Procédures modérées

Les 200 études prévues consistent à tester, sur des tumeurs humaines greffées, des molécules présélectionnées en amont, à un stade précoce du développement des médicaments. 12 000 souris immunodéprimées vont y être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un fragment tumoral est implanté sous leur peau, une puce électronique posée ou les oreilles marquées, puis viennent les administrations jusqu'à deux fois par jour et jusqu'à seize prélèvements sanguins par animal. Le porteur qualifie ces 12 000 souris de nombre "strictement nécessaire", et précise que celles chez qui la tumeur ne prend pas sont tuées elles aussi, "compte tenu des nuisances occasionnées".

Objectifs

Le but de ce projet est de tester l’efficacité de nouveaux traitements contre le cancer sur des modèles de tumeurs humaines implantées chez la souris. Ces modèles, appelés xénogreffes dérivées de patients (PDX), permettent de reproduire au mieux les caractéristiques des tumeurs humaines, comme leur morphologie, leurs mutations et leur comportement biologique. Grâce à cela, ils offrent un moyen fiable d’évaluer l’action de nouveaux médicaments avant qu’ils ne soient testés chez l’Homme. Notre collection de modèles PDX couvre la majorité des cancers solides (par exemple : sein, poumon, côlon, foie, rein, peau, pancréas, ovaire, vessie, cerveau ou prostate) et reflète la diversité des patients. Chaque modèle est soigneusement étudié afin de mieux comprendre ses particularités et de relier ces informations à la réponse observée aux différents traitements anticancéreux. Les 200 études prévues dans ce projet sont réalisées à un stade précoce du développement des médicaments. Elles impliquent un nombre d’animaux strictement nécessaire et visent à identifier rapidement les traitements les plus prometteurs pour un type de tumeur ou une mutation donnée. Les molécules les plus efficaces seront ensuite testées plus largement pour confirmer et approfondir les résultats obtenus.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier de nouveaux traitements efficaces contre différents types de cancers, à partir de modèles de tumeurs humaines implantées chez la souris (modèles de PDX). En testant des médicaments présélectionnés lors d’analyses préalables (modélisations informatiques, in vitro), nous pourrons repérer rapidement ceux qui montrent les effets les plus prometteurs. Ces candidats seront ensuite étudiés plus en détail pour définir les doses et les associations thérapeutiques les plus adaptées. Grâce à la diversité et à la caractérisation approfondie de notre collection de modèles PDX, nous pourrons également mieux comprendre pourquoi certains traitements fonctionnent mieux sur certaines tumeurs ou chez certains patients. À terme, ces travaux devraient contribuer à proposer de nouvelles options thérapeutiques aux patients pour lesquels les traitements actuels sont inefficaces ou inexistants, améliorer l’efficacité des traitements disponibles et réduire les effets secondaires associés aux thérapies anticancéreuses actuelles.

Procédures

Greffe : implantation d’un fragment tumoral sous la peau. Le temps de chirurgie n’excèdera pas 10 minutes. Identification : des puces électroniques sont implantées en sous cutané au moment de la chirurgie ou un marquage aux oreilles est réalisé. Surveillance des animaux : observation quotidienne du comportement par déplacement et/ou ouverture des cages d’hébergement. Administration de médicament : préhension des animaux à une fréquence dépendant du schéma de traitement : biquotidienne ou moins. La durée de préhension n’excèdera pas 1 minute. Prélèvement de sang : préhension des animaux à une fréquence dépendant des besoins en prélèvements, 16 prélèvements seront effectués maximum par animal. La durée de préhension n’excèdera pas 2 minutes.

Impact sur les animaux

Stress dû à la préhension (suivi du poids et de la taille tumorale, administration de molécules): nuisance transitoire de classe légère ; Douleurs post-opératoires: nuisance transitoire de classe modérée ; Risque d’infection: nuisance transitoire de classe modérée ; Perte de poids (cachexie, anorexie ou perte d’appétit): nuisance transitoire de classe modérée ; Diarrhées: nuisance transitoire de classe modérée

Devenir

Les animaux pour lesquels les tumeurs se seront développées seront euthanasiés pour réaliser les analyses associées (biologiques, histologiques). Les animaux n’ayant pas développé de tumeur malgré la greffe d’un fragment tumoral seront euthanasiés compte tenu des nuisances occasionnées. Les animaux de ce projet ne seront pas utilisés dans un autre projet.

Remplacement

Le développement de nouveaux traitements permettant de lutter contre le cancer nécessite la réalisation de tests précliniques afin de valider leur efficacité sur la croissance tumorale, avant une application chez l’Homme. Il existe des méthodes alternatives et préalables à la réalisation de tests sur les animaux (prédictions informatiques, in vitro …), permettant de tester rapidement un grand nombre de molécules, et de sélectionner celles qui semblent le plus efficace. Cependant, ces méthodes réalisées en dehors du cadre d’un organisme vivant n’offrent pas la possibilité de lier les effets des traitements avec la complexité de l’organisme, par exemple elles ne prennent pas en compte l’effet de la circulation sanguine ou le rôle du foie dans la transformation et la distribution des médicaments. Cela limite la possibilité de prévoir comment un traitement agira réellement dans le corps d’un patient. C’est pourquoi, une fois les tests préliminaires terminés, et les molécules les plus prometteuses identifiées, il est nécessaire de poursuivre leur évaluation chez l’animal. Ces études sont réalisées sur un nombre strictement nécessaire d’animaux, uniquement lorsque les alternatives ne permettent plus d’obtenir les informations nécessaires à l’avancée du projet.

