Procédures modérées

192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem. Chacune subit une chirurgie de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, une injection dans le cerveau et l'implantation d'un dispositif d'enregistrement qu'elle gardera dans sa cage, avec un risque d'infection et une gêne liée à l'encombrement. Les enregistrements durent jusqu'à deux heures et demie par jour, y compris chez des femelles en lactation, ce que le porteur reconnaît susceptible de provoquer un rejet de la portée. Il écrit qu'il n'existe "malheureusement pas d'alternatives", tout en indiquant que son projet global comporte un modèle numérique du circuit neuronal étudié.

Objectifs

Notre projet vise à explorer comment l’activité des neurones producteurs d’ocytocine (ou neurones ocytocinergiques) est modulée par certains récepteurs spécifiques dans deux régions d’intérêt du cerveau. Ces neurones jouent un rôle central dans la régulation de nombreuses fonctions physiologiques et comportementales, notamment le stress, la reproduction et les interactions sociales. La modulation de leur activité par des récepteurs spécifiques pourrait constituer un mécanisme essentiel pour ajuster finement la libération d’ocytocine. Nous étudierons, chez des souris génétiquement modifiées ou non, comment les récepteurs modulent l’activité des neurones ocytocinergiques dans le cerveau adulte, et l’impact de cette modulation sur l’activité du cerveau. En clarifiant ces mécanismes, notre objectif est de mieux comprendre le rôle des récepteurs étudiés dans la régulation de l’ocytocine, ainsi que leur impact potentiel sur les comportements sociaux et émotionnels dépendants de cette neurohormone.

Bénéfices attendus

Les troubles neuropsychiatriques et neuroendocriniens affectent profondément la qualité de vie des patients, avec des conséquences sur leur bien-être émotionnel, leurs interactions sociales, leur autonomie et leur santé physique. Ces affections représentent un enjeu majeur de santé publique, tant sur le plan humain qu’économique. Malgré les progrès récents, les bases neurobiologiques de ces pathologies restent encore mal comprises, ce qui limite le développement de traitements efficaces. Il est donc crucial de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux qui régulent l’activité neuronale dans les circuits impliqués dans la régulation des émotions, du stress, de la reproduction et des comportements sociaux. Parmi ces circuits, les neurones ocytocinergiques occupent une position centrale. Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre le lien entre une dysrégulation de circuits spécifiques au niveau du cerveau et des altérations du comportement social et émotionnel. À long terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques, avec l’ambition d’améliorer la prise en charge des patients atteints de certains troubles neurodéveloppementaux et psychiatriques.

Procédures

Tous les animaux auront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour réaliser une injection dans le cerveau et implanter un dispositif d’enregistrement de l’activité cérébrale (45 minutes maximum par animal). Pour une partie des animaux des enregistrements (animal vigile) de l’activité cérébrale seront ensuite réalisés au cours de sessions d’habituation (4 séances d’une heure chacune, réparties sur 4 jours) puis lors de sessions d’enregistrements de l’activité cérébrale chez des femelles pendant la lactation et après la lactation (2.5h maximum par enregistrement, une fois par jour répété sur 4 jours répartis sur une période de 8 jours pendant la lactation puis 4 jours consécutifs après la lactation). Pour l’autre partie des animaux ils auront des enregistrements (animal vigile) de l’activité cérébrale réalisés au cours de sessions d’habituation 4 séances de 0,5h, 4 jours consécutifs) suivis d’enregistrements réalisés au cours de tests comportementaux visant à représenter divers types de stimuli connus pour activer les neurones ocytocinergiques : 4 tests comportementaux seront réalisés avec 5 jours de repos entre chaque test. Le premier test consistera en une session quotidienne de 15 minutes pendant 3 jours consécutifs, le deuxième en deux sessions quotidiennes de 15 minutes pendant 2 jours consécutifs, le troisième test en deux sessions quotidiennes de 15 minutes pendant 3 jours consécutifs, et enfin le quatrième test en une session quotidienne de 6 minutes maximum pendant 3 jours consécutifs. Tous les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

La chirurgie sera associée à un risque de douleur et un inconfort pendant quelques jours. Une telle procédure implique une anesthésie générale qui entrainera un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et un risque de difficultés cardiaques et respiratoire. De plus, après l'implantation du dispositif sur sa tête, l'animal devra vivre dans la cage avec, ce qui peut provoquer une gêne due à l’encombrement et limiter son comportement habituel, et présenter un risque d’endommagement de l’implant. Cet implant sera également associé à un risque d’infection. Les enregistrements réalisés chez les femelles pendant la lactation pourront entraîner un stress chez la mère et provoquer un rejet de la portée. Les tests comportementaux pourront générer un stress lié au changement d’environnement et au test en lui-même.

Devenir

À la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses post-mortem pour répondre à notre objectif scientifique.

Remplacement

Il n’y a malheureusement pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car l'objectif est de découvrir le fonctionnement de zones spécifiques dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie neuronale des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, ces expériences ne seraient pas possibles en culture cellulaire. Il est important de noter que notre projet scientifique global comporte une composante alternative à l’expérimentation animale : l’analyse de modèles in silico (création d’un modèle numérique du circuit neuronal étudié incluant les résultats de notre caractérisation expérimentale). Ce modèle sera diffusé publiquement et constituera une alternative à l’expérimentation animale pour l’étude du rôle fonctionnel de certaines cellules cérébrales spécifiques.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (192) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal. Nos compétences chirurgicales permettront également de réduire le nombre de complications chez les animaux et de minimiser les dommages durables. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille réelle de l'échantillon dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Il est également important de noter que le projet comporte un plan de partage de données. Les données expérimentales seront disponibles en libre accès sur la plateforme ebrains.eu (la plateforme de partage de données neuroscientifiques financées par l’Union Européenne) ce qui permettra à d’autres équipes de profiter de ces données, leur évitant ainsi de reproduire ces expériences, et réduira donc le nombre d’animaux utilisés à terme.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton, bâtonnet de bois à ronger et maison) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement. En cas d’anomalie celle-ci sera gérée en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire qui apportent conseils et recommandations pour assurer une prise en charge adaptée de l’animal. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale et des analgésiques seront administrés avant et après l’intervention pour limiter la douleur. Nous maintiendrons la température des animaux au cours de toute la durée de l’anesthésie pour éviter toute hypothermie et appliquerons un gel oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire. Un soutien nutritionnel et hydrique ainsi qu’une surveillance étroite seront mis en place à la suite des chirurgies pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. Pour les séances d’imagerie, afin de réduire le stress, nous prévoyons une d'habituation des animaux au dispositif. Nous prévoyons également des périodes de repos entre les sessions d’imagerie. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits de cellules du cerveau chez la souris sont similaires à celles des autres mammifères, y compris l'homme, ce qui rend les résultats obtenus avec un tel modèle éventuellement transposables à la médecine humaine. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types de cellules spécifiques que nous étudions. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. Le développement du cerveau chez la souris est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Dans ce projet, des animaux adultes seront utilisés pour toutes les procédures, car les interventions chirurgicales requises ne peuvent être réalisées que sur des sujets adultes (8 semaines minimum). Une partie du projet nécessitera également d’utiliser des femelles après une chirurgie et après une période de gestation dès la naissance des petits car nous nous intéresserons spécifiquement à l’activité des neurones ocytocinergiques pendant la lactation.

