Maladies animales

45 vaches laitières vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réintégrées au troupeau et susceptibles d'être réutilisées. Trente-six d'entre elles reçoivent une injection de lipopolysaccharide dans un quartier de la mamelle pour déclencher une inflammation, en plus de prises de sang répétées, afin de tester des compléments alimentaires censés prévenir les mammites. Le porteur indique que l'injection provoque une fièvre et une mamelle douloureuse de quatre à douze heures, et qu'aucun analgésique n'est administré car il interférerait avec l'inflammation étudiée. Il affirme que la réponse immunitaire doit être évaluée à l'échelle de "l'animal entier", ce qu'aucun système in vitro ne permettrait.

Objectifs

Les mammites sont parmi les maladies les plus fréquentes en élevage bovin laitier. Elles affectent les performances zootechniques et économiques et sont source de mal-être des animaux. La capacité des bovins laitiers à résister à l'établissement de mammites est liée, en partie, à l'efficacité de leur système immunitaire mais également au fonctionnement du tissu mammaire. Par ailleurs, les vaches laitières sont sujettes à un stress oxydant intense au démarrage de la lactation. Le stress oxydant interfère avec le système de défense immunitaire et peut également entrainer des dommages tissulaires au niveau mammaire. Alimenter les vaches laitières avec des extraits de plantes riches en antioxydant et en d’autres principes actifs susceptibles d’agir directement sur le système immunitaire pourrait permettre d’optimiser le statut immunitaire et antioxydant des vaches laitières et ainsi prévenir les mammites, cliniques ou sub-cliniques. Ainsi, les effets de ces extraits de plantes sur les mécanismes impliqués dans la réponse du système immunitaire et le fonctionnement mammaire méritent d’être objectivés pour permettre le développement de ces solutions sur le terrain. L’objectif de cette étude est de déterminer si des extraits de plantes ou un apport de vitamine E peut agir sur le statut immunitaire et antioxydant de la vache laitière en situation d’épreuve inflammatoire en réduisant le stress oxydant et l’inflammation et en améliorant l’intégrité de l’épithélium mammaire. La supplémentation en vitamine E correspond à une stratégie de prévention des mammites dont les effets ont été objectivés dans la littérature et constitue un témoin positif. Les supplémentations en vitamine E et en extrait de plantes seront comparées à un traitement témoin non supplémenté. Les extraits de plante testés ont vocation à être commercialisés en fermes laitières et à ce titre leur usage répond à toutes les réglementations en vigueur garantissant leur innocuité pour les animaux.

Bénéfices attendus

Les mammites sont le fait d’une pathologie courante en élevage laitier, notamment pendant les premières semaines de lactation. C’est aujourd’hui une des premières causes d’usage des antibiotiques dans ces élevages. L’adoption de stratégies alimentaires de prévention des mammites pourrait être un levier, à associer à d’autres, pour réduire le risque de mammites. Cependant, afin de définir les stratégies les plus efficaces possible, leurs effets méritent d’être objectivés. Le présent projet a pour objectif de mettre en évidence les mécanismes par lesquels ces stratégies peuvent favoriser un fonctionnement adéquate du système immunitaire face à une infection. Les bénéfices attendus sont une réponse inflammatoire améliorée avec les suppléments de vitamine E ou extraits de plantes. Cette réponse sera suivie par la mesure dans le lait des marqueurs de l’inflammation notamment la présence de cellules somatiques et le dosage de molécules de l’inflammation dans le sang et le lait. L’épreuve inflammatoire mise en œuvre dans ce projet peut être qualifiée de mécaniste par rapport à des approches épidémiologiques qui pourraient être une alternative. Elle se traduit par l’implication de peu d’individus dans l’objectif de mesurer l’effet des stratégies ciblées sur un mécanisme en amont de la déclaration des mammites (à savoir la réponse immunitaire) avec l’objectif de généraliser ces résultats. Ces travaux pourront permettre de donner de nouvelles recommandations pour une nutrition préventive des vaches laitières en début de lactation. La substitution des traitements antibiotiques par un ensemble de stratégie de prévention répond au concept de gestion intégrée de la santé aussi bien à destination des animaux, notamment en élevage, que des hommes.

