Maladies animales

104 cochons vont être utilisés, 26 truies et 78 porcelets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les animaux étant gardés vivants dans l'élevage expérimental à l'issue. Les truies subissent des prises de sang au lasso nasal, des collectes de fèces après stimulation anale et des traites précédées d'une injection d'ocytocine, les porcelets étant séparés de leur mère quarante minutes avant chaque prélèvement. Le projet décrit les oligosaccharides du lait de truie pour la filière porcine, avec l'objectif affiché de réduire les troubles digestifs des porcelets au sevrage. Le porteur reconnaît la contention comme stressante et affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour des animaux de ce poids.

Objectifs

Les oligosaccharides sont des composés du colostrum et du lait, présentant une grande diversité de structure, non digérés par les jeunes mammifères mais utilisés par les bactéries intestinales. Dans l’espèce humaine, ils auraient des effets bénéfiques sur le microbiote intestinal des bébés (effet prébiotique), contre des pathogènes, bactéries, virus et parasites (effet anti-adhésion) et sur l’activité des cellules intestinales épithéliales et immunitaires. Leurs effets dépendraient de leur structure. Chez les animaux d’élevage, cependant, leurs bénéfices sont peu ou pas connus. En élevage porcin, les porcelets sont très susceptibles aux troubles digestifs (diarrhées notamment), qui sont généralement traités par des antibiotiques. Dans l’enjeu de démédication des élevages et d’amélioration du bien-être des animaux, il est impératif de développer des stratégies préventives qui permettent d’améliorer la santé des porcelets. Dans ce contexte, le projet vise d’abord à décrire les oligosaccharides du lait de truie et leur diversité de structure et ensuite à étudier les liens entre ces profils en oligosaccharides du lait et le microbiote intestinal et la santé des porcelets.

Bénéfices attendus

A court terme, les données sur les oligosaccharides du lait de truie, quantité et diversité de structure, alimenteront une base de données multiespèce qui sera mise à disposition dans un répertoire public. Le projet apportera aussi des connaissances nouvelles sur le lien entre les profils d’oligosaccharides et la santé intestinale des porcelets allaités. A plus long terme, ces connaissances permettront de tester des stratégies de nutrition préventive pour les porcelets, en étudiant les effets d’oligosaccharides spécifiquement identifiés comme potentiellement bénéfiques. Nous fournirons ainsi des pistes à la filière porcine pour développer un aliment premier âge pour porcelet allaité qui serait enrichi en oligosaccharides bénéfiques, aliment qui permettrait de réduire les problèmes digestifs des porcelets au sevrage, une phase critique en élevage.

Procédures

Les truies seront soumises à une prise de sang (à 109 jours de gestation), une collecte de fèces (à 6 jours de lactation), une collecte de colostrum à la mise bas et 3 collectes de lait à 6, 20 et 27 jours de lactation. La durée de la prise de sang est limitée à 2 minutes. Si une stimulation anale légère est nécessaire pour stimuler la défécation, celle-ci ne dure pas plus d’une minute. La traite pour collecter le colostrum et le lait dure entre 5 et 15 minutes. Les porcelets seront soumis à 3 prises de sang et 3 collectes de fèces à 6, 20 et 27 jours d’âge. La durée de la prise de sang est limitée à 2 minutes et celle de la collecte de fèces est limitée à 5 minutes.

Impact sur les animaux

La prise de sang par ponction dans la veine jugulaire nécessite de tenir la truie au lasso nasal afin qu’elle soit la plus rapide et la moins douloureuse possible. La durée de la prise de sang est limitée à 2 minutes. Cette contention, même brève, est stressante pour la truie. A ce jour, il n’existe pas de méthode alternative approuvée et utilisable de manière systématique sur des animaux de cet âge, de ce poids et de cette force. Les truies sont récompensées par un morceau de pomme à l’issue de la procédure. La collecte de fèces est réalisée à la défécation naturelle ou après stimulation anale légère, donc sans stress ni douleur. La collecte de colostrum n’entraine pas de douleur et tout au plus une gêne de la truie à l’approche des expérimentateurs. Par contre, chaque prélèvement de lait nécessite de séparer les porcelets de leur mère pendant 40 minutes avant le prélèvement. Les porcelets sont alors placés dans une caisse placée à proximité de leur mère afin de réduire le stress engendré chez les porcelets et la truie. Cette séparation est requise pour que le lait s'accumule dans la mamelle, elle facilite la traite. Les porcelets sont remis avec leur mère dès la fin du prélèvement. Le prélèvement de lait nécessite aussi une injection préalable d’ocytocine en intramusculaire afin d’induire l’éjection du lait, engendrant la douleur de la piqure. Les porcelets seront soumis à 3 prises de sang et 3 collectes de fèces à 6, 20 et 27 jours d’âge. La prise de sang est faite dans la veine jugulaire avec un dispositif de type Vacutainer en maintenant les porcelets immobilisés en décubitus dorsal. L’immobilisation ne dépasse pas 5 minutes et la durée de la prise de sang est limitée à 2 minutes. La collecte de fèces est réalisée sur des porcelets allaités. Le lait étant très digestible, l'obtention de quelques grammes de fèces peut être difficile, notamment à 6 et 20 jours d’âge. Elle nécessite de tenir le porcelet et de faire une stimulation anale avec un thermomètre tout en appuyant sur l’abdomen. Mais cette étape ne sera pas nécessaire pour tous les porcelets car la collecte se fait au moment de la prise de sang qui favorise la défécation. La durée de contention de chaque porcelet est limitée à 5 minutes.