Maintenir en croissance une collection commerciale de plus de 220 tumeurs humaines suppose de les regreffer en continu sur des souris. 22 104 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue et exclues de tout autre projet. Chacune reçoit un fragment tumoral ou des cellules tumorales sous la peau, une puce électronique ou un marquage aux oreilles, puis des administrations de molécules jusqu'à deux fois par jour. Le porteur range parmi les nuisances transitoires modérées les douleurs postopératoires, les infections, les diarrhées et la cachexie, et indique que l'effectif dépend de l'offre de sa collection et de la demande en tests de médicaments.

Objectifs

Le but de ce projet est de maintenir une collection de modèles tumoraux vivants, en croissance chez la souris, afin de garantir et d’optimiser leur accessibilité pour tester de nouveaux médicaments contre le cancer. Ces modèles, appelés xénogreffes dérivées de patients (PDX), sont des tumeurs humaines implantées chez la souris. Ils permettent de reproduire au mieux les caractéristiques des tumeurs humaines, comme leur morphologie, leurs mutations et leur comportement biologique. Grâce à cela, ils offrent un moyen fiable d’évaluer l’action de nouveaux médicaments avant qu’ils soient testés chez l’Homme. Notre collection de plus de 220 modèles PDX couvre la majorité des cancers solides (par exemple : sein, poumon, côlon, foie, rein, peau, pancréas, ovaire, vessie, cerveau ou prostate) et reflète la diversité des patients. Chaque modèle est soigneusement étudié afin de mieux comprendre ses particularités et de relier ces informations à la réponse observée aux différents traitements anticancéreux. Le développement de nouveaux médicaments contre le cancer nécessite des phases de test de leur efficacité antitumorale et de leurs mécanismes d’action qui sont réalisés sur ces modèles tumoraux, permettant d’obtenir des résultats fiables sur les traitements les plus prometteurs pour un type de tumeur ou mutation donnée. Elles peuvent également permettre d’étudier les mécanismes d’action des médicaments dans l’organisme. Elles sont nécessaires pour constituer un dossier de demande d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) des médicaments. Ce projet prévoit le maintien de 120 modèles tumoraux parmi notre collection de PDX, sous forme de collection vivante sur souris, afin de garantir la disponibilité de ces modèles pour les tests réglementaires de nouveaux médicaments, et ce durant 5 ans. Ce maintien consiste en des étapes de décongélation et passages successifs.

Bénéfices attendus

Chaque année, dans le monde, près de 20 millions de personnes sont diagnostiquées atteintes d’un cancer (tous types confondus) dont plus de 400 000 en France, et on recense plus de 10 millions de décès (1/6) dont plus de 150 000 en France. Le nombre de personnes atteintes d’un cancer est en constante évolution, mais les progrès en terme de développement de traitements depuis 25 ans ont permis d’observer une diminution de la mortalité. La recherche de nouvelles solutions thérapeutiques est essentielle pour espérer diminuer le taux de mortalité dû au cancer, limiter les effets indésirables des traitements, et augmenter les taux de guérison. Dans ce contexte, ce projet vise à maintenir une collection vivante de tumeurs humaines implantées chez la souris (modèles de PDX) dans le but de réaliser des tests pour de nouveaux traitements contre différents types de cancers. Le maintien d’une partie de notre collection sous forme vivante garantie l’accessibilité des modèles pour les tests réglementaires et la découverte de nouvelles options thérapeutiques. Plusieurs paramètres sont régulièrement évalués durant ce maintien pour garantir la conservation des caractéristiques principales de chaque modèle tumoral et garantir des résultats qualitatifs.

Procédures

Greffe : implantation d’un fragment tumoral ou injection de cellules tumorales sous la peau. Le temps de chirurgie n’excèdera pas 10 minutes. Identification : des puces électroniques sont implantées en sous cutané au moment de la chirurgie ou un marquage aux oreilles est réalisé. Surveillance des animaux : observation quotidienne du comportement par déplacement et/ou ouverture des cages d’hébergement. Administration de médicament : préhension des animaux à une fréquence dépendant du schéma de traitement : biquotidienne ou moins. La durée de préhension n’excèdera pas 1 minute.

Impact sur les animaux

Stress dû à la préhension (suivi du poids et de la taille tumorale, administration de molécules): nuisance transitoire de classe légère ; Douleurs post-opératoires: nuisance transitoire de classe modérée ; Risque d’infection: nuisance transitoire de classe modérée ; Perte de poids (cachexie, anorexie ou perte d’appétit): nuisance transitoire de classe modérée ; Diarrhées: nuisance transitoire de classe modérée

Devenir

Les animaux seront euthanasiés compte tenu des nuisances occasionnées (greffe d’un fragment tumoral ou de cellules tumorales). Les animaux de ce projet ne seront pas utilisés dans un autre projet.

Remplacement

Le développement de nouveaux traitements permettant de lutter contre le cancer nécessite la réalisation de tests précliniques afin de valider leur efficacité sur la croissance tumorale, avant une application chez l’Homme. La réalisation de ces tests est dépendante de la disponibilité de modèles tumoraux représentatifs de la diversité des cancers humains. Il existe des méthodes alternatives et préalables à la réalisation de tests sur les animaux (prédictions informatiques, in vitro …), permettant de tester rapidement un grand nombre de molécules, et de sélectionner celles qui semblent le plus efficace. Cependant, ces méthodes réalisées en dehors du cadre d’un organisme vivant n’offrent pas la possibilité de lier les effets des traitements avec la complexité de l’organisme, par exemple elles ne prennent pas en compte l’effet de la circulation sanguine ou le rôle du foie dans la transformation et la distribution des médicaments. Cela limite la possibilité de prévoir comment un traitement agira réellement dans le corps d’un patient. C’est pourquoi, le développement puis, dans le cadre de ce projet, la disponibilité de modèles tumoraux sous forme vivante chez l’animal, sont essentiels à la réalisation de tests de nouveaux médicaments. Ces modèles tumoraux représentent la diversité des caractéristiques retrouvées dans les cancers humains. Leur maintien sous forme vivante chez l’animal est finement contrôlé pour garantir la conservation de leurs caractéristiques principales et l’obtention de résultats fiables.

