Toxicologie (hors obligations réglementaires)

2400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, l'injection d'un candidat-médicament marqué à un isotope radioactif puis jusqu'à dix prélèvements sanguins, certaines étant isolées jusqu'à 96 heures en cage à métabolisme, pour suivre la distribution du produit dans les organes. Le porteur précise que ces études sont commandées par des entreprises clientes, selon un schéma répétitif de sélection de candidats-médicaments. Il indique que la tumeur peut atteindre 1500 mm3 ou se nécroser et que la toxicité peut entraîner une perte de poids supérieure à 20 pour cent, et affirme qu'aucun modèle ex vivo ou sur organoïdes ne reproduit la complexité physiologique de l'animal.

Objectifs

Les études de pharmacocinétique sanguine, de distribution tissulaire et d’élimination de candidats médicaments biologiques représentent une étape essentielle dans le développement d’un médicament. Ces études, demandées par les conseils scientifiques des entreprises clientes, ont pour but la compréhension et l’analyse du devenir du médicament dans l’organisme, d’évaluer une potentielle accumulation de ce dernier dans les organes et/ou tissus et ainsi de pouvoir mieux appréhender d’éventuels effets indésirables. Dans le cadre d'études en cancérologie, il est également crucial de vérifier le ciblage spécifique des candidats médicaments pour les cellules cancéreuses que ce soit à but diagnostic ou thérapeutique. Ces études in vivo s’inscrivent dans un contexte d’études répétitives car elles seront réalisées selon un même schéma directeur expérimental ayant pour unique objectif l’étude pharmacologique de sélection de candidats médicaments biologiques. Les variations peuvent porter sur la souche de souris sélectionnée pour l’évaluation du candidat, le mode d’administration du candidat, le nombre d’animaux par groupe et le nombre de groupes (différentes doses et/ou différents temps d’euthanasie à analyser). Ces études in vivo sont menées à partir de l’administration de candidats médicaments préalablement marqués par un isotope radioactif de faible énergie afin de tracer et de quantifier ces candidats dans les différents tissus dont le tissu tumoral et fluides biologiques d’intérêt. La radioactivité est administrée à des doses ne présentant aucun effet nocif pour la santé de l’animal.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont que la molécule testée soit spécifique du tissu tumoral ciblé afin dans un second temps de développer des candidats-médicaments spécifiques de ces tumeurs à but diagnostique et/ou thérapeutique.

Procédures

Toutes les souris sont injectées en sous-cutanée avec des cellules cancéreuses ; fréquence : 1 fois/animal durée : 30 sec. Les souris recevront toutes une injection d'un candidat-médicament ; voies possibles : IV, SC, IM, IP, voie orale et intravésicale fréquence : 1 fois/animal durée : 30 sec à 3 min. A l'exception des souris en cage à métabolisme, toutes les souris seront prélevées en sang : - Cas du microsampling : fréquence max 3 fois sur 24 heures puis 1 fois par 24 heures pendant 7 jours = 10 prélèments durée/prélèvement : 1 min - Cas des autres techniques de prélèvements: fréquence max 2 fois avec un intervale minimum de 1 heure et maximum de 5 jours durée/prélèvement : 1 min Les souris en cage à métabolisme sont isolées pendant 96 heures au maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables inattendus sont: - tumeur aggressive dépassant les 1500 mm3 et/ou nécrosante entrainant l'arrêt de l'étude pour les animaux concernés. - toxicité de la molécue testée se traduisant par une perte de poids >20% et/ou un état général dégradé ( poils piqués, réduction de la motricité , perte d'appétit...) entrainant l'arrêt de l'étude pour les animaux concernés.

Devenir

Tous les organes d'intéret doivent être prélevés d'où l'impossibilité de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Ces étude ne peuvent pas être remplaceées étant donné que le système d'intéraction tumeur et molécule à tester est complexe et qu'à l'heure actuelle ex-vivo, sur organoides ou modélisation ne permet de reproduire la complexité physiologique de l'animal.

Réduction

Un groupe composé de 6 individus au maximum est nécessaire et suffisant à la détermination d'un coefficient de variation prenant en compte la variabilité interindividuelle. La mesure radioactive est très précise et répétable ne nécessitant pas l'intégration d'animaux supplémentaires. Aucun test statistique n'est envisagé. Il sera uniquement prévu de calculer la moyenne et l'écart-type obtenus sur chaque groupe de 6 animaux.

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place: Une une période d'acclimatation de 5 jours minimum avant l'entrée dans le protocole ; Des conditions d'hébergement adéquates incluant un enrichissement avec du papier accordéon et des tunnels teintées un suivi quotidien des animaux ; la mise en place de méthodes d'anesthésie et d'euthanasie reconnues et validées ; l'instauration de points limites pertinents et précoces le respect des volumes d'injection , de la fréquence et des volumes de prélèvements sanguinss

Choix des espèces

Les souris sont des animaux préférentiellement utilisés dans les phases précoces de recherche de biodistribution tissulaire. Le choix de la souche et du sexe dépendra ensuite des résultats antérieurs de la Société cliente. Les animaux sont utilisés à l'âge de jeune adulte (environ 6-8 semaines). Le système immunitaire à cet âge est mature.

690 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent gavages, injections intrapéritonéales, une inhalation et une irradiation reproduisant l'exposition à des substances génotoxiques comme l'acétaldéhyde, le formaldéhyde ou les UV, pour étudier la réparation de l'ADN et le risque de cancer. Le porteur indique que les irradiations peuvent provoquer une inflammation aiguë de la peau et affirme que l'exposition aux produits mutagènes sera trop courte pour causer des lésions visibles. Les souris sont ensuite tuées pour analyse des tissus et organes.

Objectifs

Les ultraviolets et les psychotropes comme le tabac ou l’alcool contribuent au développement de tumeurs. L’exposition à la lumière UV ainsi qu’aux drogues récréatives endommagent l’ADN des cellules humaines et augmentent le risque de cancers dans la population en induisant des mutations sur l’ADN. Les altérations produites par ces substances nuisibles à l’ADN sont pris en charge par des systèmes de protection de l’ADN tels que la réparation par excision de nucléotides (NER) et, à défaut, par les polymérases translésionnelles (TLS). Des lésions non réparées entraînent des mutations qui augmentent le risque de cancers. Ces produits communément présents dans de nombreuses drogues récréatives, tels que l’acétaldéhyde, le formaldéhyde et le benzo(a)pyrène, ainsi que l’exposition prolongée et chronique aux UVs, produisent une large gamme de lésions à l’ADN qui sont réparées par le NER. Xeroderma Pigmentosum (XP) est une maladie génétique rare causée par une déficience constitutive du NER. Les patients XPs ont un risque de cancer de la peau 10 000 fois plus élevé, dû à leur inaptitude à réparer les dommages induits par les UV. Il a été montré que les patients XP ont un risque de cancer interne plus de 100 fois plus élevé. Les processus mutationnels impliqués ne sont pas bien compris. Il est possible qu’ils soient dus à l’action de sources mutationnelles interne ou externe au corps, telles que l’acétaldéhyde ou le formaldéhyde. De plus, une augmentation du risque de cancers corrélé à des mutations délétère sur un allèle (mutation inactivant une copie d’un gène, c’est-à-dire une mutation hétérozygote) de gènes du NER a été montrée dans des modèles murins et humains. La consommation excessive des psychotropes cités pourrait impacter le risque de cancer chez des porteurs de ces mutations NER dans la population générale. Certaines populations présentent ces mutations hétérozygotes de manière particulièrement fréquente, allant de 0,5 à 2% de la population. L’évaluation de la susceptibilité aux cancers associés à l’abus de ces substances, ainsi qu’à l’exposition excessive aux UV est donc de haute pertinence clinique. Notre projet vise à identifier les conséquences au niveau de l’ADN et des mutations engendrées par l’exposition chronique d’animaux adultes et pendant la grossesse à ces substances cancérigènes et au rôle joué par le NER et la voie des TLS.

