Procédures modérées

4 768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des métabolites bactériens par gavage jusqu'à une fois par jour pendant six semaines, ou par injection sous-cutanée jusqu'à huit semaines, avec un risque d'irritation locale, de perte de poils et de fausse route. Suivent des tests de sociabilité, de comportements répétitifs et d'anxiété, dont le test du champ ouvert, et des évaluations de la physiologie intestinale allant jusqu'à six heures, pour reproduire chez la souris des traits associés à l'autisme. Le porteur écarte le rat au motif qu'il est plus grand, a besoin de plus d'espace et "ne convient pas à la taille de notre animalerie, surtout avec le nombre important d'animaux prévus".

Objectifs

Les troubles du neurodéveloppement, comme les troubles du spectre de l’autisme (TSA), concernent environ 1 % de la population mondiale. Ces troubles se manifestent par des difficultés d’interaction sociale, des comportements répétitifs, mais aussi par des troubles associés comme l’anxiété ou l’hyperactivité. Les patients atteint de la maladie présentent également des problèmes digestifs (constipation, diarrhée, douleurs abdominales), souvent associés à un déséquilibre de leur flore intestinale. Les causes exactes des TSA restent mal comprises, mais de plus en plus de travaux suggèrent un lien entre le cerveau, l’intestin et les milliards de microbes qui le peuplent : le microbiote intestinal. Le microbiote intestinal aide à réguler nos défenses immunitaires, notre digestion, et même à communiquer avec le cerveau, notamment grâce à certaines petites molécules produites par les bactéries intestinales- appelées métabolites. Chez les patients autistes, plusieurs études ont observé des anomalies dans certains métabolites présents dans leur corps. Par exemple, des métabolites issus de la dégradation par le microbiote intestinal d’un acide aminé appelé phénylalanine, sont retrouvés en quantité plus élevée dans les urines et le sang des patients. Le but de ce projet est d’identifier des métabolites capables de déclencher chez la souris des altérations du comportement (sociabilité, comportements répétitifs, anxiété) et/ou des troubles gastro-intestinaux (transit, perméabilité, inflammation), et d’explorer leur mode d’action, notamment par des approches pharmacologiques ciblant le système nerveux. Nous testerons également l’effet de traitements ciblant le microbiote, susceptibles de contrebalancer ces effets. Nous utiliserons un modèle murin, permettant la manipulation de nombreux outils génétiques, une bonne reproductibilité et une forte sensibilité aux variations du microbiote. Néanmoins, ce modèle ne reflète pas toute la complexité des TSA humains (cognition, langage) et les différences interespèces limitent l’extrapolation. Ce projet générera donc des données utiles pour guider de futures recherches cliniques.

Bénéfices attendus

Cette étude est conçue pour générer des connaissances fondamentales qui pourront être utiles pour la recherche chez l’humain. Elle permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans les TSA, en particulier le rôle du microbiote intestinal. Ce projet contribuera à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques ciblant le microbiote, et à tester leur efficacité dans des modèles animaux avant de les envisager pour une application chez l’humain, en vue d’améliorer la santé et la qualité de vie des personnes autistes. Ces résultats seront accessibles à court terme, à l’issue des différentes étapes expérimentales, c’est-à-dire dans les 2 à 3 ans suivant le début du projet. En revanche, leur application en santé humaine nécessitera des étapes supplémentaires, notamment des validations dans d’autres modèles expérimentaux, puis des essais cliniques. Ainsi, même si ce projet contribue à poser les bases de futures approches thérapeutiques, une application concrète chez l’humain ne pourra être envisagée qu’à moyen ou long terme.

Procédures

Identification par injection de puce : durée 10s ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Test de comportements évaluant le phénotype social : durée 4min30s, 10min, 12min, 25min et 72h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant les comportements répétitifs : durée 5 à 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant l’anxiété : durée 5min, 6min et 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Evaluation de la physiologie intestinale : durée 60min, 90min et 6h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Prélèvement sanguin après incision de l’extrémité de la queue : durée 10min ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Gavage : durée 5s ; fréquence allant d’une seule fois à une fois par jour pendant 6 semaines en fonction de la procédure. • Injections : durée 5s ; fréquence une seule fois à une fois par jour pendant 4 à 8 semaines en fonction de la procédure. • Anesthésie gazeuse : durée 10 min ; fréquence 1 fois sur la procédure.

Impact sur les animaux

Certains des métabolites administrés pourraient impacter le métabolisme ou provoquer des troubles digestifs chez les souris, comme de la constipation, de la diarrhée, ou un inconfort intestinal (ballonnements, douleurs abdominales). Ces effets seront surveillés par l’observation du comportement des animaux, leur poids et leur consommation d’eau et de nourriture. Les substances seront parfois administrées par gavage, une méthode qui peut engendrer un stress temporaire et/ou une légère irritation de l’œsophage, mais la réalisation du geste par du personnel formé limite l’inconfort. Il est à noter que lorsque pratiqué quotidiennement, ce geste est susceptible entraîner un stress modéré lié à la contention répétée des animaux pour chaque gavage, bien que celui-ci tende à diminuer avec l’habituation. L’administration quotidienne de substances sous la peau, au niveau de la nuque, peut entraîner de la même manière, un stress modéré lié à la contention répétée des animaux. Une irritation locale, une perte de poil et une modification de la peau sont susceptible d’apparaitre au site d’injection. Certains des tests comportementaux prévus dans les procédures sont générateurs d’un inconfort faible à moyen mais de courte durée (comme le test du champ ouvert qui évalue les comportements anxieux) et n’induisent pas de douleur ni de signes caractéristiques de mal-être chez la souris (perte de poids, prostration, poil hirsute, absence de toilettage ...). Enfin, un petit prélèvement de sang sera effectué en coupant l’extrémité de la queue. Cette méthode entraîne un léger saignement, rapidement stoppé par une pression douce (hémostase), et ne laisse pas de séquelle à long terme.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront sacrifiés afin de permettre le prélèvement d’organes nécessaires à la réalisation d’analyses biologiques. Ces analyses sont indispensables pour approfondir la compréhension des mécanismes impliqués dans notre contexte d’étude.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, des alternatives non animales pourraient apporter des informations précieuses mais aucune ne permet actuellement de reproduire la complexité du microbiote ni ses interactions avec le système digestif et le système nerveux et l’impact sur la cognition. Par exemple, l’utilisation de cultures cellulaires intestinales permet d'étudier la perméabilité intestinale et l’inflammation mais s’affranchit de la complexité du microbiote et de ses interactions avec le système immunitaire ou nerveux. Les cultures de cellules neuronales ne permettent pas d'étudier les circuits neuronaux fonctionnels ni les comportements associés. L’utilisation de modèles informatiques (in silico) permettrait de simuler des voies de signalisation, des paramètres d'absorption intestinale, ou la distribution des métabolites dans l’organisme. Néanmoins, ces modèles dépendent fortement de données expérimentales préexistantes et sont incapables de prédire des effets émergents à l’échelle comportementale.