Réduction

Ce projet utilise le nombre d’animaux nécessaire pour garantir la disponibilité et la fiabilité des modèles tumoraux maintenus sous forme vivante chez l’animal. Le nombre de modèles tumoraux maintenus sur souris est conditionné par l’offre proposée au sein de notre collection et par la demande en terme de tests de médicaments. Notre collection de modèles de PDX s’étoffe en permanence pour répondre à la demande grandissante en terme de diversité de types de cancers (mutation d’intérêt, réponse au traitement) représentant la population de patients. Les besoins en modèles tumoraux sont actualisés en temps réels en fonction des besoins des industries pharmaceutiques, afin d’évaluer et d’actualiser les modèles conservés sous forme vivante sur animaux. Le nombre d’animaux utilisés est calculé en fonction des différentes étapes du projet (décongélation, maintien ou préparation d’une phase de test de nouveaux médicaments), des paramètres de croissance de chaque modèle tumoral et des besoins pour les phases de tests pharmacologiques ultérieurs, tout en garantissant la disponibilité et la qualité des modèles. Sur notre collection de plus de 220 modèles tumoraux de PDX, seulement les 120 les plus demandés sont maintenus sous forme vivante chez l’animal. Les modèles tumoraux à croissance rapide sont facilement accessibles, et ne sont donc pas maintenus sur souris s’ils ne sont pas demandés. Les modèles les plus rarement demandés, dû à leur type tumoral ou leurs caractéristiques moléculaires, ne sont pas maintenus sur souris pour limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Pour prévenir l’hypothermie durant l’acte chirurgical, les animaux seront placés sur un tapis chauffant. Pour la prévention de la douleur et la souffrance lors de l’acte chirurgical les animaux recevront une anesthésiés générale. Si une perte de poids est observée, un supplément nutritionnel sera proposé à l’animal. Pour les soins, si une lésion ou une sécheresse sont observées au niveau de la sphère oculaire, une solution nettoyante et/ou protectrice sera appliquée. Si une lésion cutanée est observée, une solution antiseptique sera appliquée. En cas d’infection, des analyses bactériologiques et/ou virologiques pourront être effectuées pour instaurer une thérapie adéquate et l’animal pourra être isolé pour lui permettre de se rétablir sans la présence de ses congénères. Dans ce cas, divers matériaux ajoutés pour atténuer l’effet d’isolement et permettre la création d’un cocon. Après l’administration de molécules, l’animal sera observé pour détecter tout comportement inattendu. Aussi, un point de compression sera réalisé au site d’administration si nécessaire.

Choix des espèces

Nous utilisons des souches murines immunodéficientes qui sont classiquement utilisées pour des greffes de cellules ou de fragments tumoraux (Patient Derived Xenograft – PDX) et dans le cadre d'évaluations pharmacologiques. Les souris présentant un système immunitaire résiduel qui se développe avec l'âge et qui peut réduire le taux de prise de greffe, nous utiliserons des animaux en fin de période d'acclimatation, âgés entre 5 et 13 semaines pour augmenter nos chances de succès.

Jusqu'à vingt prélèvements sanguins par animal, cinq injections intraveineuses d'un virus sur lapin vigile, puis une exsanguination par ponction intracardiaque sous anesthésie. 60 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le porteur ne retient de ces gestes qu'un léger stress lié à la contention et une possible montée de température, et écrit n'avoir constaté aucune autre nuisance importante en plusieurs dizaines d'années. La mise à mort vise à obtenir "le maximum de sérum" et à prélever des organes, le nombre de lapins étant fixé par la quantité de sérum attendue par le client.

Objectifs

Nous développons depuis plusieurs dizaines d’années des anticorps pour la recherche. Les résultats obtenus grâce aux anticorps générés par notre entreprise ont participé à l’avancée des connaissances scientifiques à travers plusieurs centaines de publications de nos partenaires. Ce projet s’inscrit dans cette continuité pour poursuivre la génération d’outils biologiques pour la recherche et le développement. Le but du projet est la collecte d’échantillon (notamment de sérum) après de multiples injections d’un virus afin d’étudier la temporalité de l’apparition d’anticorps spécifique.

Bénéfices attendus

Depuis sa création, notre entreprise se spécialise dans le développement d’anticorps polyclonaux de lapin, principalement destinés aux acteurs du monde académique. Chaque projet d’immunisation vise à créer un nouvel outil de recherche sur mesure, répondant à des besoins spécifiques. Bien que le marché propose déjà une large gamme d’anticorps standards, notre expertise en conception d’immunogènes nous permet d’atteindre un taux de réussite exceptionnel - supérieur à 95 %, tout en garantissant des anticorps polyclonaux de haute qualité et en limitant le nombre d’animaux utilisés. Nos anticorps ont déjà contribué à des avancées significatives, avec des publications dans des revues prestigieuses comme Nature ou Science. Ils ont notamment permis d’explorer des pathologies variées, telles que la surdité infantile ou différents types de cancers. À terme, ces recherches visent à éclairer les mécanismes biochimiques du vivant et à poser les bases de nouvelles thérapies pour les décennies à venir. Ce nouveau projet représente une avancée majeure : il nous permettra d’étudier en détail l’apparition et l’évolution des anticorps dans le sérum après l’injection de virus Oncolytique. À l’issue de ce processus, nous pourrons récupérer plusieurs lots de sérum, offrant ainsi une ressource précieuse pour analyser la réponse immunitaire.

Procédures

- Injection intraveineuse sur animaux vigiles, environ 1 min, maximum 5 injections. - Prélèvements sanguins sur animaux vigiles, environ 5 min, maximum 20 prélèvements. - Exsanguination en intracardiaque sous anesthésie, sans réveil

Impact sur les animaux

La contention lors des prélèvements et des injections peut causer un léger stress. Une augmention de la température des animaux peux apparaitre après l’injection des virus. Avec l’expérience de notre société depuis plusieurs dizaines d’années, nous n’avons pas constaté d’autres nuisances importantes. Nous resterons néanmoins vigilants à tout effet imprévu.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.