Réduction

Ce projet utilise le nombre d’animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats fiables lors des premières étapes d’évaluation des traitements. Les expériences sont réalisées sur de petits groupes de souris afin de déterminer rapidement si un traitement est efficace ou non. La croissance des tumeurs est mesurée de manière standardisée pour savoir si le traitement fonctionne : s’il stabilise ou diminue le volume de la tumeur. Seules les molécules les plus prometteuses sont ensuite étudiées plus en détail sur un nombre plus important d’animaux pour confirmer les résultats avant des essais chez l’Homme. De plus, les animaux dont les tumeurs ne se développent pas sont utilisés pour la formation en vue de l’acquisition, de l’entretien et de l’amélioration des compétences professionnelles du personnel, ce qui permet de limiter encore l’usage d’animaux supplémentaires. La phase de formation est intégrée dans ce projet.

Raffinement

Pour prévenir l’hypothermie durant l’acte chirurgical, les animaux seront placés sur un tapis chauffant. Pour la prévention de la douleur et la souffrance lors de l’acte chirurgical et lors de prélèvements invasifs, les animaux recevront une anesthésiés générale. Un point de compression sera réalisé sur le site de prélèvement pour éviter l’hémorragie. Si une perte de poids est observée, un supplément nutritionnel sera proposé à l’animal. Pour les soins, si une lésion ou une sécheresse sont observées au niveau de la sphère oculaire, une solution nettoyante et/ou protectrice sera appliquée. Si une lésion cutanée est observée, une solution antiseptique sera appliquée. En cas d’infection, des analyses bactériologiques et/ou virologiques pourront être effectuées pour instaurer une thérapie adéquate et l’animal pourra être isolé pour lui permettre de se rétablir sans la présence de ses congénères. Dans ce cas, divers matériaux ajoutés pour atténuer l’effet d’isolement et permettre la création d’un cocon. Après l’administration de molécules, l’animal sera observé pour détecter tout comportement inattendu. Aussi, un point de compression sera réalisé au site d’administration si nécessaire.

Choix des espèces

Nous utilisons des souches murines immunodéprimés qui sont classiquement utilisées pour des greffes de fragments tumoraux issus de tumeurs humaines et dans le cadre d'évaluations pharmacologiques. Les souris présentant un système immunitaire résiduel qui se développe avec l'âge et qui peut réduire le taux de prise de greffe, nous utiliserons des animaux, en fin de période d'acclimatation, âgés entre 5 et 13 semaines afin d'homogénéiser les conditions de croissance entre les différentes études.

11 babouines vont être capturées et anesthésiées six fois chacune, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois de ces anesthésies servent à une échographie, un prélèvement de 16 millilitres de sang et une injection de denosumab ou de placebo, une quatrième à l'ablation chirurgicale des deux ovaires, les deux dernières à de nouveaux prélèvements. Le porteur indique que le médicament provoque fréquemment des douleurs ostéoarticulaires chez la femme ménopausée et que la chirurgie expose à des saignements, une infection ou une réouverture de la plaie, suivis de deux à cinq jours d'isolement. Toutes sont gardées vivantes dans leurs groupes sociaux d'origine, le porteur estimant que ces prélèvements "ne sont pas invalidants", après le retrait de leurs deux ovaires.

Objectifs

Dans le squelette, certaines cellules osseuses expriment une protéine "RANKL" qui se lie et active un récepteur spécifique "RANK". Ce système de signalisation RANKL est un régulateur reconnu de la santé osseuse, mais sa présence a été démontrée dans les gonades de souris et d'humains, et les données montrent que c'est un puissant régulateur dans la production de spermatozoïdes et de leur motilité. Récemment, des études ont montré que le système RANKL est également présent et actif dans la fonction reproductrice féminine (souris et humains). Les données chez les femmes qui subissent une fécondation in vitro suggèrent que le système RANKL intervient dans le stade précoce de la folliculogenèse et qu'il est également associé à l'âge (sa concentration son inhibiteur plus faible chez les femmes les plus jeunes que chez les femmes âgées de plus de 40 ans). Sur la base de nos données préliminaires, nous suggérons que la signalisation du RANKL joue deux rôles distincts dans la fonction ovarienne : l'un régulant la réserve folliculaire, l'autre jouant un rôle clé durant les dernières étapes de la maturation ovocytaire. Nous émettons l'hypothèse que la signalisation RANKL joue un rôle essentiel dans la fonction ovarienne en régulant la réserve folliculaire et en modulant la maturation ovocytaire pendant les étapes finales du développement folliculaire. Pour tester cette hypothèse, nous mènerons une étude chez le primate non humain (PNH) afin de découvrir le rôle régulateur de la signalisation RANKL pendant la folliculogenèse et la maturation des ovocytes. Ainsi, l'objectif global de ce projet est de découvrir une nouvelle biologie ovarienne qui pourrait être utilisée pour améliorer la fertilité des femmes infertiles et prolonger la longévité reproductive des femmes.

