Procédures modérées

Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids sont mises à mort, le poids n'étant relevé qu'une fois par mois. 57 souris déficientes en lipase hormono-sensible vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser l'expression de leurs gènes. Vigiles, elles subissent des évaluations comportementales et motrices de cinq à trente minutes chacune sur quatre jours, avec préhension d'une à cinq minutes et stimulations électriques, sans qu'aucun test soit nommé. Le porteur qualifie le stress lié à ces dispositifs de "léger à modéré", et écrit ailleurs que les mêmes tests génèrent "peu de stress".

Objectifs

La quantité et la distribution de la masse grasse évolue au cours de l’âge. Les souris déficientes en HSL présentent moins de masse grasse répartie différement que les souris contôles. L’objectif est de déterminer les liens entre masse grasse (caractéristiques du tissu adipeux) et le déclin fonctionnel lié au vieillissement par phénotypage comportemental. Ces travaux peuvent déboucher sur l’identification de nouveaux biomarqueurs de fragilité.

Bénéfices attendus

Au cours du vieillissement, les tissus adipeux sont affectés précocémment par les phénomènes de sénescence cellulaire. Cette étude permettra d’avoir une compréhension plus fine des processus de vieillissement dans les tissus adipeux, de déterminer l’importance de l’évolution de la masse grasse dans les complications liées à l’âge et d’identifier des marqueurs et des facteurs de risque précoces.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à une série d'évaluations comportementales et motrices, d'une durée de 5 à 30 minutes chacune, et réparties sur 4 jours non consécutifs.

Impact sur les animaux

Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent un certains niveau de stress : préhension de une à cinq minutes lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement ainsi que des stimulations électriques. Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent un stress léger à modéré lié notamment à la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement et l'exploration d'un nouvel environnement non familier.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et les tissus seront récupérés afin de réaliser des analyses d’expression des gènes.

Remplacement

Ce projet vise à étudier l'impact de la masse grasse sur les capacités globales des individus âgés, notamment les fonctions physiques et mentales. Pour répondre à cette question, l'étude nécessite un organisme vivant et intact capable d'intégrer des processus physiologiques complexes (métabolisme, vieillissement) et de manifester des comportements. Or, les tests comportementaux utilisés pour évaluer ces processus ne peuvent être reproduits par des approches sur cultures cellulaire. L’utilisation d’un modèle animal demeure indispensable pour cette étude, car il n’existe à notre connaissance aucun modèle alternatif reproduisant les effets du vieillissement et permettant une comparaison avec des modifications de la répartition des tissus graisseux (lipodystrophie). Le modèle de la souris a été choisi en raison de son espérance de vie plus courte et de la similarité de ses processus physiologiques avec l'Homme. Cette approche in vivo est la seule manière fiable et peu invasive d'étudier l'interaction entre la masse grasse et le déclin fonctionnel.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum en se basant sur les données de la littérature et ce nombre a été corrigé par un calcul de puissance statistique.

Raffinement

Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent peu de stress (préhension lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement). Une habituation aux gestes de manipulation sera effectuée avant chaque lot de tests pour limiter le stress généré par l’expérimentateur. De plus, Les animaux seront suivis quotidiennement afin d'identifier le plus précocement possible tout signe de souffrance ou de stress. Si l’animal présente des signes de détresse, comme une diminution modérée du poids corporel (en 10 et 20%), ou une aggressivité inhabituelle ou une prostration, l’animal sera placé en surveillance rapprochée. Des mesures de renforcement de l’enrichissement peuvent être mis en place comme la nourriture liquide, nidification supplémentaire. Si les signes persistent ou s’aggravent, l’animal sera temporairement exclu de l’étude et recevra si nécéssaires des soins adaptés. Si l’animal présentent des singes cliniques critiques ou irréversibles comme l’apathie, la perte de poids >20% (poids mesurés tous les mois), difficultés de déplacements, alors l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Lors de ce projet, nous cherchons à étudier les capacités d’un individu d’âge avancé en fonction de la quantité de masse grasse. Cela nécessite de l’étudier sur des organismes vivants, humains ou modèles animaux. La souris semble un choix plus approprié pour cette étude grâce à l’espérance de vie plus courte et des processus physiologiques similaires à l’Homme. Pour étudier la fragilité et les processus de vieillissement, une évaluation initiale sera effectuée à l'âge adulte (12 mois). L'objectif est d'identifier des marqueurs précoces liés à ces phénomènes.

Caractériser la pharmacocinétique de produits en vue d'une autorisation de mise sur le marché : 72 furets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour quantifier ces produits dans leurs organes. Chaque animal reçoit jusqu'à trois administrations, par voie intraveineuse, intratrachéale, intranasale ou orale, puis subit jusqu'à vingt prélèvements sanguins sous anesthésie sur cinq mois et jusqu'à cinq lavages broncho-alvéolaires de vingt minutes. Les furets sont mis à jeun deux à cinq heures avant chaque anesthésie pour limiter les vomissements. Le porteur justifie l'espèce par sa proximité pulmonaire avec l'humain et par la recommandation de tester sur un rongeur et un non-rongeur, et résume les bénéfices attendus en une phrase, contribuer au développement et "éventuellement" à la mise sur le marché de nouveaux produits.

Objectifs

L’autorisation de mise sur le marché (AMM) d’un produit (médicament, agent de contraste…) nécessite au préalable de caractériser notamment sa pharmacocinétique (PK) et sa pharmacodynamique (PD). La pharmacocinétique consiste à évaluer l’absorption, la diffusion, la métabolisation et l’excrétion du produit par l’organisme. Elle permet notamment d’améliorer les dosages et la posologie du produit par l’étude de sa concentration sanguine au cours du temps. Elle permet également de déterminer les voies d’administrations optimales selon la métabolisation du produit dans l’organisme. La pharmacodynamique consiste quant à elle à évaluer les effets du produit sur l’organisme. Ce projet a pour objectif de caractériser la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de produits après administration chez le furet.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera au développement et éventuellement à la mise sur le marché de nouveaux produits.

Procédures

Les animaux recevront une injection de produit en dose unique ou répétée (maximum 3 administrations) par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire, intrapéritonéale, intratrachéale, intranasale ou pers os. Ces administrations seront réalisées en moins de 1 minute sur animaux vigiles ou en environ 10 minutes sur animaux anesthésiés. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 8 fois pour des études courtes (moins de 2 semaines) et au maximum 20 fois pour des étude longues (5 mois). Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes soit 10 minutes au total en comprenant le temps d’anesthésie volatile. Des lavages broncho-alvéolaires pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 5 fois. Ces lavages s’effectuent en moyenne en 20 minutes avec le temps d’anesthésie. L’ensemble des prélèvements seront réalisés autant que possible lors d’une même anesthésie. Pour limiter le risque de vomissements, les animaux seront mis à jeun entre 2 et 5h avant chaque anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes avec ou sans anesthésie susceptibles d’induire un stress : pesées, suivi clinique, mise à jeun, administration des produits, prélèvements de sang et lavages broncho-alvéolaire. Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés et selon les voies d’administration, pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques (risque de pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies répétées, inflammation locale des sites d’injection).