Devenir

Le projet sera mené sur des truies et leurs porcelets jusqu'à la fin de la période d'allaitement. Les porcs sont ici l'espèce cible du projet qui consiste à apporter des éléments scientifiques sur le lien entre des composés spécifiques du lait, les oligosaccharides, et le microbiote et la santé intestinale des porcelets. Les connaissances serviront de base pour tester des stratégies de nutrition préventive pour les porcelets sous la mère qui permettrait de réduire les problèmes diggestifs des porcelets au sevrage. En élevage porcin, le sevrage est une phase critique pour les porcelets. Truies et porcelets poursuivent leur carrière dans l'élevage expérimental.

Remplacement

Les deux objectifs du projet sont de décrire les profils en oligosaccharides du colostrum et du lait de truie et d’étudier les liens entre ces profils et le microbiote intestinal et la santé des porcelets. Le projet porte donc sur le continuum truie-sécrétions lactées- porcelets et nécessite d’être réalisé sur des animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux prévus est de 104 au maximum ; il correspond à 26 truies et 78 porcelets (3 porcelets/portée x 26 portées). Le nombre de truies (26 truies à la mise bas pour au final 20 truies avec un jeu de données complet) est suffisant et nécessaire pour décrire les profils en oligosaccharides du lait et leur variabilité au sein de truies d’un même génotype, d’un même élevage et conduites de la même façon. Il est suffisant aussi pour suivre la cinétique d’évolution de ces profils sur 4 semaines de lactation. Pour les porcelets, seul un nombre limité de porcelets par portée seront soumis aux interventions invasives. Ils seront représentatifs des porcelets de poids moyen dans la portée. Le choix de 2 et 3 porcelets pour les collectes de sang et de fèces permet d’évaluer l’effet de la mère dans les analyses. Deux ou 3 porcelets sur 20 portées (au final) permettent aussi de suivre la cinétique d’évolution du microbiote fécal et des indicateurs de santé des porcelets pendant leur phase d’allaitement. Ce choix est basé sur nos expériences précédentes, validées. Les cinétiques seront étudiées par analyse de variance comportant l’effet temps de prélèvement et l’effet truie.

Raffinement

L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel expérimenté et en respectant des points limites afin de réduire la souffrance et la douleur des animaux. Les mesures de raffinement consisteront à réduire le plus possible l’intensité et la durée de la douleur ou du stress que peuvent engendrer les interventions. La durée des contentions des truies et des porcelets sera limitée à 5 minutes. Les prises de sang seront stoppées au bout de 2 minutes. Les collectes de fèces seront aussi interrompues si sans succès au bout de 5 minutes. Truies et porcelets seront particulièrement surveillés après chaque intervention invasive.

Choix des espèces

Le projet sera mené sur des truies et leurs porcelets jusqu'à la fin de la période d'allaitement. Les porcs sont ici l'espèce cible du projet qui consiste à apporter des éléments scientifiques sur le lien entre des composés spécifiques du lait, les oligosaccharides, et le microbiote et la santé intestinale des porcelets. Les connaissances serviront de base pour tester des stratégies de nutrition préventive pour les porcelets sous la mère qui permettrait de réduire les problèmes diggestifs des porcelets au sevrage. En élevage porcin, le sevrage est une phase critique pour les porcelets. Le projet porte sur la transmission d’éléments de la truie aux porcelets via le colostrum et le lait. Il utilise donc des truies en lactation et des porcelets allaités par ces truies.

230 furets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une instillation nasale de variants du SARS-CoV-2 sous anesthésie, puis des lavages nasaux quotidiens et des prises de sang, pour comparer gravité, réplication et transmission entre furets naïfs, vaccinés ou convalescents. Le porteur décrit une infection peu symptomatique, avec au plus une toux faible et une apathie transitoire, et garde certains animaux jusqu'à quatre mois comme convalescents avant de les tuer. Il affirme que l'excrétion virale et la transmission entre individus ne peuvent être reproduites in vitro.

