Maladies animales

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit quatre injections d'antigène avec adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund, suivies de prélèvements sanguins et de la mise à mort pour prélever la rate et produire des anticorps monoclonaux. Il indique que ces immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Sur le remplacement, il affirme que l'immunisation animale reste la "méthode de référence" et présente le recours in vivo comme "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Le but du projet est d’assurer la production d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Pour répondre à ce besoin, il est pertinent de mettre en œuvre la méthode de référence, qui consiste à réaliser une fusion cellulaire entre un lymphocyte B et un myélome de souris.

Bénéfices attendus

Les anticorps monoclonaux (AcM) ont permis le développement de remarquables outils de recherche fondamentale, de diagnostic et plus récemment d’agents thérapeutiques. En recherche fondamentale, les AcM représentent des outils essentiels, en biochimie et en histologie pour la réalisation d’immunomarquages (immunohistochimie/ immunofluorescence) permettant la mise en évidence d’antigènes d’intérêts au sein d’un tissu, en biochimie dans des applications de type ELISA ou immunoprécipitation, et en biologie moléculaire pour la révélation de Western Blot. Dans le cadre du diagnostic, les tests de grossesse reposent classiquement sur la capacité d’AcM à détecter la présence de l’hormone Gonadotrophine Chorionique humaine (hCG), une glycoprotéine produite par le placenta. Les AcM sont également essentiels pour le diagnostic de différentes pathologies oncologiques et infectieuses. Les AcM demeurent aujourd’hui les outils de diagnostic tissulaire les plus performants. En parallèle de leur utilisation diagnostique, les développements menés depuis une quarantaine d’années ont abouti à la production de plus d’une vingtaine d’AcM à visée thérapeutique disposant d’une autorisation de mise sur le marché pour diverses applications, dont le domaine de l’oncologie et des maladies inflammatoires. L’ensemble de ces éléments permettent de justifier la pertinence de pouvoir assurer le développement d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées, travaillant sur des approches fondamentales ou appliquées (diagnostic/ thérapeutique).

Procédures

4 injections seront réalisées : J00 (IP ou SC en ACF), J07 (AIF en SC ou IP), J14 (AIF en IM ou IP) et J21 une injection en intraveineuse sans adjuvant. Des prélèvements seront effectuée sur animaux vigiles : un pré-immun (qui sera le témoin négatif), un à J14 (suivi immunitaire) et J24 (jour de sacrifice de la souris). Injection IP/ SC ou IM, 30 sec pour la contention qui change à chaque point d’injection effectué + 30 secondes d’injection par point d’injection + 30 secondes de massage de la zone injectée, avec injections en 1, 2 ou 4 points suivant le type d’injection (IP, IM ou SC). Injection intraveineuse : 2 à 3 minutes de contention pour la dilation des veines caudales et 1 minute pour l’IV (l’injection en tant que telle ne prend que quelques secondes), mais la réalisation du geste technique (mise en place, maintien de la queue à demande de maintenir l’animal calme pendant 1 minute environ) Prélèvements, maintien de la souris et prélèvement 5 minutes

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles au niveau de la veine sous-mandibulaire afin de remplacer le prélèvement en rétro-orbitaire.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, les souris ne peuvent pas être réutilisées pour d’autres protocoles, elles sont donc toutes euthanasiées en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcM reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. Toutefois l’isolement de la rate des souris immunisées, afin d’en isoler les plasmocytes sécrétant les anticorps et de les fusionner à des cellules immortalisées, aboutira à l’obtention d’hybridomes permettant la production d’anticorps in vitro sans avoir de nouveau à immuniser un animal.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 souris par protéine immunisée) est adapté au plus juste par rapport à la faible quantité d’antigène. Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d’éviter la variabilité interindividuelle

Raffinement

Raffiner : Les souris sont hébergées dans des cages adaptées, proposant des objets d’enrichissement (abri, coton pour fabrication de nid) permettant de stimuler l’activité des animaux et de maintenir leur sociabilisation. Un contrôle des animaux et des sites d’injection est réalisé chaque jour. Cette observation quotidienne par un personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