Devenir

L’ensemble des animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements d’organes dans le but de réaliser la quantification ex-vivo des produits par différentes analyses.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire afin de pouvoir caractériser la pharmacocinétique et notamment la biodistribution d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique). Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable la biodistribution d’un produit dans un organisme vivant.

Réduction

Cette étude a fait l’objet d’une réflexion étayée par des connaissances statistiques et des données de la littérature scientifique afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Toutefois, pour obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’évaluer la biodistribution du traitement testé, des groupes de minimum 6 animaux seront utilisés. Si nécessaire, lors de phases amont, des études pilotes pourront être réalisées sur un nombre limité d’animaux (3 par groupe minimum). Afin de limiter le nombre d’animaux utilisé lors de ce projet, les analyses seront réalisées également en amont de l’administration des produits afin que chaque animal soit son propre contrôle.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines minimum sera respectée durant laquelle une période d’habituation pourra être mise en place si nécessaire. Cette phase consiste à caresser, porter et faire rentrer les animaux dans la boîte d’induction d’anesthésie qui sera ensuite utilisée lors des anesthésies pour les actes techniques. Les 3 premiers jours, les animaux ne seront pas stimulés pour s’habituer aux locaux et au personnel. Avant le démarrage de l’étude, le vétérinaire assurera une visite de contrôle clinique. Les animaux seront hébergés en groupes avec des enrichissements et appropriés à leurs besoins (distinction stricte entre les aires de repos avec des panières et linges permettant la nidation et des zones où ils pourront faire leurs besoins). Des hamacs comme aires de repos en hauteur et des jeux comme des balles avec des clochettes à l’intérieur, des hochets avec des objets à l’intérieur émettant du bruit à la manipulation, des tubes PVC organisés en un réseau à sorties multiples et servant également de cachettes pour les furets seront ajoutés au parc ou cages d’hébergement. Une alternance des jouets pour stimuler l’intérêt des animaux sera respectée afin d’éviter l’ennui. Un temps de jeux quotidiens (hors weekend et jours fériés) de 15 à 30 minutes avec les animaliers, en particulier ceux réalisant les soins quotidiens des animaux, sera également respecté pour habituer progressivement les animaux au contact humain et diminuer le stress lors des manipulations. Les animaux seront observés quotidiennement et ce depuis leur arrivée jusqu’à leur euthanasie. De plus, durant l’étude, le poids des animaux sera mesuré régulièrement (a minima une fois par semaine), accompagné d’un suivi clinique plus précis basée sur une grille de scoring (comportement général, écoulements nasaux et oculaires, aspect du pelage, difficultés respiratoires, aspect des muqueuses). En cas d’apparition de signes cliniques anormaux, des examens cliniques approfondis pourront également être réalisés par un vétérinaire responsable du suivi. Les signes cliniques observés seront pris en charge (injection de fluides, analgésiques, antibiotiques, etc…) dans la mesure où les actions n’interfèrent pas avec les produits injectés. Enfin, le personnel réalisant les actes sera habilité, formé et expérimenté.

Choix des espèces

Le modèle furet a été choisi car il constitue un modèle plus proche de l’homme que la souris à la fois sur le plan anatomique et au niveau physiologique et particulièrement pulmonaire. Cela en fait une espèce particulièrement pertinente pour l’étude de composés à visée thérapeutique ciblant les maladies respiratoires, permettant une meilleure transposition des résultats précliniques vers l’homme. De plus, il est souvent utilisé comme modèle préclinique intermédiaire permettant de conforter des résultats préliminaires obtenus en modèle souris qui est souvent un prérequis des agences réglementaires pour mieux prédire la biodistribution humaine et évitant ainsi le recours aux primates non-humains. Il est également fortement recommandé de réaliser les études de PK/PD sur deux espèces : rongeur et non-rongeur. Par ailleurs, ce modèle a l’avantage d’être plus grand qu’une souris permettant ainsi de réaliser des prélèvements tels que les prélèvements sanguins de façon plus fréquentes et en plus grandes quantités. Les animaux sélectionnés pour ce projet seront âgés au minimum de 3 mois correspondant au début du stade adulte.

Jusqu'à six injections par animal, des tests de suspension et d'agrippement répétés treize fois sur quatre mois, puis une chirurgie de vingt minutes sans réveil pour mesurer la contractilité du muscle : 1 008 souris porteuses d'une mutation myopathique vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyses moléculaires et histologiques des muscles injectés. Le projet vise à optimiser une thérapie génique que l'équipe dit avoir déjà validée dans le muscle, l'administration par voie sanguine ayant échoué lors des essais antérieurs. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de poursuivre dans ce modèle et que seule l'injection dans le sang permettra de vérifier l'effet à l'échelle d'un "organisme entier". La lignée fait l'objet d'une autorisation d'élevage pour phénotype dommageable, alors que le même document décrit des souris au comportement locomoteur, au poids, à la longévité et à la fertilité comparables à ceux des souris non modifiées.

Objectifs

Nous développons des approches thérapeutiques pour une maladie génétique rare du muscle, causée par des mutations dans un gène codant une protéine impliquée l’entrée et le transport de vésicules à l’intérieur de la cellule. Nous avons démontré que l'injection dans le muscle d’un virus thérapeutique exprimant une molécule ciblant la forme mutée de la protéine permet de restaurer la structure et la fonction du muscle dans un modèle murin de la maladie, lorsqu’elle est administrée à l’âge d’un mois. Cependant, le traitement est moins efficace chez les souris plus âgées qui présentent une atteinte musculaire plus prononcée. Par ailleurs, les essais d’administration systémique visant à traiter l’ensemble des muscles via la circulation sanguine se sont révélés inefficaces, même chez les souris âgées d’un mois. L’expression de la molécule thérapeutique dans la cellule par l’intermédiaire d’un vecteur viral est dépendante de son entrée dans la cellule et de son transport jusqu’au noyau. Nos travaux antérieurs ont montré que le vecteur est moins bien acheminé chez les souris malades et que ce phénomène s’empire avec la progression de la maladie. Ainsi la pathologie elle-même, semble compromettre l’efficacité de l’administration du traitement. L’objectif de ce projet est d’évaluer des stratégies thérapeutiques alternatives permettant d’acheminer efficacement la molécule de thérapie génique, notamment à travers l’utilisation de différentes combinaisons de vecteurs viraux ou non viraux.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’une maladie neuromusculaire rare et invalidante (prévalence estimée inférieure à 1 pour 100 000 naissances), pour laquelle aucun traitement curatif n’est actuellement disponible. La faiblesse musculaire progressive entraîne une perte d’autonomie, altérant significativement la qualité de vie des patients et nécessitant une prise en charge pluridisciplinaire. La réussite de ce projet représentera une avancée cruciale dans l’évaluation préclinique de notre molécule et permettra d’envisager le développement de traitements qui, à ce jour, n’existent pas pour les patients atteints de cette maladie. Par ailleurs, ce travail enrichira notre compréhension des différentes voies d’administration (virale et non virale) de thérapies géniques dans un contexte où la transduction virale est altérée. Les stratégies optimisées et les données générées pourront être extrapolées à d’autres pathologies caractérisées par des défauts similaires de délivrance du vecteur, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques

Procédures

Toutes les souris participant à cette étude recevront une thérapie via différentes voies d’injections (entre 1 à 6 injections maximum par souris selon le protocole suivi) réparties sur plusieurs semaines. Suivant la voie, les animaux seront vigiles ou anesthésiés. L’acte technique dure 2 minutes maximum et sera répété 6 fois maximum. Afin d’évaluer la force musculaire des animaux et donc l’efficacité des thérapies testées, certains animaux suivront des tests de force non invasifs (capacité à s’agripper ou à se suspendre). Les animaux seront vigiles lors de ces tests, chaque test pourra durer 5 minutes maximum et ils seront répétés 13 fois maximum sur 4 mois. Tous les animaux auront une chirurgie en phase terminale sans réveil afin de tester la contractilité musculaire. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie et durera 20 minutes. Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

La lignée de souris présente un phénotype dommageable. Les souris hétérozygotes développent progressivement une atrophie et une faiblesse musculaire (mais sur certain muscle uniquement et après mesure spécifique de la force). Elles n’ont pas d’autre signe clinique, et présentent un comportement locomoteur, un poids, une longévité et une fertilité comparables à ceux des souris non génétiquement altérées. Les manipulations nécessaires aux différentes procédures peuvent provoquer un léger stress chez l’animal. Les différentes injections dureront quelques minutes et sont susceptibles d’occasionner une douleur au moment de l’injection et, secondairement, un saignement et/ou hématome, une inflammation locale et rarement une infection. Les administrations répétées comportent un faible risque de péritonite. L’anesthésie gazeuse utilisée peut entraîner une perturbation de la thermorégulation et, dans de rares cas, une détresse cardio respiratoire. Les tests comportementaux de 5 minutes maximum pourront engendrer de la fatigue musculaire. Enfin, une chirurgie sans réveil sera effectuée sur certains animaux, l'anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de protocole selon la réglementation en vigueur pour études moléculaires et analyses histologiques des muscles injectés.

Remplacement

L’efficacité et l’absence de toxicité de notre approche thérapeutique ont été démontrées au préalable sur des cellules de patients en culture. La validité du modèle de souris de la maladie est reconnue par les experts du domaine et par plusieurs publications dans des articles à comité de lecture ainsi que par des présentations lors de congrès internationaux. Nous avons préalablement démontré l’efficacité et l’innocuité de l’approche dans le muscle de souris du modèle en utilisant un vecteur de type virus thérapeutique. Le but de ce projet est l’optimisation de cette thérapie dans le modèle de souris en testant différent véhicule pour délivrer le médicament dans tout l’organisme. Il est indispensable pour le développement préclinique de la molécule de poursuivre l’étude dans ce modèle. Seule l’administration du traitement dans le système sanguin permettra de vérifier son efficacité et sa potentielle toxicité à l’échelle d’un organisme entier.

Réduction

Le nombre maximal théorique de souris impliquées si toutes les procédures sont réalisées est de 1008. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et nos études précédentes afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. La réalisation des procédures et des étapes à l’intérieur des procédures seront réalisées de manière successive et adaptative, dans un ordre permettant de limiter le nombre d’animaux en fonction des résultats positifs ou négatifs. Les organes et tissus de souris issus de ce projet seront conservés en banque pour d’autres projets de l’équipe, évitant ainsi de nouveau prélèvements. Grâce à ces mesures de réduction, nous limitons au strict nécessaire le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant la validité statistique et scientifique de chaque protocole.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Un enrichissement de leur environnement est mis place avec au moins 2 éléments aux choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’entretien des animaux ainsi que les expériences seront réalisés par un personnel titulaire des autorisations et formations nécessaires. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les injections seront réalisées sous anesthésie gazeuse pour éviter toute douleur ou gêne, elles durent moins d’une minute par souris. Une analgésie sera pratiquée avant certaines injections pour éviter toute gêne. L’anesthésie gazeuse est réalisée en maintenant la thermorégulation en utilisant un tapis chauffant. Les jours suivants les injections une surveillance renforcée des souris sera exercée par l’animalier en charge de la lignée ou les personnes en charge des protocoles. Les mesures de forces sont non invasives et seront réalisés entre 1 et 13 fois maximum par souris afin de limiter un stress répété. Les mesures de forces en fin de projet seront réalisées sous anesthésie et analgésie et sans réveil. Les animaux ne développent habituellement pas de phénotype conduisant à une diminution de leur locomotion mais le cas échéant, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage pour améliorer la prise alimentaire. La lignée fait l’objet d’une autorisation d’élevage pour phénotype dommageable. Dans toutes les procédures, des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur excessive (retrait ou vocalisation excessive à la manipulation, prostration ou agitation anormale) seront considérées comme points limites et critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduira à l’euthanasie des animaux concernés.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé est le plus adapté pour développer et tester notre traitement, car la molécule étudiée cible précisément la mutation génétique présente chez ces animaux. Il s’agit du plus petit modèle de mammifère reproduisant cette myopathie, reconnu par les experts du domaine et largement utilisé dans des études publiées et présentées lors de congrès internationaux. Nous avons déjà montré que le vecteur viral thérapeutique que nous utilisons est sûr et efficace dans le muscle de ces souris. Il est donc indispensable, à ce stade du développement préclinique, de poursuivre les tests dans ce modèle afin d’optimiser l’efficacité du traitement et de vérifier l’absence d’effets indésirables sur l’ensemble de l’organisme, après une injection dans le sang. Les souris de ce modèle développent progressivement des symptômes musculaires à partir d’un mois, qui s’aggravent jusqu’à environ huit mois. Cependant, leur déplacement, leur fertilité et leur durée de vie restent normaux. Nos travaux précédents ont montré qu’entre un et deux mois, un défaut apparaît dans le transport du vecteur thérapeutique à l’intérieur des cellules, et que ce défaut s’accentue avec la progression de la maladie. Les procédures seront réalisées sur des souris adultes âgées de 1 à 6,5 mois. Les souris âgées d’un mois serviront à évaluer la capacité de nos approches à améliorer la diffusion du traitement dans tout l’organisme, tandis que celles de trois mois, présentant des signes intermédiaires de la maladie, permettront de mesurer l’efficacité du traitement pour stopper ou inverser son évolution.

