Toxicologie (hors obligations réglementaires)

1 978 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Un glioblastome leur est implanté dans le cerveau par stéréotaxie, avec suivi par IRM et injections répétées d'un peptide seul ou couplé à des nanocapsules de paclitaxel, une perte de poids supérieure à 20 % déclenchant la mise à mort. Le porteur revendique une combinaison d'études permettant de "raffiner" les doses et de réduire les lots suivants. Il affirme qu'il est "indispensable" de passer par un modèle animal reproduisant le glioblastome avant tout essai chez l'humain.

Objectifs

Le glioblastome (GBM) est le cancer cérébral le plus fréquent et le plus agressif, avec 200 000 décès par an dans le monde, une survie médiane de 14 mois et aucun traitement curatif. Le traitement actuel consiste en une exérèse chirurgicale suivie par le protocole de Stupp (radiothérapie et chimiothérapie avec le témozolomide). Des travaux publiés ont montré l’action anti-mitotique du peptide NFL-TBS.40-63 dans des cellules de GBM (rats, souris, humain). Ce peptide inhibe la prolifération et la viabilité des cellules souches et différenciées de GBM. Chez des rats porteurs d’un GBM orthotopique (F98), des injections intraveineuses répétées de ce peptide (15 mg/kg, une injection par jour pendant 5 jours) diminue de 53,5% la taille de la tumeur et améliore leur survie par rapport aux animaux non traités (résultats non publiés). Sur ce même modèle tumoral, la barrière hémato-encéphalique est lésée et permet le passage de molécules comme ce peptide (APAFIS N°2901) (résultats non publiés). De plus, adsorbé à la surface de nanocapsules lipidiques (LNCs), ce peptide augmente leur internalisation dans des cellules murines de GBM (GL261) comparativement aux LNCs seules. In vivo, une seule injection intratumorale de LNCs couplées au peptide et chargées en paclitaxel (0,8 mg/kg) diminue de manière plus efficace le volume tumoral de souris portant un GBM murin comparativement aux LNCs chargées en paclitaxel et non couplées au peptide (75% contre 60%, respectivement). Une société de biotechnologies en santé travaille sur les formulations du peptide seul (GC01) et combiné aux LNCs-paclitaxel (GC04) pour en faire de futurs candidats-médicaments pour le GBM. Leur développement pharmaceutique a permis de les formuler pour une utilisation clinique (formulations validées in vitro sur des cellules de GBM, notamment les cellules F98 utilisées dans ce projet) (résultats non publiés). Le but de ces travaux avancés de recherches pré-cliniques non réglementaires est d’étudier la tolérance et l’efficacité de GC01 et GC04 après administrations répétées chez des rats sains ou porteurs de GBM en déterminant la voie d’administration la plus adaptée (intraveineuse IV, intrapéritonéale IP ou sous-cutanée SC) dans un modèle physiopathologique proche de celui observé chez l’Homme afin de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients.

Bénéfices attendus

Une société de biotechnologies en santé travaille actuellement sur des formulations du peptide seul (GC01) et combiné aux LNCs chargées en paclitaxel (GC04) pour en faire de futurs candidats-médicaments dans le traitement du GBM. Ces nouvelles formulations ont été préalablement testées et validées in vitro sur des cellules de GBM (notamment sur les cellules F98 qui seront utilisées dans ce projet) (résultats non publiés). Le but de ces travaux avancés de recherche pré-clinique non réglementaire est donc d’étudier in vivo la tolérance et l’efficacité de GC04 et de valider le maintien de l’activité de GC01 après administrations répétées chez des rats sains ou porteurs de GBM tout en déterminant la voie d’administration la plus adaptée pour ces traitements (intraveineuse IV, intrapéritonéale IP ou sous-cutanée SC) dans un modèle physiopathologique le plus proche possible de celui observé chez l’Homme, dans le but de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients opérables ou non. Ces travaux avancés de recherche pré-clinique non réglementaire ont pour but de valider l’innocuité des traitements et leur efficacité et ainsi, confirmer leur intérêt thérapeutique. Si l’intérêt thérapeutique est attesté et la posologie déterminée, ces travaux pourront servir de base pour la mise en place d’essais pré-cliniques règlementaires avant la mise en place d’essais cliniques.