La souris est l'animal référent pour l'obtention d'AcM. Les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques des souris immunisées contiennent des cellules lymphocytaires sécrétant des anticorps contre l'antigène d'intérêt. Ces lymphocytes fusionnés avec des cellules de myélome issues de souris, permettent d'obtenir des AcM dirigés contre l'antigène d'intérêt. Le protocole nécessite des jeunes adultes immunocompétents de 6 à 8 semaines au moment de la première injection, afin d'obtenir une bonne réponse immunitaire. Par conséquent, les souris sont reçues à l’âge de cinq semaines. Elles sont mises pendant une semaine en quarantaine dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation avant le début du protocole

150 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections sous-cutanées d'antigène associé à un adjuvant et trois prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus comme réactifs à des équipes de recherche. Le porteur indique que les immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et que le recours à l'animal vivant reste "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces immunoglobulines constituent des ressources largement utilisées dans des applications analytiques et thérapeutiques. Les AcP sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ils trouvent des applications en biologie et en biochimie, en tant que ligand de colonne d’immunoaffinité. Ils possèdent également de nombreux emplois en recherche tel que la détection de molécules dans les essais du type enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), les révélations de Western Blot, les procédures immunohistochimiques et d'immunoprécipitation, en immunofluoromicroscopie et en immunoélectromicroscopie. Notre processus de production assure la production d’AcP pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les antisérums sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps ; lorsque le titre est suffisamment élevé, on prépare un antisérum en effectuant une prise de sang suivie de l'isolement du sérum puis, si nécessaire, de la purification des anticorps à partir du sérum

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux (AcP) seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. Les anticorps développés de cobaye dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe. L’utilisation du cobaye interviendra dans des projets particuliers pour lesquels, cette espèce présente un avantage par rapport à d’autres. En effet, les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Le cobaye étant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, il permet l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où les cobayes ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins.

Procédures

Six injections aux cobayes en sous-cutané de l’antigène associé à un adjuvant. Trois prélèvements sanguins seront réalisés, au niveau de la veine saphène sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné). Injection sous-cutanée : 8 minutes dont 4 minutes pour prendre avec délicatesse l’animal, le rassurer et le préparer, 30 secondes par injection et 30 secondes pour masser la zone injectée (4 injections), c’est-à-dire 4 min. Prélèvement : l’endormissement sous anesthésie gazeuse prend 10 minutes pour être effective. Le prélèvement sous anesthésie au masque est réalisé pendant 3 à 4 minutes. Le réveil de l’animal prend 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 cobayes par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Raffiner : L’environnement des cobayes est enrichi pour améliorer leur bien-être (tunnel de jeu, friandises, foin, jouets,…). Les animaux seront particulièrement suivis pendant les 24h suivant les injections, puis quotidiennement pour examiner leur état de santé. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Les prélèvements réalisés, sous anesthésie, concerneront de faibles volumes afin de ne pas induire de souffrance chez l’animal. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

Les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Etant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, ils permettent l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où ils ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins. Ils permettent également l’obtention d’anticorps ayant une forte capacité à fixer le système du complément. Ils permettent en comparaison des souris de Réduire le nombre d’animaux engagés dans chaque protocole à 3 individus. La production d’anticorps chez le cobaye nécessite de faibles doses d’antigène. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les cobayes entreront en protocole à l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine d’une semaine, sans incident durant ce temps, ils seront aptes à rentrer en protocole.

45 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gardés vivants ensuite pour une éventuelle réutilisation ou un placement. Leur peau est lésée avec un adhésif puis exposée à un allergène pour déclencher une dermatite de contact, avec jusqu'à huit biopsies cutanées par animal sous anesthésie locale, dans le but de tester des traitements de la dermatite atopique canine. Le porteur héberge une partie des chiens en cage individuelle quelques jours et revendique un modèle applicable "rapidement sur le terrain". Il affirme que la maladie met en jeu des réactions impossibles à reproduire sur peau artificielle et justifie le recours à l'animal par l'observation des effets sur un "organisme entier".