Bénéfices attendus

L'infertilité est un problème courant, qui touche jusqu'à 15 % des couples dans le monde. Actuellement, la plupart des couples infertiles sont traités par des techniques de procréation assistée. Ce traitement réussit dans 70 % des cas, mais il est coûteux, invasif et associé à de potentiels effets secondaires chez la mère. Nos résultats préliminaires indiquent que le système de signalisation RANKL est présent et actif dans la fonction reproductive féminine, constituant ainsi une nouvelle cible pour le traitement de l'infertilité. Le dénosumab, un inhibiteur du RANKL, est actuellement utilisé pour traiter l'ostéoporose et peut donc avoir une importance clinique immédiate. Cependant, les résultats des études chez la souris contrastent avec les données chez l'Homme ce qui limite l'utilisation de modèles murins pour étudier les effets du traitement par le denosumab sur les résultats reproductifs chez les femmes, d'où la nécessité d'étudier les effets de ce traitement chez les PNH. En raison de leur similarité anatomique et physiologique avec l'humain, les babouins constituent un excellent modèle pour les études sur la reproduction et ont été largement utilisés pour étudier la reproduction chez la femme. Nous avons réalisé une étude pilote au cours de laquelle l'analyse de marqueurs sanguins ont démontré que le babouin était sensible au traitement par le dénosumab. Le projet décrit fournira à court terme des informations précieuses sur les effets du traitement au denosumab sur la fonction reproductive féminine évaluée par les changements hormonaux et de l'ovaire. Lorsque nous traitons des animaux ou des humains in vivo avec un inhibiteur de RANKL tel que le Denosumab, moins de petits follicules meurent et plus de follicules survivent et peuvent être recrutés plus tard dans la vie. Cela implique que les femmes vieillissantes pourraient en bénéficier et que les femmes souffrant d'insuffisance ovarienne pourraient profiter de cette opportunité pour avoir de meilleures chances de réussir le prélèvement d'ovocytes lors d'une FIV.

Procédures

Chaque animal sera capturé et anesthésié SIX fois au cours de l'étude : - 3 courtes anesthésies (20-30 minutes) pour prélèvement sanguin + ECHOGRAPHIE (16 mL) et injection de denosumab ou placebo (T0-T1-T2) - 1 anesthésie de 1 à 2h pour chirurgie (ovariectomie BIlatérale) avec prélèvement sanguin (16mL) (T3) - DEUX courteS anesthésieS (20-30 minutes) pour prélèvement sanguin (16 mL) (T4 et T5)+ ECHOGRAPHIE

Impact sur les animaux

Stress lors de la capture. Anesthésie (dépression cardiorespiratoire, déshydratation, hypotension, hypothermie). Prélèvement sanguin (risque hématome). Effets secondaires du denosumab : douleurs ostéo articulaires ou musculosquelettiques rapportées fréquemment chez la femme ménopausée sous traitement chronique, de manière moins fréquente infection du tractus urinaire ou respiratoire, constipation, gêne abdominale ou éruption cutanée (aucun effet secondaire rapporté chez le macaque cynomolgus à 8 fois la dose administrée). Complications chirurgicales : saignements, hémorragies, infection de plaie ou déhiscence. Isolement de 2 à 5 jours en post opératoire (ennui, stress).

Devenir

Tous les femelles seront gardées en vie et dans leurs groupes sociaux d’origine car les prélèvements prévus ne sont pas invalidants.

Remplacement

Récemment, des études ont montré que le système étudié est présent et actif dans les gonades femelles de souris et humains. Cependant, ces études in vitro ont des limites, car l'administration de denosumab a des effets systémiques qui doivent être évalués in vivo. Ce protocole vise à étudier les effets du denosumab qui est un médicament qui agit sur différents organes par des effets systémiques. Ce projet est donc une étape ultérieure à ces analyse in vitro et qui est nécessaire pour étudier les effets du denosumab sur la résorption osseuse et la reproduction féminine. Pour étudier de tels effets systémiques et hormonaux, une étude in vivo est obligatoire et dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives.

Réduction

Avant la mise en place de cette étude, une étude pilote a été réalisée pour s'assurer que les babouins sont sensibles au denosumab, et donc que les babouins sont des modèles animaux valables pour le traitement. Le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des données fiables a été choisi afin de minimiser le nombre d'animaux utilisés. Le calcul de la puissance est basé sur une étude pilote menée sur un seul babouin, où le taux sanguin d'une hormone a augmenté de 40 %. Avec un niveau de test de 5 % (niveau de signification) et une puissance de 80 %, 5 babouins femelles dans chaque groupe à chaque point dans le temps seront suffisants pour atteindre une signification statistique. L'effet sur la folliculogenèse nécessitera également une comparaison entre le placebo et le traitement au denosumab. 4 à 5 animaux dans chaque groupe sont normalement utilisés pour effectuer une telle analyse, ce qui justifie la taille de l'échantillon. Pour réduire le nombre d'animaux, chaque babouin injecté servira également de contrôle interne. L'effet du denosumab sera examiné en comparant les échantillons sanguins de base avec ceux prélevés après l'injection.

Raffinement

Concernant la capture, elle est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Elle consiste d’abord à isoler l’animal lors de son passage dans le tunnel de son hébergement. Une fois isolé dans le tunnel, l’animal est transféré dans une boite de transport accolée au tunnel puis transféré dans une zone d’isolement temporaire avec une cage à fond amovible. Tous les prélèvements sont réalisés sous anesthésie injectable. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés par les vétérinaires (i.e. ECG, Fréquence Cardiaque, Fréquence Respiratoire, Température rectale). Suite aux anesthésies, les femelles seront réveillées dans leurs loges d’origine et réintroduites dans leurs groupes dès qu’elles sont suffisament réveillées, selon la procédure validée par la SBEA. Pour l’ovariectomie (T3), l'intervention a lieu sous anesthésie ) et sous analgésie (anti inflammatoires et morphiniques). L’animal sera isolé la veille de l’intervention de son groupe pour assurer la mise à jeûn, puis restera en infirmerie pendant 2 à 5 jours en post opératoire sous traitement antalgique. Il sera alors suivi avec une grille de score et de douleur spécifique et disposera d’un planning d’enrichissement dédié avec 4 enrichissements manipulatoires ou alimentaires journaliers. Après validation de sa récupération et de son état de santé par l’équipe vétérinaire il sera réintroduit dans son groupe d’origine, en accord avec les procédures validées par la SBEA et sous surveillance de l’équipe BEA.