Remplacement

Le remplacement du modèle in-vivo ne peut être envisagé car la réponse immunitaire est un phénomène complexe impliquant la coopération entre de multiples types cellulaires, pour lequel il n’existe pas d’équivalent in-vitro. Bien que des méthodes alternatives émergent, ces approchent n’apportent pas la même qualité d’anticorps. Pour palier partiellement à ce défaut, cela nécessite d’utiliser des banques dites « immunes » qui nécessitent d’immuniser le lapin et n’apporte aucun bénéfice en termes de remplacement. De plus ces technologies de développement d’anticorps monoclonaux chez le lapin, ne sont pas encore matures. Ils nécessitent un matériel particulier et des réactifs adaptés.

Réduction

Le nombre de lapins utilisé pour chaque expérimentation est réduit au minimum, il est déterminé par la quantité de sérum attendue par le client. Une précédente étude a permis de conforter le choix de cinq animaux par groupe.

Raffinement

Les animaux ont un enrichissement dans les cages sous forme de tablette et de palet dans les cages. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. De plus les animaux sont manipulés et caressés régulièrement (2 fois par semaines). Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des lapins pour limiter le stress au maximum. Si l’animal présente une souffrance qui ne diminue pas avec l’arrêt des injections et les soins apportés, et que les points limites sont atteints alors, l’animal sera mis à mort pour éviter des toutes souffrances.

Choix des espèces

Le lapin est l’animal de laboratoire bien adapté au développement d’anticorps pour la recherche. Il montre en effet une très bonne réponse immunitaire humorale. Par ailleurs il permet de récolter une quantité de sérum conséquente suffisante pour les applications en recherche. Nous utilisons des jeunes adultes car c’est chez les jeunes adultes que la réponse immunitaire est la meilleure et par là même la génération d’anticorps.

Dès que le serpent prend la posture enroulée typique du sommeil, une stimulation le réveille, et la privation se poursuit ainsi jour après jour, à chaque température testée. 6 serpents vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans un programme de recherche comparative. Ils passent une IRM et un scanner sous sédation, subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes sous anesthésie générale, puis sont transportés sédatés dans un sac opaque entre deux établissements, pour caractériser un sommeil encore inconnu chez cette lignée de reptiles. Le choix s'est porté sur de grands serpents calmes, non venimeux et faciles à obtenir en élevage, les espèces protégées ou dangereuses ayant été écartées.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser le sommeil des serpents, dernière grande lignée de reptiles encore non étudiée dans l’évolution du sommeil. Le projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Leur physiologie atypique (absence de paupières, forte inactivité, faible métabolisme) en fait un modèle pertinent pour redéfinir les critères de sommeil chez les reptiles. Pour ce faire, nous allons enregistrer en télémétrie l’activité cérébrale et les paramètres physiologiques associés (tonus musculaire, fréquence cardiaque, respiration, activité des yeux) chez des serpents, et en les comparant aux états d’éveil calme et actif. Afin de déterminer si les animaux dorment, nous évaluerons leur seuil de réveil et leur réponse à la privation de sommeil. L’effet de la température sera aussi évalué du fait que le comportement de ces animaux est extrêmement lié à la température ambiante.

Bénéfices attendus

Ce projet aidera à mieux définir les critères comportementaux et physiologiques du sommeil chez des espèces qui ne présentent pas les signes typiques observés chez les mammifères. Il complétera aussi notre compréhension parcellaire sur l’évolution des états de sommeil et notamment du sommeil paradoxal. Les résultats de ce projet pourraient aussi avoir un impact sur le bien-être animal en identifiant les conditions favorables à un sommeil réparateur chez les serpents, ces données pourront ainsi améliorer les pratiques d’élevage, de détention et de conservation des reptiles, notamment pour les espèces menacées ou maintenues en captivité (zoos, centres de sauvegarde).

Procédures

Les animaux subiront une sédation pour passer une IRM et un scanner dans l’EU2 (1 journée). Ensuite, ils subiront une anesthésie générale permettant une intervention chirurgicale dans l’EU1 EU1 afin de mettre en place des électrodes d’enregistrement, suivie d’un traitement antalgique postopératoire. Après une phase de récupération (1 semaine), les animaux seront à nouveau sédatés pour passer un nouveau scanner (EU2) et vérifier la position des électrodes. Ils seront ensuite enregistrés dans l’EU1 en télémétrie dans leur propre terrarium à différentes températures, 4 jours par température. Après 1 jour d’acclimatation, ils seront privés de sommeil par une stimulation douce (dès que l'animal prendra une posture enroulée sur lui-même, typique d'une posture de sommeil) et sa récupération sera monitorée. Enfin, après 4 jours, une évaluation du seuil de réveil (à l’aide d’un micro-vibreur induisant des vibrations légères) sera réalisée pour estimer les latences de réveil et la profondeur du sommeil (4 jours). Pendant la durée des enregistrements, les animaux seront stabulés dans un terrarium adapté à leur taille et ne seront pas dérangés outre le remplacement des batteries du dispositif d’enregistrement entre chaque protocole.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues concernent l’intervention chirurgicale d’implantation d’électrodes et la phase expérimentale de privation de sommeil. L’implantation d’électrodes, bien que réalisée sous anesthésie générale, constitue une procédure invasive. Elle peut provoquer une douleur transitoire post-opératoire, une réduction temporaire de la mobilité, une perte d’appétit ou une altération du comportement. Un inconfort local (lié à la cicatrisation ou à la présence des électrodes) est également possible dans les jours suivant l’intervention. Chez les reptiles, ces effets sont souvent discrets mais seront systématiquement recherchés. La phase d’enregistrement, bien qu’exempte de contrainte physique, impose le port d’un dispositif fixé sur le crâne. Celui-ci peut gêner légèrement les mouvements ou induire un stress comportemental transitoire, notamment au moment de sa mise en place. Toutefois, les serpents étudiés étant peu mobiles et dociles, ces effets sont attendus comme modérés. La privation de sommeil, réalisée par stimulation douce manuelle en période de repos, peut entraîner une augmentation du stress, une agitation ponctuelle ou une altération du comportement exploratoire. Chez les reptiles, les effets secondaires restent généralement limités mais incluent une possible fatigue, une baisse de vigilance ou une altération temporaire des rythmes biologiques. Aucune douleur n’est induite par cette procédure. Des manipulations régulières sont nécessaires pour les soins post-opératoires, le changement de batterie et les tests de réactivité. Elles peuvent provoquer un stress ponctuel ou une réponse de défense, bien que les individus soient habitués au contact humain. Enfin, un risque faible de complications chirurgicales (infection locale, mauvaise cicatrisation, rejet du matériel) existe, bien qu’il soit réduit par l’expérience de l’équipe et le protocole appliqué. Ces effets sont rares mais potentiellement délétères pour l’individu concerné.