Des tâches de locomotion de dix secondes, répétées pendant une heure au cours d'une unique séance : 412 souris vont être utilisées pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue par une chirurgie terminale sous anesthésie profonde. Elles subissent avant cela une ou deux chirurgies d'une à deux heures pour injection virale et implantation d'un dispositif d'enregistrement, certaines étant isolées vingt-quatre à quarante-huit heures. Le porteur reconnaît que ces chirurgies entraînent inévitablement un stress et des douleurs, avec une perte de poids et un risque que l'animal endommage sa cicatrice à force de se gratter. Il s'agit d'enregistrer l'activité de neurones inhibiteurs pendant la marche libre, et l'effectif de 412 animaux est présenté comme "défini mathématiquement au plus juste", sans que le calcul soit donné.

Objectifs

Pour marcher, courir ou simplement bouger, notre système nerveux doit constamment ajuster la communication entre les neurones sensoriels (qui perçoivent les mouvements) et les motoneurones (qui les déclenchent). Dans la moelle épinière, des neurones appelés GABApré jouent un rôle clé dans ce réglage fin, en modulant les signaux entre les muscles et les motoneurones. Mais on connaît encore mal comment ces neurones agissent pendant le mouvement, car la plupart des recherches ont été faites ex vivo, dans des conditions peu naturelles. Ce projet a pour but de mieux comprendre le rôle des neurones GABApré pendant la marche libre chez la souris, en enregistrant leur activité en temps réel. Nous verrons aussi comment le blocage de ces neurones affecte la capacité de l’animal à s’adapter à des mouvements plus complexes. Enfin, une étude anatomique nous aidera à savoir si certains GABApré ont des rôles différents selon leur position dans la moelle, ce qui pourrait révéler une spécialisation fine dans le contrôle moteur.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera plusieurs bénéfices, à court et à long terme. À court terme, il permettra de mieux comprendre comment la moelle épinière ajuste les signaux sensoriels pour produire des mouvements fluides et adaptés. Grâce à des techniques innovantes, nous pourrons observer pour la première fois l’activité de certains neurones en temps réel, chez des animaux en mouvement libre. Ce travail contribuera aussi au développement de nouvelles méthodes de recherche combinant enregistrements neuronaux, manipulations ciblées et mesures précises du comportement. À long terme, ces avancées pourraient avoir des retombées pour la recherche médicale. En comprenant mieux les mécanismes naturels de filtrage sensoriel, ce projet pourrait ouvrir la voie à des stratégies thérapeutiques plus ciblées pour traiter certaines affections neurologiques, comme la spasticité, les douleurs neuropathiques ou les troubles moteurs liés à des lésions de la moelle épinière.

Procédures

Les animaux subiront, sous anesthésie, une chirurgie d’environ 1 à deux heures pour injection virale et/ou implantation de dispositif d’enregistrement (2h quand il s’agit des deux objectifs combinés) ou bien 2 chirurgies d'une heure avec un délai de récupération de 2 à 4 semaines. Deux semaines après la ou les chirurgies, ou 1h après dans le cas d’expériences terminales, les animaux effectueront des tâches comportementales de locomotion fine. Ces tâches durent une dizaine de secondes et sont répétées pendant un maximum 1h. Une seule session comportementale est prévue. Tous les animaux subiront une chirurgie terminale sous anesthésie profonde pour prélèvement de tissus.

Impact sur les animaux

Les chirurgies entraînent inévitablement un stress et des douleurs chez la souris. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les sutures peuvent aussi entraîner une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparaît également en quelques jours. Les tests comportementaux envisagés peuvent également être source de stress pour les animaux, ainsi que les contentions et les injections effectuées pendant les tests. Certains animaux devront être isolés pendant 24 à 48h, ce qui est également un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.

Remplacement

Le projet porte sur le rôle de l’inhibition présynaptique dans le contrôle de la locomotion, c’est-à-dire un circuit comprenant une sortie physiologique complexe. Un tel circuit est impossible à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doit être intact pour pouvoir être étudié. Il est impossible à modéliser numériquement car les propriétés des différents éléments sont encore méconnues. Nous devons donc recourir à l’animal pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Les mesures pour réduire le nombre d’animaux ont été étudiées en adéquation avec le projet. Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini mathématiquement au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement fiables et robustes. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et obtenir des résultats spécifiques de genre. Les expériences seront effectuées de façon séquentielle, afin de finaliser les expériences de mise au point des différents outils avant d’effectuer les expériences de comportement, ce qui permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire et la température de l’animal est maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. Les yeux sont hydratés avec un gel oculaire. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les chirurgies sont espacées d’au moins 2 semaines. Un temps d’habituation à la pièce et au dispositif d’enregistrement est prévu, sur 20-30 minutes pendant deux jours consécutifs. Pendant les tests comportementaux, une couverture de 5cm de mousse souple est placée sous le dispositif expérimental, afin d’amortir une éventuelle chute de l’animal. Les animaux sont manipulés grâce à une petite coupelle en plastique, afin d’éviter la préhension répétitive par la queue. Des animaux qui ne subissent par les chirurgies sont herbergés avec les animaux tests. Ils sont présents sur la plateforme d’arrivée des tests de comportements, réduisant ainsi le stress des animaux tests.

Choix des espèces

Pour étudier comment certains neurones contrôlent les mouvements, nous utilisons la souris. Ce choix est justifié car la souris permet de cibler très précisément des neurones grâce à des outils scientifiques avancés. Cela aide à comprendre comment les signaux qui freinent ou modulent les mouvements fonctionnent. La souris permet aussi d’enregistrer l’activité des neurones tout en observant les animaux bouger librement, ce qui est difficile à faire avec d’autres animaux. De plus, beaucoup d’études existent déjà sur les circuits nerveux de la moelle épinière de la souris, ce qui facilite l’analyse des résultats. Nous travaillons avec des souris d’au moins 21 jours, car à cet âge les circuits de contrôle des mouvements sont complètement développés et stables. Cela garantit que les résultats ne sont pas influencés par la croissance.

Soumises à une laparotomie de quarante-cinq minutes pour une électroporation in utero du placenta, 72 souris gestantes sont utilisées dans ce projet, qui compte 1 008 souris au total, toutes tuées à l'issue dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur descendance passe des tests sensorimoteurs quotidiens, avec un test moteur de trente minutes à quinze puis quarante-cinq jours. L'objet est de réprimer deux facteurs placentaires pour reproduire les effets d'une exposition prénatale à l'alcool sur la migration des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs. Le porteur écrit que l'électroporation in utero n'entraîne "aucune nuisances ou effets indésirables sur l'embryon", alors que le projet consiste à provoquer chez ces embryons des troubles du neurodéveloppement.