Choix des espèces

Les résultats des études chez la souris contrastent avec les données chez l'être humain et le schéma d'expression du système de signalisation RANKL chez la souris ne reflète pas celui de l'être humain. Cela limite l'utilisation de modèles murins pour étudier les effets du traitement par le denosumab sur les résultats reproductifs chez les femmes, d'où la nécessité d'étudier les effets de ce traitement chez les primates non humains. En raison de leur similarité anatomique et physiologique avec l'homme, les babouins constituent un excellent modèle pour les études sur la reproduction et ont été largement utilisés pour étudier la reproduction chez la femme. Un autre avantage est qu'il est facile de suivre le stade du cycle œstral chez le babouin car il peut être distingué visuellement chez les babouins femelles par des modifications anatomiques de la région périnéale (gonflement et règles). Les animaux inclus seront tous des babouins femelles d'un âge avancé (15-25 ans), mais non ménopausées. En effet, ces animaux seront plus sensibles aux traitements affectant les résultats reproductifs que les jeunes animaux très fertiles, ce qui est important si nous voulons utiliser le médicament pour le traitement de l'ovaire vieillissant chez les femmes.

Les souris utilisées appartiennent à une souche athymique dépourvue de défenses immunitaires, choisie pour que des cellules cancéreuses humaines prennent sous leur peau. 974 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, un fragment de tumeur humaine est implanté dans leur flanc droit, puis elles reçoivent des injections intraveineuses hebdomadaires pendant deux à six semaines selon la progression de la tumeur, complétées par des gavages et des injections dans l'abdomen. Toutes sont tuées, le porteur indiquant que des animaux porteurs d'une tumeur au flanc ne peuvent pas être inclus dans un autre protocole.

Objectifs

La sénescence est un processus biologique naturel qui intervient en protégeant les cellules contre des stress cellulaires comme le raccourcissement des télomères, les dommages à l’ADN ou encore le stress oxydatif. Durant certains processus naturels, comme par exemple l’embryogénèse, la senescence a un rôle fondamental. Cependant, l’accumulation de ces cellules sénescentes dans l’organisme au cours du temps conduit à l’émergence de pathologies que l’on retrouve majoritairement chez les personnes âgées. Par exemple, les fibroses comme celle du foie, des poumons, des reins ou du coeur, le cancer, les maladies neurodégénératives ou l'arthrose sont des ptahologies directement liées à l’accumulation de ces cellules sénescentes. L'objectif de ce projet est la mise au point de thérapies innovantes capable d'éliminer les cellules senecentes dans les tumeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de valider l'efficacité de nouveaux composés dans le traitement du cancer. Ces thérapies ciblées permettent d'éliminer spécifiquement les cellules senescentes tumorales responsables des mécanismes de résistance aux drogues et de la formation des métastases. De plus, le ciblage des cellules senescentes cancéreuses permettra de limiter les effets secondaires associés aux traitements classiques comme la chimiothérapie comme par exemple la formation de tissus fibrotique.

Procédures

Les animaux seront greffés en sous-cutané avec des modèles de lignées cellulaire humaines tumorales. Au début du protocole, les souris seront anesthésiés puis des cellules cancéreuses seront implantées sous la peau au niveau du flanc droit. Puis, les animaux se verront injecter différents produits par intraveineuse, une par semaine, durant 2 à 6 semaines consécutives en fonction de la progression des tumeurs.

Impact sur les animaux

Plusieurs éléments peuvent nuire au bien être des animaux et engendrer un stress et une douleur notamment lors des greffes sous cutanées des cellules tumorales, des gavages et lors des injections intraveineuseet intrapéritonéales.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le protocole expérimental seront mis à mort soit en fin de procédure. En effet, les animaux présentant une tumeur dans le flanc ne pourront être réutilisés ou inclus dans un autre protocole.

Remplacement

Ce projet a pour but le développement de potentielles thérapies ciblées pour la traitement du cancer. Ces études in vivo font suite à de nombreux résultats in vitro qui nous permettent d'affirmer que nos nouveaux ADC présentent un réel intérêt thérapeutique. Cependant, à ce stade du développement de nos recherches, l'utilisation de modèles complexes, comme des modèles de xénogreffes, est requise pour pouvoir prouver l'efficacité thérapeutique de nos candidats. De plus, pour le développement préclinique de nos ADC, nous devons apporté la preuve d'une efficacité sur des modèles complexes en plus d'étude de pharmacocinétique précise des molécules en développement.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum tout en maintenant la possibilité d'une analyse statistique des résultats. Etand donné que l'originalité de nos ADC, ces expériences n'ont jamais été faites précédemment dans la littérature.

Raffinement

Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin de s'assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance. L'apparition de signes évocateurs de souffrance, de mal-être comme la prostation, un comportement erratique ou une altération de l'état général de la souris permettra rapidement, en fonction de la gravité des observations, de procéder soit à une prise en charge de l'animal (administration d'un antalgique) soit à la mise à mort de l'animal concerné.