Bénéfices attendus

Identifier la quantité et le type de mutations engendrés par ces sources cancérigènes chez nos souris nous permettra de préciser les diagnostiques fait pour les cancers humains, ainsi que la mise en évidence d’une potentielle population particulièrement à risque pour l’exposition à ces substances.

Procédures

Gavages: nombre= 3, durée = 2 minutes . 4 injections intrapéritonéales :30 secondes:. Inhalation (1), durée: 10 minutes. Irradiation (1) : durée: 14 minutes.

Impact sur les animaux

Les irradiations sont susceptibles de provoquer des inflammations de la peau de manière aigue et contenue à la zone d’irradiation. L'exposition aux produits mutagènes ne sera pas d'une durée suffisante pour provoquer des lésions macroscopiques qui entraîneraient des nuisances.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses sur les tissus et organes.

Remplacement

L’utilisation d’animaux se révèle essentielle pour l’étude de la mutagenèse dans un contexte prénatal. En effet il est impossible de répliquer ce processus complexe de développement ex vivo. Pour ce qui est de la tumorigenèse induite par les UV, les études In vitro, bien que points de départ nécessaires et importants, ne nous permettent pas de modéliser ni de prendre en compte le processus complexe qu’est la tumorigenèse chez un être vivant complet, avec toutes les interactions entre organes.

Réduction

Notre projet n’étudie pas de caractéristiques quantifiables sur les animaux mêmes, mais sur des séquençages fais à partir de tissus récupérés sur ces animaux. De ce fait, les statistiques elles-mêmes sont fait sur les résultats de séquençage, et ne prennent pas en compte le nombre d’animaux. Nous avons besoin de 10 individus différents par génotypes et traitements pour rendre nos statistiques robustes sur l’analyse haut débit.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subis par les animaux, ceux-ci sont suivis quotidiennement par le même manipulateur et les mêmes animaliers. Pour les interventions et procédures des anesthésies seront effectuées. Un traitement d’appoint sous forme de crème analgésique est prévu en cas d’inflammation cutanée suite aux expositions aux ultraviolets. Des points limite et des critères d'arrêt de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les 9 modèles nécessaires sont tous d’ores et déjà existants chez la souris sur un fond génétique C57BL/6 et/ou BALB/c. L’organisation du système vasculaire de la souris et les relations avec le microenvironnement tumoral sont très proches de celles observées chez l’Homme. L’utilisation de la souris permet d’obtenir des effectifs suffisants et des lots homogènes permettant une reproductibilité des résultats. Les stades choisis sont justifiés par les maladies qui peuvent apparaître, suivant les carcinogènes, à différents stades de la vie dans l'espèce humaine. Des femelles et mâles à maturité sexuelle (à partir de 8 semaines) pour les expériences sur les animaux adultes et pour permettre un maintien de la lignée. Des femelles pour les traitements au cours de la gestation. Pour analyser la mutagenèse prénatale après exposition aux différentes génotoxines, nous aurons besoin d'individus âgés de 2 à 3 semaines.

116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, des injections intraveineuses et des séances d'imagerie répétées sous anesthésie, pour suivre la biodistribution de six molécules anticancéreuses modifiées. Les souris dont la tumeur dépasse 400 mm3 ou se nécrose sont mises à mort par dislocation cervicale. Le porteur présente l'étude comme préliminaire, destinée à sélectionner les meilleurs candidats, et revendique une réduction du nombre d'animaux grâce à l'imagerie de fluorescence.

Objectifs

Le TLR3 est un récepteur de l'immunité permettant au corps de se protéger des infections. Il est exprimé par les cellules immunitaires et épithéliales normales ainsi que de très nombreux cancers solides. Le concept du TLR3 comme cible anticancéreuse existe depuis près de 30 ans, même si son mécanisme exact n’est connu que depuis peu. L’activation de ce récepteur entraine une mort programmée spécifique des cellules cancéreuses (pas des cellules normales), ainsi qu’une inflammation locale ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes d’action induit une autovaccination empêchant les récidives. Malgré cela, aucun activateur de ce récepteur n'a jusqu’ici obtenu l'autorisation de mise sur le marché en raison d'effets toxiques, de manque d'efficacité ou d’homogénéité. Un nouvel activateur de ce récepteur a récemment été découvert, homogène, actif, spécifique et surtout très bien toléré. De nombreuses études sur souris ont permis d’objectiver l’efficacité de ce nouveau candidat médicament (non protégées, ni vectorisé), administré par voie locale (intratumorale). Afin de favoriser l'administration par voie veineuse, ce candidat médicament sera protégé (pour résister aux enzymes présentes dans le sang qui peuvent dégrader ces molécules), et vectorisé (afin de cibler spécifiquement les cellules tumorales et immunitaires d’intérêt). L’objectif de cette étude est donc d’observer les effets de ces protections et vectorisations sur la stabilisation et la localisation des candidat médicament au cours du temps. Il s’agit d’une expérience préliminaire destinée à raffiner le choix des meilleurs candidats (qui devront être confirmé par la suite par des études de biodistribution plus complètes et à visées statistiques). Pour cette étude préliminaire, six différentes molécules (portant différentes combinaisons de protection et de vectorisation), seront analysées. Ces molécules seront toutes marquées avec une molécule fluorescente. C’est cette fluorescence qui permettra de les localiser et de les quantifier au cours du temps, grâce à des méthodes innovantes d’imagerie en trois dimensions. Cela permettra d’obtenir une biodistribution corporelle de ces composés. Pour chacune des six molécules, cinq souris seront injectées par voie intraveineuse. Les souris seront analysées quand leurs tumeurs atteindront 100 à 200mm3. A cette taille-là, les tumeurs sont suffisamment bien vascularisées pour permettre une délivrance à la tumeur par voie sanguine.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de de définir les bases pour une nouvelle voie d’administration d'un candidat médicament, en ciblant plus spécifiquement certains types de tumeurs ainsi que des cellules immunitaires d’intérêt, ce qui diminue les doses nécessaires à son activité ainsi que les effets indésirables. Il s’agit d’une étude de recherche à la fois fondamentale et translationnelle, permettant de poser les bases d’une nouvelle voie d’administration d’un candidat médicament anticancéreux, en vue d’une étude clinique chez l’homme. La première procédure permettra de sélectionner et caractériser le meilleur model tumoral à utiliser pour les études de biodistribution. La seconde procédure permettra de cribler les molécules modifiées sur la base de leur cinétique et quantité de distribution à la tumeur et ainsi d'évaluer le/les meilleurs candidats pour une étude clinique en injection par voie intraveineuse.