Procédures

Dans l’étude 1, les animaux subiront deux types d’intervention, des injections IV ou IP ou SC sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) et un prélèvement par ponction cardiaque (1 fois puisque cette intervention sera suivie par la mise à mort des animaux). Dans l’étude 2, les animaux subiront trois types d’intervention, l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure quelques heures, le suivi de la croissante tumorale par IRM (3 IRM de suivi qui dureront quelques heures et qui seront espacées de plusieurs semaines) et des injections IV ou IP ou SC sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles). Dans l’étude 3, les animaux subiront deux types d’intervention, une injection unique IV ou IP ou SC qui durera quelques minutes et des prélèvements répétés de sang au niveau de la veine caudale et de la veine jugulaire (5 à 7 prélèvements maximum, qui dureront quelques minutes chacun et qui seront espacés de plusieurs minutes à plusieurs heures). Dans l’étude 4, les animaux subiront trois types d’intervention, l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure quelques heures, le suivi de la croissante tumorale par IRM (1 IRM de suivi qui durera quelques heures) et des injections IV ou IP ou SC (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours) ou une injection unique IV, qui dure quelques minutes, ou une injection intra-tumorale qui durera quelques heures.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des candidats médicaments seront évalués lors de l’étude 1 qui a pour but d’évaluer l’innocuité des traitements et de définir ainsi les doses maximales répétées tolérées (MTRD) ou les doses sans effet nocif observables (NOAEL). GC04 étant composé d’un anticancéreux (le paclitaxel), des effets indésirables communément retrouvés après injection de ce type de composé pourraient être observés (modification de la formulation sanguine, perte de poids, faiblesse, etc.). Les effets indésirables peuvent être également liés à l’acte chirurgical et la croissance tumorale (hyperpression intracrânienne, œdème, etc.) ainsi qu’à l’injection des traitements (rougeur, inflammation, etc.).

Devenir

A l’issue de toutes les procédures, pour toutes les études décrites, les animaux seront tous mis à mort par inhalation de CO2 pour prélèvements de sang et/ou d’organes afin de réaliser des études post-mortem, ou seront mis à mort suite à l’atteinte de points limites spécifiques et établis selon un tableau de score (par animal) qui permettra d’évaluer l’état général des animaux (une perte de poids supérieure à 20%, par rapport au poids mesuré en début de protocole, ou un score égal ou supérieur à 12 points impliquera la mise à mort de l’animal avant la fin de la procédure ou de l’étude).

Remplacement

L’utilisation de GC01 et GC04 en thérapeutique étant à visée humaine, il est nécessaire de réaliser des études précliniques, comme ici des études toxicologiques et d’efficacité pour démontrer et valider sans aucune ambiguïté leur innocuité et efficacité avant de passer à des essais cliniques chez l’Homme. Ces traitements visent les femmes et les hommes, c’est pourquoi il est important de démontrer leur innocuité chez les deux sexes. Des travaux menés sur des cultures de cellules tumorales et saines ont déjà été réalisées pour valider les molécules et formulations testées. Pour compléter l’étude, il est indispensable de passer sur un modèle animal mimant les conditions de développement du GBM avant de pouvoir tester les molécules sur des patients atteints de ce cancer.