Objectifs

La gestion de l'épidémie de COVID19 est compliquée par l'émergence régulière de nouveaux variants de SARS-CoV-2 dont les mutations génétiques influencent la capacité du virus à se transmettre entre individus infectés, la gravité de l’infection et l’efficacité protectrice issue d’une vaccination ou d’une infection préalable. Le présent projet a pour objectif d’évaluer ces caractéristiques pour 5 variants en faisant appel à des études in-vitro et in-vivo. Pour les études in-vivo, le furet est un bon modèle de l’infection humaine de l’appareil respiratoire supérieur. Ce projet vise donc à évaluer pour chaque variant testé 1/ la gravité de l’infection 2/ sa vitesse de réplication chez le furet 3/ sa transmission entre furets. Pour chaque variant testé, cette évaluation se fait par comparaison avec un variant pour lequel la gravité de l’infection, la vitesse de réplication et la transmissibilité sont connues. L’autre partie du projet vise pour chaque nouveau variant à mesurer l’efficacité vaccinale ou la protection conférée par une infection préalable à SARS-CoV2. Les mêmes caractéristiques de gravité de l’infection, de vitesse de réplication et de transmissibilité seront ainsi évaluées chez des furets vaccinés ou convalescents d’une infection préalable. Les furets seront gardés en groupes sociaux de trois animaux à six animaux dans des cages de dimensions répondant à celles requises par la réglementation. Un enrichissement composé de tunnels, de coins de repos, d’espaces de jeux et d’exploration sera assuré. Tous les prélèvements seront effectués sous anesthésie générale. Le suivi des animaux sera réalisé quotidiennement, puis deux fois par jours dès apparition des symptômes. Le nombre d’animaux utilisé par variant est de 46 furets pour obtenir les données requises pour caractériser un nouveau variant, pour évaluer la protection vaccinale et la protection conférée par une infection préalable. Le projet est prévu pour l’étude de l’émergence de 5 nouveaux variants.

Bénéfices attendus

La caractérisation des nouveaux variants d’intérêt, l’évaluation de la protection vaccinale et la protection conférée par une infection préalable est une aide aux pouvoirs publiques dans l’anticipation et la gestion des nouveaux variants.

Procédures

Les inoculations expérimentales seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse pour un furet par lot (virus instillé dans les narines). Des lavages nasaux seront réalisés quotidiennement sous anesthésie générale gazeuse (500µl d’une solution saline instillés à l'entrée de chaque narine, le liquide de lavage étant recueilli sous l'animal par gravité) (1minute). Des prises de sang seront réalisées à J4 et J8 sous anesthésie générale gazeuse dans la veine cave antérieure (3minutes).

Impact sur les animaux

L’infection à SARS-CoV-2 chez les furets est peu symptomatique: pas ou peu de perte de poids, peu d'hyperthermie. Une faible toux a été remarquée chez certains animaux et une apathie transitoire vers le 7ème- 8ème jour d’infection avec le variant alpha. L’inflammation locale des voie aériennes supérieures reste modeste et courte. L'inoculation virale intranasale et les lavages nasaux sont peu invasifs. Les furets étant des animaux sociaux, ils seront hébergés par groupes d’au moins 3 animaux avec des contacts permanents 6 heures après l’inoculation expérimentale des donneurs.

Devenir

Certains animaux issus de la procédure 1 seront gardés en vie jusqu'à 4 mois maximum après la fin de la procédure en tant que convalescents immunisés pour la procédure 2. Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure 2.

Remplacement

Les objectifs de ce projet requièrent une excrétion physiologique virale, de la transmission inter individus par la pénétration du virus dans des tissus des volutes nasales et le développement de réponses immunitaires locales et périphériques qu'il n'est pas possible de reproduire in-vitro. Le modèle animal reste donc nécessaire pour étudier la capacité réplicative de variants et son impact après infection chez des animaux immunisés ou non.

Réduction

Les nombres de furets par lot sont réduits. Certains lots pourront être supprimés. Ainsi, pour la procédure 1, les 2 lots utilisés pour le variant de référence pourront être supprimés s’il est conservé pour plusieurs variants à tester. Les lots sacrifiés à J8 des procédures 2 et 3 pourront s’avérer inutiles s’il est démontré par les résultats des essais préliminaires que la meilleure date pour avoir un maximum de titre viral est J4 (voir procédures 2 et 3). Aucune approche statistique n'a été réalisée, car les comparaisons entre variant seront qualitatives ou semi-quantitative.

Raffinement

Les furets sont anesthésiés pour tout prélèvement (prise de sang, lavage nasal) et pour les inoculations. Les furets seront gardés en groupes sociaux de trois à six animaux dans des cages de dimensions répondant à celles requises par la réglementation. Un enrichissement composé de tunnels, de coins de repos, d’espaces de jeux et d’exploration sera assuré. Tous les prélèvements seront effectués sous anesthésie générale. Le suivi des animaux sera réalisé quotidiennement, puis deux fois par jours dès apparition des symptômes.

Choix des espèces

Les furets constituent un modèle expérimental reproduisant la pathogénicité généralement peu marquée et courte de l’appareil respiratoire supérieur, ce qui est aussi observé lors de COVID-19. Les animaux auront plus de 18 semaines, car il est nécessaire que les animaux aient un système immunitaire mature afin que le modèle animal soit le plus proche possible de l’infection adulte humaine.

8 chevaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis rendus à leur établissement éleveur à la fin de l'étude. Chaque animal, sous sédation, subit une nouvelle technique de pose de garrot, quatre perfusions locorégionales d'antibiotique et de nombreux prélèvements, jusqu'à seize prises de sang et vingt ponctions dans l'articulation du boulet. Le porteur indique que l'arthrite septique, jugée très peu probable, constitue un point limite qui exclurait le cheval de l'étude. Il conclut que ces cinétiques mettent en jeu plusieurs systèmes et que le remplacement est donc impossible, les manipulations devant se faire dans l'espèce cible.