Procédures

Durant ce projet, 45 vaches seront soumises à 2 prises de sang au niveau de la veine de la queue avant leur mise-bas. Parmi ces vaches, 36 seront soumises à l'injection d'un composé inflammatoire (lipopolysaccharide) dans un des quartiers de la mammelle en 5ième semaine de lactation et à 4 prises de sang au niveau de la veine jugulaire, une avant l'injection de LPS, les 3 autres, 4h, 28h et 76h après l'injection. En parallèle, des échantillons de lait seront également prélevés par traite partielle avant l’injection puis 0h, 4h, 7h, 10h, 28h, 52h et 76h après l’injection. L’injection de LPS dans un des quartiers de la mamelle des vaches déclenche une réaction inflammatoire aiguë, mais de courte durée, avec un retour en production des animaux dans la semaine qui suit le déclenchement de la réponse inflammatoire.

Impact sur les animaux

Entre quatre semaines avant la date prévue de vêlage et la fin de la 4ième semaine de lactation, les vaches seront conduites de la même façon que les autres vaches de la ferme, à la seule différente de la nature des stratégies de supplémentation destinées à prévenir les mammites. Le traitement ‘sans supplémentation’ se traduira par la non administration de suppléments alimentaires susceptibles d’aider les vaches à prévenir les maladies infectieuses, ce qui donnera lieu à un suivi rapproché afin de détecter précocement tout signe d’infection et de sortir rapidement les animaux de l’essai pour un traitement adapté. Les doses de vitamine E offertes seront toujours inférieures au maximum tolérable et l’extrait de plante utilisé a été évalué en amont de l’essai pour son absence de nocivité pour les vaches. Lors de cet essai, nous observons aussi les conséquences d’une injection d’un composé pro-inflammatoire dans un quartier de la mamelle. L’injection de lipopolysaccharide dans un des quartiers de la mamelle des vaches déclenche une réaction inflammatoire aiguë, mais de courte durée, avec un retour en production des animaux dans la semaine qui suit le déclenchement de la réponse inflammatoire. Compte-tenu des travaux antérieurs et des données de la littérature, l'injection du composé inflammatoire (LPS) induira une inflammation locale de courte durée (plus de signes locaux d'inflammation 12h après injection) accompagnée d’une fièvre de courte durée (pic de température rectale à 8h post-injection et retour à une température normale 12h post-injection). Le quartier injecté sera douloureux à la palpation entre 4h et 12h post-injection. L’état général, l’intensité de l’inflammation locale et la douleur sont évalués à l’aide d’une grille de notation. L’utilisation d’un médicament pour limiter la douleur (analgésique) n ‘est pas possible en raison de son impact sur le déroulement de l’inflammation. Les animaux seront par ailleurs suivis de près pour détecter dans les jours qui suivent tout cas de pathologie autre que cette injection pourrait masquer. Enfin, les animaux seront soumis à des prélèvements sur animaux vigils. Les prises de sang ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à la contention lors de la distribution des aliments. La douleur causée par l’aiguille ne nécessite pas d’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront réintégrés dans le troupeau des vaches laitières de la ferme expérimentale pour retrouver une vie de vache laitière similaire à celles que l’on peut trouver dans les troupeaux laitiers expérimentaux. Ces animaux sont donc susceptibles d’être réutilisés pour d’autres projets expérimentaux.

Remplacement

Même si des premières études sur cellules en culture ont permis de réaliser une première sélection des extraits de plantes susceptibles de moduler favorablement la réponse immunitaire et dont l’usage en ferme pourrait être envisagé, il n’est pas possible de remplacer entièrement l’utilisation d’animaux pour définir les modes d’actions des extraits de plantes. En particulier, l’amélioration de la réponse immunitaire et du statut antioxydant doit être évalués à l’échelle de l’animal entier afin de prendre en compte à la fois les régulations cellulaires mais aussi systémiques de ces réponses. La méthode proposée permet l'évaluation globale des premières étapes de la réponse au niveau de l’animal entier et permet de ré-introduire les animaux en élevage et donc de les garder en vie.

