insuline adaptée au cours du temps. Des systèmes de mesure du glucose en continu (CGM) existent déjà mais évaluent la concentration de glucose dans le liquide interstitiel et non le taux de glucose dans le sang, entraînant un décalage temporel dans l’ajustement de la dose d’insuline à délivrer. Notre projet vise l’élaboration d’un système d’insulinothérapie automatisée implanté dans la cavité abdominale (péritoine) pour le traitement du diabète. Il comprendra : 1) un capteur de mesure du glucose (CGM) implanté dans le péritoine, 2) une pompe de perfusion d’insuline dont le réservoir sera rempli par un port disposé contre la paroi intestinale, auquel se connecteront, par un système magnétique, des gélules contenant de l’insuline administrées par voie orale, 3) un algorithme de contrôle, hébergé par la pompe, modulant la perfusion d’insuline selon les données CGM pour établir et maintenir la glycémie dans un intervalle physiologique. La partie du projet concernée par ce travail expérimental est d’étudier la faisabilité de l’implantation du capteur de CGM dans le péritoine, et de vérifier l’exactitude de la mesure du glucose par ce capteur intrapéritonéal, par rapport au glucose mesuré dans le sang d’une part et par rapport au glucose mesuré en sous-cutané par le même capteur implanté sous la peau de l’abdomen d’autre part. La mesure du glucose intrapéritonéal présente un intérêt plus important que la mesure du glucose interstitiel sous-cutané. En effet, la vitesse de variation du glucose intra-péritonéal est plus rapide que la variation du glucose sous-cutané lorsque que le taux de glucose sanguin varie. L’identification plus précoce des variations glycémiques permettrait un ajustement plus rapide de la perfusion d’insuline par la pompe grâce à son algorithme. Il est aussi établi que l’insuline délivrée dans le péritoine est plus vite absorbée et que son action est plus rapide que la perfusion sous-cutanée. Ainsi, la combinaison d’une détection plus rapide des variations glycémiques et d’une adaptation plus rapide de l’action de l’insuline ferait du système un dispositif actif plus physiologique que les pompes actuelles connectées à des capteurs de glucose sous-cutanés.

Bénéfices attendus

Cette expérimentation permettra : 1- D’évaluer la faisabilité de la procédure d’implantation d’un capteur de mesure continue du glucose dans le péritoine, 2- D’évaluer la fonctionnalité du capteur de mesure du glucose implanté dans le péritoine par rapport au capteur implanté en sous-cutané et des deux capteurs par rapport à la mesure du glucose dans le sang qui servira de référence. 3- D’évaluer la durabilité de la fonctionnalité des capteurs après 7 jours d’implantation. Les résultats de cette expérimentation permettront d’orienter le projet sur la décision de localisation du capteur de mesure du glucose qui fournira l’information à l’algorithme de régulation de la perfusion d’insuline par la pompe implantée. L’option qui indiquera la meilleure fonctionnalité du capteur sera retenue pour la poursuite du projet. La démonstration de la faisabilité de l’implantation d’un capteur de glucose intra-péritonéal, et de sa capacité à mesurer avec exactitude et de façon plus rapide et durable les variations glycémiques, permettrait d’envisager la mise à disposition aux personnes atteintes de diabète d’un dispositif implantable de capture des mouvements glycémiques, idéal pour asservir la délivrance d’insuline de façon proche de la physiologie, et réduire ainsi les écarts hyper- et hypoglycémiques.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, l'étude durera 9 jours au cours desquels les animaux seront opérés pour implanter les capteurs de mesure du glucose (2h maximum d'intervention), puis ils seront anesthésiés 2 jours et 9 jours après l'opération pour réaliser des mesures dans le sang (1 heure d'intervention à chaque fois). Ainsi, à J2 et à J9, 3 injections intraveineuses de 2, 4 et 8 ml d’une solution de glucose à 50 mg/ml seront réalisées à 20 minutes d’écart, puis 2 ml de sang seront prélevés toutes les 2 minutes sur 3 fois 20 minutes, soit un total de 60 ml de sang. Au total l'animal aura donc reçu 6 injections de glucose et 120 ml de sang auront été prélevés. Tous les gestes seront réalisés sous anesthésie générale associée à des anti-douleurs. En dehors de ces 3 jours de manipulation, les animaux ne subiront pas d'autres nuisances.