Réduction

Pour garantir l’obtention de résultats fiables et statistiquement exploitables, nous avons défini des tailles d’échantillons optimales à l’aide de calculs de puissance réalisés avec un logiciel dédié. Ces calculs ont permis de déterminer qu’un effectif de 12 animaux par groupe est suffisant pour détecter des effets de taille moyenne avec les tests statistiques les plus adaptés à nos données, tout en limitant le nombre total d’animaux utilisés. Par ailleurs, nous intégrerons à la fois des mâles et des femelles dans notre étude, ce qui permet de couvrir les deux sexes dans une même expérimentation, réduisant ainsi le nombre global d’animaux nécessaires. L’ensemble des résultats sera analysé à l’aide de logiciels statistiques spécialisés. Au total, 4768 animaux sont requis pour l’ensemble du projet, ce chiffre ayant été réduit au strict nécessaire en respectant les principes de la règle des 3R.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes d’au moins quatre, dans des conditions contrôlées (température, humidité) et surveillés quotidiennement par les expérimentateurs. La plupart des procédures n’induiront qu’un inconfort léger et bref. Celles pouvant affecter le bien-être feront l’objet d’un suivi renforcé basé sur une grille de score permettant d’identifier toute souffrance et d’appliquer des points limites précoces. Pour limiter stress et douleur, les gavages répétés seront effectués avec des canules souples à bout rond de sorte à limiter au maximum une irritation de l'oesophage, et les animaux seront habitués avant au geste de contention et à l'introduction d'un cône dans la cavité bucale. En cas de fausse route,l'animal recevra un analgésique injectable toutes les 8–12 h. Si les signes de détresse (difficultés respiratoires, prostation) apparaissent ou persistent 24h après, l'animal sera euthanasié. Les injections seront réalisées en alternant les sites et avec des aiguilles fines. En cas d’inflammation locale, le site sera surveillé et traité si besoin. Les prélèvements sanguins seront effectués par incision de l’extrémité de la queue, méthode permettant de collecter rapidement du sang sans anesthésie et avec un stress minimal. En cas de saignement prolongé, une compresse stérile sera appliquée, et un stylet hémostatique utilisé si nécessaire. Les animaux seront systématiquement surveillés après le prélèvement. Les tests comportementaux seront précédés d’habituation aux dispositifs expérimentaux ; les sessions seront espacées pour favoriser la récupération et réalisées dans un environnement calme par les mêmes expérimentateurs autant que possible. Les procédures nécessitant une anesthésie seront conduites avec soin : le puçage se fera sous anésthésie gazeuse, assurant une intervention rapide et indolore ; avant les prélèvements d’organes, une analgésie préventive injectable sera administrée 30 min avant l’anesthésie générale injectable. Une surveillance clinique renforcée sera assurée tout au long de l’étude. Les points limites incluent : perte de poids > 20 %, altération de l’état général, troubles locomoteurs, blessures persistantes, refus de s’alimenter ou stress prolongé. Tout animal présentant ces signes sera examiné et, sans amélioration rapide, retiré de l’étude et euthanasié conformément aux recommandations.

Choix des espèces

L’autisme entraîne des troubles du comportement importants, et ces troubles peuvent être reproduits chez le rongeur grâce à des séries de tests comportementaux adaptés aussi bien aux jeunes souris qu’aux adultes. La souris est un modèle particulièrement pertinent car son système nerveux et son développement cérébral partagent de nombreuses similitudes avec ceux des humains, ce qui n’est pas aussi bien le cas chez d’autres espèces comme le poisson. En outre, la physiologie intestinale, notamment la perméabilité et la motilité de l’intestin et du côlon, ne peut être étudiée que chez un animal vivant, et la souris offre un bon compromis entre complexité biologique et faisabilité expérimentale. Notre institut a une animalerie avec des rats et des souris, mais les rats sont plus grands et ont besoin de plus d’espace, ce qui ne convient pas à la taille de notre animalerie, surtout avec le nombre important d’animaux prévus. Puisque notre projet porte sur les effets des métabolites produits par les microbes sur le développement du cerveau, nous avons choisi d’étudier les souris à des stades où leur système nerveux garde une certaine capacité d’adaptation, notamment à l’adolescence (vers 4 semaines), ainsi que pendant la gestation, afin de mieux comprendre comment l’exposition précoce influence le développement ultérieur. Ces choix permettent d’étudier les mécanismes liés aux troubles du neurodéveloppement dans un modèle fiable, pertinent et bien caractérisé, indispensable pour développer des traitements adaptés.

À dix semaines de vie, le ménisque médial du genou droit est déstabilisé par une chirurgie d'un quart d'heure pour déclencher une arthrose. À douze semaines suivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, cinq jours de suite, sur 2 004 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'arthrose qui s'installe peut faire souffrir les animaux, les conduire à la prostration, à s'isoler de leurs congénères et à cesser le toilettage social, et les injections de tamoxifène peuvent provoquer une péritonite. Toutes sont ensuite tuées pour prélever le sang, la colonne vertébrale, les pattes, la trachée, les poumons et l'aorte.

Objectifs

L’arthrose, la plus répandue des maladies rhumatismales, impacte plus de 500 millions de personnes dans le monde. A ce jour, il n’existe pas de traitements qui permettent de soigner ou ralentir la maladie, les traitements disponibles sont uniquement palliatifs. Notre projet s’intéresse particulièrement aux mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la dégradation du cartilage articulaire lors de l’arthrose. L’une des étapes clé de cette dégradation correspond à une augmentation anormale du volume (i.e. hypertrophie) des cellules du cartilage (chondrocytes). A un stade plus avancé de la maladie, une invasion pathologique du cartilage articulaire par des vaisseaux sanguins nouvellement formés se met en place, via un mécanisme nommé « angiogenèse ». Cette invasion vasculaire accélère fortement la dégradation du cartilage. Nous proposons l’hypothèse que les chondrocytes hypertrophiques, joueraient un rôle fondamental dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Nos premiers résultats indiquent qu’une protéine ligand est spécifiquement produite par les chondrocytes hypertrophiques et que l’interaction avec son récepteur, présent à la surface des cellules endothéliales vasculaire, favorise l’angiogenèse. C’est dans ce contexte, que notre projet, se propose, pour la toute première fois, de documenter le rôle de l’interaction entre cette protéine ligand et son récepteur dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Pour ce faire, nous utiliserons une lignée de souris génétiquement modifiées, permettant à la fois d’induire une invalidation du gène codant pour le récepteur spécifiquement au niveau des cellules endothéliales vasculaires mais aussi de visualiser cette population cellulaire grâce à une protéine fluorescente. Une arthrose sera induite chirurgicalement chez ces souris et l’invasion vasculaire du cartilage articulaire sera suivie au cours du temps. Par la suite, ces expérimentations nous permettrons de définir le moment idéal pour mettre en place des stratégies thérapeutiques anti-arthrose qui ciblent spécifiquement l’interaction entre la protéine d’intérêt et son récepteur.

Bénéfices attendus

Notre projet comporte plusieurs bénéfices attendus. Dans un premier temps, notre projet va permettre d’approfondir, de manière générale, les connaissances de la communauté scientifique sur les mécanismes cellulaires/moléculaires impliqués dans l’apparition de l’arthrose et plus précisément, sur le rôle que tiennent les chondrocytes hypertrophiques dans le développement de cette maladie. Ce projet comporte également une partie dédiée à évaluer des modes d’administrations du traitement moins invasif et stressant pour les souris, ce qui permettra, in fine, une amélioration et un raffinement de ce protocole, dans un souci de respecter les 3Rs de l’expérimentation animale. Enfin, il faut prendre en compte que l’arthrose est une maladie chronique douloureuse et extrêmement répandue au sein de la population (40% des personnes de plus de 70 ans développe de l’arthrose), qui, de fait, exerce une pression importante sur le milieu médical. De manière connexe, l’arthrose de la hanche et du genou représentent des poids financiers conséquents pour les pays européens, en effet, ils sont estimés entre 408-817 milliards d’euros et 350-700 milliards d'euros/an respectivement. Ainsi, au travers de l’étude de nouvelles cibles thérapeutiques, notre projet s’inscrit dans une démarche visant à améliorer la qualité de vie des patients (amélioration de la mobilité et de l’autonomie des patients, diminution des douleurs chroniques et de comorbidités associées) et à réduire les coûts socio-économiques (limitation de dépenses liées aux arrêts de travail prolongés et aux interventions) exercées par l’arthrose sur notre société.

Procédures

A l’âge de 10 semaines de vie post-natale, les animaux seront soumis à une chirurgie d’environ 15 minutes consistant en une déstabilisation d’un ménisque (cartilage servant de cales et d’amortisseurs de l’articulation) du genou droit. Les animaux âgés de 12 semaines recevront des injections quotidiennes du composé d’intérêt de quelques secondes sur une période de 5 jours. Un site différent sera choisi pour chaque injection afin de limiter les risques d’irritation pour l’animal.

Impact sur les animaux

Lors du développement de l’arthrose post-traumatique, de la douleur peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Dans le cas du modèle chirurgical DMM, une douleur pourrait être causée par une dilacération du tissu cutané supplémentaire, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant les chirurgies. De plus, une infection pourrait survenir au niveau des sutures post-chirurgicales. Les injections intrapéritonéales, bien que ne durant que quelques secondes, peuvent entraîner une irritation au niveau du site d’injection. De même, les injections de tamoxifène et plus généralement la technique d’injection intrapéritonéale en elle-même peuvent entrainer des nuisances chez l’animal : stress/anxiété, perte d’appétit, inflammation du péritoine (péritonite), injection mal placée conduisant à l’accumulation du produit au niveau d’un site non ciblé (i.e. organes présents dans le péritoine) avec conséquences multiples.