Réduction

L’objectif est de disposer de résultats sur 12 animaux par stratégie testée. Ce nombre a été évalué pour disposer d’une puissance statistique suffisante compte-tenu que chaque lot de vache ne recevra qu’un des trois traitements au cours de l’expérimentation. L’objectif est de disposer de suffisamment d’animaux pouvant détecter une différence entre les groupes en fonction des traitements et des réponses analysées. L’épreuve inflammatoire nécessitant de disposer d’animaux répondant à deux conditions qui sont difficiles à anticiper, des animaux de réserves (3 par stratégie) vont devoir être inclus. Les deux conditions sont de disposer au moment de l’épreuve de vaches à un même stade de lactation et ayant au moins un quartier de la mamelle avec un très bon niveau sanitaire constaté par une concentration faible de cellules somatiques dans le lait. Selon les dates effectives de vêlage et les résultats d’analyses de lait avant l’épreuve inflammatoire, certaines vaches pourront être remplacées par ces vaches de réserve pour l’épreuve inflammatoire. Des résultats expérimentaux passés permettent d'évaluer que 3 animaux de réserve par stratégie seront suffisants. Au final, le nombre d’animaux impliqués sera donc de 45, dont au maximum 36 seront soumis à l’épreuve. Les données seront analysées par analyse de variance en modèle mixte à l’aide du logiciel R. Nous étudierons l'effet des traitements en mesures répétées avec analyse de l’effet du temps et prise en compte de la vache en effet aléatoire.

Raffinement

La conduite d’élevage sera respectueuse du bien-être des animaux. Un suivi régulier du comportement et des paramètres indicateurs de la souffrance des animaux (fièvre supérieure à 40°C, animal couché faible, et les œdèmes de la mamelle qui engendre une sensibilité importante) sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de perturbations et traiter si besoin les animaux malades. Les parties du protocole pouvant entraîner de la souffrance chez les animaux sont clairement identifiées (prise de sang et épreuve inflammatoire). Le traitement visant à induire une inflammation dans un quartier de la mamelle est suivi d’une réponse inflammatoire de courte durée avec un retour en production des animaux dans la semaine qui suit le déclenchement de la réponse inflammatoire. L’utilisation d’un composé non infectieux pour le déclenchement de l’inflammation réduit l’intensité de cette inflammation. De plus, contrairement à une infection expérimentale, ce protocole permet de garder les animaux en vie tout en permettant de mimer les premières étapes d’une mammite. Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à être contentionnés lors de la distribution des aliments. A la fin de l’essai tous les animaux réintègreront le troupeau de la ferme.

Choix des espèces

La problématique de l’étude, assez spécifique aux vaches laitières, nécessitera de travailler avec cette espèce. Les vaches seront de race Prim’ Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. L’incidence des mammites étant la plus forte et de façon nette en début de lactation, de même que le stress oxydatif, les vaches impliquées seront majoritairement en début de lactation.

3 000 micromammifères sauvages vont être capturés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés sur leur lieu de capture. Sur chaque animal vigile le porteur prélève du sang dans le sinus rétro-orbitaire, une biopsie d'oreille et des tiques, en moins de cinq minutes. Il indique un taux de mortalité de 1 à 2 % lors des captures, par hypothermie, choc cardiaque ou prédation dans les pièges. Le projet suit sur quinze à vingt ans l'exposition de ces rongeurs aux agents transmis par les tiques, dont la bactérie de la maladie de Lyme, et le porteur affirme que le remplacement ne peut être envisagé.

Objectifs

Les micrommamifères sauvages sont réservoirs de nombreux agents pathogènes transmis par les tiques qui peuvent entraîner des maladies chez l'homme, dont la borréliose de Lyme, l'encéphalite à tique (appelée aussi TBE), l’anaplasmose granulocytaire, la rickettsiose ou la neoerhlichiose. La densité de tiques infectées par ces différents agents pathogènes présente dans l’environnement est généralement utilisée comme une approximation du risque d’expositition de l’homme vis-à-vis de ces agents pathogènes. Elle varie en fonction de la saison et des années, en lien avec les variations des conditions météorologiques et des populations des hôtes. Très peu d’études de terrain ont été réalisées sur du long terme pour étudier les variations temporelles de la densité de tiques infectées par les différents agents infectieux et comprendre l’influence respective des conditions météorologiques et de la dynamique intra- et inter-annuelle des populations de micromammifères sur les densités de tiques infectées et donc sur le risque d’exposition à l’homme vis-à-vis de ces agents infectieux. L’objectif du projet est de réaliser un suivi long terme des populations de rongeurs (par espèce), de leur infestation par les tiques, de leur exposition aux agents infectieux étudiés et de la densité de tiques infectées par ces agents infectieux afin (i) d’étudier l’influence des conditions météorologiques et des densités de rongeurs sur les variations inter-annuelles de densités de tiques infectées et (ii) de modéliser le risque de contact et de transmission de l’Homme vis-à-vis de ces agents infectieux.