Objectifs

Le projet présenté répond à un problème de santé public majeur, à savoir l’exposition prénatale à l’alcool. En effet, l’alcool présente de nombreuses cibles et notamment les vaisseaux sanguins. Il a été mis en évidence que l’exposition prénatale à l'alcool désorganise les vaisseaux sanguins et perturbe l’expression de certains acteurs importants dans la mise en place des vaisseaux, comme le Placental Growth Factor et la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome. Cette dérégulation des vaisseaux retentie sur la mise en place des cellules neurales qui utilisent les vaisseaux comme support de migration. En effet, les oligodendrocytes et les neurones inhibiteurs, qui migrent de manière vasculo-associée, présentent un défaut de positionnement à la suite d’une exposition prénatale à l'alcool. Enfin, l’exposition prénatale à l'alcool entraine des troubles du neurodéveloppement à la fois au niveau cognitif et moteur qui pourrait s’expliquer par le défaut de positionnement des cellules neurales. Le placenta est un organe transitoire présent au cours de la grossesse qui assure des fonctions endocrines, immunitaires et métaboliques. Il synthétise le Placental Growth Factor et la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome indispensables au bon développement du fœtus. En effet, la diminution au niveau du placenta de ces acteurs entraine une désorganisation des vaisseaux dans le cerveau, à l’image de celle observée à la suite d’une exposition prénatale à l'alcool et apporte une nouvelle preuve d’un axe placenta-cerveau fonctionnel. Cependant aucune étude ne fait le lien entre les acteurs placentaires et l’apparition de troubles du neurodéveloppement. Ce qui fait l’objet de cette étude. Le premier objectif ayant pour but d’étudier les effets de la diminution au sein du placenta du Placental Growth Factor et de la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome sur la mise en place des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs. Le second objectif est d’étudier les conséquences sur le comportement sensorimoteur de la jeune descendance et le comportement moteur du jeune adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’une part de comprendre l’impact de l’environnement fœtal (notamment l'exposition prénatale à l'alcool) sur le devenir des individus et d’autre part d’identifier dès la naissance de potentiels cibles permettant de prédire l'apparition de troubles du neurodéveloppement. Nous nous attendons a observé qu’une diminution au niveau placentaire du Placental Growth Factor et de la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome ait un impact sur le développement du cerveau et le comportement des souriceaux en réponse à l'exposition prénatale à l'alcool, notamment dans la mise en place et la maturation des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs : soulignant le rôle important de l’axe placenta-cerveau. De plus, ce projet permettra le suivi à long terme des individus dont l’environnement fœtal aura été modifié par l'exposition prénatale à l'alcool.

Procédures

Les femelles gestantes (72 femelles) subiront une chirurgie d’électroporation in utero d’une durée de 45 minutes par femelle. La descendance suivra des tests sensorimoteurs, d’une durée maximale d’une minute par test, par animal et par jour. Le test moteur à P15 et P45 sera réalisé une fois par animal pour une durée de 30 minutes.

Impact sur les animaux

L’électroporation in utero n’entraine aucune nuisances ou effets indésirables sur l’embryon, l’injection dans le placenta peut provoquer une petite gène de quelques secondes lors de l’insertion de l’aiguille. La laparotomie réalisée sur la femelle gestante pourrait entraîner une douleur d'une durée estimée à 24 heures qui sera contrôlée par une analgésie pré- et post-opératoire.

Devenir

A chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. En effet, il est nécessaire d’étudier la mise en place des structures cérébrales des individus dont l’environnement maternel aura été modifié afin de mieux comprendre le rôle du placenta dans le neurodéveloppement et de pouvoir corréler ces observations avec les troubles du neurodéveloppement.

Remplacement

Dans ce projet visant à étudier l’impact de l’environnement fœtal sur le devenir des individus, les expériences in vivo ne peuvent à l’heure actuelle pas être remplacées par des études in vitro. Les études de l’interaction inter-organe placenta-cerveau ne peuvent se faire que sur des individus vivants et l’évaluation du devenir cognitif de ces individus dont l’environnement fœtal aura été modifié ne peut s’effectuer que par des études sur les animaux. Aucune approche de remplacement n’est aujourd’hui disponible dans les études pré-cliniques.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au minimum nécessaire pour atteindre l’objectif scientifique de cette étude. Les procédures comportementales de ce projet sont non invasives et un même animal sera soumis aux différents tests dès que possible. Le nombre d’individu est de 14 (7 dans chaque groupe). Avec une perte estimée à 30%, le nombre de femelles gestantes nécessaire est de 10 par groupe. Des animaux des deux sexes issus de la descendance seront utilisés pour cette étude puisqu’il a été démontré un effet sexe au cours du neurodéveloppement et lors de la mise en place des comportements. Lors des analyses, si aucun effet sexe n’est détecté, alors les animaux seront regroupés afin de réduire au maximum. Selon les expérimentations et les comparaisons à effectuer les tests statistiques appropriés seront choisis.

Raffinement

Pour raffiner, les femelles gestantes dont les souriceaux seront prélevés après la naissance seront hébergées dans des cages individuelles avec enrichissement (nid en carton, lanières de papier kraft, tunnel). Cet hébergement individuel est nécessaire afin d'éviter le cannibalisme des femelles entre les portées à la naissance. Les animaux seront maintenus dans un environnement contrôlé et stabilisé (température de 21°C, hydrométrie à 55 %, luminosité à 100 lux avec une durée de cycle jour/nuit 12h/12h). Après l’intervention, les femelles gestantes seront remises dans leur cage avec accès dans la cage à l’eau et à la nourriture. Elles seront par la suite surveillées par les porteurs du projet (suivi de la douleur, suivi des points de suture, prise de poids, évaluation du comportement). Si des points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie profonde. A la naissance des souriceaux, ceux-ci seront manipulés lors des différents tests comportementaux et remis immédiatement, après chaque test, au contact de leur mère. Au jour 21, les souriceaux seront sevrés, séparés selon leur sexe et hébergés par 5 individus au maximum par cage contenant un environnement enrichi (nid, tunnel, lanières de papier kraft).

Choix des espèces

Ce projet s’inscrit sur une volonté de mieux comprendre la communication placenta-cerveau et d’identifier des marqueurs diagnostics d’atteintes cérébrales liés au changement de l’environnement placentaire capables d’avoir des répercussions sur le devenir des individus. La souris est un modèle de choix pour l’étude de nombreux systèmes complexes comme ceux retrouvés au cours du neurodéveloppement. De plus, la maturation corticale des souriceaux est le reflet de la maturation corticale du cortex humain. Ainsi, l’étude chez le souriceau permet de répondre à la problématique de la neuroplacentologie. Ce choix se justifie également par l’abondante littérature et par l’expérience du laboratoire qui contribuent à réduire le nombre d’animaux à utiliser. Les femelles gestantes seront utilisées au 13ème jour de vie embryonnaire afin de réalisée l’électroporation in utero placentaire. Ce stade développemental a été choisi sur la base des études précédentes et d’un point de vu neurodéveloppemental correspond au début des vagues de migration cellulaire des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs. La descendance sera prélevée au 20ème jour de vie embryonnaire et au 2ème jour après la naissance afin d’évaluer les conséquences de la répression placentaire du Placental Growth Factor et de la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome, d’une part, sur le développement cortical du fœtus et sur son placenta apparié et d’autre part sur l’angiogenèse corticale et la migration vasculo-associée des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs. La descendance sera étudiée en comportement et sera prélevée au 15ème jour après la naissance ou au 45ème jour après la naissance afin d’évaluer les conséquences de la répression placentaire du Placental Growth Factor et de la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome sur le comportement à court et moyen terme et sur le neurodéveloppement.