Devenir

L’ensemble des animaux de ce projet seront utilisés afin de réaliser des prélèvements multi-organes post-mortem. Ces prélèvements sont indispensables pour la validation de notre modèle murin génétiquement modifié et pour mener à bien notre étude visant à déterminer l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques contre le développement de l’arthrose.

Remplacement

Des modèles in vitro/ex vivo permettent d’étudier la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et sont utilisés en amont de la présente étude pour remplacer au maximum le recours aux expérimentations animales. Ces modèles impliquent l’utilisation de cellules endothéliales d’origine humaine pour des tests de formation de tubes ou de migration cellulaires. Lors de ces tests il est possible de faire varier plusieurs paramètres et d’évaluer l’effet de communications cellulaires d’intérêt. Cependant l’utilisation de ces modèles reste limitée par le fait que les cellules endothéliales nécessitent un milieu de culture spécifique, peu compatible avec de nombreux autres types cellulaires. Or, dans le cadre de l’arthrose, l’environnement articulaire se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial trop complexes à prendre en compte dans la mise en place de modèles in vitro ou informatiques, ni même dans un modèle d’animal invertébré. D’autre part, l’arthrose est une pathologie aux causes et conséquences multiples difficilement reproductibles dans un système in vitro non intégré. C’est pourquoi, aujourd’hui, aucun autre modèle substituable aux modèles animaux ne nous permet d’évaluer les processus impliqués dans le développement de l’arthrose ni l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

Réduction

Dans le cadre du respect des 3Rs en éthique animale, le nombre d’animaux utilisés dans les procédures a été réduit au strict minimum. Pour ce projet scientifique, les nombres de 9 et 35 animaux de chaque sexe par groupe ont été calculés par un test reconnu de puissance statistique, afin de s’assurer de pouvoir conclure sur une différence significative. Pour l’analyse des résultats, le test statistique le plus adapté sera utilisé pour pouvoir comparer toutes les conditions. Il est également important de souligner que chaque souris fera l’objet de prélèvements multi-organes (prélèvement de sang, colonne vertébrale, pattes avant et arrières, trachée et poumons, artère aorte). Cette approche présente l’avantage de rassembler une collection d’échantillons suffisante sur un nombre restreint d’animaux. Enfin, notre projet comprend l’utilisation de techniques d’analyses très haut débit qui permettent de générer un grand nombre de données pertinentes scientifiques à partir d’un faible nombre d’échantillons.

Raffinement

Pour le protocole d’induction de l’arthrose, une analgésie est assurée avant et après l’opération. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’écarter tout risque d’hypothermie. Les souris seront ensuite transférées dans une cage de réveil également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer. Après 6h et 24h post-chirurgie, un traitement antalgique est administré aux animaux dans un souci de raffiner la prise en charge de la douleur ressentie par ces derniers. Les animaux sont observés quotidiennement pendant les 3 premiers jours post chirurgie puis 2 fois par semaine. Deux semaines post-DMM, les souris seront à nouveau observées quotidiennement le temps des injections puis 2 fois par semaine. Des grilles de points limites ont été définies pour chacune des procédures et permettront une gestion de la douleur adaptée selon le nombre et la sévérité des signes cliniques observés.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle animal dans ce projet est fondé sur plusieurs critères. La souris est tout d’abord un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques, car de nombreux outils de laboratoires sont développés et optimisés pour cette espèce. Notre projet est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés qui permettent des études précises et pertinentes dans les tissus squelettiques d’intérêt pour la recherche thérapeutique sur l’arthrose. Ces lignées de souris génétiquement modifiées sont déjà développées et disponibles. Le modèle de souris d’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médian est le plus décrit dans la littérature et fait ainsi office de référence pour l’étude de cette pathologie. Le choix de l’espèce souris s’explique également par la nécessité de travailler sur des animaux arrivés à maturité squelettique. Les animaux inclus dans cette étude seront à maturité squelettique et âgés de 10 à 22 semaines. La procédure chirurgicale sera réalisée à 10 semaines de vie, il s’agit du stade de développement consensus dans la littérature pour l’induction de l’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médial

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 90 d'entre elles soumises pendant vingt semaines à une alimentation riche en graisses destinée à les rendre obèses. Chacune est identifiée par poinçonnage de l'oreille, mise à jeun six puis douze heures avant deux tests métaboliques, gavée d'une solution sucrée puis d'huile, incisée au bout de la queue pour dix prélèvements de sang, puis reçoit une injection de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie. Les tumeurs sont ensuite palpées chaque jour, puis mesurées sous anesthésie tous les trois jours. Le porteur espère qu'un régime riche en oméga-3 réduira l'inflammation liée à l'obésité et améliorera l'immunothérapie, en renvoyant toute application humaine à des recherches ultérieures.

Objectifs

Lorsqu’un cancer se développe, le système immunitaire réagit en envoyant des signaux pour combattre la tumeur, comme des substances inflammatoires. Mais les cellules cancéreuses ont trouvé un moyen de tromper ce système en utilisant ces signaux pour activer des "freins" qui empêchent le système immunitaire d'attaquer la tumeur. L’immunothérapie fonctionne en bloquant ces "freins", ce qui permet au système immunitaire de mieux lutter contre le cancer. Cette approche est particulièrement prometteuse pour des cancers agressifs, comme le cancer du sein triple négatif, qui peut être aggravé par l’obésité. En effet, chez les personnes obèses, les cellules graisseuses se gonflent et libèrent des signaux inflammatoires qui activent en permanence le système immunitaire. Ces signaux peuvent aider les cellules cancéreuses, proches du tissu graisseux, à échapper à la surveillance du système immunitaire et à se développer. Des recherches, y compris des travaux de notre équipe, suggèrent que les acides gras oméga-3, présents dans certains aliments, pourraient réduire cette inflammation liée à l’obésité et rendre l’immunothérapie plus efficace contre le cancer du sein triple négatif. Pour mieux comprendre ce lien entre obésité, nutrition et immunothérapie, nous devons aller au-delà des études théoriques et mener des expériences concrètes sur des souris. Cela nous permettra de mieux identifier les mécanismes en jeu et d’explorer de nouvelles pistes pour améliorer les traitements. Les objectifs de notre étude sur les souris sont : 1. Comprendre l’impact de l’obésité sur la défense du corps contre une tumeur agressive du sein. 2. Tester l’effet de l’alimentation sur cette défense, en introduisant des aliments riches en oméga-3 et des extraits de plantes aux propriétés bénéfiques. 3. Vérifier si ces changements alimentaires peuvent aider à renforcer l’effet des traitements d’immunothérapie contre ce type de cancer du sein. Notre objectif est donc d’identifier de nouvelles stratégies basées sur la nutrition pour améliorer la lutte contre le cancer, en tenant compte du rôle de l’obésité et du système immunitaire.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment l’alimentation peut influencer la santé. Il pourrait montrer qu’un régime riche en oméga-3, avec ou sans extraits de plantes bénéfiques, aide à réduire l’inflammation causée par l’obésité. Cette diminution de l’inflammation pourrait alors améliorer l’efficacité des traitements contre le cancer. À plus long terme, ces résultats pourraient mettre en évidence le rôle clé de la nutrition dans la protection du corps contre la maladie, en particulier chez les personnes obèses. Cela ouvrirait la voie à de nouvelles approches pour renforcer l’action des traitements contre le cancer. Enfin, cette étude pourrait poser les bases de futures recherches chez l’Homme, afin de voir si des ajustements alimentaires permettent d’optimiser les traitements et d’améliorer la lutte contre le cancer.