Objectifs

Lors d’une atteinte des membres des chevaux, un traitement incluant une antibiothérapie peut être nécessaire. Une alternative intéressante est la réalisation de cette antibiothérapie par voie locorégionale, grâce à une injection d’antibiotique par voie intraveineuse (veine du membre du cheval) sous garrot afin de concentrer l’antibiotique dans la zone d’intérêt. En temps normal le garrot est mis en place sur le membre du cheval avec le pied posé au sol, cependant dans ces conditions les muscles et tendons sont en tension. Nous avons donc souhaité étudier une nouvelle technique de pose du garrot avec le membre fléchi afin de limiter la fuite de produit sous le garrot, permettant une meilleure concentration des antibiotiques dans la zone d’intérêt et en conséquence une perfusion locorégionale plus efficace. Cette procédure peut se réaliser sur cheval sédaté (ne nécessite pas d’anesthésie générale). Cette technique permettrait d’obtenir des concentrations d’antibiotiques effectivement supérieures aux techniques précédemment décrites. Pour évaluer l’efficacité de cette nouvelle méthode, il est nécessaire de réaliser des dosages d’antibiotiques dans une articulation du membre du cheval (boulet) ainsi que d’évaluer la décroissance de leur concentration locale, puis d’évaluer la fuite des antibiotiques dans la concentration sanguine au moment de la perfusion locorégionale. Ces mesures seront réalisées sur deux groupes de traitement (pose du garrot sur membre à l’appui ou au soutien) avec l’utilisation des deux antibiotiques les plus fréquemment utilisés en pratique vétérinaire équine, et les données seront comparées par des études statistiques. Il pourra également être discuté de l’intervalle de temps nécessaire entre deux administrations d’antibiotiques par perfusion locorégionale. En effet, en pratique les perfusions locorégionales sont répétées toutes les 24 à 48 heures, sans que les différentes études n’aient tranché sur l’intervalle de temps optimal. Les dosages d'antibiotiques réalisés dans notre étude permettront d’établir si les perfusions locorégionales peuvent être d'avantage espacées dans le temps, ou au contraire s'il est nécessaire de les réaliser plus fréquemment.

Bénéfices attendus

L’administration d’antibiotiques par voie locorégionale permet d’augmenter la concentration de la molécule dans la région que l’on souhaite traiter (distale au garrot) au niveau du membre du cheval. Cette technique est également une méthode alternative à l’antibiothérapie par voie générale et permet donc d’en limiter les effets secondaires (toxicité rénale par exemple). Notre étude a pour but de raffiner la méthode de réalisation de la perfusion locorégionale afin d’obtenir une efficacité maximale de l’antibiothérapie et donc de permettre un traitement plus efficace des affections du membre distal chez le cheval. Par ailleurs cette étude pourrait aussi permettre de montrer qu’il est nécessaire de rapprocher ou à contrario d’espacer les administrations d’antibiotiques par voie locorégionale, afin d’améliorer également l’efficacité de ces perfusions et donc de diminuer au maximum le développement de souches bactériennes résistantes aux antibiotiques (liées à une concentration circulante d’antibiotique insuffisante).

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types d'interventions : Prélèvements sanguins sur chevaux sédatés : avant réalisation de la perfusion locorégionale, 1 minute post-injection, puis 1 min avant et une minute après le retrait du garrot, pour évaluer l’efficacité de ce dernier. Soit 4 prises de sang par cheval et par phase (chaque phase étant espacée d’au moins 2 semaines), en comptant 30 secondes par prise de sang. Soit un total de 16 prises de sang sur la durée de l'étude. Les chevaux (sédatés) seront également soumis à des prélèvements articulaires dans l’articulation du boulet : prélèvement à 10 min, 12h, 24h, 36h et 48h après le retrait du garrot. Soit 5 prélèvements de synovie par cheval et par phase, en comptant 2 minutes par ponction synoviale (sans compter le temps de nettoyage de la peau). Soit un total de 20 prélèvements sur la durée de l'étude. En plus des différents prélèvements, les chevaux seront soumis à des perfusions locorégionales. Ces perfusions sont réalisées sous sédation et consistent en l'injection d'un anesthésique local (pour réduire la douleur), d'un antibiotique et de liquide stérile physiologique. Cette injection se réalise dans la veine céphalique du membre antérieur selectionné, après la mise en place d'un garrot. L'injection en elle même dure 1 minute puis le garrot est laissé en place pendant 20 minutes après cela. Chaque cheval recevra donc 4 perfusions locorégionales sous sédation au cours de l'étude (espacées de 2 semaines). Après la perfusion locorégionale et les ponctions synoviales, des bandages stériles seront mis en place. Cela correspond à la mise en place d'un bandage à 5 reprises par phase de l'étude l’étude (soit 20 bandages en tout dans l'étude), en comptant 5 minutes par pose de bandage. Enfin, les chevaux recevront deux examens cliniques par jour (en comptant 5 minutes par examen) pendant les 10 jours de box de chaque phase (soit 20 examens cliniques par phase et donc 80 examens cliniques au total sur l'étude); ainsi qu’un examen locomoteur simplifié une fois avant le début de la procédure, puis de manière quotidienne pendant les 3 jours de manipulation et une dernière fois au 10ème jour de la phase avant de remettre le cheval dans son environnement initial, soit 5 examens locomoteurs par phase de l’étude (20 examens locomoteurs au total pendant l'étude), en comptant 10 minutes par examen locomoteur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux sont les suivants : Douleur très faible immédiate associée à des ponctions sanguines et synoviales multiples (effet qui ne dure pas dans le temps), douleur modérée en cas de développement d'un complication (au niveau de la veine céphalique ou de l'articulation métacarpo-phalangienne) - pouvant durer quelques jours (mais prise en charge immédiate en cas de développement d'une complication). Le développement d'une arthrite septique semble très peu probable mais constitue un point limite qui entraînera l'exclusion du cheval de la procédure expérimentale (et la mise en place immédiate du traitement adapté).