Procédures

# Greffe tumorale: injections sous-cutannées de cellules tumorales dans le flanc sous anesthésie gazeuse (3-5 minutes). # Injections par voie intraveineuses (produit de contraste dans la procédure-1 et molécules fluorescentes dans la procédure-2), sous anesthésie gazeuse (3-5 minutes). # Analyses par imagerie échographiques (échodoppler et echographie de contraste) sous anesthesie gazeuse (temps d'analyses cumulés de 30-40 minutes environ). # Analyses par imagerie de fluorescence 3D (non invasive) sous anesthesie gazeuse (5 minutes environ - répétées aux temps 5min, 15min, 30min, 1h , 2h, 4h, 6h et 24h ).

Impact sur les animaux

Douleurs engendrées par l’injection de cellules tumorales, la pousse tumorale, les anesthésies répétées, stress engendré lors des analyses de volume tumoral et de poids de la souris. De façon plus détaillée: #Procédure-1: (1) les animaux seront greffées avec des cellules cancéreuses par injection sous-cutanée dans le flanc sous anésthésie gazeuse. (2) Suivi de croissance tumorale trois fois par semaine avec manipulation des animaux pour mesurer la tumeur et peser les animaux. (3) Lorsque les tumeurs atteignent environ 100 à 200mm3, les souris sont anesthésiées pour deux analyses en imagerie échographique consécutives (non invasive). La seconde analyse nécessitera l'injection intraveineuse (dans la veine caudale) d'un agent de contraste (toujours sous anésthésie). Le temps cumulé de ces deux analyses est d'environ 30 à 40 minutes. (4) Les souris ayant des tumeurs au-delà de 400mm3 ou nécrosée seront mises à mort par dislocation cervicale. #Procédure-2: Les animaux seront greffés avec des cellules cancéreuses par injection sous-cutanée dans le flanc (du modèle déterminé en procédure-1). Les souris seront anesthésiées et injectées avec les molécules fluorescentes par voie intraveineuse (dans la veine caudale). Les souris seront alors analysées en imagerie de fluorescence (non invasive) sous anesthésie aux temps 5min, 15min, 30min, 1h , 2h, 4h, 6h et 24h (chaque analyse prenant environ 5 minutes). Après la dernière analyse à 24h, les animaux seront mis à mort et leurs organes récupérés post-mortem pour analyses.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort. Leurs organes et tumeurs seront prélevés post mortem pour analyse.

Remplacement

Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo des molecules modifiées (efficacité, stabilité, internalisation), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle préclinique physiologique complexe est nécessaire dans les donditions d'injection par voie intraveineuse afin d’analyser la biodistribution dans les organes/tissus/tumeurs au cours du temps et de définir une approche qualitative et cinétique pour poser les bases d’une étude clinique.

Réduction

La procédure-1 permet de mettre au point le modèle et de le caractériser au mieux sur un nombre limité d’animaux (5 souris par modèle tumoral – 4 modèles). Ce nombre limité d’animaux est permis grâce à des méthodes non invasives d’imagerie échographiques de pointe permettant de répondre avec précision aux questions posées sur vascularisation des tumeurs et de perméabilité de celles-ci aux traitements injectés par voie intraveineuse. Seul le meilleur modèle sera utilisé par la suite. La procédure-2 s’effectue également sur un nombre limité d’animaux (8 animaux greffées pour 5 animaux analysés par molécule – jusqu’à 12 molécules). Pour éviter la dispersion des résultats, seuls les animaux les plus homogènes en termes de taille de tumeur mais aussi en termes de vascularisation seront analysés. La cinétique de biodistribution par imagerie de fluorescence constitue en soit une réduction par rapport aux biodistribution classiques en point final à chaque temps. Cette méthode évite ainsi d’avoir à procéder à de très nombreuses mises à mort d’animaux aux différents temps d’intérêt pour obtenir les mêmes résultats. Le fait que nous ne cherchions pas de résultats statistiques mais tout en étant sur un pool de tumeurs homogène et bien caractérisé, nous permet d’avoir les résultats suffisamment robustes pour répondre à la question du criblage de ces molécules in-vivo sur ce nombre limité d’animaux.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux, en environnement enrichi avec eau et nourriture (classique et non fluorescente) à volonté, dans des conditions sanitaires permettant que leur phénotype ne soit pas dommageable. Le changement d’alimentation pour une nourriture non fluorescente est généralement très bien toléré par les animaux et n’engendre pas de diarrhées ou autres troubles digestifs. Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscris à partir de la greffe tumorale afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs (significatifs d'exclusion de l'expérience et de Mise à Mort), et seront compensés par une augmentation des quantités de balles de coton et de batons à ronger. Les souris seront greffées avec tumeurs en injection sous-cutanée dans le flanc sous anesthésie gazeuse, selon les conditions publiées dans la littérature. La surveillance des animaux sera effectuée trois fois par semaine avec une analyse scorée du comportement animal, du poids corporel et du volume tumoral. La taille des tumeurs (de 100 à 200mm3 pour les études d’imagerie), permet une bonne analyse de la fluorescence ainsi qu’une souffrance et une gêne physique minimale pour l’animal, avec moins de risque de nécrose. L’imagerie par fluorescence et par échographie sont des processus non invasif et non douloureux mais nécessitant l’immobilité de la souris pendant l’acquisition des données. L'animal est anesthésié sous isoflurane et est placé dans une cassette de contention. Pour l’imagerie échographique, la souris est fixée sur un plateau chauffant réglable afin de maintenir sa température interne, contrôlable par une sonde anale. De plus les pattes sont fixées à des électrodes permettant de contrôler en direct l’ECG. Pour l’imagerie de fluorescence, de l’air chauffé circule dans l’appareil et permet de maintenir constante la température de l’animal. Les animaux sont réveillés sous une lumière chauffante et sous surveillance. Tous les animaux de l’expériences seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques permettant de démontrer dans un modèle physiologique complexe que les organes et/ou tissus normaux ne sont pas touchés par ces mécanismes d’action pouvant induire une toxicité du candidat médicament. En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé. Qui plus est, il existe aussi de nombreux outils (souris immunodéprimées, appareillage adapté comme le FMT...), qui permettent d'étudier précisément les différents mécanismes d’action de thérapies ciblées chez cette espèce. Des souris de 7 semaines seront utilisées. A cet âge, les souris sont physiologiquement matures, ce qui est nécessaire dans notre étude de biodistribution (assimilation, barrière hématoencéphalique...) etc. Les quatre types de tumeurs greffées provenant de patients humains ou d'une souche murine différente, donc toutes non immuno-compatibles, l'utilsiation des souris immunodéficientes BALB/c Nude permettra l'absence de rejet de ces tumeurs. De plus, s'agissant d'une souche de souris sans poils, l'acquisition de fluorescence s'en trouvera facilitée.