Objectifs

dermatite de contact est une maladie inflammatoire qui représente 1 à 10% des maladies de peau chez le chien. C’est une maladie qui est responsable d’abandons ou euthanasies. Une molécule étrangère traverse la peau et entre en contact avec les cellules de Langerhans. Ces cellules, après avoir phagocyté la molécule, vont présenter l’antigène aux lymphocytes T helper. Ces lymphocytes T activés produisent des interleukines qui induisent la prolifération des lymphocytes T spécifiques, effecteurs et mémoires, qui circulent alors dans tout le corps. Lors d’un second contact avec la molécule étrangère, les cellules de Langerhans activent les lymphocytes T se trouvant au point d’entrée de la molécule étrangère ce qui déclenche l’inflammation. L’objectif de ce projet consiste à : - Induire plusieurs modèles de dermatite de contact par allergie à un allergène chez le chien - Evaluer l’allergie de contact par un ensemble de critères afin de mieux comprendre l’allergie et de pouvoir la caractériser d’un point de vue physiologique et clinique. - Evaluer différents traitements innovants

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet de disposer d'un modèle pour étudier des médicaments de traitement de la dermatite atopique du chien.

Procédures

Nous réalisons une application d'un allergène sur la peau après avoir lésé la peau avec un adhésif type scotch. Ensuite, une fois le chien sensibilité, nous appliquons à nouveau l'allergène sur la peau lésée en un autre endroit et évaluon la réactions allergique locale. Pour suivre la réactions cutantée nous réalisons des biopsies cutanées de 6-8mm à raison d'un maximum de 8 biopsiées sur la totalité du protocole par chien, sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour le chiens sont : l'hébergement temporairement en cage individuelle, mais limité à quelques jours suivant l'application des haptènes, ainsi que les biopsies cutanées sous anesthésie locale (maximum de 8 biopsies par procédures)

Devenir

0Les chiens sont conservés pour une éventuelle réutilisation ou ils pourront ensuite être placés.

Remplacement

La dermatite de contact par allergie est une affection complexe. Cette maladie met en jeu des réactions locales et systémiques qui ne peuvent être reproduites sur peau artificielle ou par toute autre technique de substitution. Il est, donc, nécessaire, pour la mise en place et l’évaluation de traitements innovants, de disposer d’un modèle animal en vu d’un traitement chez le chien, voire chez l’homme. Le fait d’utiliser des animaux permet d’observer les effets de la maladie sur un organisme entier.

Réduction

Nous utiisons le nombre minimum nécessaire de chiens pour avoir des indications applicables rapidement sur le terrain. Avec 4 à 5 animaux par haptène et par traitement, nous pouvons orienter le choix d'un traitement.

Raffinement

La procédure est peu invasive. Les contraintes sontlimitées. La plupart du temps, les chiens sont hébergés en groupes sociaux, avec un enrichissement adapté et l'accès à l'extérieur. Les procédures sont réalisées par des vétérinaires spécialisés en dermatologie. L'hébergement et les soins quotidiens sont assurés par une équipe formée au suivi des chiens et à la détection des signes d'inconfort. Les chiens peuvent ensuite être réutilisés voire placés.

Choix des espèces

Le chien est la seul espèce animale qui présente une dermatite de contact aux protéines semblable à celle de l’homme sur le plan clinique et pathogénique. C’est également une maladie fréquente avec des formes graves. L’utilisation de chiens permettra, d’une part, d’approfondir les connaissances sur la dermatite de contact et ainsi de pourvoir explorer le rôle de l’allergène dans le déclenchement ou l’aggravation de la maladie et, d’autre part, de tester un traitement basé sur l’application de micro ou nanoparticules. Adultes, car l'étude de l'allergie nécessite un système immunitaire mature.

2 220 souris et 2 220 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le diabète leur est provoqué par injection de streptozotocine, qui détruit le pancréas, pour reproduire une rétinopathie et une atteinte de la cornée, avec examens oculaires sous anesthésie et désépithélisation cornéenne. Le porteur décrit une soif et des urines accrues, une perte de tonus et un poids réduit, les rats malades ne pesant après un mois que 50 à 60 % du poids des rats témoins. L'objectif affiché est de mettre au point un "modèle expérimental" pour tester de futurs traitements, le recours à l'animal étant présenté comme "nécessaire" faute de pouvoir mimer la maladie autrement.