Choix des espèces

La souche NMRI nude athymique sera utilisée dans l'étude de modèles de xénogreffes de cellules humaines cancéreuses en greffées en sous-cutanée. Il s'agit d'un modèle immunodéprimé avec une courbe de poids homogène et couramment utilisée dans la littérature associée à la recherche en oncologie. Ce souche permettra l'évaluation de l'effiacité anti-tumorale de nos candidats médicaments dans des modèles de xénogreffes exprimant les cibles d'intérêts thérapeutiques. Les souris NMRI athymique nude seront âgées de 6-7 semaines lors de la greffe sous-cutanée pour garantir une prise tumorale homogène.

Tous tués en fin d'expérience pour prélever leur cerveau, destiné à des analyses moléculaires ou à l'enseignement universitaire de neuroanatomie, 673 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un cathéter est implanté à demeure dans leur veine jugulaire, une partie subit en plus une chirurgie intracérébrale, puis ils consomment de la cocaïne quelques heures par jour, cinq jours par semaine pendant cinq semaines. Après quatre semaines de sevrage, ils sont replacés face aux signaux lumineux et sonores associés à la drogue pour mesurer leur comportement de recherche. Le porteur reconnaît que la douleur postopératoire résiste aux anti-inflammatoires et qu'un traitement aux opiacés est exclu dans une étude sur l'addiction, quand les cibles thérapeutiques annoncées sont renvoyées au moyen terme.

Objectifs

Le présent projet s'intéresse notamment à l'implication, dans le comportement de consommation et/ou de recherche de cocaïne, d'une voie de communication dans le cerveau qui participe de façon prépondérante au contrôle des processus liés aux émotions et à la motivation. Plus précisément, ce projet veut d'une part tester si des changements de l'activité de cette voie impactent la consommation volontaire de cocaïne puis sa recherche après sevrage, et d'autre part examiner si le comportement de consommation et/ou recherche de cocaïne peut lui-même modifier cette voie. A l'heure actuelle, la littérature est très pauvre concernant cette voie pourtant intéressante dans le domaine de l’addiction, et devient inexistante si on s'intéresse à des protocoles expérimentaux conduisant les animaux à développer un comportement de consommation de cocaïne mal contrôlé qui, ensuite après sevrage, génère un comportement de recherche de drogue exacerbé. L'hypothèse formulée ici est que la voie qui nous intéresse est fondamentale dans l'expression de ces comportements de consommation et de recherche de cocaïne exacerbés qui modélisent les difficultés rencontrées par les toxicomanes à contrôler leur consommation. Si elle est confirmée, elle participera à une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux mis en jeu dans l'addiction. Le modèle utilisé ici est basé sur un test comportemental qui permet au rat de consommer lui-même volontairement la drogue. Cette approche présente l'avantage d'exposer l'animal à la drogue de façon très rapide (le passage au cerveau e fait en quelques secondes) et de façon dépendante du comportement volontaire de l'animal, qui a la liberté de ne pas consommer, ce qui lui confère une haute valeur de modélisation de la pathologie. Par ailleurs, nos modèles, qui soumettent les animaux à des protocoles d'accès particuliers à la drogue, peuvent les conduire à consommer des quantités importantes de drogue ou à la consommer de façon très intense, comme cela est observé chez les cocaïnomanes, et permettront ainsi de mettre en évidence des modifications tissulaires, notamment au sein de la voie cérébrale qui nous intéresse, susceptibles de se produire dans la pathologie humaine.

Bénéfices attendus

Les connaissances actuelles sur l’addiction sont considérables, mais force est de constater que les traitements actuels manquent d'efficacité, notamment en raison de l’utilisation de modèles animaux imparfaits. L'étude que nous proposons devrait permettre, de par la comparaison des modifications cérébrales induites chez des rats consommant la cocaïne de façon moins contrôlée que dans des conditions standard, de mettre en lumière, à moyen terme, des cibles de nouvelles approches thérapeutiques. Par ailleurs, la mise en évidence de l'implication potentielle d'une voie cérébrale nouvelle dans ces modèles de consommation et recherche exacerbées de cocaïne participera à susciter l'intérêt d'étudier une structure cérébrale jusqu'ici peu examinée et dont les caractéristiques neuronales ou moléculaires offriront peut-être, à long terme, de nouvelles approches pharmacologiques.

Procédures

Tous les animaux de ce projet sont soumis à une intervention chirurgicale (45 min max) qui permet d'implanter, de façon définitive, un système de cathéter accessible de l'extérieur de l'animal et qui se termine dans la veine jugulaire. Certains animaux recevront également, par chirurgie intracérébrale (1h30 max) des administrations de séquences de gènes permettant ultérieurement l'expression locale d'un récepteur artificiel. Tous les animaux de ce projet sont soumis à un test comportemental, quelques heures / jour, 5 jours / semaines pendant 5 semaines, où ils pourront consommer la cocaïne de façon totalement volontaire par le biais du cathéter préalablement implanté. Cette phase de consommation doit être suivie d'une phase de sevrage de 4 semaines. L'expérience se termine par une évaluation du comportement de recherche de cocaïne (30 min) provoquée par l'exposition de l'animal à des signaux (lumineux et sonores) qu'il a pu associer aux effets de la drogues durant la phase de consommation. Cette séance est immédiatement suivie, chez une partie des animaux, par une évaluation du comportement de recherche de drogue par l'exposition de l'animal à la drogue elle-même (30 min).