Devenir

Il est prévu que les animaux soient réutilisés après l’expérimentation dans un programme de recherche comparative.

Remplacement

Le sommeil est un phénomène à la fois comportemental, neurophysiologique et physiologique, impliquant de nombreuses fonctions intégrées telles que l’activité cérébrale, les rythmes circadiens, les régulations hormonales, métaboliques, cardiovasculaires et thermiques. Ces fonctions interconnectées ne peuvent pas être reproduites ni simulées de manière fiable à l’aide de modèles in vitro, in silico ou ex vivo. De plus, l’étude de l’évolution des états de sommeil nécessite une approche comparative entre espèces vivantes, dans leur intégrité biologique, afin de caractériser les similitudes et différences entre groupes phylogénétiques. Chez les reptiles, et en particulier les serpents, aucun modèle substitutif n’existe aujourd’hui pour étudier les états de sommeil de manière complète (comportement, physiologie, activité cérébrale). Ainsi, l’utilisation de l’animal est indispensable et constitue la seule méthode permettant de répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. Il n’existe donc actuellement aucune alternative éthique ou technique permettant de se passer de l’animal pour ce type d’étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé en tenant compte à la fois des exigences méthodologiques et des principes de réduction. L’objectif principal est de caractériser un phénomène biologique présent dans une espèce : le sommeil. Pour cela, il est nécessaire d’observer ce phénomène chez plusieurs individus afin de démontrer sa constance et de contrôler les variations interindividuelles. Nos travaux antérieurs et ceux d’autres équipes ayant étudié les lézards ont montré que 6 individus étaient suffisants et nécessaires pour identifier et caractériser finement un état de sommeil, son homéostasie et son seuil de réveil associé. Le design expérimental a été rigoureusement conçu pour limiter le nombre d’animaux tout en assurant la robustesse des données. Une étude pilote sur un python tapis a permis de déterminer notre capacité à obtenir des signaux de qualité en ciblant des structures cérébrales précises. L’utilisation de techniques d’imagerie pré- et post-opératoire (IRM/Scanner) pour guider l’implantation, ainsi que la maîtrise technique des interventions, permet de garantir un taux de succès élevé, réduisant ainsi le nombre d’animaux. L'ensemble des procédures suit une logique intra-individuelle : chaque animal sert de témoin à lui-même avant et après privation, avant et après nourrissage, avant et après changement de température, ce qui permet de réduire considérablement le nombre total requis tout en augmentant la puissance des comparaisons.

Raffinement

Les études sur le sommeil nécessitent des observations sur des animaux non anesthésiés vivants dans de bonnes conditions psychophysiologiques. Le bien-être des animaux est donc une condition sine qua non de chaque étape de l’expérimentation. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. L'environnement sera notamment enrichi de branches et de substrats adaptés pendant les périodes d’acclimatation et de récupération. Durant les enregistrements, l’animal est libre de ses mouvements dans son propre terrarium. Les animaux seront transportés entre les établissements, sédatés, dans un sac opaque, adapté au transport de serpent afin de réduire leur stress. Les mesures de raffinement lors du transport incluent le maintien d’une température stable et adaptée à l’espèce, la réduction des vibrations et du bruit, ainsi qu’une manipulation minimale pour limiter le stress et tout risque de réveil ou de blessure. Par ailleurs, une grille de suivi du bien-être animal, et des points limités adaptés et précoces, spécifiques à l’espèce ont été mis en place en consultant des spécialistes (vétérinaires, éleveurs, herpétologues). Les décisions relatives aux points limites sont prises en concertation avec le vétérinaire référent et des spécialistes des serpents, si un comportement inhabituel est identifié.

Choix des espèces

L’objectif est d’étudier le sommeil des serpents, dernière grande lignée de squamates encore peu étudiée dans l’évolution du sommeil. Leur physiologie atypique (absence de paupières, forte inactivité, faible métabolisme) en fait un modèle pertinent pour redéfinir les critères de sommeil chez les reptiles. Toute espèce appartenant au sous-ordre des serpents pourrait donc être choisie. Cependant, beaucoup d’espèces de serpents ne sont pas adaptées à cette expérimentation, pour des raisons de statut de protection, de taille, de disponibilité en élevage et de dangerosité. Nous nous tournons ainsi vers des espèces de serpent de grande taille, calmes, non venimeuses et disponibles facilement en élevage. Les individus doivent avoir une tête de taille adaptée à l’implantation stable d’électrodes pour l’étude du sommeil. Leurs morphologies et leurs comportements moteurs doivent aussi faciliter les interventions, avec un risque minimal de blessure ou de stress durable. Phylogénétiquement, M. spilota, et B. constrictor sont tous les deux des représentants du groupe des serpents qui pourraient convenir. Les individus choisis, seront adultes (>5 ans) nés en captivité, et habitués aux manipulations . M. spilota, et B. constrictor par exemple, offrent un compromis optimal entre pertinence scientifique, faisabilité technique et respect du bien-être animal. Par ailleurs, les deux espèces présentent le même mode de vie semi-arboricole et le même régime alimentaire, et ce sont deux espèces assez courantes en élevage. Elles constituent donc des modèles cible.