Procédures

Une identification par poinçonnage de l’oreille pour les 120 souris. • 90 souris recevront une alimentation riche en graisses pendant 20 semaines. • 2 mesures de la composition corporelle seront réalisées sur les 120 souris éveillées et placées dans un tube (- de 2 min/souris). 16 semaines entre les mesures. • Tests du métabolisme : - Du sucre : toutes les souris seront à jeun pendant 6h avant le test puis un petit volume d’une solution sucrée sera administré par gavage à toutes les souris éveillées (- d’1 min/souris, contention incluse). Une incision à l’extrémité de la queue (- de 1 mm) sera réalisée pour permettre 6 prélèvements d’une goutte de sang (quelques secondes/souris). - Des graisses : toutes les souris seront à jeun 12 heures avant le test puis un petit volume d’huile sera administré par gavage à toutes les souris éveillées (- d’1 min/souris, contention incluse). Une incision à l’extrémité de la queue (- de 1 mm) sera réalisée pour permettre 4 prélèvements de quelques gouttes de sang (30 sec/souris, sans contention). - Ces tests seront effectués avec une 1 semaine d’écart. • Injection des cellules tumorales et suivi : - Avant l’injection des cellules, une injection d’anesthésiques sera réalisée chez toutes les souris (30 sec/souris, contention comprise). L’injection des cellules tumorales se fera sous anesthésie générale dans la glande mammaire (injection < 30 sec/souris, anesthésie 45 min, toutes les souris). - Palpation de la zone d’injection tous les jours pour détecter la tumeur (toutes les souris vigiles, 30 secondes par souris contention comprise, 5 jours de suite maximum) - Traitement : 7 injections des traitements auront lieu sur une période de 21 jours (30 sec/souris, contention comprise, toutes les souris sont concernées). - Surveillance de la tumeur pour toutes les souris : Une mesure tous les trois jours pendant 21 jours sous anesthésie gazeuse (30 sec/souris). • A la fin de l’étude : - Une injection d’anesthésique pour toutes les souris (quelques sec/souris). - Un prélèvement sanguin final sous anesthésie pour toutes les souris (30 sec/souris). MODIFICATION DU 30-09-2025 : Après l’anesthésie locale et générale et avant l’injection des cellules tumorales, une incision de 3mm autour du mamelon sera réalisée afin de repérer précisément la glande mammaire pour injecter les cellules. L’incision sera refermée par 4 points de suture résorbables. Six heures après toutes les souris recevront une injection complémentaire d’un antidouleur.

Impact sur les animaux

La pesée des souris peut être une source de stress temporaire. L’alimentation riche en graisses entraînera une prise de poids importante, sans impact sur la mobilité. Le bref placement dans un petit tube (moins de 2 minutes) pour la mesure de la composition corporelle cause un stress. Les périodes de jeûne avant les tests métaboliques peuvent être inconfortables pour les animaux. L’administration par voie orale de la solution sucrée et de l’huile est une source de stress transitoire et d’inconfort pour les animaux. La petite incision au bout de la queue réalisée avant les deux tests métaboliques peut provoquer une douleur passagère. Le fait que pendant le test sur les sucres, les souris soient placées seules dans une cage pendant deux heures peut générer un léger stress. Les différentes injections (anesthésiques, antidouleurs, traitements, cellules tumorales) réalisées vont provoquer du stress et une légère douleur transitoire. La palpation des glandes pour détecter l’apparition des tumeurs va générer un inconfort transitoire chez les animaux. Le développement de la tumeur peut générer un inconfort et une légère douleur pour les animaux. MODIFICATION DU 30-09-2025 : Avant l'incision cutanée, un anesthésique sera appliqué au niveau de la zone d'incision. Les points de sutures peuvent entraîner une douleur post-opératoire localisée au niveau de l’incision et des sutures, ainsi qu’un tiraillement transitoire lié à la cicatrisation. L'injection supplémentaire d'un antidouleur après l’intervention implique une manipulation supplémentaire pouvant générer stress et douleur transitoire.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du dernier prélèvement sanguin afin de collecter les tissus d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Ce projet fait suite à des recherches déjà réalisées en laboratoire, où des expériences sur des cellules cultivées en laboratoire ont permis d’étudier l’influence de la graisse corporelle sur l’évolution du cancer du sein. Ces travaux ont montré que les oméga-3 et certains extraits de plantes pourraient avoir des effets bénéfiques. Cependant, ces expériences ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions entre le cancer et son environnement dans un corps vivant. C’est pourquoi il est nécessaire d’utiliser un modèle avec des organismes complets, comme la souris, pour observer l’impact global de l’alimentation sur l’inflammation, les déséquilibres liés à l’obésité et la manière dont le corps se défend contre la tumeur. Ce type d’étude nécessite un modèle vivant, car il n’existe actuellement aucune alternative qui permette d’obtenir ces résultats uniquement avec des cellules en laboratoire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été soigneusement calculé pour limiter leur utilisation tout en garantissant des résultats fiables. D’après les informations existantes dans la littérature scientifiques et les échanges avec des experts, chaque groupe doit contenir 30 souris, réparties ensuite en deux sous-groupes de 15. Cela permet d’assurer que les résultats seront suffisamment solides et exploitables. Au total, 120 souris seront utilisées. Pour éviter de multiplier les expériences, un maximum de prélèvements de tissus sera effectué et mis à disposition pour d’autres recherches.

Raffinement

Pour éviter les gavages, les oméga-3, antioxydants et extraits de plantes sont ajoutés à la nourriture. Seules 2 personnes expérimentées manipuleront les souris tout au long de l’étude. Une surveillance de tous les animaux sera mise en place 2X/semaine avant l’injection des cellules cancéreuses puis 7jrs/7 après injection. A chaque passage une vérification de l’état général des souris (apparence et comportement) sera réalisée. Un suivi du poids sera réalisé 1X/semaine. L’évaluation de la prise alimentaire sera faite 2X/semaine. En ce qui concerne les tests pour évaluer le métabolisme les quantités de solution sucrée et d’huile ont réduites au minimum pour éviter l’inconfort, une seule incision au bout de la queue (1 mm) sera réalisée par test pour prélever du sang, une semaine d’intervalle sera respectée entre les tests pour limiter le stress. Les prises de sang seront faites sans immobilisation des animaux. Enfin, si le taux de sucre ne revient pas à la normale en 90 min, il sera surveillé à 240 min et, si besoin, à 360 min. L’injection des cellules cancéreuses sera réalisée sous anesthésie générale avec ajout d’un antidouleur. Ensuite, une palpation quotidienne sera faite pour détecter la tumeur dès son apparition. Concernant le suivi de la tumeur et les traitements : une mesure de la tumeur sera faite tous les 3 jours sous anesthésie dès que la tumeur est détectée, l’injection du traitement contre le cancer sera réalisée en même temps (volume d’injection réduit au strict nécessaire et changement de site d’injection à chaque fois pour limiter l’inconfort). L’expérience durera 4 semaines maximum afin d’éviter que le volume de la tumeur ne devienne trop important. Des aménagements seront mis en place pour faciliter l’accès à la nourriture. A la fin de l’étude : les souris seront anesthésiées avant un dernier prélèvement de sang puis mises à mort rapidement et sans douleur. Des points limites précis ont été définis pour stopper immédiatement l’étude si un seuil critique est atteint, afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux. MODIFICATION DU 30-09-2025 L’incision est réduite au strict minimum (≈ 3 mm) et réalisée sous anesthésie générale, garantissant l’absence de douleur pendant la procédure. Les sutures sont résorbables, évitant une intervention pour leur retrait. Un antidouleur est administré avant et après l’intervention. Une surveillance rapprochée des animaux est mise en place pour détecter toute complication locale.

Choix des espèces

Le choix de la souris repose sur plusieurs raisons : • Elle peut développer une obésité comparable à celle de l’humain en suivant un régime riche en graisses. • Son métabolisme des graisses est similaire à celui de l’Homme, ce qui en fait un modèle idéal pour étudier les effets protecteurs des oméga-3 et des composés naturels contre l’obésité et le cancer. Les souris seront intégrées à l’étude à l’âge de 7 semaines. À cet âge, elles tolèrent bien une alimentation riche en graisses, et les modifications métaboliques qui en découlent sont bien documentées et maîtrisées. Nous avons choisi des souris jeunes, car le cancer du sein triple négatif est souvent diagnostiqué chez des patientes jeunes.

Pour établir le rôle d'un neuropeptide dans la préférence alimentaire, 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue par ponction cardiaque ou perfusion intracardiaque sous anesthésie. Chacune subit sept prélèvements de sang après incision de l'extrémité de la queue, des injections quotidiennes pendant cinq jours et cinq jours d'isolement en cage métabolique. Le porteur indique que les tests glycémiques peuvent provoquer une hypoglycémie si la dose d'insuline n'est pas optimale, et que l'isolement peut entraîner un stress et une perte de poids. Le raffinement tient en une phrase, qui annonce des points limites sans en préciser un seul.