Impact sur les animaux

Au cours de cette procédure expérimentale, les principales nuisances pour l'animal seront liées à la chirurgie destinée à l’implantation des capteurs aux niveaux intra-péritonéal et sous-cutané, entraînant des brèches de petites tailles de la paroi abdominale et du péritoine. La prise en charge de la douleur sera maîtrisée par l’injection d'un morphinique au cours de l'intervention, puis l’administration post-opératoire d'anti-douleurs. Au cours des phases de surveillance, et au delà des soins apportés pour une bonne cicatrisation suite à l'opération, la surveillance des animaux sera très rigoureuse, notamment par l'évaluation quotidienne du comportement de l'animal à l’aide une grille de score. Les jours où seront réalisée des mesures, les animaux seront anesthésiés et ne subiront donc qu’un traumatisme mineur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Il n’est pas possible de reproduire artificiellement les conditions d’implantation dans le péritoine d’un capteur de mesure du glucose. Néanmoins le développement d’un tel dispositif nécessite de recueillir des données in vivo. Par sa taille et son anatomie, l’implantation chez le porc permettra de reproduire des conditions voisines d’une implantation chez l’Homme. Les exigences requises pour la réalisation du protocole en font un modèle expérimental pertinent pour cette étude.

Réduction

Pour réduire le nombre de porcs utilisés pour l’expérimentation, deux capteurs seront implantés dans le péritoine (un dans chaque flanc) et deux en sous-cutané dans la paroi abdominale, chez chacun des deux animaux. On pourra ainsi tester 4 capteurs implantés au total. Cela permettra de tester la reproductibilité des résultats avec un nombre réduit d’animaux. Les données de mesure du glucose dans le péritoine, le tissu sous-cutané et le sang seront appariées et comparées à la suite de chaque injection intraveineuse de glucose. On disposera ainsi pour chaque couple de capteurs péritonéaux et sous-cutanés de 30 points de mesure (10 temps de mesure dans les 20 minutes qui suivront chacune des 3 injections de glucose) représentant 120 points de mesure comparables pour 4 capteurs permettant une analyse statistique pertinente.

Raffinement

Toutes les étapes de la procédure expérimentale seront réalisées sous anesthésie générale. Pour la chirurgie, elle sera associée à la gestion de la douleur per-opératoire par un morphinique, et post-opératoire par l'administration d'anti-inflammatoires. De même la mise à mort sera réalisée en fin de procédure alors que les animaux sont anesthésiés. Pendant la phase post-opératoire immédiate, une grille d'évaluation sera utilisée pour s'assurer du bon réveil de l'animal. Pendant la période de surveillance, une grille de score sera utilisée pour évaluer l'état clinique des animaux, portant sur des critères d'absence d'infection en lien direct avec le modèle (laparotomie), sur des points généraux de comportement et des signes d'inconfort ou de douleur. Cette grille aidera à la prise de décision en cas d'atteinte des points limites. Ainsi en cas d’infection aux sites d’implantation ou de signes de souffrance persistante malgré les mesures antalgiques et anti-inflammatoires d’un animal soumis à l’expérimentation, celle-ci sera abandonnée (animal sorti d’étude). Les dispositifs implantés et portés étant peu invasifs, ils n’altèreront pas la qualité de vie des animaux entre l’implantation et les jours d’évaluation des capteurs (J2 et J9).