627 rats porteurs d'une myopathie de Duchenne vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie de trente minutes pour l'implantation d'une pompe sous la peau, d'autres reçoivent des injections quotidiennes dans le péritoine, d'autres une injection de cardiotoxine directement dans le muscle, avec des prélèvements de sang chaque semaine pendant deux mois. Le porteur indique que les rats seront tués entre quatre et six mois, avant l'apparition des atteintes majeures du phénotype dystrophique qu'il situe après dix mois. Sur le remplacement, il reconnaît que l'inhibition de la ferroptose réduit déjà la mort des fibres musculaires en culture, et conclut que seule l'expérimentation sur "l'animal entier" permet de valider un traitement, en visant à terme un essai chez le chien puis chez l'enfant.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique rare, grave et encore incurable. Elle est causée par des mutations d'un gène responsable de la production d'une protéine appelée dystrophine. Cette protéine est essentielle pour protéger les fibres musculaires pendant l’effort. Son absence rend les muscles fragiles, ce qui provoque leur mort progressive. Cela entraîne une faiblesse musculaire sévère qui touche les muscles squelettiques, mais aussi les muscles respiratoires (comme le diaphragme) et le cœur. Bien que la mort des fibres musculaires (appelée myonécrose) soit une caractéristique bien connue de la DMD, on ne comprend pas encore parfaitement comment elle se déclenche. Récemment, une nouvelle forme de mort cellulaire appelée ferroptose a été découverte. Cette forme de mort est liée à un excès de stress oxydatif dans les cellules, notamment au niveau des graisses qui composent les membranes cellulaires, et à une baisse des défenses naturelles de la cellule. Des travaux récents ont montré que cette ferroptose pourrait jouer un rôle dans la DMD. À l'heure actuelle, il n'existe aucun traitement permettant de s’attaquer directement à la cause de la maladie ou d’arrêter son évolution. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer si bloquer la ferroptose permettrait de protéger les muscles et de ralentir la progression de la DMD. Pour cela, nous testerons trois composés qui ont déjà montré leur efficacité en laboratoire ou dans d'autres modèles de maladie. Ces traitements seront administrés à des rats atteints de DMD entre 2,5 et 4 mois, une période où la dégénérescence musculaire est particulièrement active. Deux méthodes d’administration à court terme seront comparées : une perfusion continue grâce à de petites pompes placées sous la peau, ou des injections quotidiennes. Les effets des traitements seront analysés à travers des biomarqueurs sanguins, des tests fonctionnels, des examens histologiques et moléculaires du muscle. La méthode la plus efficace sera retenue pour une étude plus longue, afin d’évaluer si les bénéfices peuvent durer dans le temps. Par ailleurs, nos premières observations en laboratoire suggèrent que ces traitements pourraient aussi aider les muscles à se réparer. Cette idée sera testée chez des rats sains, dans un modèle de lésion musculaire aiguë, afin d’observer si les médicaments favorisent la régénération des fibres musculaires après une blessure.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples : (1) évaluer le potentiel thérapeutique d’un inhibiteur spécifique de cette voie, seul ou en association ; (2) identifier des effets secondaires ou bénéfiques non anticipés, comme une possible stimulation de la régénération musculaire. Ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques combinées pour la DMD, et, à plus long terme, être transposables à d'autres myopathies impliquant des phénomènes de mort cellulaire régulée. A plus long terme et en cas de résultats encourageant, nous envisageons de pouvoir programmer un essai préclinique chez le chien afin de consolider le dossier préclinique qui serait utile pour un essai clinique chez l'enfant.

Procédures

Dans ce projet, certains animaux subiront une chirurgie légère pour poser une pompe (environ 30 minutes/animal), d’autres seront soumis à des injections quotidiennes dans le péritoine (environ 30 secondes/animal) et enfin certains subiront une injection dans le muscle de cardiotoxine (environ 30 secondes/animal). Des prélèvements de sang seront réalisés de manière hebdomadaire sur une durée de maximum 60 jours. Des tests non invasifs fonctionnels pour évaluer la force musculaire seront réalisés tous les 15 jours sur une durée maximale de 60 jours

Impact sur les animaux

Utilisation de modèles pathologiques : Les animaux dystrophiques utilisés dans ce projet (modèles DMD) présentent un phénotype pathologique progressif. Toutefois, les signes cliniques majeurs n’apparaissent qu’après l’âge de 10 mois. Dans ce protocole, les animaux seront mis à mort au plus tard à 6 mois, avant l’apparition des altérations sévères. Intervention chirurgicale pour l’implantation de pompes : Cette procédure, réalisée sous anesthésie générale, peut induire un stress opératoire, une douleur post-chirurgicale modérée et un inconfort local dû à la présence du dispositif. Ces nuisances seront limitées grâce à un protocole analgésique adapté (pré, per et post-opératoire) et à une surveillance étroite des animaux durant la phase de récupération. Injections répétées : Les injections quotidiennes peuvent engendrer une douleur légère et transitoire ainsi qu’un stress lié à la contention répétée Prélèvements sanguins hebdomadaires : Les prélèvements seront réalisés via des techniques peu invasives entraînant un stress modéré et une douleur légère de courte durée. Tests fonctionnels : Certains tests peuvent provoquer une fatigue musculaire, en particulier chez les animaux myopathes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Il a été démontré, dans des modèles cellulaires, l’activation des voies de mort cellulaire régulée de type ferroptose, ainsi que la capacité de leur inhibition à réduire significativement la mort des myofibres en culture. Ces résultats in vitro soulignent la pertinence de la ferroptose comme cible thérapeutique, mais nécessitent désormais une validation in vivo. En effet, seule l’expérimentation sur l’animal entier, dans un environnement physiologique intégrant l’ensemble des organes et systèmes en interaction, permet d’évaluer de manière complète et fiable l’efficacité et la tolérance d’un traitement. Nous proposons ainsi de tester l’efficacité d’inhibiteurs de la ferroptose dans des modèles de rats DMD, afin de confirmer leur potentiel thérapeutique dans un organisme vivant.

Réduction

De nombreuses données ont été cumulées sur les modèles animaux utilisés dans ce projet. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique et le calcul de puissance statistique nous recommande d'utiliser 8 animaux par groupe. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés pour lesquels nous avons pu conclure qu'il était suffisant et approprié pour conclure de façon non ambiguë.