Objectifs

Ce projet a pour but d'étudier le rôle d'une molécule dans la détermination de la préférence alimentaire et des intolérances alimentaires chez la souris. Cette étude pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de ces intolérances et de maladies inflammatoires intestinales.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous souhaitons mettre en lumière le rôle d'une molécule dans la préférence alimentaire et faire le lien avec les intolérances alimentaires et les maladies inflammatoires de l'intestin. Cela pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de ces troubles chez l'humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tests glycémiques d'une durée de 1h et 2h durant lesquels des prélèvements de sang seront effectués à partir de l'extrémité de la queue des animaux. Ils resteront libres de leurs mouvements (7 prélèvements de microgouttes de sang par animal, moins d'une minute par prélèvement). Les traitements par injections auront lieu une fois par jour pendant 5 jours. On réalisera une mesure de la prise alimentaire des souris grâce aux cages métaboliques où les souris seront isolées pendant 5 jours. Les souris seront également soumises à un prélèvement de sang terminal (ponction cardiaque causant la mort de l'animal) ou à une perfusion intra-cardiaque en étant anesthésiées, cela durera 5 min avant d'être mises à mort.

Impact sur les animaux

L'isolement dans les cages métaboliques pendant 5 jours peut entraîner un stress et une perte de poids chez les souris. Le gavage, les injections et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress. La légère incision à l'extrémité de la queue peut provoquer une douleur. Les tests glycémiques peuvent entraîner une hypoglycémie si la quantité d'insuline injectée n'est pas optimale. Les injections des molécules ont déjà été réalisées lors de précédentes études et n'ont pas montré d'effets indésirables. Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement par le personnel de l'animalerie ou les expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car nous avons besoin de prélever leur sang et/ou leurs organes pour les analyser ultérieurement.

Remplacement

Pour étudier le rôle de notre molécule dans la détermination de la préférence alimentaire, nous devons travailler sur des modèles murins in vivo. Nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures cellulaires puisque nous avons besoin de mesurer des paramètres sanguins et métaboliques ainsi que d'étudier le comportement alimentaire, ce qui ne peut être effectué que sur des organismes entiers in vivo. De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de la glycémie et de la prise alimentaire.

Réduction

Les expériences seront limitées à un nombre de 24 souris (12 femelles et 12 mâles) par condition de traitement pour être statistiquement analysables. Les tests glycémiques, qui n'impliquent pas d'effet néfaste à long terme pourront êtres menées successivement sur les mêmes animaux en respectant une période de repos aux cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés pour analyser les résultats efficacement.

Raffinement

L'anesthésie et l'analgésie seront utilisées selon les procédures décrites dans ce document, des points limites seront mis en place et le bien-être des souris sera vérifié régulièrement par le personnel de l'animalerie et les expérimentateurs.

Choix des espèces

Pour étudier le rôle de la molécule dans la détermination de la préférence alimentaire, nous devons travailler sur des modèles murins in vivo. Nous avons besoin de mesurer des paramètres sanguins et métaboliques ainsi que d'étudier le comportement alimentaire, ce qui ne peut être effectué que sur des organismes entiers in vivo. De plus, les modèles animaux invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de la glycémie et de la prise alimentaire. Au cours de cette étude nous étudierons la physiologie de la souris adulte. Elles seront donc âgées d'au moins 8 semaines.

Hébergés seuls quarante-six heures en cage à métabolisme et nourris pendant vingt et un ou cent jours d'un régime dont seule la forme du fer change, 400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements du côlon. 240 d'entre eux reçoivent en plus une injection intrapéritonéale d'azoxyméthane, un cancérogène, pour déclencher les premiers stades d'un cancer colorectal. L'objet réel est d'évaluer si un substitut végétal de viande riche en fer, dont la mise sur le marché européen est envisagée à court terme, produit les mêmes effets sur le côlon que la charcuterie. Le porteur écrit que les régimes n'ont pas d'effet attendu sur le bien-être des rats et que la formation des phases précoces du cancer du côlon n'induit aucune douleur, tout en déclarant les 400 animaux au niveau de souffrance modéré.

Objectifs

La consommation excessive de viande rouge et de charcuteries est associée chez l’Homme à une perturbation du fonctionnement de l’intestin, et à un risque augmenté de développer un cancer du côlon. Des études scientifiques ont permis de démontrer que ces impacts sont liés au fer présent dans les viandes. Ainsi, ce fer va pendant la digestion arriver au niveau du côlon et favoriser la formation de molécules toxiques. Les recommandations nutritionnelles actuelles sont donc de limiter la consommation de produits carnés riches en fer. Dans ce contexte, plusieurs produits alternatifs à la viande sont proposés aux consommateurs. Plus précisément, certaines de ces alternatives misent sur la ressemblance parfaite avec les produits carnés en utilisant une forme de fer végétale proche de celle apportée par les viandes afin de provoquer une couleur et un goût similaires aux viandes. La mise sur le marché d’une alternative à base de ce fer d’origine végétale est envisagée à court terme en Europe. Au regard de sa proximité avec le fer des viandes, se pose donc la question de savoir si ce produit destiné à végétaliser davantage nos régimes est susceptible d’engendrer des effets néfastes sur le côlon et le cancer du côlon. En termes de santé publique, l’objectif de cette étude est d’évaluer si un apport en fer d’origine végétale risque ou non d’induire les mêmes effets délétères sur le côlon qu’un apport en fer d’origine animale. Étant donné que chez l’Homme, aucune étude interventionnelle n’est envisageable, une évaluation pré-clinique chez le rat identique à ce qui a été mis en place par le passé pour alerter les politiques publiques sur la consommation des viandes rouges et le risque de carcinogénèse colorectale est proposée.

Bénéfices attendus

À l’issue du projet, nous serons en mesure de savoir si le fer d’origine végétale peut engendrer ou non la formation dans le côlon de produits toxiques en comparaison avec d’autres formes de fer d’origine animale. Ainsi, ces études permettront de (i) évaluer le risque de pathologies associées à la consommation humaine de ces substituts, et en conséquence, selon les résultats obtenus (ii) alerter les pouvoirs publics, pour qu’ils puissent à terme proposer des messages de recommandation nutritionnelle adaptés spécifiquement à ces substituts riches en fer végétal.

Procédures

400 rats recevront un régime expérimental dont seule la nature du fer sera modifiée selon le groupe expérimental pendant 21 jours pour 160 d’entre eux, et pendant 100 jours pour les 240 autres. Ces 400 rats seront hébergés individuellement une fois pendant 46 heures en cage à métabolisme après avoir été habitués 3 heures en amont. Parmi eux, les 240 rats exposés 100 jours aux régimes expérimentaux recevront en amont une injection intrapéritonéale d’azoxyméthane d'une durée de moins d'une minute, le temps de la préhension et l'injection, pour induire les premiers stades non douloureux du cancer du côlon.

Impact sur les animaux

Les régimes n’ont pas d’effet attendu sur le bien-être ou la croissance des rats. L’hébergement en cage individuelle d’une journée peut générer un stress transitoire mais il disparait dès le retour en hébergement conventionnel. Hormis les stress attendus lors de l’injection, seule une légère douleur passagère peut se produire au site d’injection en raison du produit injecté. La formation progressive des phases précoces du cancer du côlon pendant cette étude n’induit aucune douleur.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les rats seront mis à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures destinées à caractériser l’effet des régimes administrés sur la muqueuse colique, et engendrant éventuellement des perturbations de l’homéostasie des tissus environnants ou d’organes plus distants.

Remplacement

Bien que nous menions des études in vitro, aucun des modèles de cellule du côlon en culture ne permet d’évaluer l’ensemble des répercussions induites par un régime riche en produits carnés au niveau du côlon. En effet, outre la formation de composés toxiques, la consommation de fer des produits carnés va fortement modifier l’ensemble des composantes du côlon. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité du côlon et de l’impact de l’alimentation sur cet organe.