Choix des espèces

Par sa taille et son anatomie, l’implantation chez le porc permettra de reproduire des conditions voisines d’une implantation chez l’Homme. Les exigences requises pour la réalisation du protocole en font un modèle expérimental pertinent pour cette étude. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 3 mois environ, permettant d'avoir des animaux de 30 kg à 35 kg, ce qui facilite également les aspects techniques en utilisant du matériel identique à celui utilisé en médecine humaine.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris transgéniques reçoivent pendant 6 à 12 mois une alimentation enrichie d'un mélange de six pesticides, avec suivi de la glycémie, séjours en cage métabolique, tests de tolérance au glucose et à l'insuline par injection puis prélèvements sanguins répétés, pour explorer un lien entre pesticides, maladie de Parkinson et diabète. Seuls des mâles sont exposés, et les animaux sont tués pour prélever cerveau, pancréas et autres organes. Le porteur affirme que ces liens n'ont "jamais été explorés" et écarte les modèles cellulaires ou invertébrés comme inadaptés à sa question.

Objectifs

Notre projet vise à apporter des connaissances sur les liens potentiels qui n’ont jamais été explorés à notre connaissance entre exposition alimentaire à des pesticides et des maladies humaines chroniques fréquentes, les maladies de Parkinson (MP) et le diabète, à l’aide d’un modèle « humanisé » développant une maladie neurodégénérative caractérisée par l'accumulation anormale d'agrégats de la protéine alpha-synucléine dans le cerveau. Ce projet s’inscrit dans un contexte ou certaines données épidémiologiques suggèrent que le diabète serait associé à un risque accru de maladie de Parkinson. Par ailleurs, plusieurs méta-analyses confirment le lien entre exposition professionnelle aux pesticides et MP. Dans ces conditions, notre projet envisage l’évaluation de la toxicité d’un mélange de 6 pesticides à des doses individuelles supposées ne pas exercer d’effets sur la santé chez l’homme mais rapportées pour induire en mélange un surpoids et/ou un diabète chez des souris non transgéniques. En utilisant ce mélange, nous étudierons alors le lien entre les perturbations métaboliques observées et les mécanismes qui sous-tendent le développement de la MP dans un modèle de souris transgéniques.

Bénéfices attendus

Le projet vise à apporter des éléments de connaissance concernant le rôle de l’exposition quotidienne à de faibles doses de pesticides en mélange via l’alimentation dans l’incidence des maladies neurodégénératives associées à la protéine alpha-synucléine (comme la maladie de Parkinson) et du diabète. Par ailleurs, ce projet doit permettre d'investiguer le lien entre le diabète et la maladie de Parkinson.

Procédures

Premièrement, 40 souris (10 par lot) feront l'objet d’un suivi périodique de la glycémie sur 6 mois (semaine 9, 17, et 24). Après une période de jeûne de 4-6h des prélèvements de sang seront effectués pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre (3 minutes par animal). Deuxièmement, 40 souris (10 par lot) feront l’objet de prélèvements urinaires et d’un suivi des paramètres métaboliques (glycémie et test de tolérance au glucose) sur 12 mois. Les animaux seront mis individuellement dans des cages métaboliques pour récupérer les urines sur une période de 24h (semaine -1, 6, 27 et 52). Pour le suivi périodique de la glycémie, les modalités du point 1 seront appliquées en semaine 9, 24, 29 et 42. Enfin, Pour les tests de tolérance au glucose (semaine 16, 36, et 48) après une période de jeûne de 4-6h, une injection intrapéritonéale d’une solution saline de D-Glucose stérile sera réalisée. Huit prélèvements de sang seront effectués, pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre sur une période de 2h30min. Par ailleurs, deux prélèvements sanguins supplémentaires seront réalisés pour un dosage ultérieur de l’insuline plasmatique qui sera mesurée 30 min avant et 15 minutes après l’injection du DGlucose. Troisièmement 20 souris (5 par lot) feront l’objet de tests fonctionnels et d’un suivi des paramètres métaboliques selon les mêmes modalités que le point 2 (glycémie et test de tolérance au glucose) sur 12 mois. Les tests fonctionnels (semaine 0/1, 12/13, 25/26, 38/39 et 51/52) seront réalisés afin d’évaluer les conséquences fonctionnelles de l’exposition aux pesticides, en comparaison avec le vieillissement normal. Lors de chaque test, les animaux seront évalués pendant 7 minutes. Quatrièmement 40 souris (10 par lot) feront l’objet de tests fonctionnels (selon les mêmes modalités que le point 3) et d’un suivi des paramètres métaboliques (glycémie et test de tolérance à l’insuline) sur 12 mois. Pour le suivi périodique de la glycémie, les modalités du point 1 seront appliquées en semaine 9, 24, 29 et 42. Enfin pour les tests de tolérance à l'insuline intrapéritonéal (semaine 15, 35 et 47) les souris seront mises à jeun pendant 4-6h puis une injection intrapéritonéale d’une solution d'insuline (0,75U insuline/kg de poids corporel) sera réalisée. Huit prélèvements de sang seront effectués pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre sur une période de 2h30min.