Devenir

L'étude est formée d'une unique procédure. A la fin de l'étude, tous les chevaux retourneront à l'établissement éleveur après accord du vétérinaire désigné.

Remplacement

Les études de cinétiques mettent en jeu plusieurs systèmes organiques et ce caractère intégratif ne peut être reproduit in vitro ou in silico. Le remplacement est donc impossible. D'autre part, les manipulations doivent être réalisées dans l'espèce cible pour reproduire les modalités de réalisations.

Réduction

Nombre minimal estimé de chevaux sains permettant la réalisation du projet (nombre de chevaux utilisés pour de nombreuses études portant sur les perfusions locorégionales d’antibiotiques dans l’espèce équine). Aucun test statistique n’a été utilisé.

Raffinement

Les chevaux utilisés seront placés dans des conditions d’hébergement répondant au bien-être animal : box individuel de taille adéquate avec une litière propre et un nettoyage quotidien, accès à de l’eau et du foin à volonté, enrichissement de l’environnement, présence de congénères placés dans des box contigus. Il y aura une période d’habituation préalable de 5 jours avec des sorties quotidiennes en main (1 heure par jour, soit 3 fois 20 minutes). Pendant les 3 jours de manipulations et les 2 jours suivants de repos, les chevaux seront laissés au box strict. Chaque jour les chevaux seront pansés. L’environnement sera enrichi à l’aide de pierres à sel et de pipolino notamment. Les manipulations seront effectuées dans une même salle dans les locaux de la clinique équine (lieu de vie des chevaux) pour éviter tout stress. Pendant toute la durée de la procédure, les chevaux seront surveillés en permanence et en cas de problème, celui-ci sera pris en charge immédiatement par le vétérinaire désigné de l'établissement. Les chevaux recevront une analgésie afin de prévenir un potentiel inconfort lié à la procédure expérimentale (sédation et anesthésique local au moment de la réalisation de la perfusion locorégionale et mise en place d’un traitement anti-inflammatoire pendant toute la durée des prélèvements synoviaux).

Choix des espèces

Espèce cible pour la pratique concernée. Chevaux adultes sains (population cible pour la pratique concernée).

60 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans mise à mort prévue, les animaux étant réintégrés dans la colonie de l'établissement pour être réutilisés. Sensibilisés à des allergènes pour développer une dermatite atopique, ils présentent érythème, papules, pustules et démangeaisons, et subissent des prélèvements de sang à la jugulaire ainsi que des biopsies de peau. Le projet sert à tester des molécules vétérinaires sur l'espèce cible. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit cette maladie, la complexité des mécanismes n'étant pas selon lui reproductible in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est de mettre en place des modèles de Dermatite Atopique Canine (DAC) aigus chez le chien, et de maintenir la sensibilisation afin d’obtenir un modèle de DAC subchronique, et d’utiliser ces modèles pour la sélection de futures molécules thérapeutiques pouvant entrer dans la composition de nouveaux médicaments destinés à une mise sur le marché. La maîtrise de ces modèles permettra d’évaluer primairement l’efficacité, secondairement la tolérance, le profil pharmacocinétique de molécules et également de suivre l’évolution de certains bio-marqueurs de l’inflammation (interleukines, PBMCs (peripheral blood mononuclear cell)…) dans nos modèles avec et sans traitement.