Réduction

La combinaison des deux premières études (études 1 et 2) permettra de raffiner la posologie et le mode d’administration, et ainsi de réduire le nombre de lot d’animaux à tester dans les études suivantes (études 3 et 4). Le nombre d’animaux mâles pourra également être réduit au strict minimum en fonction des résultats obtenus chez les femelles. De plus, lors de l’étude de toxicité, une seule dose à la fois sera testée. Ainsi, si la plus haute dose n’est pas toxique, les doses plus basses ne seront pas systématiquement testées. Le nombre d’animaux choisi par groupe est suffisant pour garantir des données précises, représentatives de l’espèce, et statistiquement exploitables. Il n’est pas utile d’avoir plus d’animaux, mais il est préférable de ne pas en utiliser moins, au risque d’être confronté à des variations entre des animaux d’un même groupe. Pour les études 1 (toxicité) et 4 (biodistribution), des comparaisons multiples (ANOVA) et des comparaisons appariées (Bonferroni’s correction) vont être effectués entre les différents groupes, notamment entre les groupes contrôles et les groupes traités. Pour l’étude 2 (efficacité), les analyses statistiques seront réalisées grâce au test Log-Rank après représentation des données sous forme de courbes type Kaplan-Meier, afin d’évaluer de potentielles différences significatives entre les différents traitements.

Raffinement

Les animaux sont reçus 2 à 4 semaines avant de débuter les expérimentations afin qu’ils s’acclimatent à leur nouvel environnement et à la contention. Selon l’Arrêté du 01/02/2013 fixant les conditions d’agrément, d’aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs, éleveurs ou fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques, le nombre de rats maximum par cage sera défini en fonction de leur poids (et âge) et du type de cage (surface adaptée). Par exemple, 7 rats femelles de 200-300g pourront être hébergées dans des cages de 1820 cm2. Aucune alimentation spécifique (à part nourriture et eau suffisantes), ni enrichissement particulier des cages (à part la présence d’une cabane) n’est nécessaire pour mener ces études. La douleur et l’angoisse de chaque animal seront évaluées par un suivi quotidien de leur poids, de leur bien-être, d’un changement dans leur comportement, de l’apparition de signes cliniques de souffrance (posture, poils hérissés et sales, tremblements, prostration, difficultés de se déplacer, aucune réponse aux stimuli …). Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi. Afin d’évaluer de façon raffiner la souffrance/douleur des animaux tout au long de l’expérimentation, un système de score sous forme de tableau sera mis en place et annoté régulièrement pour chaque animal et pour chaque paramètre contrôlé (apparence physique, comportement, hydratation et prise de poids). Un score de 0 à 4 sera établi pour chaque paramètre contrôlé, 0 correspondant à un paramètre normal et 4 correspondant à un paramètre anormal fortement prédictif d’une souffrance ou d’une douleur. Dans le cas où un animal présenterait un ou des signes de souffrance, pour un score inférieur à 12 points (points limites prédictifs et précoces adaptés), de la buprénorphine (0,05 mg/kg) serait administrée (en sous-cutanée) toutes les 4h en journée (3 injections maximum par jour), pendant plusieurs jours, jusqu’à ce que ces signes disparaissent. Une perte de poids supérieure à 20%, par rapport au poids mesuré en début de protocole, ou un score égal ou supérieur à 12 points (critère d’arrêt) impliquera la mise à mort de l’animal. Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi, mais la décision finale sera prise dans les 24h par le porteur de projet.

Choix des espèces

Au début de l’expérimentation, les rats Fischer adultes seront âgés de 9-10 semaines. A leur arrivée à l’animalerie, les rats fournis seront âgés de 6-7 semaines. Pendant les 2 à 3 semaines de stabulation, les animaux s’acclimateront à leur nouvel environnement et seront manipulés par les expérimentateurs quotidiennement pour les habituer à la contention et ainsi réduire leur stress lors des études. Le choix de l’âge en début de projet a été dicté par la procédure de chirurgie (la taille de l’animal doit être suffisante pour être adaptée au cadre de stéréotaxie utilisé dans l’animalerie), mais aussi par les précédents travaux réalisés dans le laboratoire. Les animaux seront des femelles et des mâles. Il est important de vérifier l’efficacité anti-tumorale de GC01 et GC04 sur les deux sexes puisque ce traitement est destiné à la fois aux femmes et aux hommes. Ces études seront d’abord réalisées sur des rats Fisher femelles adultes, qui ont déjà été utilisées dans de précédentes études menées sur GC01. Selon les résultats (étude 1 et 2), les doses à injecter chez les rats mâles pourront être modulées pour ainsi réduire au strict minimum le nombre de lots d’animaux mâles à utiliser (réduction).