304 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant recevoir jusqu'à 15 administrations d'un candidat médicament et subir jusqu'à neuf temps de prise de sang, des prises de température rectale et deux examens des yeux sous anesthésie. Ces études de toxicité, d'un jour à quatre semaines, doivent aider à choisir les doses de futures études réglementaires, pour des molécules de cardiologie, d'oncologie, de neuropsychiatrie ou de maladies métaboliques. Les macaques des études de cinétique et de toxicité courte seront réutilisés après accord vétérinaire, 156 selon le décompte déclaré, ceux de la troisième catégorie tués par exsanguination pour prélever leurs organes, mais les effectifs donnés ("soit 12096 animaux sur la durée du projet") ne permettent pas de vérifier ce partage. Le porteur affirme qu'il est "indispensable de passer sur une espèce non-rongeur", et indique qu'aucune étude statistique ne fixe le nombre de 1 à 3 macaques par sexe et par dose.

Objectifs

Il reste encore de nombreuses pathologies pour lesquelles les besoins thérapeutiques ne sont pas satisfaits. L’objectif principal de la Recherche Pharmaceutique est de développer de nouvelles molécules à visées thérapeutiques qui seront évaluées durant des essais cliniques. Pour cela, un profil de sécurité de ces nouvelles molécules doit être établi conformément à la réglementation. Les études préliminaires vivo de sécurité non clinique interviennent précocement dans le processus de développement pharmaceutique et ne sont réalisées que sur des molécules testées au préalable sur les méthodes alternatives disponibles. Ces études préliminaires sont généralement de courte durée (entre 1 jour et 2 semaines, peuvent exceptionnellement aller jusqu’à 4 semaines dans le cas de molécule de type biologique) et utilisent un nombre restreint d’animaux. Leur objectif est d’identifier le profil cinétique, les potentiels effets secondaires et de cibler la gamme de doses à tester dans les futures études réglementaires. La conception de ces études est optimisée de manière à obtenir un maximum d’informations pour rendre plus efficace l’utilisation de ces animaux. En effet, en fonction des données disponibles du médicament, les examens pourront inclure certains paramètres cliniques (suivi du comportement, de la température, du poids, de la consommation alimentaire), hématologiques, biochimiques et cinétiques nécessitant des prises de sang ou encore histopathologiques par autopsie. Ces analyses seront adaptées à la molécule étudiée et à la pathologie concernée. Les études réalisées dans ce cadre ont pour but d’aider à choisir les doses pour les études réglementaires précliniques et, à terme, permettre de sécuriser la première administration du candidat médicament chez l’humain. Dans le cadre de ce projet, différents médicaments (molécule chimique ou biologique, thérapie génique, anticorps) pourront être testés en fonction des études réglementaires à réaliser.. Cela pourra inclure l'évaluation de médicaments avec une indication en cardiologie, en oncologie, en neuropsychiatrie ou pour le traitement de pathologies métaboliques et maladies auto-immunes. Liste des études concernées - Etudes précoces d’évaluation du profil cinétique et/ou du métabolisme chez le macaque cynomolgus - Etudes précoces d’évaluation de la toxicité de courte durée chez le macaque cynomolgus - Evaluation du profil toxicologique et toxicocinétique chez le macaque cynomolgus

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’évaluer très précocement la toxicité éventuelle de candidats-médicaments en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental des études réglementaires (diminution des contraintes pour l’animal). Détecter le plus précocement possible des effets potentiellement toxiques des candidats-médicaments en développement permettra en plus d’assurer la réduction du nombre d'animaux qui seront utilisés à des fins de recherche pour sécuriser in fine l’utilisation chez les patients.

Procédures

Les études incluses dans ce projet ont une durée de 1j à 4 semaines selon le mode d’administration prévu chez l’humain. Les voies d’administrations (orale ou parentérale) sont celles prévues chez l’Homme. Des examens réguliers seront faits à l’aide de matériel adapté à l’espèce et incluent : observations cliniques, prise de température corporelle (mesure rectale), prélèvements de sang pour vérifier les paramètres hémato-biochimiques et vérifier le passage du médicament dans le sang, examen cardiologique (ECG ou mesure de pression artérielle généralement par télémétrie non invasive sur 24h maximum), collecte d’urines sur 24h maximum (via des entonnoirs placés sous les unités d’hébergement), examen ophtalmologique (sous anesthésie, technique non invasive, en début et en fin d’étude : 30minutes maximum/examen ). Administration des traitements : voie IV (de quelques secondes à 30 minutes si perfusion) et PO (moins d’une minute) et sous-cutané (moins d’une minute); en fonction de la procédure, 1 à 15 administrations max Prélèvements sanguins : durée du prélèvement (moins de cinq minutes) 9 temps maximum sur plusieurs jours par semaine en fonction du type de candidat médicament (exemple : anticorps). Le volume total prélevé par semaine ne dépassera jamais à 7.5 % du volume total circulant

Impact sur les animaux

En fonction de la classe des produits et de la dose, on pourrait s’attendre à avoir, comme mentionné dans notre grille des points limites, des changements ou modifications de l’apparence (ex : absence de toilettage), du rythme respiratoire, de la consommation alimentaire et hydrique, de la température corporelle, de l’activité comportementale, des fonctions digestives et poids corporel. On s’assurera que la somme des observations ne dépassera le degré de sévérité mentionné dans chacune des procédures en mettant des actions correctives avec le support du vétérinaire du centre.

Devenir

Les animaux de l'études précoces d’évaluation du profil cinétique et/ou du métabolisme chez le macaque cynomolgus Les animaux (n=24/an ; soit 12096 animaux sur la durée du projet) seront réutilisés après accord vétérinaire. Les animaux de l'études précoces d’évaluation de la toxicité de courte durée chez le macaque Cynomolgus Les animaux (n=1520/an ; soit 75 80 animaux sur la durée du projet) seront réutilisés après accord vétérinaire. les animaux de l'évaluation du profil de sécurité non clinique et toxicocinétique chez le macaque Cynomolgus Les animaux (n=32/an ; soit 160 128 sur les 54 ans du projet) seront euthanasiés par exsanguination pour prélèvement des organes et analyse histologique post-mortem des tissus.

Remplacement

Il n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes alternatives à l’utilisation d’animaux pour définir les marges « sécurité » d’un candidat-médicament. Il est indispensable de passer sur une espèce non-rongeur pour sécuriser le passage d’un composé en développement clinique (demande réglementaire).