550 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections de vaccin ARN sous anesthésie, une injection de cellules tumorales, un à trois prélèvements de sang, un lavage broncho-alvéolaire et un lavage nasal. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer une immobilité, un isolement, une cachexie et des douleurs. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro ne miment pas le microenvironnement muqueux pulmonaire, que l'expérimentation animale est "indispensable" et qu'"aucune méthodes alternatives n'existent", sa rubrique réduction tenant pour sa part en deux phrases générales.

Objectifs

Les vaccins ARN actuels sont capables d’induire une bonne immunité générale mais restent peu efficace pour limiter la transmission. Pour limiter la transmission il est nécessaire d’induire une immunité locale au niveau des sites barrières, comme par exemple au niveau des voies respiratoires. L’immunisation par la voie respiratoire permet d’induire des réponses immunitaires locales dans les poumons et les voies aériennes. Jusqu’à présent les vaccins ARN administrés par la voie respiratoire se sont révélés peu efficaces. Les principaux obstacles pour les vaccins ARN sont de traverser la barrière muqueuse et le risque de dégradation. Ce projet a pour objectifs : 1/de tester de nouvelles formulations de vaccins ARN capables de traverser la barrière muqueuse et moins sensibles à la dégradation. 2/ tester de nouveaux schémas et voies de vaccination qui optimiseraient la distribution du vaccin et l’induction de réponses immunes locales 3/ enfin évaluer leur efficacité dans 2 modèles de cancer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer de nouveaux vaccins ARN administrables par voie mucosale et capables d’induire des réponses locales pour traiter le cancer.

Procédures

3 injections de vaccin sur animaux anesthésiés ( durée injection 2-5 min, durée anesthésie: 5 et 30 min) ; 1 injection de tumeur sur animaux anesthésiés ( injection 2 min,durée anesthésie: 30min) ; 1 injection de tumeur sur animaux vigiles ( 5min); 1 à 3 prélèvements de sang sur animaux anesthésiés ( 5 min) ; 1 prélèvement de lavage broncho-alvéolaire (5min),1 prélèvement de lavage nasal (2min) et 1 perfusion sur animaux anesthésiés (2 min).

Impact sur les animaux

Les différentes injections peuvent induire une gêne respiratoire transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration, une douleur légère de courte durée ou une irritation au niveau du site d’injection. La contention des souris peut générer un stress durant la durée de la contention. Les souris avec les tumeurs peuvent présenter des troubles du comportement (immobilité, isolement...), un aspect physique altéré (perte de poids, cachexie, ) et des douleurs associées à la présence de la tumeur.

Devenir

mise à mort pour analyses des tissus

Remplacement

L’analyse des cellules impliquées dans les réponses immunitaires, dans différents organes au cours du temps, ne peut être évaluée que dans des organismes entiers. Les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement muqueux pulmonaire. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de conditions observées chez l’homme. Aucune méthodes alternatives n'existent

Réduction

Les paramètres expérimentaux ont été déterminés selon des données déjà publiées. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les différentes injections et les prélèvements de sang sont réalisés sous anesthésie pour le confort de l’animal. La profondeur de l’anesthésie est surveillée, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Les vaccins sont préparés dans des formulations validées pour des administrations chez l’animal et ne sont pas décrits comme toxiques aux doses utilisées. Des points limites spécifiques ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L’atteinte d’un point limite qui ne peut être soulagé induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée avec des souris, car nous avons des formulations de vaccins déjà validés dans cette espèce ainsi que tous les outils et techniques d’analyse adéquats. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, car le système immunitaire est développé et mature.

Réutilisés dans un autre projet plutôt que tués, 12 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont castrés sous anesthésie, l'intervention étant plafonnée à une heure, puis évalués sur la douleur post-opératoire que le porteur qualifie de modérée et transitoire. La molécule analgésique testée peut par ailleurs entraîner une sédation, des troubles gastro-intestinaux et une modification du comportement. L'intervention retenue pour produire cette douleur est une chirurgie que le porteur nomme lui-même "de convenance", et l'étude vise un usage à la fois humain et vétérinaire.

Objectifs

L’analgésie représente un pilier fondamental de toute intervention chirurgicale, tant en médecine humaine qu’animale. Une gestion optimale de la douleur contribue non seulement à améliorer le confort du patient, mais aussi à favoriser une récupération post-opératoire plus rapide, plus sûre et avec moins de complications. Elle participe également à une meilleure qualité globale de la prise en charge. Dans ce contexte, cette étude vise à évaluer l’efficacité analgésique d’une molécule innovante, en vue de son potentiel usage en médecine humaine et vétérinaire. L’objectif est d’apprécier ses effets sur la douleur post-opératoire, sa tolérance et son intérêt en tant qu’alternative aux traitements antalgiques conventionnels.

Bénéfices attendus

Amélioration de la prise en charge de la douleur post-opératoire : en évaluant une nouvelle molécule analgésique, ce projet vise à proposer des alternatives efficaces et potentiellement mieux tolérées que les traitements classiques. Réduction de la consommation d’antalgiques conventionnels : si la molécule testée montre une bonne efficacité, elle pourrait permettre de diminuer l’utilisation de médicaments opioïdes ou AINS, souvent associés à des effets secondaires.

Procédures

Les animaux sont soumis à une procédures chirurgicales : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 1h, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux;

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue : - Douleur post-opératoire : bien que des protocoles analgésiques soient mis en place, une douleur modérée transitoire peut survenir après la castration. - Effets secondaires liés aux molécules analgésiques : selon le traitement administré, des effets indésirables légers sont possibles (sédation, troubles gastro-intestinaux, modification du comportement, etc). - Stress de l’anesthésie, hypothermie lors de l’anesthésie.

Devenir

Le projet étant peu invasif et ne nécéssitant pas d'euthanasie, les chiens pouront être réutilisés pour un autre projet.

Remplacement

La réponse à l’objectif de l’étude nécessite une évaluation directe de la réponse à la douleur, ce qui ne peut être réalisé que sur l’animal vivant. En effet, il n’est pas envisageable de tester une molécule innovante directement chez l’homme ou en clinique vétérinaire, en raison des risques encore inconnus liés à son utilisation.

Réduction

Au total, 12 animaux seront utilisés (6 + 6). Un nombre d'animaux se trouve réduit au minimum nécessaire pour l'obtention de données suffisamment fiables sur l’évaluation de l’efficacité d’une nouvelle molécule.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. De plus, la température de la salle d’hébergement sera augmentée après la chirurgie. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec des chiens. En cas de troubles liés au dispositif, des traitements pourront être mis en place, similaires à ceux pratiqués en médecine humaine. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). Si nécessaire, la douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés : AINS et/ou morphiniques. Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique.