Bénéfices attendus

La DAC est la deuxième cause de démangeaisons chez le chien : elle touche environ 10% de la population canine mondiale. C’est une dermatose inflammatoire, prurigineuse, caractérisée parfois par une prédisposition génétique, le développement d’allergie à des allergènes environnementaux et des altérations de la barrière cutanée. Elle se caractérise par du prurit, des lésions cutanées plus ou moins caractéristiques et nécessite des soins coûteux et chronophages de la part du propriétaire tout au long de la vie de l’animal. Sa gravité réside principalement dans son impact sur la qualité de vie du propriétaire et de son chien, ceci pouvant être une cause de demande d’euthanasie. Le traitement et la gestion à long terme de la dermatite atopique sont difficiles. La majorité des traitements anti-inflammatoires ou immunomodulateurs sont susceptibles de causer des effets secondaires, surtout quand ils sont utilisés à forte dose et/ou de façon répétée, quotidienne ou prolongée. La recherche de nouveaux traitements pour un contrôle efficace et sûr de cette maladie chronique doit être évaluée sur l’espèce cible lors d’un épisode clinique. La mise en place, la maitrise et le maintien d’un modèle de DAC (aigu et subchronique) induisant des signes cliniques similaires aux lésions dermatologiques observés chez les chiens souffrant de la DAC spontanée, permettent d’évaluer l’efficacité d’un traitement dans des conditions réelles, d’améliorer les phases de screening de nouvelles molécules et ainsi de sélectionner plus vite et de façon plus sûre, des molécules présentant une probabilité de succès importante sur un nombre optimisé d’animaux. Un modèle de DAC présente plusieurs avantages par rapport aux dermatites atopiques de terrain. Lors d’une inflammation expérimentale de la peau, la dose appliquée d’allergène est connue et les caractéristiques de l’inflammation/lésions dermatologiques peuvent être suivies dès la phase précoce de la maladie. Un suivi rapproché par des personnes formées dans des conditions standardisées permet une évaluation d’efficacité mais aussi de tolérance, pharmacocinétique et la possibilité de chercher des bio-marqueurs. C’est un grand avantage de pouvoir récolter autant d’informations dans l’espèce cible par procédure expérimentale dans un modèle représentatif de la DAC spontanée.

Procédures

Traitements : Lors de cette procédure expérimentale, l’administration du produit sera réalisée par voie intraveineuse (IV), intramusculaire (IM), sous-cutanée (SC), orale, transcutanée, ou autre. Le volume maximal administré sera en accord avec les bonnes pratiques vétérinaires : • IV : 1-5 mL/kg • IM : 0.25-0.5 mL/kg • SC : 1-2 mL/kg • Transcutanée : le volume administré dépendra de la viscosité du produit et de l’espèce de destination. • Oral : les tablettes/comprimés ou solutions liquides seront adaptées à l’espèce de destination. Prélèvements de sang : généralement à la veine jugulaire sur animal vigile Les volumes totaux de sang prélevés suivent les volumes définis pour respecter le bien-être animal, et ne dépasse jamais 20% du volume de sang circulant par kg de poids vif. Un temps de repos suffisant est déterminé entre chaque phase de prélèvement si l’étude en compte plusieurs et entre chaque étude. Ainsi, pour un volume maximum prélevé correspondant à 7.5%, 10%, 15% et 20% du volume de sang circulant par kg de poids vif sur une période de 24h, le temps de récupération est de 3, 7, 14, et 28 jours respectivement. Prélèvements de fluides biologiques/tissus/matrices : Des raclages cutanés et/ou des biopsies de peau pourraient être réalisés. Dans le premier cas, le prélèvement s’effectuera avec une lame de bistouri émoussée. Dans le second cas, l’acte sera réalisé sous anesthésie locale, sur un animal vigile avec ou sans tranquillisation et suivies les cas échéant par des points de suture. Le nombre de biopsies sera limité à 3 par jour et 12 par étude pour chaque chien. La taille et la profondeur de la biopsie seront définies et argumentées dans le plan d’étude.

Impact sur les animaux

Les chiens sensibilisés dévélopperont des signes d’allergie cutanée ; l’erythème (rougeur de la peau), des papules (surélévation de la peau), pustules (soulèvement de la peau contenant du pus) et/ou de l’excoriation (écorchure superficielle). Ils peuvent aussi dévélopper un prurit passager (démangeaisons). Les signes cliniques apparaissent généralement dans les 24h après l’application des allergènes. Les lésions dermatologiques les plus sévères seront généralement observées entre 72h et 96h après la première application, ensuite ils se résolvent spontanément. Des prélèvements sanguins répétés pourront également générer un léger inconfort. Des biopsies de peau pourraient être collectées Avant de conduire des études d’efficacité nous avons généralement des informations de tolérance dans le chien, des réactions d’intolerance sévère à cause des produits évalués ne sont donc pas attendues. Les phases de traitement/prélèvement sur un animal vigile peuvent occasionner un léger stress/baisse de bien-être en raison de la légère contention nécessaire pour le traitement/recueil d’échantillons.

Devenir

Dans le cadre de ce projet, les euthanasies ne sont pas prévues. Par conséquent une réintroduction de l’ensemble des animaux qui participeront à ce projet dans la colonie hébergée au sein de l’EU est envisagée. Les informations concernant chaque animal sont conservées et consultées avant une réutilisation potentielle d’un animal dans un autre projet.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative pour reproduire la DAC et pouvoir évaluer l’état général de l’animal et l’intensité des manifestations dermatologiques, la complexité des mécanismes biologiques en jeu ne pouvant être reproduite in vitro.