Impact sur les animaux

1/ Chirurgies - La technique permettant la consommation volontaire de cocaïne nécessite une chirurgie vasculaire chez tous les animaux pour implanter à demeure un cathéter intraveineux. Une partie des animaux subit en outre une chirurgie intracérébrale pour, ultérieurement, pouvoir moduler l’activité de la voie cérébrale d’intérêt. Donc, une douleur post-opératoire (résistante aux anti-inflammatoires) pourrait être ressentie transitoirement, d'autant qu'un traitement aux analgésiques forts (opiacés) ne peut être envisagé dans le cadre d'une étude sur l'addiction. 2/ Isolement - Après implantation du cathéter, un isolement de maximum 24h est nécessaire pour protéger les cicatrices et optimiser la récupération de l'animal. 3/ Vulnérabilité infectieuse - Au-delà des actes invasifs nécessaires à la chirurgie vasculaire, les animaux sont ensuite connectés et déconnectés de façon quotidienne de l'appareillage permettant la consommation de solution de cocaïne. Ainsi, le milieu intérieur de l'animal est exposé à l'environnement extérieur de façon répétée. Malgré toutes les précautions qui pourront être prises en termes d'asepsie, il existe un risque d'infection par des agents pathogènes (surtout bactériens), essentiellement en raison de l'interdiction de traitement antibiotique préventif. 4/ Sevrage à la cocaïne - Suite à la phase de consommation de cocaïne, les animaux sont soumis à une phase de sevrage. Même s'il n'existe aucun syndrome reconnu de sevrage physique à la cocaïne, des symptômes psychologiques, comme un niveau accru de réaction aux stimuli anxiogènes, peuvent être mis en évidence. Même si nous nous appliquons à ne pas soumettre les animaux à des situations anxiogéniques, cette éventuelle nuisance n'est pas traitée car le sevrage et ses conséquences font partie intégrante des processus addictifs et leur traitement pharmacologique pourrait induire des biais d'interprétation des résultats. 5/ Modulation de la voie cérébrale d'intérêt - La voie de communication cérébrale qui nous intéresse est connue pour être inhibée par des stimuli récompensants et plutôt activée dans des situations aversives. Même s'il n'est pas démontré que l'activation de la voie est un médiateur du ressenti aversif, l'activation pharmacogénétique que nous envisageons est susceptible de générer transitoirement un état dysphorique.

Devenir

Tous les animaux de ce projet sont mis à mort à la fin des expériences car les cerveaux doivent ensuite être prélevés pour analyses moléculaires ou tissulaires ou bien pour utilisation dans le cadre d’enseignement universitaire de neuroanatomie (principe de réduction).

Remplacement

A l'heure actuelle, les études in vitro et in silico dans le domaine de l'addiction existent mais elles présentent les limites inhérentes à leur nature, c'est-à-dire l'impossibilité, pour les premières, d'envisager l'aspect intégré de la pathologie et, pour les secondes, une sur-simplification des systèmes biologiques associée à un manque de prise en compte de la variabilité interindividuelle due aux multiples facteurs mis en cause dans la pathologie. L'addiction étant un trouble psychiatrique qui nécessite le fonctionnement du cerveau en situation intégrée dans un organisme vivant et vigile doté de ses particularités propres, elle requiert aujourd'hui encore l'utilisation d'animaux dans sa modélisation préclinique. Notre projet visant à étudier l'implication, dans l'addiction à la cocaïne, d’une voie cérébrale mise en jeu dans les émotions et la motivation, processus hautement variables et sous l'influence de l'organisme entier, il nécessite donc l'emploi d'animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est calculé au plus juste pour pouvoir déterminer d’éventuelles différences statistiquement significatives avec un minimum d’animaux. Pour cela, des calculs mathématiques dédiés à l’estimation prospective d’effectifs nécessaires aux études scientifiques sont employés.. Dans la mesure du possible, chaque animal est son propre contrôle. Par ailleurs, chaque procédure expérimentale est réalisée sur plusieurs cohortes succesives d'animaux, de sorte que les cohortes initiales peuvent donner des indications pertinentes sur la suite des expériences à mener (réitérer ou arrêter), notamment en utilisant les tests statistiques les plus adaptés aux données recueillies pour déterminer les analyses avec le plus de puissance possible. L’utilisation de groupes témoins est réduite au strict minimum.

Raffinement

Les animaux sont soumis aux tests comportementaux durant leur période d’activité naturelle pour limiter au maximum la perturbation de leur sommeil. La manipulation des animaux commence une semaine après leur arrivée et est ensuite obligatoirement quotidienne. Seules les personnes assurant les expérimentations (maximum 2 personnes) manipulent les animaux. Les actes chirurgicaux sont réalisés dans une pièce dédiée, avec constitution de champs stériles et utilisation de matériel à usage unique ou stérilisable, et tant que possible en travail d’équipe permettant au chirurgien de ne pas s’extraire du champ stérile. La qualité de l’anesthésie est vérifiée fréquemment. La température interne des animaux est contrôlée. Dans la mesure du possible, les chirurgies seront regroupées en une seule intervention. Les cicatrices sont enduites d’une pommade cicatrisante qui, en outre, empêche le contact direct des agents pathogènes et irritants avec l’épiderme. Un isolement post-opératoire de quelques heures est appliqué afin de protéger les cicatrices de l’animal et de quantifier les comportements alimentaire et de boisson d’eau. L’analgésie pendant et après la chirurgie est couverte. Les animaux sont examinés quotidiennement avec, tant qu’elles sont apparentes, une attention particulière portée aux cicatrices, systématiquement désinfectées. Les conditions d’asepsie durant les tests et lors de la manipulation des animaux sont validées par la structure du bien-être animal (SBEA) et/ou le vétérinaire référent et scrupuleusement suivies pour éviter les infections. Les tests comportementaux sont réalisés dans une pièce dédiée à laquelle les animaux sont habitués. La première exposition de l’animal à la chambre de test est une séance d’habituation pour éviter un stress de l’animal combiné aux effets de la drogue. La passation des animaux dans les tests est organisée de sorte qu’aucun animal n'est isolé, en attente dans sa cage. La mise à mort est le plus souvent immédiate et sans aucune souffrance grâce à l'administration intraveineuse de l’agent euthanasiant par le biais du cathéter préalablement implanté. De façon générale, le bien-être des animaux est fréquemment vérifié à l’aide d’une grille d’évaluation individualisée indiquant les points limites de différents paramètres adaptés aux procédures (comportement, poids, pelage, cicatrices…). En cas d’altération, cela fait obligatoirement l’objet d’interventions adaptées.