Réduction

Les études antérieures associées à ce projet ont permis d’améliorer les procédures sur le plan technique et du bien-être de l’animal, contribuant ainsi à minimiser le nombre d’animaux nécessaires pour mettre en évidence l’effet des régimes chez le rat. De plus, afin d’assurer la fiabilité des résultats, les études et analyses des échantillons issus de l’étude seront conduites en aveugle. La reproductibilité sera assurée par une répétition indépendante des études. Le traitement des données sera réalisé grâce à des tests statistiques appropriés permettant d'exploiter au maximum l'ensemble des données générées.

Raffinement

Le nombre et la durée d’hébergement individuel en cage individuelle seront limités au minimum nécessaire (46h) pour obtenir les quantités suffisantes d’urines et de fèces. Des phases d’habituation à ce type d’hébergement ont été mises en place afin de minimiser le stress. Quel que soit le type de cages, elles seront transparentes, alignées pour maximiser les échanges visuels, olfactifs et auditifs. Lors de l’injection pour induire les premiers stades du cancer du côlon, l’acidité de la solution sera corrigée pour éviter une douleur au moment de l’injection, une habituation au geste de la piqure sera réalisée les jours précédents. Une observation des rats à l’occasion notamment de la distribution quotidienne des régimes permettra, grâce à l’utilisation de fiches individuelles de suivi, de détecter à temps toute anomalie éventuelle. Enfin, toutes les mesures susceptibles de réduire la douleur sans affecter l’objectif scientifique seront mises en application.

Choix des espèces

Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études chez l’Homme mais aussi des approches qui reposent sur les modèles animaux. Le modèle le plus approprié à notre étude est le rat qui a l’avantage de présenter un développement de la maladie comparable à celui chez l’Homme. De plus, ce modèle chez le rat permet d’obtenir des résultats fiables dès les stades précoces du cancer, sans qu’il soit nécessaire de poursuivre l’étude aux stades avancées de la maladie (tumeur, métastases), qui sont des stades davantage susceptibles d’engendrer des dommages et des douleurs. Les études se feront sur des rats adultes de 5 à 6 semaines à leur arrivée. À cet âge, le système digestif est suffisamment mature et fonctionnel et la composition du microbiote bien stabilisée. Afin de se placer dans les conditions pour lesquelles le modèle est maîtrisé au laboratoire, il est important de rester au même stade de développement.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du pancréas par chirurgie de trente minutes, un gavage quotidien pendant trente jours, jusqu'à deux injections par semaine durant cinq semaines et deux échographies hebdomadaires sous anesthésie pendant quatre semaines. La chimiothérapie peut provoquer une nécrose de la queue, une perte de poids et des douleurs. Les probiotiques ou antibiotiques censés améliorer le pronostic des patients restent une espérance, alors que le porteur affirme que les organoïdes et les tumeurs sur puce ne permettent pas d'étudier les interactions avec le système immunitaire et qu'il faut donc "travailler avec des animaux vivants".

Objectifs

Nous travaillons sur le cancer du pancréas qui a un pronostic très sombre car il ne répond pas bien aux traitements (chimiothérapie, immunothérapie). Le but de ce projet est de comprendre comment certaines bactéries naturellement présentes dans notre organisme (microbiote) favorisent la résistance de ce cancer aux traitements. Il a été démontré que certaines bactéries du microbiote, naturellement présentes dans l’intestin ou la cavité orale pouvaient se retrouver dans les tumeurs au sein même du pancréas. Certaines de ces bactéries lorsqu’elles étaient présentes dans les tumeurs étaient même corrélées à un mauvais pronostic. Le but de notre projet est de comprendre comment les bactéries migrent du système digestif jusqu’à la tumeur et comment elles interagissent avec la tumeur. Nous cherchons à comprendre comment ces bactéries interagissent avec les cellules tumorales mais aussi les cellules immunitaires présentes dans la tumeur.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels du cancer du pancréas sont décevants car bien souvent la tumeur est résistante aux traitements. Et lorsqu’elle est initialement sensible aux traitements, elle développe petit à petit des résistances. La résistance aux traitements est une des clefs pour traiter cette maladie. Une partie de la résistance aux traitements vient des bactéries naturellement présente dans notre organisme. : le microbiote. En comprenant comment ces bactéries migrent dans la tumeur et comme elles interagissent avec les cellules tumorales et les cellules du système immunitaire, il sera possible d’agir à la fois sur leur mécanisme d’action voir directement sur les bactéries à l’aide de probiotiques et d’antibiotiques. Nous espérons à terme améliorer l’efficacité des traitements et donc le pronostic des patients.

Procédures

Pour la chirurgie (greffe des cellules tumorales) : Celle-ci n’a lieu qu’une fois par animal, d’une durée de 30 minutes. Ce geste est réalisé sous anesthésie générale. Pour les injections de traitements Dans cette étude, un traitement est donné par la bouche (gavage) aux souris pendant 30 jours (moins de 30 secondes). Les animaux pourront recevoir jusqu’à deux injections par semaine pendant cinq semaines maximum (3 à 5 minutes). Pour les échographies : Elles sont pratiquées pendant 4 semaines, à raison de 2 fois par semaine sur un animal sous anesthésie générale. Chaque échographie dure environ 10 min (de l’endormissement au réveil).

Impact sur les animaux

Les traitements de chimiothérapie peuvent induire une nécrose de la queue de la souris. Le développement de tumeur ainsi que le traitement par chimiothérapies peuvent s’accompagner d’une perte de poids, et de douleur. L’administration des traitements peut rajouter du stress à l’animal ansi qu’une douleur modérée ou un inconfort lors de leur réalisation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de procéder à l’analyse des tissus. En effet, nos recherches nécessitent l’analyse des organes des animaux. Les expériences sont conçues pour permettre la récupération de la tumeur ainsi que des organes de métastases. Les tumeurs seront collectées soit pour des analyses histologique, soit pour l’analyse des cellules immunitaires présentes dans la tumeur.

Remplacement

L'identification des phénomènes de résistances aux thérapies ne peut être réalisée que directement chez l’animal car il met en jeu des interactions entre de nombreuses populations cellulaires (interactions cancer / microenvironnement (réaction fibreuse) / réaction de l’hôte) qui ne peuvent pas encore être mimées in vitro, notamment le rôle complexe du système immunitaire. Les modèles précliniques classiques, comme les organoïdes ou les tumeurs sur puce, ne permettent pas d'étudier efficacement les interactions complexes entre les organes et le système immunitaire. Cependant, dès que possible, nous remplacerons les études faites sur les modèles murins par des expérimentations réalisées sur des cultures de cellules isolées de nos modèles murins, qui peuvent être maintenues plusieurs semaines en culture et permettront de tester nos hypothèses. Ce projet est multidisciplinaire et vise à mieux comprendre le rôle des cellules du système immunitaire dans le contrôle d'un modèle murin mimant le cancer du pancréas. De ce fait nous devrons travailler avec des animaux vivants afin de pouvoir analyser le rôle des différents organes et différents types cellulaires suspectés d'être impliqués dans le développement de cette pathologie et dans l'immuno- et chimiorésistance.