Réduction

Les réactions allérgiques sont répétables entre chaque « challenge » pour tous les chiens sensibilisés mais avec une variabilté entre individus. L’expérience avec ce modèle nous montre qu’il ne faut pas utiliser moins de 4 et idéalement 6 ou 8 chiens par groupe pour garantir des résultats exploitables. Ce sont des études de preuve de concept : étapes précoces de l’évaluation d’un nouveau produit/composé actif. L’évaluation et l’intérprétation des résultats sont faites en comparant l’évolution des moyennes des scores dermatologiques journaliers des différents groupes de traitement. Les groupes de traitement sont : non-traité (contrôle négatif) et/ou le groupe traité avec un produit de référence (contrôle positif) et le (ou les) groupe(s) traité(s) avec le produit à évaluer. Le score moyen des chiens dans le contrôle négatif est au dessus du score défini le « seuil allergique » et le score moyen des chiens dans le groupe contrôle positif est en dessous du « seuil allergique ». Il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe, au cas par cas, selon la finalité de la procédure expérimentale. Cette décision sera dûment justifiée dans le plan d’étude spécifique dans le cadre de ce projet. Dans le plan d’étude, le nombre d’animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié de manière à optimiser l’utilisation des animaux et à en réduire leur nombre tout en s’assurant que ce nombre d’animaux permette d’atteindre l’objectif de l’étude, c'est-à-dire que les résultats de l’étude permettent de prendre une décision sur le niveau de sensibilisation et/ou l’efficacité du produit/des produits évalués.

Raffinement

Les animaux sont régulièrement manipulés afin de les habituer à la contention et au contact des expérimentateurs. Les traitements et prélèvements sont réalisés généralement sur animaux vigiles selon les procédures en vigueur au sein de l’EU. Pour les chiens, une contention légère est suffisante pour l’administration du traitement et les collectes d’échantillons et n’induit pas de nuisance au bien-être des animaux autre que d’être maintenus pendant des temps très courts. Les volumes prélevés et les temps de récupération des animaux sont déterminés de manière anticipée pour s’assurer que le bien-être ne sera pas altéré. Dans le cas d’administrations ou de prélèvements spécifiques (biopsie de la peau), les animaux pourront être anesthésiés localement ou totalement pendant la durée de l’acte. L’anesthésie et le réveil des animaux se feront sous la surveillance d’un vétérinaire et selon les procédures en vigueur au sein de l’EU. Depuis leur inclusion dans l’étude jusqu’à la fin de la phase animale, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel formé. Des observations plus fréquentes sont prévues dès que requis, particulièrement après l’application des allergènes et la prise de traitements (examen dermatologique et observations cliniques générales), pour s’assurer que l’apparition des signes cliniques n’entraine pas de dégradation trop importante de l’état général de l’animal et que les traitements sont bien tolérés. Toute observation d’un état de santé ou d’un comportement anormal d’un animal fera l’objet d’un examen par un vétérinaire qui proposera les mesures adéquates pour protéger l’animal : si nécessaire, le sortir de la procédure expérimentale et/ou lui administrer un traitement. L’euthanasie (si nécessaire) sera effectuée sur site. Pendant le challenge, des personnes qualifiées évaluent quotidiennement les lésions cutanées avec une grille qui permet de définir si les réactions sont absentes, légères, modérées ou sévères, le seuil allergique et /ou plusieurs points limites qui une fois atteints ou dépassés, entraineront l’exclusion de l’animal de l’étude et son traitement. La réaction allergique et l’inconfort que le challenge peut engendrer sont vite et efficacement contrôlés avec par exemple des corticoïdes et/ou des shampooings. La grille d’évaluation des lésions et les points limites sont validés par le comité d’éthique et pourront être révisés de manière rétrospective selon les résultats obtenus à chaque étude.

Choix des espèces

Les produits vétérinaires doivent obligatoirement être testés dans l’espèce de destination. Les modèles expérimentaux qui permettront d’évaluer les produits vétérinaires doivent être développés dans la même espèce pour plus de pertinence. L’espèce canine a été retenue comme correspondant à l’application clinique future des produits visant à traiter les signes d’allergie suite à la dermatite atopique du chien. Les modèles seront à mettre en place chez des chiens jeunes adultes sains. Ceci correspond à des animaux de plus de 6 mois avec un système immunitaire mature.

1 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souriceaux de trois jours et adultes reçoivent le parasite Cryptosporidium par voie orale puis des immunostimulants par injection intrapéritonéale, avant une mise à mort pour prélèvement de tissus. Le projet évalue des immunostimulants contre cette infection responsable de diarrhées. Le porteur signale que le stress de certaines lignées favorise le cannibalisme des portées, et affirme que l'étude de l'immunité intestinale ne peut se faire sans animaux, les modèles in vitro ignorant selon lui la complexité de l'environnement intestinal.