Impact sur les animaux

L'administration d'aliment enrichi avec le mélange de 6 pesticides a déjà été réalisée chez la souris sans complication observée pour elles-mêmes. Le taux de mortalité lié à ce régime est nul. Les suivis envisagés sont couramment utilisés et n'induisent pas d'effet indésirable particulier en dehors de la douleur ou du stress induit par l'acte lui-même. En cas de souffrance (blessure, absence de prise de poids ou perte de poids supérieure à 20%), les souris seront mises à mort. Concernant les animaux qui seront soumis à un ensemble de tests fonctionnels, la planification des tests est prévue afin de limiter le stress des animaux et garantir un niveau d’activité. En particulier, lors de chaque session, les tests seront étalés sur 2 semaines et aucun suivi des paramètres métaboliques ne sera réalisé durant la période de suivi des capacités motrices des souris.

Devenir

Les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement des organes nécessaires à l'exploitation des résultats : cerveau, pancréas, foie, moelle épinière, tissu adipeux, intestin, fèces, yeux et sang.

Remplacement

L'étude des liens entre la maladie de Parkinson et le diabète de type 2 en condition d'exposition chronique à un mélange de faibles doses de pesticides à l'aide de cellules, organoïdes, modèles numériques ou modèles animaux moins sensibles (invertébrés) constituerait des approches différentes qui ne pourraient pas répondre aux questions que nous souhaitons aborder. Par ailleurs, l'étude des mécanismes moléculaires au niveau pancréatique dans un modèle murin de synucléinopathie n’a jamais été réalisée, et encore moins dans des conditions d’exposition alimentaire à un mélange de pesticides à faibles doses, pertinente au regard de l’évaluation des risques de l’alimentation humaine.

Réduction

Les animaux exposés seront tous étudiés dans les différentes expériences (tests fonctionnels, suivi métabolique) et ils seront analysés avec les différentes techniques choisies. Les souris seront mises à mort après 6 mois ou 12 mois afin de mimer une exposition d'un consommateur humain durant 15 et 30 ans. Ces choix de durée d’exposition sont également motivés par les caractéristiques spécifiques de l’évolution de la neuropathologie dans la lignée M83 d’une part et par les données déjà publiées sur l’évolution des troubles métaboliques chez la souris conventionnelle d’autre part. La quantité d'animaux par groupe de 35 animaux/groupe est le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet. Une fois les données relevées (comparaison de la masse des souris (en g), mesure de la glycémie, réponse au test de tolérance au glucose, réponse au test de tolérance à l’insuline, capacité motrice, étude des perturbations métaboliques et des mécanismes liés au développement de la MP) des tests statistiques sont prévus pour la comparaison des 2 groupes entre eux (exposé, non-exposé). En accord avec les récentes observations publiées, seules les souris mâles seront exposées de façon continue, à l’aliment enrichi (ou non) par le mélange de 6 pesticides pendant 12 ou 6 mois.