Choix des espèces

Le Rat représente un choix intéressant pour la modélisation préclinique de l’addiction. Sur un plan évolutif, les rongeurs appartiennent à l’ordre des mammifères, parmi ceux disponibles en laboratoire, le plus proche de celui des Primates. Le Rat s’impose par l’existence de très nombreuses données neuroanatomiques et comportementales solides sur les processus addictifs qui ont permis de mieux les comprendre chez l’Homme. Doté de capacités cognitives élaborées, le Rat développe facilement des comportements complexes permettant d’étudier des aspects précis de l'addiction. Enfin, sur un plan pratique, la durée de vie des cathéters intraveineux implantés à demeure est moins importante chez la Souris que chez le Rat et peut sérieusement compromettre la tenue des expériences sur le long terme (plusieurs semaines). Les rats arrivent au laboratoire âgés de 3 semaines. Débutant le comportement au moins 3 semaines plus tard, ils sont alors dans l'adolescence et entrent dans l'âge adulte. Cette période de vie chez le rat correspond à une période de vulnérabilité accrue de l'être humain (phase adolescence/post-adolescence) vis-à-vis de la dépendance aux drogues.

Pour valider un substitut de peau fabriqué avec des cellules modifiées afin d'échapper au rejet, 140 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est anesthésié, un morceau de peau du dos lui est retiré et le substitut greffé, pour une chirurgie d'environ quinze minutes. Le porteur indique que l'opération peut provoquer une douleur et une perte de poids pendant trois à quatre jours, et que l'isolement en cage individuelle quatre jours avant l'expérience induit un stress. Toutes sont tuées pour prélever la peau en cours de cicatrisation, les observations visuelles de la plaie ne suffisant pas, selon lui, à conclure sur l'efficacité du substitut.

Objectifs

En raison de sa fonction protectrice, la peau est un organe indispensable à la survie de l’organisme. Lors d’agressions importantes, telles qu’une brûlure du troisième degré, la peau n’est plus capable de cicatriser spontanément et induit un déséquilibre parfois mortel. La prise en charge des victimes de brûlures sévères se base aujourd’hui sur l’utilisation de substituts cutanés préparés avec les cellules du patient. Cependant, la disponibilité limitée de cellules saines du patient et le long procédé de fabrication peut mettre en jeu la vie du patient. Une des solutions envisagée pour pallier au problème de disponibilité de cellules saines et limiter les temps d’attente est d’utiliser les cellules d’une autre personne saine. La contrainte alors rencontrée est le phénomène de rejet. Pour contrer cela, il est possible d’utiliser les propriétés de tolérance immunitaire d’une molécule centrale dans la protection du foetus contre le rejet par le système immunitaire maternel. En se basant sur cette stratégie, nous avons développé une méthode permettant de modifier des cellules de peau de manière à permettre une production contrôlable de cette molécule. L’objectif de ce projet est maintenant de valider la capacité de notre substitut cutané immunotoléré, préparé dans des conditions correspondant aux exigences réglementaires d’un médicament, à reformer une peau fonctionnelle après greffe.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de sélectionner un milieu de culture chimiquement défini répondant aux exigences règlementaires d’un médicament et de valider la capacité du substitut immunotoléré à favoriser d’une bonne prise de greffe, la maturation de la peau et son auto-renouvèlement. Cette étape permettra une avancée significative vers la conception de nouveaux substituts cutanés immunotolérés pouvant servir de bio-pansements lors de greffes de peaux chez l’Homme (ex : grands brulés). En d’autre terme, ce projet a pour objectifs, à court et moyen termes de sélectionner les conditions optimales de culture de substituts cutanés universels pour, à plus long terme, développer le traitement des grands brulés en proposant un accès plus rapide et universel à des greffons tissulaires pour des patients chez qui l’autogreffe est limitée voire même impossible.

Procédures

Les animaux, sous anesthésie générale, seront soumis à l’enlèvement d’un morceau de peau et une greffe d’un substitut cutanée sur le dos pour une durée moyenne de chirurgie de 15 minutes par souris.

Impact sur les animaux

La nécessité d’isoler les animaux le temps de la procédure et la greffe d’un substitut de peau peuvent induire un stress. L’anesthésie peut provoquer chez les animaux une légère baisse d’activité au réveil pendant une ½ journée. La chirurgie peut provoquer une douleur et une légère perte de poids pendant 3 à 4 jours.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux inclus dans l’étude est nécessaire pour prélever la peau en cours de cicatrisation et réaliser les analyses qui viendront compléter les observations visuelles de la plaie et permettre de conclure à l’efficacité du substitut cutanée. .