Objectifs

L’objectif du projet est la mise en place, au sein de l’établissement utilisateur, d’un modèle expérimental de rétinopathie diabétique et également d’un modèle de cicatrisation cornéenne chez le rat ou la souris afin de tester l'efficacité de traitements potentiels. La rétinopathie diabétique est une complication du diabète qui atteint l'oeil au niveau de la rétine et serait la première cause de cécité avant 65 ans. Le taux élevé de sucre dans le sang entraine une détérioration des capillaires sanguins de la rétine. Ils perdent leur étanchéité conduisant à des hémorragies et des exsudats, lésant la rétine. La maladie peut évoluer vers une rétinopathie proliférative avec production anormale de nouveaux vaisseaux peu fonctionnels, des décollements de la rétine et des saignements dans le vitré. Un oedème au niveau de la macula, zone de la rétine responsable de la bonne acuité visuelle, peut survenir à tout moment et entrainer la perte de la vision. Le diabète est également responsable d’une dégradation de la cornée, le tissu transparent en avant de l’oeil, il ralentit notamment la cicatrisation cornéenne en cas de blessure, causant l’apparition d’opacités qui altèrent la vision.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements des complications du diabète au niveau de la rétine et de la cornée qui sont invalidantes pour les patients et peuvent aboutir à la cécité. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et preserver au mieux la visions des patients.

Procédures

L’induction du diabète chez les rats et les souris se fait par injection intrapéritoneale de streptozotocine. Le taux de glycémie sera contrôlé sur bandelette une à deux fois dans l'étude par le prélèvement d'une goutte de sang à la queue de l'animal. Les examens ophtalmologiques qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Pour la partie sur l'étude de la cicatrisation cornéenne, une désepithelisation cornéenne se fera sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les animaux sont rendus diabétiques par injection de streptozotocine. La streptozotocine détruit les cellules du pancréas qui ne produit plus d’insuline et ne peut plus controler la glycémie. L’hyperglycémie altère vaisseaux et nerfs avec une répercussion sur différents organes, comme la neuropathie, les troubles cardiovasculaires, la néphropathie, et la rétinopathie. Les animaux diabétiques ont un besoin de boire et des urines accrus, et perdent du poids. Ils perdent du tonus et prennent un aspect vouté au cours du temps. Les animaux n’ont plus ou peu de gain de poids malgré une consommation d’eau et de nourriture accrue. Au bout d’un mois de diabète, le poids des rats malades représente 50 à 60 % du poids des rats contrôles du même âge, la différence semble moins importante chez la souris serait plutôt autour de 80% du poids des souris contrôles non induites au bout d'un mois de diabète.

Devenir

L'euthanasie des animaux est réalisée en fin d'étude pour analyse des tissus.

Remplacement

Le recours à un modèle animal est nécessaire en raison de la physiologie particulière l'oeil composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen) en interaction les uns avec les autres. Le développement de la rétinopathie ou de la kératopathie diabétique ne peut être mimé par un modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. Une analyse de puissance (placé à 0,8) avec un calcul de l’effectif sera réalisé ce qui permettra d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). En raison de la polydipsie et de la polyurie des animaux diabétiques, la litière sera changée plus fréquemment (1 fois par jour), et un biberon supplémentaire sera ajouté. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'oeil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l‘établissement.

Choix des espèces

Ce modèle est bien décrit sur ces espèces dans la littérature et l’apparition des signes cliniques recherchés de la rétinopathie est rapide selon les articles de la bibliographie. Bien que différentes souches de rat pigmenté ou albinos soient utilisées dans la littérature, les rats Brown Norway semblent avoir une sensibilité supérieure et plus durable dans le temps à la perméabilisation vasculaire rétinienne en réponse au diabète, et les souris C57bl6 semblent repondre le mieux à l'induction par la streptozotocine. Nous choisirons ces souches, mais n’excluons pas de modifier ce choix en fonction des résultats, des échanges avec collaborateurs extérieurs ou nouvelles données de la bibliographie, les rats Wistar, Sprague Dawley et long Evans sont également largement utilisés dans la bibliographie. De même pour l’étude de la cornée diabétique la souris pigmentée ou le rat albinos sont utilisés. Les animaux, rats et souris, seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de 6 semaines minimum à l'induction du diabètes conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 3 jours.