Choix des espèces

Le modèle de chien a été choisie en raison de la pertinence directe du modèle animal avec l’application clinique visée. En effet, la molécule testée présente un potentiel d’utilisation non seulement en médecine humaine, mais également en médecine vétérinaire, notamment dans la gestion de la douleur post-opératoire. Le chien étant une des principales espèces concernées par ce type d’indication (chirurgie de convenance, douleur aiguë), il constitue un modèle approprié, à la fois pour l’évaluation de l’efficacité analgésique et pour l’extrapolation clinique future. De plus, les protocoles d’évaluation de la douleur sont bien validés chez cette espèce, ce qui garantit la fiabilité des données recueillies. Des chiens adultes seront utilisés dans ce projet, car ils représentent la catégorie d’animaux la plus fréquemment concernée par les interventions chirurgicales en pratique clinique. Leur utilisation permet ainsi de reproduire des conditions proches de la réalité vétérinaire.

Les souris sont rendues anxieuses par un isolement social chronique et par un régime hyperlipidique, que le porteur présente comme un modèle de pathologie psychiatrique. 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique d'une heure et demie pour implanter des fibres optiques dans le cerveau, parfois doublée de la pose d'une pompe sous-cutanée, puis une privation alimentaire les maintenant à 90 % de leur poids pour les tâches de conditionnement opérant. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses histologiques, une perte de poids supérieure à 20 % déclenchant une mise à mort immédiate.

Objectifs

Les maladies psychiatriques sont un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, la prise en charge de ces pathologies demeure incomplète puisqu’entre 30 et 50 % des patients souffrant de depression sont résistants aux traitements existants. Dès lors, la recherche de nouvelle piste thérapeutique est essentielle et urgente. La neuroinflammation est une composante essentielle des pathologies psychiatriques. Notamment l’activation des cellules microgliales, qui controle l'inflammation dans le cerveau, a été observé dans des pathologies comme la dépression. Notre projet a débuté par une partie clinique qui a permis d’identifier différents métabolites d’intérêt dans la circulation sanguine chez des sujets atteints de troubles psychiatriques. Notre objectif est donc de tester si l’administration de ces métabolites a des effets sur le fonctionnement cérébral, la neuroinflammation et le comportement. L’objectif final du projet sera de mettre en évidence les mécanismes par lesquels les métabolites influencent le cerveau afin de pouvoir proposer de nouvelles stratégies dans la prise en charge des pathologies psychiatriques. Parmi les facteurs de risques des maladies psychiatriques l'isolation sociale chronique AINSI QUE L’OBESITE ONT été démontréS comme délétère pour la santé mentale que soit dans des études chez l'animal ou l'humain. L'objectif est donc de tester si les métabolites bactériens sélectionnés pourraient diminuer les effets délétères de l'isolation sociale ET DE L’OBESITE sur la neurotransmission dopaminergique et le comportement chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre comment les métabolites bactériens qui sont diminués chez les sujets atteints de maladies psychiatriques pourraient protéger des altérations comportementales et de neurotransmission dans un modèle validé de pathologies psychiatriques chez la souris.

Procédures

Les animaux subiront des interventions chirurgicales visant à implanter des fibres optiques dans le cerveau et potentiellement des pompes sous cutanées. La chirurgie stéréotaxique dure 1h30 avec une phase de réveil de 2 heures. L'implantation de pompes sous cutanée quant à elle dure au maximum 15 minutes. Cette dernière sera réalisée en même temps que l'implantation pour les souris concernées.

Impact sur les animaux

Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum). Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. Le modèle de pathologie psychiatrique reposant sur l'isolation sociale qui induira, d'après la littérature scientifique un phénotype anxieux chez les souris. LA CONSOMMATION DU REGIME HYPERLIPIDIQUE INDUIRA UN GAIN DE POIDS QUI PEUT ETRE ASSOCIE A DES TROUBLES METABOLIQUES (DIABETE) ET UN PHENOTYPE ANXIEUX CHEZ LES SOURIS. Pour les injections ou les tests comportementaux, les animaux subiront des préhensions et contentions. Les souris réaliserons des tests comportementaux dont certains induisent un stress de courte durée. Enfin dans le cas ou les métabolites ne pourraient être administrés par l'eau de boisson ou la nourriture (pour des raisons organoleptiques conduisant à la non consommation par la souris), une chirurgie visant à implanter des pompes osmotiques sous-cutanées sera réalisée.

Devenir

Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques (800).

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons des mâles et des femelles. Le nombre d'animaux (800) nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes ayant subis un stress chronique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement ultra-enrichi (carré de coton, maison en carton, pièce en plastique pour se cacher et jouer) même en cas d'isolation sociale. Ce stress chronique a été sélectioné par rapport au stress chronique de défaite sociale, modèle de référence en psychiatrie, car il induit des altérations comportementales similaires sans induire de potentielles blessures à l'animal. Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage (en annexe): - Perte de poids anormale (10-20% score 1, score 3 si supérieur à 20%) - état du pelage - site de chirurgie - Comportements anormaux (poil hérissé, prostration,...). Si le score est supérieur ou égal à 3 une mise à mort immédiate aura lieu. Un suivi du bien être animal sera effectué sur tous les animaux de manière quotidienne pendant le protocole de stress et l'étude comportementale en utilisant une fiche de suivi du bien être (en annexe). Le poids, le comportement général, l'apparence et les signes neurologiques seront scorés. Si un animal présente un score supérieur à 3 dans une des 4 rubriques il sera mis a mort. Sinon si un mal être est détecté il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin) et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Concernant l’administration des métabolites d’intérêt, nous priviligérons l’utilisation de l’eau de boisson, la nourriture ou l'implantation d'une mini pompe sous cutanée par rapport à des méthodes plus traumatisantes comme les injections intrapéritonéales répétées ou le gavage. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

Ce modèle d'étude chez la souris âgée de 8 semaines (jeune adulte) est la référence dans les pathologies psychiatriques et les métabolites d'intérêt dans ce projet sont naturellement présent chez la souris.

Des souriceaux reçoivent sept instillations nasales d'allergènes sous sédation à l'isoflurane, geste dont le porteur admet le risque de fausse route et d'étouffement, certains subissant en plus quatorze injections intrapéritonéales. 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La mesure finale des paramètres respiratoires passe par une trachéotomie sous anesthésie, sans que les animaux soient réveillés, avant prélèvement des organes. Le porteur annonce que le modèle d'asthme pédiatrique n'entraîne aucune nuisance particulière et que sa symptomatologie est "sans conséquence sur le bien-être animal", tout en déclarant les 288 souriceaux au niveau de souffrance modéré.