Réduction

Pour ces études, on utilise 1 à 3 animaux/sexe/dose en tenant compte de la disponibilité de données historiques pour de nombreux paramètres étudiés et de leur variabilité. Le choix du nombre d’animaux dépend de la variabilité des paramètres étudiés. Il n’y a pas d’études statistiques utilisées dans ce cas. Le nombre d’animaux est classiquement défini pour répondre à l’objectif de ces études.

Raffinement

Dans les études de sécurité non clinique, il est rarement fait usage de médicaments qui risquent d’interférer avec le produit à étudier et on s’appuie sur les fiches de point-limite pour prise de décision rapide (arrêt de la dose, euthanasie de l’animal etc…). Cependant, ponctuellement, le vétérinaire peut intervenir et décider de la mise en place de soins spécifiques (adaptés à l’observation notée). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie suite à l’administration d’un traitement) et mettre en place des techniques de raffinement telles que l’habituation par renforcement positifs (training) Une grille de points limite est employée afin de limiter la souffrance inutile de l’animal en permettant de mettre des actions correctives.Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (enregistrement télémétrie ou signes cliniques nécessitant l’hébergement individuel) ou éthologiquement (incompatibilités), avec de l’enrichissement adapté aux besoins des primates.

Choix des espèces

Les études de sécurité non-clinique n’ayant pas pour but de d’étudier un modèle de pathologie ni un effet thérapeutique mais de prédire au mieux les effets indésirables secondaires liés aux candidats médicament chez l’Homme, des PNH sains peuvent être sélectionnés à la place d’une autre espèce non-rongeur parce qu’ils sont plus proche de l’humain en considérant la totalité des paramètres listés ci-dessous : - Pharmaco et toxicocinétique : exposition plasmatique au médicament, élimination, fraction libre du médicament … - Métabolisme : type et quantité relative de métabolites produits - Pharmacodynamie : homologie, présence, affinité et répartition de la cible pharmacologique - Physiologique : le PNH ne doit pas présenter de réactions physiologiques spécifiques non pertinentes pour évaluer la sécurité chez l’Homme (ex : pH gastrique). - Techniques expérimentales : formulation et excipients tolérés, voie d’administration possible - Expérience des médicaments compétiteurs de la même catégorie. Les animaux utilisés dans ce projet seront de jeunes adultes ou adultes, conformément aux requis réglementaires.

100 mulots sylvestres capturés dans la nature vont être utilisés, tous tués à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire sous anesthésie et une injection de LPS, avant d'être tués pour prélever leurs organes. Le porteur anticipe une mortalité de 3 % dans les pièges et un stress lié à la capture et à l'hébergement. Il affirme que l'usage d'animaux sauvages est "requis", la réponse immunitaire des individus sauvages différant de celle des animaux de laboratoire.

Objectifs

Le concept de «One Health» postule que la santé humaine, animale et environnementale sont liées et promeut une approche systémique des questions environnementales, au profit des problématiques de santé publique associées. De nombreux changements environnementaux induits par les activités humaines (Fragmentation des habitats, pollution, zoonoses, ...) affectent les écosystèmes et la faune sauvage à l’échelle mondiale. Parmi ces menaces, l’exposition aux éléments traces métalliques (ETM) peut induire de nombreux effets toxiques à tous les niveaux d’organisation biologique (de la molécule aux services écosystémiques). L’exposition de Mammifères sauvages à des ETM toxiques a montré un effet immunosuppresseur aussi bien en laboratoire qu’en milieu naturel, les rendant potentiellement plus susceptibles aux pathogènes circulant dans l’environnement. Les performances du système immunitaire des animaux sont par ailleurs modulées par la qualité et la quantité des ressources alimentaires disponibles dans leur environnement. Les études abordant les effets des métaux sur le système immunitaire des Mammifères terrestres in natura sont rares et les mécanismes de l’immunomodulation par les métaux et par les ressources alimentaires mal connus. Des études comparatives portant sur le système immunitaire de rongeurs ont montré une différence significative des réponses immunitaires entre des groupes d’individus sauvages et de laboratoires, rendant nécessaire l’expérimentation sur le terrain, en complément d’approches en laboratoire. Dans ce contexte, l’objectif du présent projet vise à comprendre les mécanismes des impacts des métaux toxiques et de la qualité nutritionnelle sur l’état et le fonctionnement du système immunitaire de Rongeurs sauvages. Après une étude préliminaire visant à la mise au point, chez le Mulot sylvestre, de tests immunologiques développés chez la Souris domestique, le projet portera sur le site d’une ancienne fonderie de zinc (Zn) et de plomb (Pb) située dans les Hauts-de-France. Ce site se distingue par un gradient de concentrations en cadmium (Cd), Pb et Zn dans les sols : les concentrations décroissent des zones les plus contaminées, situées au pied de l’ancien site métallurgique, vers des zones peu affectées à plusieurs kilomètres de l’ancienne usine (et considérées comme « témoin » dans la présente étude).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de l’impact des polluants métalliques sur le système immunitaire d’une espèce sauvage, le Mulot sylvestre. Ces résultats permettront de développer des marqueurs de toxicité non conventionnels (par opposition aux marqueurs classiquement utilisés en évaluation des risques écotoxicologiques (ERE) que sont la mortalité, la croissance ou la reproduction) qui pourront à terme être transposés dans les procédures réglementaires d’ERE. L’immunomodulation du système immunitaire par les métaux permettra également d’évaluer l’impact potentiel sur la susceptibilité de ces Rongeurs à héberger des pathogènes zoonotiques, c’est-à-dire transmissible à l’Homme (par exemple les bactéries Borrelia sp. responsables de la maladie de Lyme).