Raffinement

Afin d’assurer leur bien-être, nous utilisons les plus grandes cages disponibles sur le marché, permettant aux rats de marcher, courir et se dresser sur leurs pattes arrière. Ce niveau d’activité spontanée est essentiel pour des rats dont les capacités locomotrices sont évaluées. Le milieu est enrichi par des éléments variés tels que des lanières de papier kraft,des bâtons à ronger, balles, tunnels et carrés de coton compressé. Pour limiter le stress lié aux manipulations et aux tests, les rats sont habitués dès leur jeune âge à être manipulés régulièrement et avec douceur. Le suivi des animaux est assuré par du personnel expérimenté, capable de détecter, évaluer, et atténuer ou éliminer les signes de douleur ou de détresse. Pour la pose de la pompe par chirurgie, une anesthésie chimique est réalisée. Les prélèvements sanguins sont effectués sous une couverture analgésique chimique. La gestion du bien-être et la mise à mort : Dans ce projet, les rats modèles DMD seront mis à mort à l’âge de 4 à 5 mois, avant l’apparition des signes délétères majeurs du phénotype dystrophique, qui surviennent généralement après 10 mois (difficultés à mastiquer, risques de rhabdomyosarcome) ou au-delà de 12,5 mois pour les insuffisances cardiaques fatales. Une grille critériée d’évaluation de la douleur et des seuils limites a été mise en place et affichée. Les animaux sont surveillés quotidiennement, y compris les week-ends et jours fériés. Toute atteinte d’un seuil critique entraîne une action corrective immédiate. En l’absence d’amélioration et en cas de trouble irréversible, une mise à mort compassionnelle est pratiquée afin de prévenir toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Nos animaux appartiennent à une espèce de mammifère évolutivement proche de l'humain, ce qui en fait un modèle apprécié pour la recherche. Grâce aux récents outils de modification du génome, cette espèce est devenue un choix privilégié pour l'étude des troubles musculosquelettiques. Nos modèles reproduisent fidèlement les myopathies humaines et sont appréciés en recherche médicale. Les animaux seront âgés de 2,5 à 4 mois jusqu’à maximum 6 mois, ce qui correspond au stade où la maladie progresse le plus et les muscles sont de plus en plus impactés, fonctionnellement et morphologiquement.

Trente-cinq minutes enfermés dans un tube de contention pour mesurer leur réaction au stress : 150 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'étude de leur cerveau. Ils reçoivent une injection intracérébrale sous une anesthésie d'environ cinquante minutes, cinq injections d'un marqueur des nouveaux neurones, et passent un test de mémoire de dix minutes, à 3, 8, 12 et 18 mois. Le résumé cite le labyrinthe comme exemple de mesure de la mémoire spatiale, sans préciser quel test est employé ici. Le porteur retient le rat pour la continuité de vingt ans de travaux du laboratoire sur cette espèce et la possibilité de comparer les données déjà collectées.

Objectifs

Avec l’âge, notre mémoire peut se dégrader, ce qui peut nuire à notre santé, notre bien-être et notre qualité de vie. Ce déclin est souvent lent et naturel, mais il ne touche pas tout le monde de la même manière : certaines personnes gardent une bonne mémoire, d’autres non. Ce phénomène dépend notamment de l’hippocampe, une partie du cerveau importante pour créer et consolider les souvenirs. Dans certains cas, le cerveau arrive à compenser cette baisse grâce à des mécanismes internes, comme la neurogénèse, c’est-à-dire la création de nouveaux neurones. Cette production de neurones se fait surtout dans l’hippocampe, et elle semble favoriser une bonne mémoire, en particulier pour se repérer dans l’espace (comme dans les tests de labyrinthe chez les rats). Ce processus peut être influencé par le stress, qui agit sur un système du corps appelé l’axe corticotrope. Mais d’autres éléments, moins connus, peuvent aussi jouer un rôle dans le déclin de la mémoire. Par exemple, une barrière protectrice du cerveau, appelée barrière hémato-encéphalique (BHE), peut devenir plus perméable avec l’âge ou en cas de maladies neurodégénératives. Quand cette barrière laisse passer trop de substances du sang vers le cerveau, cela peut dérégler son fonctionnement normal, et donc affecter la mémoire. Le but du projet est donc de mieux comprendre ces phénomènes en étudiant l’état de cette barrière chez des individus âgés, et voir comment les nouveaux neurones et d’autres cellules s’intègrent dans le réseau sanguin du cerveau.

Bénéfices attendus

Ce projet est le premier à s’intéresser à la façon dont les vaisseaux sanguins du cerveau interagissent avec les nouveaux neurones produits à l’âge adulte, pour aider à préserver nos capacités mentales en vieillissant. C’est une approche innovante, car jusqu’à présent, on pensait surtout que le déclin de la mémoire avec l’âge venait uniquement des neurones eux-mêmes. En étudiant aussi la circulation sanguine dans le cerveau, ce projet pourrait mieux expliquer les mécanismes du vieillissement cérébral.

Procédures

Dans le cadre de l’étude, 4 types d’interventions seront réalisés sur les animaux. À différents âges (3, 8, 12 et 18 mois), ils seront brièvement placés dans un tube de contention afin d’évaluer leur réaction au stress. Cette situation provoque un stress modéré, pendant lequel des prélèvements sanguins seront effectués ; la durée totale de cette procédure est de 35 minutes par animal. Des injections cérébrales seront également réalisées sous anesthésie, pour une durée d’environ 50 minutes par animal. Par ailleurs, un marqueur permettant d’identifier les nouveaux neurones sera injecté à plusieurs reprises (cinq fois au total, chaque injection dure environ 4 minutes. Enfin, un test comportemental de 10 minutes sera mené afin d’évaluer leurs capacités de apprentissage et de mémoire.

Impact sur les animaux

Comme pour tout projet impliquant des injections et des opérations sur le cerveau, certains effets secondaires peuvent apparaître, même si nous faisons très attention et suivons des procédures adaptées. Par exemple, il arrive, même si c’est rare, que les zones où l’on fait les injections (sous la peau) ou les plaies liées à l’opération chirurgicale s’irritent. Cette opération est susceptible de provoquer des douleurs après l’opération qui seront traitées grâce à des anti-douleurs. Par conséquent, dans les deux jours qui suivent l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids (jusqu’à 5 % de leur poids de départ).

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre l'étude poussée du cerveau.

Remplacement

Dans ce projet, nous voulons comprendre comment le vieillissement agit sur le cerveau, en particulier sur la façon dont les cellules nerveuses et les vaisseaux sanguins communiquent entre eux. Pour cela, nous étudions directement des animaux vivants, car cela nous permet aussi d’évaluer leur mémoire. C’est une approche globale qui demande que l’animal puisse se comporter normalement. Nous ne pouvons pas faire ce type d’étude en laboratoire sur des cellules isolées ou par ordinateur. Enfin, pour bien comprendre les effets du vieillissement sur le système sanguin dans son ensemble, il est indispensable d’étudier un organisme entier. C’est pourquoi nous ne pouvons pas utiliser de méthodes de substitution.