Bénéfices attendus

L’objectif long terme de ce projet est de déterminer l’influence respective des facteurs météorologiques et de densités de micrommamifères sur les variations inter-annuelles des densités de tiques infectées par différents agents infectieux d’intérêts afin de mieux prédire le risque d’exposition de l’Homme, en particulier pour Borrelia burgdorferi sl. (bactéries responsables de la maladie de Lyme). A moyen terme, il est prévu que les données collectées soit utilisées pour paramétrer un modèle mathématique de la transmission de Borrelia burgdorferi sl. à l’Homme. De plus, les données collectées permettront également d’apporter plus d’informations sur l’épidémiologie d’agents infectieux pour lesquelles les données existantes sont faibles (Anaplasma phagocytophilum, Rickettsia spp., Neoerhlichia mikurensis, TBEV), si ceux-ci sont présents dans la zone étudiée.

Procédures

Chaque animal, une fois par session, est immobilisé entre deux doigts au niveau de la nuque. Les prélèvements suivants sont réalisés sur animaux vigiles : prise de sang effectuée dans le sinus rétro-orbitaire, une biopsie de peaux d’oreille, prélèvements de tiques et identification par une puce. Le temps de manipulation n’excède pas 5 minutes, et l’animal est relaché au plus vite dans le milieu naturel sur son lieu de capture.

Impact sur les animaux

Les animaux sont soumis à un certain stress lors de la capture et de la manipulation (pesée, marquage, prise de sang rétro-orbital, biopsie, collecte de tiques). Pour limiter ce stress, la durée maximale de manipulation n’excèdera pas 5 minutes et les manipulateurs sont attentifs à la détection de points limites. Les animaux sont manipulés dans la matinée et sont relachés le plus rapidement possible sur leur domaine vitale grace à un quadrillage précis de la zone d’étude. Dans nos expériences précédentes de piégeage par méthode de capture-marquage-recapture, il est fréquent que des animaux soient recapturés trois nuits consécutives lors d’une même session de capture et durant plusieurs sessions, ce qui peut indiquer que la manipulation et les prélèvements réalisés n’ont pas induit d’effets négatifs à long terme sur certains individus. Un faible taux de mortalité (1-2%) lors des captures est généralement observé. La mortalité peut être liée à de l’hypothermie, un choc cardiaque lors de la manipulation et très ponctuellement à de la prédation dans les pièges par des martres ou fouines.

Devenir

Les animaux sont relachés sur leurs lieux de capture, dans le milieu naturel

Remplacement

Le but étant d’étudier la circulation des agents pathogènes au sein des populations de micromammifères dans leur milieu naturel pour mieux comprendre leur épidémiologie et le risque d’exposition pour l’Homme, le remplacement ne peut-être envisagé pour ce type de projet.

Réduction

Nous avons choisi de piéger sur trois sites différents distants de 1.5-2.5 km afin d’avoir trois réplicats au même moment. L’objectif est de réaliser ce suivi sur du très long terme (15-20 ans) sur ces trois sites afin d’avoir suffisamment de données pour l’analyse et mettre en évidence certains effets. Le nombre de pièges par site (100 par site), correspondant à un nombre attendu d’individu capturés variant de 30 à 300 individus pour une session selon les années de pullulations de micromammifères, a été défini afin d’avoir suffisamment de rongeurs capturés pour estimer leur exposition aux agents infectieux et leur infestation par les tiques au regard des contraintes matérielles et avec suffisammement de précision au moins pendant les phases de pullulation de rongeurs. Le nombre d’animaux maximum pour lesquels des prélèvements seront réalisés par session de capture est fixé à 300, nombre suffisant pour répondre aux objectifs de l’étude. Il permettra d’estimer des niveaux d’infestation par les tiques et des prévalences d’infection avec des précisions de 2 à 5% pour des prévalence d’infection attendues variant entre 5 et 30%.

Raffinement

Les animaux sont capturés la nuit par des pièges qui permettent de les maintenir à l’abri des intempéries et nous mettons à disposition des carottes et des graines de tournesol permettant un apport d’énergie (graines de tournesol) et d’eau (carottes) aux animaux capturés. Quand les animaux sont sortis des pièges, ils sont mis dans des gants de fouille (un individu par gant). Du papier est ajouté dans ces gants pour que les animaux puissent se blotir dedans et pour permettre d’absorber l’humidité (urines, …), de maintenir la température des animaux et de réduire leurs stress. Les animaux sont manipulés et relachés le plus rapidement possible sur leur domaine vitale grace à un quadrillage précis de la zone d’étude. Si les animaux sont capturés plusieurs fois au sein d’une même session, ils ne sont prélevés qu’une fois au sein d’une même session.