Procédures

Pour les procédures 1 et 2, une prise de sang sera réalisée sous anesthésie générale pour chaque animal. Pour la procédure 3, les animaux recevront deux prises de sang sous anesthésie générale espacées de 5 jours. La prise de sang est effectuée en insérant une pipette Pasteur dans le sinus rétro-orbitaire des Mulots sylvestres pour collecter un échantillon sanguin (~150-200 µL en fonction de la masse de l’animal considéré) par capillarité, méthode de prélèvement considérée comme la moins stressante chez des souris de laboratoire. Le volume de sang maximal prélevé est estimé à 1,5% de la masse corporelle, soit 300 µL de sang pour un individu de 20 g. La prise de sang sera réalisée 2h après une injection intrapéritonéale de LPS (500 µg/kg). A la suite de cette intervention les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Mortalité La littérature ainsi que l’expérience des personnels impliqués dans ce programme laissent envisager un taux de mortalité de l’ordre de 3%. Les causes de décès peuvent être un stress conduisant à une rupture des cervicales ou un refroidissement en période froide (peu probable au printemps) et/ou pluvieuse dans les pièges. Des arrêts cardiaques peuvent être constatés dans les pièges ou lors des manipulations. En dehors de l’arrêt des captures en cas de conditions météorologiques défavorables, ces mortalités indésirables sont difficilement totalement évitables. Stress à la capture et durant les manipulations Les captures d’organismes sauvages entrainent nécessairement un stress, réduit au minimum par la relève des pièges dès que possible le matin (les captures ayant généralement lieu la nuit). Dès que les animaux sont sortis des pièges ou des cages, et après détermination spécifique immédiate, les animaux non-cibles (Campagnols par exemple) sont immédiatement relâchés, réduisant le stress au minimum. Les animaux-cibles (Mulots sylvestres) sont immédiatement anesthésiés pour la suite des manipulations (examen morphologique pour la détermination du sexe, mesures mophométriques pour la détermination de l’âge, prise de sang, injection de LPS). Les animaux trop jeunes sont relâchés dès les mesures morphométriques permettant d’estimer leur âge, de même que les femelles gestantes. Stress durant l’hébergement L’hébergement, sous tente et avec contrôle des conditions environnementales (Température, hygrométrie), dure de quelques heures à 5 jours maximum dans le présent projet. L’hébergement est individuel, ce qui, au printemps, correspond au comportement solitaire des Mulots sylvestres en période de reproduction et évite d’éventuels comportements antagonistes. L’observation comportementale et la pesée (permettant d’évaluer un point-limite fixé à une perte de masse de 20%) sont quotidiennes de manière à détecter un éventuel stress élevé chez les individus. L’expérience de l’équipe sur cette espèce montre que les individus tolèrent la captivité courte (5 jours) sans montrer de comportements (activité motrice, alimentaire…) dénotant un stress élevé.

Devenir

Les individus seront mis à mort pour un prélèvement d'organes. Ces organes permettront la mise au point de mesures immunologiques et la mesure de l’exposition aux métaux, grâce aux mesures des concentrations dans les tissus. Il s’agit d’une décision prise collégialement par les membres de la structure du bien-être animal de notre unité, au regard des aspects éthiques, scientifiques et logistiques.

Remplacement

L’objectif du projet est d’étudier la réponse immunitaire d’animaux exposés à une contamination environnementale en fonction de leur charge parasitaire (helminthes intestinaux) et de la qualité nutritionnelle de leur alimentation. L’utilisation d’animaux est requise car, à notre connaissance, aucune approche de modélisation ne permettrait d’obtenir de telles données. Des études comparatives sur le système immunitaire de rongeurs ayant montré que la réponse immunitaire d’individus sauvages et d’animaux de laboratoire différaient significativement, l’utilisation d’animaux sauvages est donc aussi requise.

Réduction

La variabilité inter-individuelle des réponses immunitaires est très forte en conditions naturelles. La variabilité liée à la biodisponibilité des ETM (Capacité de transfert de l’environnement vers un organisme) conduit aussi à des concentrations variables en ETM dans les organes cibles de différents individus du même site. Sur la base de ces informations, les effectifs prévus pour les procédures 1, 2 & 3 ne peuvent être inférieurs à 20 Mulots (Procédure 1), 40 Mulots (Procédure 2) et 40 Mulots (Procédure 3) pour garantir une puissance statistique suffisante et la valorisation scientifique des résultats.

Raffinement

Suite à une procédure invasive telle qu’une prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire ou une injection de LPS, les animaux sont remis en cage et observés à différents temps après la procédure pour évaluer leur état sanitaire (blessure à l’œil, comportement dénotant une diminution de la vue, apathie, manque d’appétit…). Un point-limite (perte de 20% de la masse) est évalué quotidiennement lors des périodes d’hébergement (qui n’excédent pas 5 jours dans le présent projet). Les animaux seront hébergés sous tente avec un contrôle des conditions environnementales (Température, hygrométrie) et les anesthésies, mesures et prélèvements seront effectués dans le véhicule agréé pour expérimentation animale, donc en un lieu séparé de l’hébergement. Les animaux conservés pour les expérimentations sont hébergés entre quelques heures et 5 jours maximum en fonction de la procédure concernée. Les animaux sont hébergés dans les meilleures conditions possibles (hébergement individuel pour éviter des comportements antagonistes, cages adaptées, enrichissement). L’ensemble des procédures est effectuée par ou sous supervision directe de personnels hautement qualifiés et expérimentés dans le domaine de ce type d’expérimentation.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus). Il s’agit d’un Micromammifère abondant, ubiquiste, opportuniste avec un régime alimentaire varié (Majoritairement granivore). Son positionnement trophique intermédiaire le place comme une source de nourriture de premier choix pour un grand nombre de prédateurs (Rapaces et Mammifères) incluant des espèces patrimoniales (Milan royal par exemple). Leurs nombreuses utilisations dans la littérature permettent de les définir comme bio-indicateurs des impacts des activités anthropiques dans les écosystèmes, incluant la pollution environnementale. Leur facilité de capture et leur capacité à être maintenus en captivité en font un modèle biologique idéal par rapport aux objectifs scientifiques de cette étude. Les Mulots sylvestres utilisées dans la procédure 1 permettront de tester le croisement possible entre les techniques développées sur Souris et l’espèce modèle retenue dans ce projet, le Mulot sylvestre. Seuls des individus d’âge subadulte et adulte (masse supérieure à 15g) seront utilisés pour cette étude.

289 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes cérébrales, puis des inhalations répétées de solvants organiques comme le toluène en chambre, avec des tests comportementaux et un test du nystagmus post-rotatoire. Le porteur indique que de fortes concentrations peuvent provoquer troubles de l'équilibre et tremblements, censés disparaître dans l'heure suivant l'exposition. Il rattache le projet à la fixation de valeurs limites d'exposition des salariés et écarte le remplacement, l'électrocorticographie n'étant pas réalisable in vitro.

Objectifs

Ce projet a pour objectif la mise en place d'une méthode de suivi en temps réel de l’action des solvants organiques sur le cerveau par une mesure de l’activité cérébrale. Cette méthode d’enregistrement sans fil permettra de mesurer ces effets chez des animaux vigiles et libres de leurs mouvements lors de l’inhalation des solvants dans des chambres à atmosphère contrôlée. En outre, divers tests comportementaux seront réalisés en fin d’exposition afin de mettre en relation les modifications de l’activité du cerveau avec d’éventuelles déficiences motrices et/ou sensorielles. Ceci permettra d’avoir une vue d’ensemble sur les effets neurotoxiques aigus d’une exposition aux solvants organiques volatils.

Bénéfices attendus

L’e xposition des salariés à des solvants peut conduire à une dépression du système nerveux central et mener à une altération de leurs performances psychomotrices. L’exposition aux solvants peut donc être responsable de d’accidents du travail. Ainsi, afin de protéger la santé des salariés et limiter l’exposition de ces derniers à de fortes doses de solvant, des valeurs limites d’exposition ont été mise en place. Néanmoins, les relations doses/réponses des solvants sur l’activité cérébrale sont mal connues. Ce projet vise à proposer une méthode de mesure objective de l’effet des solvants sur le système nerveux central et d’améliorer les connaisances sur les risques liés aux expositions aiguës aux solvants organiques.