28 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gardés vivants puis réutilisés pour des travaux d'enseignement ou proposés à l'adoption. Une inflammation douloureuse est provoquée à la patte par injection de kaolin sous anesthésie, avec un pic de douleur autour de 24 heures, pour tester un candidat vaccin anti-NGF censé soulager les douleurs d'arthrose. Les chiens subissent aussi jusqu'à huit prélèvements sanguins et l'administration du vaccin ou d'un traitement de comparaison. Le porteur affirme que le modèle est "complètement réversible" au bout de huit semaines et justifie l'étude par la "nécessité" de tester la réponse de l'"organisme entier" chez l'espèce cible.

Objectifs

Le NGF (Nerve Growth Factor) est un polypeptide impliqué dans la croissance, la prolifération et la survie des neurones et d'autres cellules. Le NGF semble aussi jouer un rôle important dans la sensiblisation des nocicepteurs après une blessure tissulaire. Il a été montré que l'inhibition par un anticorps monoclonal de la signalisation cellulaire médiée par le NGF permet de soulager les douleurs ostéoarticulaires. Un nouvel anticorps monoclonal, le bedinvetmab, est récemment disponible en médecine vétérinaire pour soulager ces douleurs ostéoarticulaires chez le chien. Un nouveau candidat vaccin est également à l'étude pour sa capacité à favoriser la production d'anticorps anti-NGF endogènes. Les objectifs de notre projet sont: (1) de tester chez le chien, l'efficacité de ce nouveau candidat vaccin sur la réduction de la douleur dans un modèle de douleur inflammatoire au kaolin, (2) de comparer l'efficacité de ce nouveau candidat vaccin à celle du bedinvetmab (Librela®), (3) de quantifier les concentrations en anticorps monoclonaux aux cours du temps après administration du candidat vaccin, (4) de vérifier que l'inhibition de la signalisation cellulaire médiée par le NGF ne perdure pas quand une nouvelle douleur apparait à distance de la vaccination.

Bénéfices attendus

L'arthrose est un maladie dégénérative, incurable et douloureuse dont la prévalence chez le chien est supérieure à 20%. Ce chiffre est par ailleurs en constante augmentation du fait de l'allongement de la durée de vie des animaux et de facteurs aggravants comme l'obésité. Cette pathologie entraine une douleur et un handicap majeur avec perte de mobilité et état dépressif de l'animal. Les premiers résultats des thérapies impliquant des anticorps monoclonaux sont prometteurs quand à l'amélioration de la qualité de vie de nos animaux. Cependant, la nécessité de renouveller les administrations de bedinvetmab régulièrement (en général tous les mois) présente le risque d'une mauvaise observance par le propriétaire de l'animal. Il est intéressant de déterminer ici si la mise en place d'un vaccin permettant l'activation d'anticorps endogènes pourrait permettre de prolonger la durée d'efficacité du traitement et d'espacer les administrations.

Procédures

1) Administration du candidat vaccin ou du placebo à 14 animaux; 2 administrations; 1 minute maximum; 2) Administration du bedinvetmab ou de meloxicam à 14 animaux; 1 seule administration; 1 minute maximum; 3) Prélèvements sanguins pour sérologie; 3 prélèvements sur 14 animaux et 8 prélèvements sur les 14 autres animaux; 1 minute maximum; 4) Administration de kaolin en sous-cutanée sous anesthésie générale; 1 seule fois pour 14 animaux et 2 fois pour les 14 autres animaux; 30 minutes/animal; 5) Pesée hebdomadaire de tous les animaux; 5 à 10 minutes/animal; 6) Mesures des paramètres pharmacodynamiques; 1h/jour/animal au minimum pour chaque jour de mesure.