Objectifs

La mise en place du remodelage du muscle lisse bronchique (MLB) dans l’asthme pédiatrique sont méconnus. Pourtant, l’augmentation de la taille du MLB chez les enfants asthmatiques est associé à la sévérité de la maladie. Nos travaux, réalisés in vitro à partir de cellules MLB de patients enfants asthmatiques, nous ont permis d’identifier le rôle clé du métabolisme énergétique dans l’hyperprolifération de ces cellules. Nos travaux chez l’homme ne permettent pas d’analyser complètement les mécanismes de prolifération des cellules MLB in vivo. Afin d’étudier le rôle du MLB dans l’asthme pédiatrique, nous souhaitons utiliser un modèle murin d’asthme. Ce modèle est particulièrement pertinent, car il permet de combiner l’exposition de deux aérocontaminants impliqués dans la sévérité de la maladie chez l’Homme. Les objectifs du projet sont donc les suivants : 1) Mettre en place un modèle d’asthme pédiatrique qui permettra d’évaluer le remodelage du MLB in vivo. 2) Interférer avec le développement du MLB en traitant les animaux avec des molécules d’intérêt thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’étudier in vivo les mécanismes de mise en place du remodelage du MLB. L’équipe de recherche travaille déjà in vitro en utilisant des cellules de patients pédiatriques asthmatiques mais l’asthme est une maladie mettant en jeu différents types cellulaires (cellules épithéliales, cellules MLB et cellules inflammatoires) qui ne peuvent à ce jour pas être étudier in vitro. Le modèle murin apparaît donc comme indispensable à la compréhension des mécanismes cellulaires. Le projet permettra également de tester des molécules d’intérêts thérapeutiques, mis en évidence sur les cellules de patients pédiatriques asthmatiques et de tester leur efficacité in vivo sur le remodelage du MLB.

Procédures

Les animaux seront soumis à des instillations nasales (IN) sous sédation à l’isoflurane (7 IN d’une durée de moins de 2 minutes) et certains animaux à des injections intrapéritonéales (IP) (14 IP). Pour les mesures terminales de mesure des paramètres respiratoires, ces expérimentations seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés. Il n’y a pas de réveil après les mesures des paramètres respiratoires qui durent environ dix minutes.

Impact sur les animaux

Nous avons identifié 3 nuisances attendues potentielles : 1) Les souriceaux seront manipulés très jeunes, il y a donc un risque de rejet après manipulation des animaux par les mères. 2) L’administration de molécule liquide en instillation nasale chez les souriceaux pourraient conduire à une fausse route / étouffement. 3) Le refroidissement des animaux pendant les manipulations d’instillation nasale et injection intrapéritonéale. En revanche, nous ne nous attendons pas à observer de nuisance particulière liée à la création du modèle d’asthme pédiatrique. La collaboration scientifique menée à Gent a permis de montrer qu’il n’y a pas de mortalité suite à ce protocole ni de modification du comportement ni stress ou perte de poids, il n’y a donc pas d’incidence sur le bien-être animal. Les allergènes utilisés dans le cadre du protocole ne sont pas des molécules toxiques pour l’animal, elles permettent uniquement de développer la maladie asthmatique dont la symptomatologie est sans conséquence sur le bien-être animal.

Devenir

A la fin du protocole d’asthme, chaque animal sera utilisé pour analyser la fonction respiratoire, l’inflammation et le remodelage du MLB. Une fois mis à mort, les organes d’intérêt seront également prélevés ex vivo pour des analyses notamment d’immunofluorescence.

Remplacement

L’asthme est une maladie complexe mettant en jeu différents types cellulaires qui ne peuvent pas être étudiés in vitro. Le modèle murin d’asthme pédiatrique permettra d’élucider les mécanismes complexes conduisant au remodelage du MLB. Parallèlement à ce protocole in vivo, des études in vitro sur les cellules de patients pédiatriques asthmatiques pourront être réalisées afin de valider les observations réalisées chez les animaux.

Réduction

Chaque protocole nécessite la comparaison de plusieurs paramètres de la fonction respiratoire et ce entre différents groupes de souriceaux exposées à différents traitements. Notre but est de réduire au maximum le nombre d’animaux par expérience tout en conservant la significativité des résultats. Chaque groupe de souris doit être composé de 12 souriceaux minimums afin de mettre en évidence une différence significative entre les groupes sur les différents paramètres analysés notamment la résistance bronchique. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Les expériences seront répétées trois fois afin de s’assurer de leur reproductibilité et de s’assurer d’un éventuel effet bénéfique d’une molécule thérapeutique. De plus, se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, après la mise à mort, nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes.

Raffinement

Un suivi quotidien sera réalisé par des personnes formées, compétentes et soucieuses du bien-être animal, basées notamment sur l’apparence physique externe, la prise de poids et le comportement des animaux. Ces contrôles permettent de repérer tout animal en souffrance, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées. Afin d’éviter toute souffrance, les animaux seront anesthésiés et analgésiés si nécessaire en fonction de l’évaluation de l’état des animaux par rapport aux points limites. Nous avons identifié 3 nuisances attendues potentielles : 1) Les souriceaux seront manipulés très jeunes, il y a donc un risque de rejet après manipulation des animaux par les mères. Pour éviter cela, on limitera au maximum le nombre d’expérimentateur au cours du protocole et ils veilleront à toucher la sciure de la cage avant manipulation des animaux. 2) L’administration de molécule liquide en instillation nasale chez les souriceaux pourraient conduire à une fausse route / étouffement. Pour éviter cela, l’administration des molécules sera réalisée sous sédation à l’isoflurane avec un volume d’injection réduit au maximum. Le choix d’un volume minimal associé à la bonne gestion de la profondeur de l’anesthésie gazeuse permettra de réduire considérablement un éventuel risque de fausse route. 3) Le refroidissement des animaux pendant les manipulations d’instillation nasale et injection intrapéritonéale. Pour éviter cela, l’expérimentateur placera la boite d’induction d’isoflurane sous un tapis chauffant pour maintenir les animaux à la bonne température. De plus, le procédé est très cours, moins de 2 minutes avec l’induction de l’anesthésie gazeuse comprise. Les souriceaux seront surveillés par des expérimentateurs qui ont l’habitude des protocoles murins d’asthme jusqu’à leur réveil.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus classiquement utilisée pour l’étude de l’asthme. L’asthme est une maladie touchant différents composants, qui interagissent de façon étroite, tels que le muscle lisse bronchique, l’épithélium bronchique et les cellules inflammatoires. Il n’existe pour l’instant pas de système in vitro permettant de faire coexister ces différents types cellulaires. Par ailleurs, nos travaux chez l’homme montrent une augmentation de la prolifération des cellules musculaires lisses bronchique chez les patients enfants asthmatiques. Grâce à un modèle de souris pédiatrique asthmatique et l’utilisation de molécules thérapeutiques, nous pouvons envisager une meilleure compréhension des phénomènes qui permettent le remodelage du MLB. De plus, le stade de maturation pulmonaire des souriceaux correspond à la catégorie asthme de l’enfant pré-solaire. Au total, le modèle murin apparaît donc comme un modèle indispensable pour évaluer les mécanismes du remodelage du MLB dans l’asthme pédiatrique et pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.