Procédures

Procédure 1 : Etude pilote (N=16) : N=12 : Chirurgie (1h) ; Inhalation « contrôle » + électrocorticographie (4 x 8h) ; inhalation « toluène » + électrocorticographie (4 x 8h) ; mise à mort et prélèvement de tissus N=4 : Mise à mort et prélèvement de tissus Procédure 2 : Mesure de l'activité cérébrale par électrocorticographie et analyse du comportement suite à l’exposition aux solvants (N=56) N=14 par dose de solvant : Chirurgie (1h) ; [Inhalation « contrôle » + électrocorticographie (4 x 8h) ; Comportement (30min) ; Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Comportement (30min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 3 : Mesure du nystagmus post-rotatoire suite à l’exposition aux solvants (N=48) : N=12 par dose de solvant : Chirurgie (45min) ; [Inhalation « contrôle » (4 x 8h) ; Test du nystagmus post-rotatoire (10min) ; Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Test du nystagmus post-rotatoire (10min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 4 : Analyse du comportement suite à l’exposition aux solvants (N=48) : N=12 par dose de solvant : [Inhalation « contrôle » (4 x 8h); Comportement (30min); Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Comportement (30min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 5 : Prélèvement sanguin et de tissus neuronaux suite à l’exposition aux solvants (N=96) N=8 par temps de prélèvement (temps 1 : à la fin du 4ème jour des périodes « solvant » ; temps 2 : à la fin de la semaine post-exposition). Les animaux seront mis à mort par prélèvement final du sang et du cerveau (5 minutes maximum, sous anésthésie profonde). Dans le cas où les quantités de solvant dans le sang ou le cerveau sont égales à zéro après une semaine de récupération lors de la phase expérimentale 1, le nombre de rats mis à mort au temps 2 pourra être réduit à n=4 pour les expérimentations suivantes.

Impact sur les animaux

Certains animaux seront exposés à des concentrations élevées de solvant. Ils pourront présenter des signes cliniques tels que des troubles de l'équilibre ou des tremblements. Ces signes cliniques devront, néanmoins, disparaître dans l'heure qui suivra la fin de l'exposition.

Devenir

La totalité des animaux prévus dans ce projet seront mis à mort à la fin des procédures les concernant, afin de récupérer les tissus biologiques d’intérêt pour les analyser.

Remplacement

Le modèle animal est indispensable pour obtenir des résultats exploitables puisque : - notre approche expérimentale, qui vise à étudier l’activité cérébrale par électrocorticographie, n’est pas possible in vitro. - notre projet étudie les atteintes au niveau comportemental et neuro-sensoriel, expérimentations qui ne peuvent être réalisées que sur l'animal vivant.

Réduction

Le protocole a été construit de telle sorte que le nombre d’animaux requis soit réduit à son minimum. Autant que possible, l’utilisation de chaque animal a été optimisée pour récolter un maximum de mesures, à la fois fonctionnelles, comportementales et histologiques. Sont décrites ci-dessous les mesures prises pour réduire le nombre d’animaux : 1) Les animaux seront leurs propres contrôles : Ils seront exposés initialement à une période de 4 jours d’air ambiant (période « contrôle ») puis 4 jours à des vapeurs de solvants organiques (période « solvant »). Les mêmes mesures fonctionnelles et comportementales seront réalisées pendant et à la fin de ces deux périodes pour comparaison. 2) Lors de la phase expérimentale 2, les effets fonctionnels et comportementaux de trois doses incrémentales du même solvant seront testés sur les mêmes animaux. Chaque exposition à une dose de solvant sera précédée d’une période « contrôle » afin de s’assurer que les animaux sont bien à leur niveau basal en terme de fonction cérébrale et de comportement. 3) Les animaux dont l'activité cérébrale sera mesurée pendant l'exposition aux solvants réaliseront également certains tests comportementaux, et seront ensuite mis à mort pour analyse histologique des tissus d’intérêt. 4) Les animaux dédiés aux tests comportementaux, mais dont l’acitivité cérébrale n’est pas enregistrée, seront également utilisés pour le dosage des solvants dans les tissus d’intérêt afin de réduire au maximum le nombre d’animaux concernés par la procédure de prélèvement seule.

Raffinement

1. Pe ndant toute la durée du projet, les animaux seront traités avec douceur et compassion par le personnel compétent. Des caresses seront prodiguées lors de chaque manipulation. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs ou les zootechniciens de façon à évaluer leur état physiologique et leur comportement. Les animaux seront hébérgés (si possible) par deux. Leur environnement sera enrichi par un tunnel en carton. 2. Concernant les chirurgies : - Afin d'atténuer la douleur, les animaux recevront un analgésique pré-opératoire et un anti-inflammatoire non stéroïdien sera délivré à l'animal (deux fois à 24h d’intervalle) après les chirurgies. - Pendant l'intervention chirurgicale : o Un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter le dessèchement oculaire o La température corporelle de l'animal sera maintenue à l’aide d’une couverture chauffante thermorégulée. - A la fin de l'intervention chirurgicale : o Une pommade sera appliquée afin d’accélérer le processus de cicatrisation. o Une injection de sérum physiologique sera faite afin de palier la déshydratation de l’animal, inhérente à la chirurgie - Suite à l’intervention : o Le réveil des animaux se fera dans une armoire chauffante ; ils bénéficieront d’une surveillance accrue avant le retour dans leur pièce d'hébergement. o De la nourriture sous forme de bouchon et sous forme gélifiée sera mise à disposition à l'intérieur de la cage. o Les animaux bénéficieront d'une période de suivi post-opératoire de 5 jours pendant laquelle ils seront observés (afin de déceler tout signe de douleur ou toute modification comportementale) et pesés quotidiennement. o Les animaux seront hébergés individuellement afin d'éviter l'exploration de sites d'incision et de suture par leurs congénères et la détérioration du dispositif implanté, mais seront mis dans des cages transparentes afin de garder un contact visuel entre eux. 3. Concernant les inhalations de solvants : - Les animaux seront habitués progressivement à être placés dans les enceintes d'inhalation afin de diminuer le stress lié à ce nouveau lieu. - Pendant la période d'exposition, les animaux seront observés toutes les 2 heures et une fiche de suivi clinique individuelle sera remplie en cas d'observation de signes de souffrance chez un animal. 4. Concernant les tests comportementaux : - Les animaux seront habitués progressivement aux divers dispositifs au moins deux semaines avant le début des expositions.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal s’est porté sur les rats Long Evans. En effet, le rat présente un métabolisme des solvants proche de celui de l'Homme. De plus, les tests comportementaux utilisés ici visent à évaluer les atteintes des solvants sur le fonctionnement de l’oreille interne. Les expérimentations, donc, doivent être menées sur des souches de rat pigmentées car, comme chez l'Homme, la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne (les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants). Les rats seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 3 mois) car l'oreille interne ainsi que les cytochromes présents dans le métabolisme des solvants doivent être matures.