Choix des espèces

Cette demande porte sur l’étude dans le milieu naturel de la circulation des agents pathogènes vectorisés par les tiques au sein des populations de micromammifères. Le stade de développement influence le niveau d’infestation des tiques et le statut d’infection, et pour en tenir compte dans l’analyse à l’échelle individuelle et populationnelle, les animaux de tous les stades de développement seront étudiés.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

18 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Douze sont infectés par un coronavirus respiratoire porcin par voie trachéale, puis subissent des lavages broncho-alvéolaires sous anesthésie et des écouvillonnages nasaux et rectaux répétés, six autres servant de témoins. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une hyperthermie, des troubles respiratoires et une baisse d'appétit, sans signes sévères attendus. Il retient le porc comme "espèce cible" du virus et prévoit aussi de récolter des sérums pour produire des réactifs de diagnostic.

Objectifs

Le coronavirus respiratoire porcin (ou PRCV pour porcine respiratory coronavirus) a été isolé pour la première fois en Belgique dans un élevage porcin en 1984 et s’est répandu massivement au sein des élevages européens, puis dans le reste du monde. Les premières études menées sur cet Alphacoronavirus ont montré qu’il était issu du virus de la gastro-entérite transmissible (GET) suite à des modifications génétiques lui permettant d’infecter les voies respiratoires alors que le virus de la GET ciblait les voies intestinales. Le PRCV entraîne généralement des signes cliniques respiratoires modérés mais il peut entraîner une atteinte respiratoire plus complexe, notamment quand il est associé au virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin ou au virus influenza A porcin. Des investigations menées récemment dans des élevages français où les porcs présentaient un syndrome respiratoire ont permis d’isoler de nouvelles souches du PRCV. Leurs génomes présentent quelques différences avec ceux des souches isolées dans les années 80-90 et les premières études menées in vitro indiquent que certains de ces virus se multiplient efficacement dans des cellules de trachée de porc alors que d’autres n’y parviennent pas. L’étude expérimentale proposée a pour objectif de mesurer et de comparer les manifestations cliniques, les voies d’excrétion virale et les réponses immunitaires de porcs infectés soit par une souche de PRCV se multipliant en cellules de trachée (souche A), soit par une souche de PRCV ne se multipliant pas dans ces cellules (souche B). Des sérums seront également collectés en fin de procédure afin de disposer de nouveaux réactifs pour le diagnostic sérologique. Pour cela, 6 porcs seront inoculés par la souche A du PRCV, 6 porcs seront inoculés par la souche B du PRCV et 6 autres porcs recevront du milieu de culture et serviront de témoins. Dans un souci de raffinement, un soin particulier sera apporté au suivi clinique de chaque animal au quotidien. En cas d’altération importante de l’état de santé (modification sévère de la température corporelle ou perte de poids anormalement élevée par exemple), les animaux concernés seront mis à mort après anesthésie.

Bénéfices attendus

Les données collectées permettront d’actualiser le modèle expérimental d’infection par le PRCV et d’acquérir de nouvelles connaissances quant au pouvoir pathogène de souches récemment isolées en élevage, en lien avec leurs caractéristiques génétiques et leurs propriétés fonctionnelles évaluées in vitro par ailleurs. De plus ce projet permettra d’évaluer les différentes voies d’excretion du virus et de produire des réactifs biologiques nécessaires au diagnostique sérologique.

Procédures

Les animaux (n=18) recevront du virus PRCV par voie trachéale (n=12) ou du milieu de culture par voie trachéale (n=6). Les porcs inoculés par du virus seront soumis à : 1/ quatre lavages broncho-alvéolaires sous anesthésie générale de courte durée (

Impact sur les animaux

L’infection par le PRCV peut provoquer une hyperthermie transitoire, des troubles respiratoires et une baisse d’appétit dans les jours suivant l’infection. Il n’est pas attendu de signes cliniques sévères lors de cette expérimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour pouvoir récolter des prélèvements de poumons

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer/comparer les manifestations cliniques, l’excrétion virale et les réponses immunitaires de l’hôte naturel, après infection par deux souches de PRCV présentant des phénotypes différents in vitro. Ceci nécessite donc de passer par des expériences sur l’animal vivant.