Raffinement

Les animaux seront suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière pour le suivi métabolique des animaux (la mesure du poids, la quantité de nourriture ingérée, tests de tolérance au glucose intrapéritonéal, prise d'urine, mesure de la glycémie) et la mise en œuvre des tests fonctionnels. Les souris seront hébergées avec un environnement enrichi. Elles auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Lors des études précédentes, la tolérance du régime était bonne, aucune sur-mortalité n'avait été enregistrée. En cas de mal être: blessure, poids trop faible (si la perte de poids est de plus de 20%), déshydratation, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La lignée de souris transgéniques (M83) exprimant l’alpha-synucléine humaine sera utilisée et exposée (ou non) au mélange de pesticides via l’alimentation, parallèlement aux souris Bl6/C3H, fond génétique de la lignée M83. Les travaux sont proposés à partir de la lignée de souris transgéniques M83 exprimant l’alpha-synucléine humaine mutée A53T. Ce modèle murin, dont l’agrégation protéique est facilitée par la mutation, permettra d’évaluer l’impact du mélange sur la neuropathologie. Nos résultats préliminaires montrent la présence très précoce d’alpha-synucléine phosphorylée en sérine 129 dans les ilots pancréatiques des souris transgéniques. Les souris seront exposées à l’aliment enrichi avec le mélange de 6 pesticides à partir de l’âge de 4 mois (stade adulte) pour nous conformer à la publication de référence.

2 550 souris et lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les animaux servant aux tests étant tués et les autres pouvant être réutilisés pour d'autres projets. Les lapins subissent un jeûne alimentaire d'environ quatorze heures et un jeûne hydrique de trois heures, deux injections sous la peau et six prélèvements de sang à l'oreille, les souris deux injections et un prélèvement à la joue. L'objet n'est pas la recherche mais le contrôle libératoire de lots commerciaux d'insuline exigé par les pharmacopées américaine et chinoise. Le porteur indique qu'un test sans animaux existe mais n'est accepté par ces pharmacopées que pour certaines insulines, et que le nombre d'animaux est fixé par la réglementation.

Objectifs

L’objectif de ces tests de contrôle de la qualité est de pouvoir mettre à disposition de patients des lots contrôlés d’insuline utilisés notamment pour le traitement de maladies métaboliques comme le diabète. En effet ce projet supporte la réalisation de tests de contrôle qualité dits « libératoires » pour des produits pharmaceutiques. La référence réglementaire appliquée à la réalisation de ces tests est la Pharmacopée (Américaine – USP et Chinoise – CH). Deux procédures sont décrites dans ce projet : L’une utilisant des lapins (Pharmacopée Américaine - US) et l’autre utilisant des souris (Pharmacopée Chinoise - CH). Ces essais permettent de vérifier l’activité hypoglycémique du médicament après son injection à un groupe de lapins ou de souris, en comparaison avec une solution d’insuline de référence injectée à un groupe témoin de lapins ou de souris. La glycémie est ensuite mesurée grâce à différents échantillons de plasma prélevés à différents temps après l’injection.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments à des patients. Ces tests (Insuline – USP et Insuline – CH) sont demandés pour la libération des lots de médicaments à base d’insuline ou homologue à destination des marchés Américain et Chinois (obligation réglementaire pour libération sur le marché). Ces tests sont décrits dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques.

Procédures

Procédure avec les lapins (vigiles) : - Animaux : Les lapins seront séparés en 4 groupes de 2 lapins - Mise à jeun alimentaire effectuée +/- 14h avant chaque jour de test - Mise à jeun hydrique : au moment des injections, les animaux subissent une mise à jeun hydrique qui durera +/- 3h - Injections : Chaque lapin recevra 2 injections en sous-cutanées en un point d’injection. Volume d’injection maximum 0.3 mL/kg. Les 2 injections se font entre 2 et 7 jours d’intervalle. - Prélèvements : Chaque lapin se vera prélever 1mL de sang via la veine marginale (oreille) : avant injection ; 1h après injection et 2h30 après injection. Procédure avec les souris (vigiles) : - Animaux : Les souris seront séparées en 4 groupes de 5 souris - Injections : Chaque souris recevra 2 injections en sous cutanée en un point d’injection. Volume d’injection maximum 10 mL/kg. Les 2 injections se font avec à minima 3 heures d’intervalle. - Prélèvements : Chaque souris se fera prélever environ 150 μL de sang via la voie submandibulaire : 40 minutes après injection. - Après le premier prélèvement une réhydration est effectuée par injection de NaCl (300 μL) en sous cutanée.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour l’animal sont : l’administration répétée des produits pharmaceutiques (2 injections par lapin et 2 injections par souris), prélèvements de sang (6 prélèvements par lapin et 2 prélèvements par souris), l’euthanasie en fin de protocole. Pour la procédure avec les lapins la mise à jeun alimentaire (+/- 14 heures) et hydrique (+/-3 heures) (procédure avec les lapins),