Réduction

Nous avons calculé que le nombre minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables, reproductibles et statistiquement interprétables est de 6 souris par groupe, avec deux répétitions indépendantes de chaque expérience afin de valider la robustesse des résultats. Nous avons pris plusieurs mesures pour réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés, tout en maintenant la qualité des données : 1-maximisation des analyses par animal en réalisant plusieurs types d’analyses sur un même animal afin d’optimiser chaque inclusion expérimentale, incluant des analyses histologiques sur plusieurs tissus atteints (pancréas, foie, poumon, péritoine), des analyses immunologiques multiparamétriques par cytométrie en flux pour caractériser la nature, le phénotype et la fonctionnalité des cellules immunitaires post-mortem, ainsi que des analyses sanguines ; 2-optimisation du design expérimental, avec un protocole conçu pour limiter la variabilité inter-individuelle, permettant ainsi d’avoir un nombre réduit d’animaux par groupe tout en conservant une puissance statistique suffisante ; 3-réutilisation de données biologiques, les mêmes échantillons biologiques (sang, tissus) pouvant dans certains cas être utilisés pour plusieurs types d’analyses complémentaires. Le nombre total d’animaux a donc été défini en tenant compte d’un équilibre rigoureux entre nécessité scientifique, réduction des effectifs animaux et qualité des données attendues d’un point de vue scientifique.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d’acclimatation lors de leur arrivée à l’animalerie. Ils sont pris en charge par le personnel de la zootechnie qui les observent quotidiennement afin de détecter d’éventuelles blessures, un comportement anormal ou un amaigrissement. Un enrichissement adapté est disposé dans les cages des souris avec alternativement des dômes en plastique, morceaux de bois, sopalin. Les souris sont regroupées par lot de 5 animaux maximum et en groupe homogène si le nombre est inférieur. Lors de la mise en place des procédures expérimentales, l’état clinique des animaux sera surveillé tous les jours. Afin de préserver le bien être animal, nous avons mis en place pour chaque procédure qui pourrait engendrer du stress ou de la douleur des procédures afin de les dmininuer au maximum. Les animaux seront habitués à chaque nouvel environnement, nous réaliserons des injections d’antalgique avant et après chaque procédure douloureuse. Nous surveillerons de près le poids de l’animal, anticiperons les pertes thermiques lors de l’anesthésie générale, anisi que le déssèchement occulaire et la potentielle deshydratation de l’animal. Pour chaque procédure, nous avons établi un système de « scoring » de la douleur et une procédure à appliquer en fonction de celui-ci. Le système de scoring prend notamment en compte les paramètres suivants : poids (prise du poids initial à l'arrivée des animaux puis suivi constant et régulier (au moins 2 fois par semaine), signes extérieurs de stress tels que le comportement, la prostration ou l’aspect du pelage (poils luisants ou bien collés et gras, etc…), volume tumoral (suivi par échographie). Lors de l'apparition des symptômes, les souris seront scorées pour évaluer la gravité de la pathologie. En cas de perte de poids trop importante, de volume tumoral ayant dépassé les limites ou de douleur non soulagées par les antalgiques, nous procéderons à la mise à mort de l’animal. Toutes les procédures seront réalisées par un personnel diplômé et entrainé aux gestes.

Choix des espèces

Lors de notre étude, nous cherchons à comprendre comment le microbiote agit sur le système immunitaire et comment cela entraîne une résistance aux traitements d’immunothérapie. Pour comprendre cela, nous avons besoin de travailler avec des systèmes entiers (être vivant). En effet, les autres modèles qui existent, tumeurs sur puce, organoïdes ne peuvent pas reproduire le système immunitaire d’un être vivant. Les souris ont l’avantage de pouvoir à la fois reproduire la pathologie cancéreuse pancréatique mais aussi le système immunitaire complexe qui entre en jeu. Les souris seront utilisées entre 8 et 12 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature.

Cinq injections en une semaine déclenchent chez des souris transgéniques adultes des néoplasies prostatiques, laissées ensuite évoluer vers des tumeurs de taille importante aux points de cinétique les plus tardifs. 6 312 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever la prostate et d'autres organes. S'y ajoutent jusqu'à trois prélèvements sanguins par animal, des traitements deux fois par jour pendant une semaine, des injections de radiomarqueur suivies de trois anesthésies et des palpations abdominales répétées tout au long de leur vie. Le porteur décrit une douleur abdominale reconnaissable à une posture inhabituelle, au poil hérissé et au dos voûté, et annonce que toute souris dans cet état sera sortie de l'étude, alors que le protocole prévoit d'observer ces tumeurs jusqu'aux stades tardifs.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020 . Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables . Une meilleure caractérisation de la progression des tumeurs est donc requise afin d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate développés au laboratoire sont basés sur l’expression de la recombinase chimérique Cre-ERT2 dont l'activité est induite par le tamoxifène dans l’épithélium prostatique, afin d'inactiver à l’âge adulte le gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines (Pten). Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l'homme . À noter que l'inactivation de Trp53 dans les cellules épithéliales prostatiques déficientes en PTEN permet de lever la barrière de sénescence, accélère le développement d'adénocarcinomes et favorise l'apparition de tumeurs sarcomatoïdes métastatiques. De plus, la perte de l'expression du récepteur à la vitamine D (VDR) favorise le developpement de métastases et de tumeurs aggressives. De récentes études, dont les notres, suggèrent un rôle important des neutrophiles, des cellules myéloïdes du système immunitaire, dans la tumorigènese prostatique. Cependant, peu d'information sont disponible sur leur hétérogénité au cours de la tumorigénèse, ni sur l'efficacité de les cibler, voire de les utiliser comme biomarqueur. L'objectif de ce projet est de déterminer en utilisant des technologies innovantes si les neutrophiles contribuent à la progression des lésions précancéreuses de la prostate induites par injection de tamoxifène. Ce projet ce déroulera dans deux Etablissement Utilisateur

Bénéfices attendus

Le cancer de la prostate est un des cancers masculins les plus fréquents et meurtriers, notamment en raison de limite d’efficacité pour les traitements et les options diagnostiques. Ce projet vise à démontrer l’intérêt des neutrophiles comme nouvel outil diagnostique et comme cible thérapeutique pour ces cancers réfractaires.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections réalisées au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance) (EU1). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur des animaux à chaque point de la cinétique, un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours (EU1). Une injection prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris (EU2). Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris. Un sous groupe subira sous anethesie générale, une injection suivi du sacrifice (EU1). (maximum 5 minutes sous anethesie gazeuse). Des cohortes independantes seront injectées avec le radiomarqueur et anesthésiées au maximum 3 fois (30 min max) (EU2). Des cohortes indépendantes seront traitées (10 secondes de contentions) 2 fois par jour pendant une semaine (EU2).

Impact sur les animaux

Suite à l'injection, une infection peut se développer au niveau de l'abdomen de la souris dans les journées suivantes l'injection, dans ce cas la souris sera sortie de l'étude. Lorsque les souris transgéniques développeront les PIN (néoplasie prostatique intraéphithéliale), à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l'animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. Dans ce cas la souris sera sortie de l'étude. Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris, dans ce cas une administration de solution saline sera réalisée. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement. Des secheresses ophtalmiques peuvent apparaitre au cours de l'anesthésie, dans ce cas un gel ophtalmique sera appliqué.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. De plus, les études longitudinales chez l'homme ne sont pas ethique puisqu'elle nécessite des biopsies à répétition. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points de cinétique ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction du nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. L’hétérogénéité des résultats des expériences antérieures demande des cohortes de 20 animaux par point de cinétique, ce qui justifie l’utilisation des test statistiques paramétriques. Afin d’obtenir des résultats significatifs, un nombre d’animaux utilisés par condition (d’un génotype donné à un âge donné) a été calculé en fonction de la différence attendue et de l'hétérogéneité observée. Dans ces conditions, on aura besoin de 20 animaux par groupe. La tomographie par émission de positrons (TEP) est un examen d'imagerie en médecine nucléaire qui est peu invasif, les quantités de produits injectées sont faible et permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux.

Raffinement

Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids et par palpations abdominales. Les premières cohortes d’animaux, injectés et divisés en sous-groupes de cinétique (précoce, intermédiaire et tardive) seront palpées afin d’établir la corrélation la plus précise entre la palpation et l’histologie de la tumeur au moment de la mise à mort de l’animal. Une période d’acclimatation d’une dizaine de jours est respectée. Enfin, nous procéderons à une habituation à la contention pour les injections intrapéritonéales. Lors des examens d'imagerie, un gel ophtalmique est appliqué pour éviter le dessèchement oculaire et une injection sous cutanée de NaCl 0.9% à température corporelle est réalisée pour éviter la déshydratation. De même, la température rectale et la fréquence respiratoire sont monitorées en continu à l'aide d'une sonde rectale et d'un capteur de pression posé sur le thorax. Pendant les séances d'imagerie, les animaux sont placés dans une enceinte chauffée afin de maintenir la température corporelle et anesthésiés à l'isoflurane . La durée d'analyse par imagerie est restreinte au maximum (3 semaines max par souris). Par ailleurs, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et formé à l’observation des effets de la pathologie. Le transport se fera dans un vehicule adapté dans des cages de transcports adaptées et enichies afin d'assurer la sécurité des animaux (en terme de manipulations, d’équipements utilisés, moyens de transport, conditions de transport). Des points limites sont mis en place sont une perte de poids supérieure à 20%, paralysie des membres, absence de toilettage, prostration et respiration difficile.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans les gènes Pten, Trp53 et VDR le plus fréquemment impliqués dans les cancers de la prostate humain. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de cancer de la prostate (CaP) afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à la prostate qui est un organe qui termine son developpement post-puberté.