Réduction

Il est nécessaire d’avoir 3 lots d’animaux au total pour répondre aux objectifs qui sont d’étudier et de comparer les manifestations cliniques, la multiplication/l’excrétion virale et les réponses immunitaires des porcs infectés par une souche de PRCV qui se multiplie in vitro sur cellules de trachée (souche A) versus une souche de PRCV qui ne se multiplie pas in vitro sur cellules de trachée (souche B): 1 lot inoculé par la souche A de PRCV, 1 lot inoculé par la souche B de PRCV et 1 lot inoculé par du milieu de culture (témoin). Les lots seront constitués chacun de 6 porcs. Cet effectif est le minimum nécessaire par groupe pour des analyses statistiques robustes compte tenu de la variabilité individuelle attendue sur les paramètres mesurés (croissance, virémie, réponses immunes, etc.).

Raffinement

Pendant tout l’essai, les animaux feront l’objet d’un examen clinique quotidien au cours d’une visite dans les animaleries et l’évolution pondérale sera suivie par des pesées individuelles quotidiennes, à partir du jour de l’inoculation jusqu’à J+4 post-inoculation, puis hebdomadaires jusqu’à la fin de la procédure expérimentale. La consommation alimentaire sera mesurée chaque semaine. Afin de diminuer la douleur pouvant être liée aux prélèvements : - les écouvillonnages répétés tous les 2 jours seront réalisés alternativement dans la narine droite puis la narine gauche afin de limiter l’irritation/lésion de la zone de prélèvement. - les prélèvements seront réalisés autant que de possible sans contention des animaux au lasso.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du Coronavirus respiratoire porcin. Les animaux seront sevrés à 4 semaines d’âge et auront 7 semaines pour s’acclimater à leur lieu d’hébergement avant le début de la procédure. Tous les animaux seront inoculés à 12 semaines d’âge. Cet âge correspond à un moment où le système immunitaire est considéré comme mature.

8 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans mise à mort, toutes réintégrant ensuite le troupeau. On leur injecte dans un quartier de la mamelle un composé inflammatoire qui provoque une fièvre brève et une douleur à la palpation entre quatre et douze heures, avec des prélèvements de lait et de sang. Le porteur indique qu'aucun analgésique n'est administré car il fausserait l'inflammation étudiée. Il affirme que cette approche évite une infection bactérienne expérimentale qui condamnerait les animaux à l'équarrissage.

Objectifs

Ce protocole s’inscrit dans le cadre de travaux visant à améliorer la résistance des animaux aux mammites, ces dernières représentant une des maladies majeures à ce jour en élevage bovin. Notre but est de mieux connaître les globules blancs, et plus particulièrement les neutrophiles qui ont un rôle essentiel dans la défense des vaches contre les mammites. Les neutrophiles sont les premières cellules immunitaires à arriver sur le site de l'inflammation mammaire lors des mammites bovines, d’où l’importance de la connaissance précise de ces cellules. Parmi les globules blancs des bovins, ces neutrophiles se répartissent en deux sous-groupes, chacun possédant des propriétés spécifiques soit d'activation ou de diminution de la réponse inflammatoire. L'objet de la présente demande est de nous permettre de caractériser finement les neutrophiles de la glande mammaires lors d'une inflammation et d’étudier comment les proportions et les activités biologiques respectives de différents types de neutrophiles évoluent, à la fois dans le sang et dans le lait, lors d'une inflammation mammaire.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans une démarche d’amélioration de la résistance des vaches laitières aux mammites. Il contribuera à une meilleure connaissance des neutrophiles recrutés dans le lait lors d'une inflammation et de leur rôle dans le contrôle de cette inflammation. Les données préalables recueillies dans le cadre du projet Masticells suggèrent que la proportion des neutrophiles régulateurs parmi les neutrophiles du lait à différents temps après déclenchement d'une mammite sont variables. Ces neutrophiles régulateurs ayant des capacités de modulation de la réponse immunitaire de l'hôte, ils pourraient intervenir dans les processus de contrôle de l'inflammation et potentiellement de réparation tissulaire après inflammation. A termes, cette meilleure caractérisation des neutrophiles du lait pourrait être introduite dans les critères d’amélioration génétique de la résistance des vaches laitières aux mammites.