Impact sur les animaux

Vu les très bons résultats d'innocuité obtenus après administration d'anticorps monoclonaux exogènes, il y a très peu de risque de réaction au vaccin. La nuisance majeure va résider dans la création d'une inflammation à la patte par administration de kaolin en sous-cutanée. Cependant, ce modèle a déjà été utilisé par la passé et présente l'avantage d'induire une inflammation limitée dans le temps et totalement réversible, ce qui permet de replacer les chiens sans sequelles après ce type d'étude. En effet, le pic de douleur survient autour de 24h après l'administration de kaolin. Cette douleur plus aiguë disparaît ensuite rapidement (autour de 48-72h) même lors d'un traitement placebo. Des paramètres moins critiques comme une diminution d'oedème au niveau de la patte (altérant peu les déplacements du chien mais permettant tout de même de mesurer l'efficacité d'un anti-inflammatoire) perdurent ensuite jusqu'à 10-15 jours après l'administration de kaolin. Enfin, le modèle est complétement réversible au bout de 8 semaines sans séquelle pour les chiens. Il est à noter également que le candidat vaccin étant administré avant induction de l'inflammation, le pic de douleur devrait être plus faible pour ce groupe.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie à l'issue de la procédure. Ils pourront être réutilisés pour des travaux d'enseignement (procédures légères) après accord du vétérinaire référent de l'Etablissement Utilisateur ou seront proposés à l'adoption. Le modèle étant complétement réversible au bout de 8 semaines sans séquelle pour les chiens, la réutilisation ou le placement des animaux pourra intervenir dès les 2 mois suivant la dernière inflammation au kaolin.

Remplacement

Le but de ce projet étant de tester la réponse de l'organisme entier à un vaccin (efficacité contre une douleur inflammatoire, cinétique d'anticorps, absence de réaction au vaccin), il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. Cependant, les études sont menées sur l'espèce cible pour laquelle le vaccin souhaite être mis sur le marché.

Réduction

Nous souhaitons déterminer si le nouveau candidat vaccin est au moins aussi efficace que le bedinvetmab pour réduire une douleur d'origine inflammatoire chez le chien. Pour déterminer le nombre n d'animaux par groupe, un calcul de puissance a été donc effectué à partir de données de la littérature sur l'effet du bedinvetmab sur la réduction de la douleur chez des chiens atteints d'ostéoarthrose. Le calcul de puissance utilisé était le suivant: nA=2x(s2/Δ2)x(za/2-zpuis)2, avec nA le nombre de sujets par groupe, s2 la variance du paramètre à mesurer, Δ la différence minimale attendue pour ce paramètre, zα/2=1.96, zpuis=-0.842. De plus, la résistance à/la sensation de douleur étant un paramètre qui peut être influencé par le sexe, le nombre d'animaux par groupe a été doublé afin d'avoir n mâles et n femelles dans chaque groupe. Enfin, un animal par groupe a été ajouté au cas où un des animaux devrait être exclu de l'étude pour cause de traitement concomitant visant à réduire une douleur trop importante causée par l'administration de kaolin.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés aux conditions du laboratoire puis entraînés aux manipulations pendant 25 jours avant l'administration du vaccin, et le seront aussi entre l'administration du vaccin et la réalisation de l'inflammation. Cela permettra de les habituer en douceur aux différents manipulateurs et d'obtenir des mesures de paramètres fiables tout au long du projet. De plus, les deux principaux expérimentateurs qui seront en charge des animaux tout au long du projet sont formés en éducation canine ainsi qu'aux différentes techniques de medical training. Les animaux seront hébergés en groupe dans des boxs comportant des jouets et auront accès quotidiennement à des courettes extérieures.

Choix des espèces

L'espèce animale choisie est l'espèce cible pour laquelle le vaccin souhaite être mis sur le marché. Les animaux seront âgés de 8 mois à leur arrivée, leur jeune âge facilitant leur capacité d'apprentissage et d'entrainement aux différentes mesures qui seront effectuées. Il ne faut pas d'animaux de moins de 6 mois car leur système immunitaire n'est pas encore totalement mature et différe trop de celui des chiens adultes voire plutôt âgés pour lesquels le vaccin souhaite être développé. L'étude sur des animaux âgés ou souffrant de problèmes ostéoarticulaires sera effectué par la suite en fonction des résultats obtenus au cours de ce projet.