Devenir

Procédure avec les lapins : Les lapins non utilisés pour le test type Insuline pourront être utilisés pour d’autres projets après une période de 3 semaines de repos et si aucun signe clinique anormale est détecté ou être réutilisé pour un projet simialire (dégré de sévérité modéré). Procédure avec les souris : Les souris utilisées seront mises à mort et les souris non utilisées pour le test type Insuline pourront être utilisées pour d’autres projets.

Remplacement

Ce test est réglementaire et rentre dans le cadre de la pharmacopée Américaine et Chinoise. Ce test permet de valider l’activité des médicaments à base d’insuline. Aucun test équivalent sans animaux n’est proposé par la pharmacopée Chinoise. Le test équivalent sans animaux proposé par la pharmacopée Américaine n’est réglementairement accepté que pour certains types d’insuline à libérer (e.g. Insuline Lispro).

Réduction

Le nombre d’animaux à utiliser est fixé par les pharmacopées CH (souris ) et USP (lapins ). Au regard des contraintes opérationnelles liées à l’exécution de ces procédures des animaux supplémentaires peuvent être commandés : 2 lapins en plus et 4 souris en plus. En effet – la pharmacopée CH demande une différence de poids de 3g maximum entre toutes les souris utilisées pour tester un produit à J0. A noter que le transport des souris inhérent à la réalisation de ce test peut leur faire perdre jusqu’à 10% de leur poids à réception. Également, les 2 procédures demandes des timings entre les injections et les prélèvements serrés. En cas d’incident (opérationnel ou sur l’animal), un autre congénère pourra être utilisé. Cela permettra d’éviter le renouvellement d’un test en entier et donc d’éviter d’utiliser plus d’animaux in-fine. Les animaux non utilisés lors de ces procédures pourront être utilisés à des fins de formation ou dans d’autres projets éthiques approuvés.

Raffinement

Lors des essais : - Les animaux sont hébérgés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre d’individus et à l’âge de ceux-ci, - Le milieu d’hébergement sera enrichi avec des moyens adaptés à l’espèce, - Des points limites sont définis et appliqués durant l’étude, - Une observation journalière des animaux est réalisée dès leur réception jusqu’à la fin de l’étude afin de garantir leur bien-être et d’identifier au plus tôt l’apparition de potentiel point limite, - Durant le test les animaux sont surveillés en permanence par les techniciens animaliers - Un poids minimal pour les souris utilisées a été validé avec le vétérinaire - Une réhydratation par injection (300 µL) de NaCl 0,9 % en sous-cutané des souris est effectuée après le premier prélèvement (bien que non demandée par la Pharmacopée CH) - Les prélèvements des souris sont effectués via la voie submandibulaire alors que la pharmacopée CH demande un prélèvement par la voie sinus rétro-orbitale.

Choix des espèces

Les espèces des animaux à utiliser sont fixées par les pharmacopées USP (lapins – procédure 1) et CH (souris – procédure 2). Les critères de sélection des animaux sont : -Lapins (USP) : poids supérieur ou égal à 1.8kg au début du protocole (requis pharmacopée) -Souris (CH) : poids supérieur ou égal à 35g à J0 (décision interne) et 3g maximum d’écart entre les souris (requis pharmacopée)

340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie stéréotaxique d'injection de virus dans le cerveau ou l'implantation d'une canule cérébrale reliée à une minipompe, complétées par un régime gras, des tests métaboliques, un jeûne de 24 heures et des prélèvements sanguins. Le porteur décrit une inflammation post-chirurgicale possible et l'isolement des souris en cage individuelle pour mesurer la prise alimentaire. Il situe l'intérêt du projet dans la recherche de cibles contre l'obésité, notant que ces médicaments sont "particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique", et affirme que cette régulation ne peut s'étudier que chez la souris.