Procédures

Une inflammation mammaire sera induite par injection, via le canal du trayon, d'un composé inducteur d'inflammation dans un des 4 quartiers de la glande mammaire des 8 vaches recrutées. Des prélèvements de lait (2x40ml) et de sang (à la jugulaire) sont prévus à 4 temps (t=0h, 4h, 72h et 144h post-injection de LPS).

Impact sur les animaux

Compte-tenu des travaux antérieurs et des données de la littérature, l'injection du composé inflammatoire (LPS) induira une inflammation locale de courte durée (plus de signes locaux d'inflammation 12h après injection) accompagnée d’une fièvre de courte durée (pic de température rectale à 8h post-injection et retour à une température normale 12h post-injection). Le quartier injecté est douloureux à la palpation entre 4h et 12h post-injection. L’état général, l’intensité de l’inflammation locale et la douleur sont évalués à l’aide d’une grille de notation. L’utilisation d’un médicament pour limiter la douleur (analgésique) n ‘est pas possible en raison de son impact sur le déroulement de l’inflammation. Les prises de sang ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à la contention lors de la distribution des aliments. La douleur causée par l’aiguille ne nécessite pas d’anesthésie.

Devenir

Les animaux réintègreront le troupeau de l’unité expérimentale sur décision de la personne responsable du bien-être des animaux. La réponse inflammatoire consécutive à l'injection de LPS est de courte durée. Ce traitement n’engendre classiquement que peu d’inconfort et, par ailleurs, les animaux seront dans tous les cas soignés en cas de pathologie.

Remplacement

Les informations collectées lors de ce protocole porteront sur l'espèce concernée par les mammites (vache). L'approche proposée permet de remplacer une infection bactérienne expérimentale qui condamnerait les animaux à l'équarissage. Cette méthode alternative permet l'évaluation globale des premières étapes de la réponse au niveau de l’animal entier. Il n'existe pas, à l'heure actuelle, de modèle in vitro permettant de reproduire le recrutement des neutrophiles sanguins dans la glande mammaire suite à une infection mammaire.

Réduction

Huit vaches laitières en lactation seront incluses dans le projet. Ce nombre permet d'obtenir une valeur médiane des proportions de neutrophiles régulateurs dans le lait lors d'une inflammation mammaire. Nous comparerons l'évolution de ce pourcentage à différents points au cours de l'inflammation (t=4h, t=72h, t=144h). Les proportions des neutrophiles régulateurs aux différents temps seront analysées statistiquement par des approches de statistiques adaptées aux petits échantillons. Ce nombre a été déterminé pour satisfaire une condition de validité du test statistique qui sera utilisé (effectif d'au moins 5 animaux) et prendre en compte la possibilité d'une non-réponse de certains animaux (situation rencontrée lors de tests précédents à une fréquence de 5%). La capacité maximale de l'installation est de 8 animaux traités simultanément. Ce nombre d'animaux permettra de traiter tous les animaux en une seule série et ainsi contrôler des variations qui auraient été liées à plusieurs séries espacées dans le temps. Les variables contrôlées seront la race des animaux et le stade de lactation : les animaux seront de la même race (Prim'Holstein) et seront en milieu de lactation (entre 3 et 7 mois).

Raffinement

L’utilisation d’un composé non infectieux pour le déclenchement de l’inflammation réduit l’intensité et la durée de l’inflammation et permet de mimer les premières étapes d’une vraie infection. Les animaux seront gardés à proximité des bâtiments le jour de l’injection afin de pouvoir les surveiller de façon suivie. Tout signe d’une dégradation de l’état de santé d’un des animaux entraînera l’intervention du vétérinaire praticien de l’unité. Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à être pris au cornadis pour la distribution des aliments. Elles sont réalisées par du personnel expérimenté. La douleur causée par l’aiguille ne nécessite pas d’anesthésie.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée est le bovin. Il s’agit de vaches laitières de race Prim’Holstein en lactation. Les travaux sont réalisés sur la vache laitière car c'est une des espèces sujette aux mammites. Ces animaux ne sont pas transgéniques et ont été obtenus par des méthodes de reproduction utilisées en élevage classique. Il s'agit de vaches adultes (âgées de 3 à 6 ans) en lactation (stade de lactation entre 3 et 7 mois) non mises en reproduction.