1 200 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés par injection ou gavage, jusqu'à dix-huit administrations sur six semaines, afin de déterminer la dose maximale tolérée avant de futures études d'efficacité. Le porteur précise que les dommages attendus tiennent à une toxicité que les tests in vitro n'auraient pas détectée et que les animaux atteignant un point limite seront tués. Il affirme qu'il n'est pas possible d'étudier la tolérance d'un composé sans animaux, les approches in vitro et in silico ne tenant pas compte de l'"organisme entier".

Objectifs

Notre laboratoire travaille avec des laboratoires qui développent des composés à visée thérapeutique. Ces laboratoires nous sollicitent ensuite afin de réaliser par imagerie In Vivo des études d’efficacité sur des modèles animaux de pathologie ; classiquement il s’agit de modèles de cancer. Avant de pouvoir réaliser ces études d’efficacité, il est nécessaire d'évaluer la dose maximale tolérée qui pourra être utilisée. Les expériences menées dans ce projet sont donc des études préliminaires de tolérance menées chez l'animal sain. L’objectif est également de cibler au mieux les doses à utiliser afin de limiter le nombre de lots expérimentaux dans les projets futurs d'efficacité menés sur l'animal porteur d'une pathologie. Avant de recevoir les composés et d’envisager l’administration à des souris, le client aura réalisé une analyse de la littérature afin de vérifier si des études ont déjà été faites sur des composés de même classe et qu’ils ne possèdent pas de toxicité avérée. Le client aura également réalisé des tests in vitro pour déterminer la dose efficace 50% du composé. A partir de cette dose, la dose efficace équivalente chez la souris est déterminée par des calculs prenant en compte différents facteurs tel que le volume sanguin. C’est à partir de cette dose théorique que les doses à tester sont déterminées. Notre laboratoire n’a pas la capacité de tester des marqueurs biochimiques ou des marqueurs de tolérabilité et/ou l’obtenir des données de pharmacocinétiques. Ces analyses nécessiteraient en outre l’utilisation d’un grand nombre de souris supplémentaires. De plus, ce projet ne s’inscrit pas dans le cadre des études réglementaires de toxicité. Le déroulement des études prévues permettra de limiter au maximum du nombre de souris. Si la dose administrée est tolérée, une dose supérieure pourra être administrée au lot de souris suivant et ainsi de suite jusqu'à l'observation d'effets indésirables. (perte de poids, diarrhée, urine foncée, altération du comportement…). Dans ce cas, la dose supérieure ne sera pas administrée et si l'un des points limites est atteint, l'animal sera mis à mort. La dose sélectionnée sera la dose précédant celle qui a induit des effets indésirables.

Bénéfices attendus

Les expériences menées dans cette saisine ne s'inscrivent pas dans les études réglementaires de toxicité mais en tant qu'études préliminaires menées chez l'animal sain, avant des essais menés sur l'animal porteur d'une pathologie. Ce projet permet de cibler les doses qui seront utilisées pour de futures études d'efficacités évalué par imagerie. Lors de ces études, le nombre de lots utilisés sera donc réduit.

Procédures

- Pour le projet" Détermination de la dose maximale tolérée pour une injection unique": Pour chaque souris, administration du composé par voie IP (100µL/10g souris) ou par voie iv (sous 100-150µL) ou par gavage (200µL) en fonction du poids de l'animal. Les administrations seront réalisées sur animal vigile par du personnel qualifié. Nous pourrons être amenés à prélever du sang sur animal vigile au niveau sous mandibulaire: Sur chaque souris, au maximum 3 prélèvements de 100µl avec au minimum 1 semaine d'intervalle entre chaque prélèvement. - Pour le projet" Détermination de la dose maximale tolérée pour des injections répétées": Pour chaque souris,administration du composé par voie IP (100µL/10g souris) ou par voie iv (sous 100-150µL) ou par gavage (200µL) en fonction du poids de l'animal. Les administrations seront réalisées sur animal vigile par du personnel qualifié. La dose sera administrée à plusieurs occasions, avec un maximum de 18 administrations sur 6 semaines maximum et au maximum 1 administration 1 fois/jour. Nous pourrons être amenés à prélever du sang sur animal vigile au niveau sous mandibulaire. Sur chaque souris,au maximum 7 prélèvements de 100µL avec au minimum 1 semaine d'intervalle entre chaque prélèvement.

Impact sur les animaux

Les dommages attendus sont liés à une toxicité in vivo qui n'aurait pas pu être détectée in vitro. Une observation méticuleuse de l'état général des animaux tout au long des expériences ainsi que la définition de points limites pertinents permettra d'anticiper toute douleur ou souffrance chez les animaux.

Devenir

Toutes les souris seront mise à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.

Remplacement

Dans le cadre du développement de futurs médicaments, il est nécessaire d'évaluer leur toxicité potentielle en fonction de la dose administrée. Pour ce type de développements, les études sont classiquement réalisées in vitro, in silico ou avec des modèles animaux. Les études in vitro et in silico ne tiennent pas compte de la complexité d'un organisme entier (variété des tissus, communications inter organes etc...) et il n'est pas possible à l'heure actuelle d'étudier la tolérance d'un composé sans utiliser d'animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au minimum permettant d'obtenir des résultats pertinents soit 2 souris par doses. Il n’y a pas de test statistiques prévu. Les doses testées seront administrées de la dose la plus faible à la dose la plus forte, en décalé dans le temps sur des souris différentes (24h minimum ou plus entre 2 doses, en fonction de la cinétique d'élimination du composé, estimée par le client) ainsi si des effets indésirables sont observés sur 1 des 2 souris d’une dose, la dose inférieure sera retenue comme étant la dose maximale tolérée et les autres souris ne seront pas injectées avec les doses supérieures.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans des cages en portoir ventilé avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum, un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation et des objets d'enrichissement du milieu (celluron). Les animaux sont observés scrupuleusement quotidiennement afin de respecter leur bien-être et de déceler tout signes d’apparition d’effets indésirables (perte de poids, diarrhée, urine foncée, altération du comportement, douleurs…). Nous avons mis en place une grille de scoring et des points limites.

Choix des espèces

Ces études sont menées chez la souris saine car elles se situent en amont d'essais qui seront ensuite réalisés sur des animaux modèles de pathologie expérimentale.(modèles animaux de cancer par implantation orthotopique ou sous-cutanée de cellules tumorales par exemple) La taille de l'animal est compatible avec l'administration de composés parfois difficiles à produire par les chimistes en grande quantité et la petite taille de la souris (nécessitant donc peu de composés) en fait un animal souvent utilisé pour les premières études réalisées in vivo. C'est chez la souris qu'il existe le plus grand nombre de modèles de pathologies. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 6 et 12 semaines en fonction de la demande du chercheur. En effet, par la suite, les études d’efficacité se feront sur des modèles pathologiques de souris. Les modèles cancéreux sont induits sur des souris de 6 semaines minimum. Les traitements peuvent commencer immédiatement et jusqu’à 6 semaines après l’induction d'où le choix de l'utilisation d'animaux agés de 6 à 12 semaines.