Objectifs

L'homéostasie énergétique se définit comme l'équilibre entre les entrées et les dépenses énergétiques. Les dépenses résultent principalement du métabolisme basal et de l’activité physique, tandis que les apports trouvent leur origine dans l’alimentation. L'organisme doit en permanence recueillir et interpréter des signaux hormonaux, métaboliques et nerveux émis par les tissus périphériques impliqués dans l'utilisation et le stockage de l'énergie (foie, muscle, tissu adipeux). En retour, l'intégration de ces signaux par le cerveau se traduit par la mise en place d'une réponse adaptée au niveau comportemental (manger ou jeûner) et métabolique (production de sucre par le foie et libération de lipides par le tissu adipeux en période de carence, ou bien stockage d'énergie par ces mêmes tissus en période d'abondance). Au niveau du système nerveux central, une région particulière de l'hypothalamus, le noyau arqué (ARC), joue un rôle fondamental dans la signalisation et l'intégration des messages circulants de satiété et de faim. L'ARC contient deux populations neuronales clés dans la régulation du comportement alimentaire : les neurones à Agouti-Related Protein (AgRP) stimulant la prise alimentaire et les neurones à pro-opiomélanocortine (POMC) inhibant la prise alimentaire. Nous avons observé que la prise alimentaire est réduite chez des souris dans lesquelles notre gène d'interêt est invalidé dans les neurones AgRP. Nous voulons maintenant: 1. déterminer les voies de signalisation moléculaires qui sont mises en jeu dans cette population neuronale. 2. Vérifier la réversibilité du phénotype observé chez les souris dont le gène d'intérêt est invalidé. 3. Verifier si la protéine codée par le gène d'intérêt peut être une cible thérapeutique pour le traitement de l'obésité.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de Diabète de Type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établie et de façon encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète à part entière est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Notre étude se concentre sur un rôle potentiel d'un gène d'intérêt dans la régulation neuronale de la prise alimentaire et du comportement alimentaire. Des mutations du gène étudié ont été trouvées dans de nombreuses cohortes de diabétiques DT2. Nos données laissent entrevoir un rôle spécifique de ce gène dans le contrôle de la prise alimentaire, une fonction qui n'a pas été mise en avant jusqu'à présent. Les expériences suggérées sont conçues pour explorer davantage les mécanismes moléculaires reliant notre gène d'intérêt à la prise alimentaire, ce qui sera nécessaire pour déterminer si la protéine codée par ce gène est ou non une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de l'obésité. Par ailleurs, l'utilisation d'inhibiteurs ciblant la famille de notre protéine d'intérêt nous permettra de fournir une première preuve de concept qui déterminera si l'inhibition pharmacologique est effectivement une voie à privilégier. En effet, les médicaments réduisant l'obésité sont particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique, notamment en combinaison avec des médicaments qui agissent pour restaurer la fonction cellulaire. Ainsi, notre approche jettera les bases de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients atteints d'obésité.

Procédures

230 animaux subiront, sous anesthésie générale, une chirurgie stéréotaxique afin d’injecter des adénovirus associés dans une zone particulière du cerveau. La durée de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est 1h – 1h30. Avant et après l'injection de virus, ils seront soumis à des tests métaboliques (1 test par semaine - 4 tests prévus). Pour chaque test ils subiront 4 injections IP (1inj/jour pendant 4 jours - durée 10 sec/inj). 90 souris seront soumises à un régime enrichi en gras qui entrainera une prise de poids. Ces animaux subiront, sous anesthésie générale, l’implantation par chirurgie stereotaxique d’une canule dans une zone particulière du cerveau. La canule est reliée à une minipompe implantée sous la peau du dos au cours de la même chirurgie. 1 semaine avant et 1 mois après la chirurgie, un prélèvement sanguin à la veine temporo mandibulaire (durée : 30-45 sec.) est réalisé sur les animaux vigiles. Par ailleurs, au cours du mois suivant la chirurgie, ces animaux seront soumis à des tests métaboliques (1 test/semaine). Le premier nécessite 1 injection IP ( durée 10 sec) et des prélèvements d’une goutte de sang (2µl - durée 5sec.) à la veine de la queue à des temps post-injection précis. Le 2ième nécessitera 4 injections IP (1 inj/jour - durée 10 sec.)