Objectifs

Les infections par le protozoaire Cryptosporidium sont très fréquentes à travers le monde. Elles conduisent à des pertes économiques importantes en santé vétérinaire puisque cette maladie provoque des diarrhées sévères chez les ruminants dès la naissance et affectent aussi la santé humaine (notamment les enfants de moins de 5 ans - 2ème cause de mortalité due aux diarrhées dans les pays en voie de développement). En absence de vaccins ou de traitements autorisés et efficaces, l’objectif du projet est d’évaluer l’effet protecteur de différents immunostimulants de l’immunité innée et de décrire les mécanismes immunologiques mis en jeu lors de ces traitements.

Bénéfices attendus

En l’absence de vaccin ou de traitements efficaces qui pourraient induire des résistances, l'utilisation d’immunostimulants pour stimuler de manière non spécifique les cellules de l’immunité est une approche très prometteuse qui pourrait être bénéfique pour toute autre infection en période néonatale puisqu’elle n’est pas basée sur une réponse spécifique vers l’agent pathogène (comme les vaccins).

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite, (une fois à l’âge de 3 jours pour les souriceaux, et une fois entre 7-12 semaines pour les adultes) puis à une administration intra-péritonéale des immunostimulants (5 jours après l’infection) (introduction aiguille) sur animaux vigiles sous contention.

Impact sur les animaux

Il est possible que la conjonction des traitements : infection et déficience génétique, immunostimulation et traitement antibiotique, puisse altérer l’état général de l‘animal.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.

Remplacement

L’étude de l’immunologie et de la muqueuse intestinale ne peut être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement intestinal (flore bactérienne et antigènes alimentaires).

Réduction

Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Toutefois, malgré l’enrichissement, l’état de stress qui caractérise certaines lignées de souris, favorise le cannibalisme, c’est pourquoi plus d’animaux sont mis en reproduction (20 à 30% de plus, les reproductions sont gérées par la PFIE). Du point de vue statistique, nous utilisons des tests non paramétriques adaptés pour les petits échantillons mais 6 animaux par lots au minimum sont requis. Les animaux surnuméraires sont toujours utilisés et peuvent être introduits dans un autre protocole. Les immunostimulants cibleront spécifiquement des récepteurs des cellules immunitaires. Les immunostimulants non commerciaux seront tous préalablement validés in vitro pour leur capacité à stimuler fortement les cellules immunitaires avant de procéder à des études in vivo. Pour analyser les données (charge parasitaire ; cytokines ; % cellules immunitaires), nous utiliserons des modèles statistiques mixtes qui tiennent compte à la fois des facteurs à effet fixe (exemple Infection ou déficience génétique de l’animal ou traitement immunostimulant) et des facteurs à effet aléatoire (répétition des expériences). D'après nos expérimentations précédentes et dans ces conditions, ces effectifs et répétitions sont suffisants pour conclure du point de vue significatif ET biologique sur nos données (ex : pour la charge parasitaire avec un effet protecteur des immunostimulants d’environ 40% (faible) : puissance estimée à 95% avec un risque de 0.05% avec 6 animaux par lots). Deux animaux supplémentaires sont ajoutés dans chaque lot car de la mortalité est parfois observée dans les portées (très jeunes animaux) (indépendamment de l’infection ou d’un traitement).

Raffinement

Les souris sont hébergées en animalerie A2 en atmosphère contrôlée, à raison de 5 souris maximum lorsqu’elles sont adultes, dans un environnement enrichi (refuge en polycarbonate, feuilles de papier absorbant, copeaux, morceau de bois) ou 1 mère avec sa portée par cage, dans un environnement enrichi (papier absorbant qui diminue le cannibalisme des souris à la mise-bas, sizzle-nest, bâtonnets de coton, morceau de bois). Toute médication est proscrite pour ne pas interférer avec les paramètres immunologiques étudiés. Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites durant tout le protocole et de limiter la douleur induite : (i) de souriceaux mis à l’écart par la mère, qui ne grossissent pas ou dont le pelage ne se développe pas (lié au retard de croissance), (ii) de souris amaigries, prostrées et avec le poil ébouriffé. Nous prenons encore plus de précautions (bruits) lors des visites lorsqu’il s’agit d’expérimentations avec les femelles gestantes et les premiers jours suivant la mise-bas

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé en tant que modèle expérimental pour étudier la cryptosporidiose. Le souriceau est représentatif de l’infection chez les jeunes ruminants. Dans les élevages, les jeunes ruminants se contaminent rapidement dès la naissance et éliminent le parasite en 3 semaines environ. Le souriceau inoculé avec le parasite entre 3 et 7 jours de vie élimine le parasite comme le jeune ruminant en 3 semaines environ. La souris adulte immunodéficiente, notamment lorsqu’elle est génétiquement modifiée pour un gène de l’immunité, est également utilisée dans la présente demande pour comprendre la spécificité du mécanisme de protection chez le jeune. Dans la présente demande, l’utilisation de souris (souriceaux, souris adulte) nous permettra de décortiquer très précisément les mécanismes de protection. Notre établissement élève de nombreuses lignées de souris transgéniques (gènes rapporteurs, déficientes, invalidation fonctionnelle etc.) pour parvenir à cet objectif. Les souriceaux sont inoculés par le parasite lorsqu’ils auront 3 jours. Les souris adultes seront également utilisées et âgées entre 7-12 semaines.