Réduction

Ce projet vise à étudier le vieillissement à 3 étapes de la vie : jeune adulte (8 mois), milieu de vie (12 mois) et fin de vie (18 mois). Pour cela, trois lots d’animaux seront constitués, correspondant à ces âges. Dans chaque lot, les animaux seront répartis en trois groupes selon leurs performances à un test comportemental à 3 mois (groupe contrôle, groupe résilient et groupe vulnérable). Le nombre de rats a été estimé sur la base d’une approche statistique permettant de déterminer la taille des groupes, et en tenant compte de nos données précédentes ainsi que des pertes possibles liées à l’âge (problèmes de santé, décès naturel). Pour garantir des résultats fiables, 50 rats seront utilisés par lot (6 rats contrôles, 22 rats résilients, 22 rats vulnérables), soit un total de 150 animaux. Ce nombre pourra être réduit si les différences entre les groupes sont plus marquées que prévu et sans nuire à la qualité scientifique de l’étude.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux sont laissés une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement, avec des conditions favorisant leur bien-être (enrichissement, contact humain régulier). Une intervention chirurgicale est ensuite réalisée sous anesthésie pour injecter un virus traceur dans une zone spécifique du cerveau. Un traitement anti-douleur est administré durant cette intervention pour limiter l’inconfort lié à cette intervention. Les animaux reçoivent des soins adaptés avant, pendant et après l’opération, ainsi qu’une surveillance quotidienne. Durant le vieillissement des animaux, un suivi régulier est mis en place pour détecter d’éventuelles complications, avec un protocole pour exclure l’animal de l’étude si nécessaire. À différents âges, les animaux participent à des tests de comportement liés à la mémoire et au stress. Pendant ces tests, ils sont logés seuls mais restent en contact sensoriel avec leurs congénères. Un entraînement progressif permet de les habituer à la tâche. Leur comportement est observé en continu pour prévenir toute détresse, avec des mesures immédiates en cas de signes de mal-être.

Choix des espèces

Dans ce projet, le modèle choisi est le rat. Le système nerveux des mammifères est trop complexe pour être reproduit en laboratoire, que ce soit en utilisant des cellules en culture ou des animaux plus simples comme les insectes. Le rat est un modèle de référence en neurosciences, souvent utilisé pour des études comportementales comme celles réalisées dans notre laboratoire. De plus, la formation de nouveaux neurones dans l'hippocampe est un phénomène commun à plusieurs mammifères, y compris le rat, le singe et l'humain. Cette étude s'inscrit dans la continuité de nos recherches menées depuis plus de 20 ans sur cette espèce, et nous permet de comparer des données déjà collectées pour mieux contrôler les résultats. Les rats seront reçus à l'âge de 10 semaines pour être opérés à 12 semaines. Ensuite, les expériences auront lieu entre 5 et 15 mois après les injections dans leur cerveau. Nous étudierons des rats adultes à différents stades de vieillissement : 1) jeune adulte (8 mois) ; 2) milieu de vie (12 mois) ; 3) fin de vie (18 mois). Ces âges ont été choisis pour pouvoir suivre, sur le long terme, l'impact de l’intégrité de la barrière hématoencéphalique sur les nouveaux neurones formés à l'âge adulte sur l'apparition de problèmes de mémoire.

Déjà présents dans les installations du laboratoire, 20 poissons Astyanax mexicanus adultes, dix mâles et dix femelles, vont être génotypés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, un morceau de nageoire caudale leur est prélevé et un marquage à l'élastomère leur est posé, avec un isolement de moins de 24 heures. Aucun n'est tué : les vingt sont élevés et reproduits pour constituer des lignées avec et sans le chromosome surnuméraire qui semble déterminer le sexe. Le porteur affirme que ce chromosome est trop propre à l'espèce pour être étudié chez le poisson zèbre et que la culture cellulaire ne rendrait pas compte des stades de développement.

Objectifs

La détermination du sexe reste une question centrale en biologie, et les poissons sont des modèles particulièrement intéressant dans ce contexte, en raison de la grande diversité de leurs mécanismes de détermination du sexe, souvent liés à des changements de leurs chromosomes sexuels. Les chromosomes B, sont des chromosomes surnuméraires et accessoires qui peuvent être impliqués dans divers processus biologiques dont la détermination du sexe. Chez la population d’Astyanax mexicanus de de surface, il existe un chromosome B qui contient un gène majeur déterminant du sexe. Cependant on a observé des mâles avec et sans chromosome B ains que de rares femelles avec un chromosome B. L'objectif de cette partie du projet est d'effectuer un génotypage des animaux présents dans nos installations afin de réaliser des lignées spécifiques pour comprendre le rôle de ce chromosome dans le déterminisme sexuel de cette espèce.

Bénéfices attendus

La création de ces lignées permet d'avoir des poissons modèles pour étudier le rôle te les mécanismes de transmission des chromosomes B.

Procédures

Nous prélèverons un morceau de nageoire caudale et marquerons à l'élastomère sous anesthésie sur 20 poissons géniteurs.

Impact sur les animaux

Les procédures de biospsie, de marquage et d’isolement (

Devenir

Les 20 animaux génotypés seront élevés et reproduits pour générer les lignées souhaitées.

Remplacement

La présence du chromosome B est très espèce spécifique et ne peut être étudié sur des poissons modèles type zebra fish. De plus le système de déterminisme du sexe chez les poissons par un chromosome B met en jeu des mécanismes complexes et encore inconnus. L’étude de ces systèmes en modèle in vitro par culture cellulaire ne prendrait pas en compte l’interaction des différents types cellulaires ni les différents stades de développement lors de la maturation et n’est pas pertinent dans le cadre de notre étude.

Réduction

Sur 20 animaux qui seront génotypés nous avons 10 mâles et 10 femelles ce qui constitue le minimum pour réaliser une fécondation et pour avoir les génotypes attendus.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau, densité). Les enrichissements faits de plantes artificielles seront aussi installés dans les aquariums. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la biopsie de la nageoire, le marquage ou la mise en balnéation seront réalisées par du personnel compétant, sous anesthésie et le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement par des zootechniciens en suivant la grille Bien Être Animal qui permet de déterminer les points limites qui mèneraient à l’arrêt de l’expérimentation.

Choix des espèces

Les espèces et populations de poissons du groupe Astyanax seront utilisées comme espèces modèles dans cette étude du fait que les mâles possèdent un chromosome B qui, d’après des études préliminaires, semblent liées au sexe. De plus les Astyanax possèdent des qualités de poisson modèle (génome entièrement séquencé, petite taille, temps de génération réduit (maturation à 6 mois), reproduction toutes les 2 semaines, fécondation in vitro possible). Les 20 poissons de cette procédure seront utilisés à l'âge adulte et à maturité sexuelle pour réaliser des reproductions.