Impact sur les animaux

La chirurgie stereotaxique est utilisée pour délivrer des vecteurs viraux (adénovirus associés) dans une zone particulière du cerveau. Ces vecteurs permettront l'expression de notre protéine d'intérêt ou de récepteurs particulier dans des populations neuronales spécifiques. La chirurgie pourrait provoquer une réaction inflammatoire locale post-chirurgicale. Différents tests métaboliques sont décrits dans ce projet: Le premier est un test de sensibilité à la ghréline (hormone de la faim) qui, pour habituer les animaux, nécessite une injection IP de NaCl0.9% quotidienne pendant jours sans aucun effet prévu. Le jour du test les animaux subiront une injection IP de ghréline qui stimulera leur appétit. Le deuxième est un test de réalimentation après un jeûne de 24H. L'effet de la mise à jeun sera la stimulation de leur appétit et une perte de poids passagère. Un troisième test est décrit, il s'agit d'un test de tolérance au glucose. Un bolus de glucose est administré par voie IP, ce qui aura pour effet l'élévation de la glycémie (taux de glucose sanguin). La glycémie est mesurée à différents temps pour évaluer la capacité à Les animaux recevront une injection stéréotaxique qui pourra provoquer une inflammation post-chirugie. La procédure pour tester la sensibilité à la ghréline nécessite l'injection quotidienne intrapéritonéale de NaCL 0.9% afin d'habituer les souris avant le jour du test. Le test de réalimentation après un jeûne prolongé nécéssite une mise à jeun des souris pendant 24H. Une diète riche gras pour créer une environement obésogène sera mis en place chez les souris traitées avec l'inhibiteur pharmacologique, ce qui peut creer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisees dans les cages. La tolérance au glucose nécessite l'injection d'un bolus de glucose qui peut entrainer un inconfort chez la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

La régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes complexes ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.

Réduction

Nous utiliserons un total de 340 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs tests métaboliques (avec un temps de récupération adapté pour les animaux) seront réalisées sur les mêmes cohortes de souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Les animaux sont surveillés par le personnel qualifié tous les jours. Le stress lié aux procédures nécéssitant l'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. Aucune douleur ou souffrance n'est attendu dans la plupart des procédures expérimentales utilisées mais l'usage d'anesthésique et d'analgésique sera systématique pour les procédures expérimentales potentiellement douloureuses. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience et les différentes expériences seront réalisées par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les volumes de sang prélevés seront réduits au minimum nécessaire pour les analyses biochimiques et les volumes injectés seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire. Chaque semaine, la prise de poids, la quantité de nourriture sont mesurées permettant ainsi un suivi hebdomadaire des souris. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour réduire tout inconfort ou douleur qui se développerait et des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale. Tout signe de douleur sera pris en charge en prenant les mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé, après avis vétérinaire. Les injections stéréotaxiques seront réalisées par une personne détentrice d'une formation en chirugie et formé spécifiquement à cet acte chirurgical.

Choix des espèces

Dans le domaine du métabolisme, la souris est un modèle animal déjà validé. D’autre part, l’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées dans lesquelles le gène codant pour la protéine CaMK1D est invalidé. Les chirurgies stéréotaxiques concernant l'injection des AAVs seront réalisées chez des animaux âgées de 8 semaines, stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées. Les animaux seront nourris avec de la nourriture riche en gras dès l'âge de 5 semaines afin de favoriser une prise de poids optimale (PE3)