144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune subissant une biopsie de la queue à trois semaines puis, à huit semaines, une injection de cellules tumorales, avant huit injections supplémentaires étalées sur quatre semaines. Une partie reçoit ces cellules par voie intracardiaque sous anesthésie gazeuse, d'autres dans la glande mammaire au cours d'une chirurgie, et la croissance des tumeurs se mesure au pied à coulisse à chaque manipulation. Le porteur indique que les tumeurs pourraient causer une douleur et une perte de poids, et que les souris sont tuées en fin de procédure ou à l'atteinte d'un point limite pour récupérer des échantillons. Le bénéfice annoncé, identifier de nouveaux marqueurs de prédisposition au cancer du sein et les valider comme cibles thérapeutiques, reste formulé au conditionnel.

Objectifs

Nous avons fait la découverte surprenante que les ostéoblastes (les cellules qui synthétisent les os) sont capables de stimuler à distance la croissance de tumeurs mammaires ainsi que leur dissémination métastatique dans l’ensemble de l’organisme. Nous avons découvert que les ostéoblastes sécrètent des molécules pro tumorales qui circulent dans le sang et stimulent la croissance des tumeurs partout où elles se trouvent. Nous avons identifié une molécule sécrétée par les ostéoblastes potentiellement responsables de ces effets : RANKL. Notre hypothese est que la secretion de RANKL par les osteoblastes puisse etre un facteur pro-tumoral direct favorisant la croissance tumoral a distance de l'os, supprimer ca secretion nous informera du role de RANKL issu des osteoblastes. Cependant, les données de la littérature indiquent que RANKL produit dans l'os pourrait egalement réguler la production cellules immunosuppressives provenant du lignage lymphocytaire B qui produisent de l’IL10. Nous supposons alors que le RANKL, lorsqu’il est produit par les ostéoblastes, exerce un contrôle négatif sur la production de ces cellules immunodépressives, de manière directe ou indirecte. Ainsi, lorsque la production de RANKL est interrompue, ces cellules deviennent plus nombreuses et favorisent la croissance du cancer du sein. Le premier objectif est de tester le rôle de RANKL produite par les ostéoblastes dans la progression du cancer du sein, à l’aide de modèles génétiques murins où la formation osseuse est augmentée par la réduction de la résorption osseuse du a labsence de RANKL, facteur d'osteoclastogenese. Notre deuxième objectif est de tester l’hypothèse selon laquelle RANKL produite par les ostéoblastes participent au contrôle systémique de la progression du cancer du sein en modulant la réponse immunitaire antitumorale via les cellules B IL10+. Ces travaux sont nécessaires afin de déterminer si le ciblage des molécules produites par les ostéoblastes est capable de limiter, voire prévenir le développement des cancers du sein.

Bénéfices attendus

Ce travail permettra d’identifier de nouveaux marqueurs de prédisposition aux cancers du sein et de valider ces marqueurs en tant que cibles thérapeutiques. Ceci pourrait permettre de prévenir l’apparition, ou du moins de limiter la progression de tumeurs mammaires métastatiques. Ce travail pourrait notamment permettre d’améliorer les traitements visant à activer l’immunité antitumorale.

Procédures

À l’âge de trois semaines, chaque souris subira une biopsie de la queue afin de permettre l’identification des modifications génétiques présentes chez l’individu. À huit semaines, une partie des souris sera soumise à une injection de cellules tumorales. L’intervention dure environ dix minutes par individu et n’est réalisée qu’une seule fois. Au cours de la croissance tumorale, les souris pourront être injectées à une fréquence de deux fois par semaine pendant quatre semaines, avant d’être euthanasiées. La mesure de la croissance tumorale se fait à l’aide d’un pied à coulisse, ne dure que quelques secondes et est réalisée en même temps que les injections durant la phase de croissance.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des tumeurs ce qui pourrait causer une douleur et une perte de poids. Les manipulations successives des animaux (anesthésies, injections, mesures des tumeurs au pied à coulisse) peuvent engendrer un stress chez les animaux

Devenir

En fin de procedure ou lors d'atteinte de point limite, euthanasie des souris, et recuperation d'echantillions biologiques.

Remplacement

Le tissu osseux comprend de nombreux types cellulaires en plus des cellues qui fabriques l'os, qui interagissent et s’influencent mutuellement. Des travaux visant au développement de modèles synthétiques capables de récapituler l’environnement osseux sont en cours, mais les versions existantes restent très rudimentaires. De plus, notre projet vise à évaluer les effets directs et indirects des ostéoblastes sur la croissance de tumeurs primitives et la dissémination de la tumeur. Tous ces processus sont d’une grande complexité et ne peuvent être reproduits de façon fidèle synthétiquement.

Réduction

La principale méthode de réduction du nombre d’animaux utilisés dans notre projet repose sur un calcul statistique de taille d’effectif nécessaire pour chaque expérience afin d’avoir une puissance d’au moins 80 % pour détecter une différence correspondant à une taille d’effet estimée pour chaque expérience, grâce aux données préliminaires disponibles. Nos expériences sont réalisées séquentiellement avec des groupes relativement petits de souris contrôles et mutantes (2 à 5 animaux/groupe) car il nous est impossible de générer des groupes importants d’animaux du même âge en une seule fois. Ceci permet éventuellement de réduire en cours de projet le nombre de souris impliquées dans une expérience donnée, en arrêtant plus tôt que prévu cette expérience, une fois que le test statistique démontre que la/les différences observées sont significatives. Le suivi longitudinal de la croissance tumorale par imagerie de bioluminescence in vivo permet d’éviter de devoir euthanasiés...

Raffinement

Les injections intracardiaques se feront sous anesthésie gazeuse permettant un réveil rapide, moins impactant que l’anesthésie par injection. Les animaux inoculés dans la glande mammaire subiront une chirurgie mineure et seront anesthésiés ayant des propriétés analgésiques. Un gel oculaire sera appliqué sur ces animaux afin d’éviter l’assèchement durant la phase de sommeil. Le lendemain de la chirurgie, les animaux présentant des signes de souffrance recevront une dose d’analgésique. De la nourriture gélifiée sera en outre ajoutée dans les cages concernées. Tous les animaux seront observés pendant les deux heures suivant la procédure afin de confirmer une activité cardio-respiratoire normale et une bonne reprise de la mobilité. Dans tous les cas, un examen clinique et comportemental sera réalisé quotidiennement lors de la première semaine après l’intervention, puis tous les 2 à 3 jours jusqu'à la fin de la procédure, afin de détecter tout signe de souffrance animale. La croissance tumorale est monitorée par bioluminescence, permettant d’évaluer l’état des animaux et de surveiller les points limites par une méthode non invasive. Au cours de cet examen, les animaux sont anesthésiés par gaz, ce qui permet un réveil plus rapide et moins stressant que l’anesthésie chimique. Des points limites précis ont été définis et seront surveillés tout au long des procédures. En cas d’atteinte d’un point limite, les mesures décidées seront mises en place immédiatement.

Choix des espèces

L’influence des ostéoblastes présents dans notre squelette sur la croissance et la dissémination métastatique de tumeurs mammaires doit être étudiée dans un modèle animal vertébré (présence d’un squelette) et mammifère (présence de glandes mammaires). De plus, notre projet requiert l’utilisation d’animaux transgéniques et la souris est le mammifère de choix pour cela. Il est relativement facile d’évaluer les troubles comportementaux et les signes de souffrance de la souris du fait des nombreuses études préalables réalisées avec ce modèle animal (recherches en cancérologie notamment). Nous possédons une expérience importante de l’utilisation de la souris en recherche et les protocoles que nous prévoyons d’utiliser ont été mis au point pour cette espèce. La souris constitue donc l’espèce la plus adaptée pour répondre à nos questions scientifiques et éviter la souffrance de nos animaux du fait de l’expérience que nous avons déjà acquise. Toutes nos expériences seront réalisées à partir d’animaux âgés de 8 semaines, stade auquel le phénotype osseux des animaux mutants est bien marqué et où les glandes mammaires et le système immunitaire sont correctement développés.