Remplacement

Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée impliquant des cultures de cellules et des reconstructions de substituts cutanés en 3D, les mécanismes physiopathologiques mis en jeu lors d’une greffe, de sa maturation et des processus de cicatrisation ne peuvent être répliqués en laboratoire. Par exemple, les modèles de cicatrisation ex vivo qui reproduisent plus fidèlement l’environnement structurel et moléculaire de la peau sont eux limités par l’absence de mécanismes de coagulation, d’inflammation et de réponse métabolique. Le remplacement par des modèles in vitro ou ex vivo n’est ainsi pas possible ici car seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité de la réparation tissulaire, notamment des effets physiopathologiques de la possible réponse inflammatoire à la suite d’une xenogreffe, permettant ainsi d’atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, des premières études in vitro de culture cellulaire 2D et 3D ont été effectuées pour valider la non toxicité et la fonctionnalité biologique de la peau greffée préparée dans différents milieux de culture. Des tests statistiques prédictifs du nombre nécessaire d’animaux pour atteindre une différence significative ont été utilisés pour chaque procédure. Des calculs de puissance préalables ont été effectués pour prédéterminer la taille de l'échantillon à l'aide d'un logiciel en accès libre et sur la base d'expériences antérieures avec des modèles de cicatrisation similaires.

Raffinement

Tout le long du projet, les animaux auront un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson. Pour réduire au maximum le stress lié à l’isolement et que ce dernier n’influence pas les résultats de l’étude, les souris seront acclimatées 3 jours à l’environnement de l’animalerie puis hébergées dans des cages séparées 4 jours avant le début de l’expérimentation, en mélangeant une petite poignée de la litière précédente à la nouvelle litière lors du nettoyage des cages. Pour réduire au maximum le stress lié à l’isolement et que ce dernier n’influence pas les résultats de l’étude, les souris seront acclimatées 3 jours à l’environnement de l’animalerie puis hébergées dans des cages séparées 4 jours avant le début de l’expérimentation dans des cages en conditions standard d’animalerie, avec un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson. Le choix de la durée d’adaptation et d’isolement des souris est justifié par l’étude de la réaction immunitaire au greffon. Ainsi, la production de cytokines due au stress pourrait interférer avec notre étude, c’est pourquoi les souris doivent être adaptées à leur environnement afin de ne pas créer de biais supplémentaire. Par ailleurs, la durée d’adaptation a été réduite au maximum afin que la totalité de l’étude dure 21 jours. Le bien-être des animaux sera assuré par l’utilisation de moyens d’enrichissement du milieu de vie des animaux, par une visite quotidienne et un suivi analgésique avant, pendant et après les chirurgies. Une analgésie multimodale sera attribuée aux animaux associant du paracétamol quotidiennement (dans l’eau de boisson) pour une durée minimale de sept jours post-chirurgie (puis en fonction du comportement de l’animal) et un anti douleur en injection, 2 fois par jour pendant les 3 premiers jours après la chirurgie (puis en fonction du comportement de l’animal). Pour pallier l’éventuelle perte de poids, des gelées enrichies sont données aux animaux quotidiennement. Une grille de suivi des animaux est mise en place et des points limites ont été définis afin de réduire la souffrance animale. L’ensemble des effets indésirables sont pris en compte lors d’examens cliniques journaliers des animaux permettant la mise en place de traitements ou le cas échéants la mise à mort des animaux si les points limites sont atteints.

Choix des espèces

Nous avons choisi l’espèce souris car c’est un modèle largement décrit dans la littérature en ce qui concerne l’excision cutanée et l’évaluation de la greffe et la cicatrisation. De plus, la manipulation de cette espèce et de cette technique de chirurgie sont bien maîtrisées au sein du laboratoire. De plus, ce choix vise à standardiser ce modèle de greffe cutanée au sein du consortium expérimental du programme sur différents sites. Les souris seront utilisées au stade du jeune adulte (8 semaines). Un compromis a été effectué pour utiliser des souris à un stade du développement suffisamment avancé pour s’affranchir du cycle de croissance des souris (pouvant entrer en jeu dans les processus de greffe et de cicatrisation) mais suffisamment jeunes pour s’affranchir des processus de vieillissement de la souris.

Infectés par le virus de la grippe au moyen d'une instillation dans le nez, 52 furets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes et mesurer les charges virales. Ils développent fièvre, éternuements, écoulement nasal et apathie, et subissent jusqu'à six prélèvements sanguins et lavages bronchoalvéolaires, plus des lavages nasaux et des écouvillonnages de la gorge quotidiens. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne permet de modéliser l'efficacité d'un antiviral dans un "organisme entier" vivant, et retient le furet comme seul modèle développant des signes cliniques proches de ceux de l'humain. La sélection in vitro des candidats les plus prometteurs est laissée au "donneur d'ordre", ce qui situe le projet dans une prestation d'évaluation pour un commanditaire.

Objectifs

Chaque année, malgré l’existence de vaccins et traitements antigrippaux déjà disponibles, environ un milliard de personnes contractent le virus de la grippe et entre 3 à 5 millions d’entre eux développeront une forme sévère conduisant entre 290 000 et 650 000 décès liés à des troubles respiratoires. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements antiviraux indiqué dans le cas d’une infection au virus de la grippe. Ce projet inclura deux études lors desquelles, des furets (mustela putorius furo), connus comme modèle de choix dans le développement d’une maladie symptomatique post-infection au virus de la grippe, seront utilisés. es animaux seront infectés avec une suspension virale du virus de la grippe. Des traitements (composé(s) à tester et traitement(s) de référence d’efficacité antivirale connue) seront injectés en préventif ou en curatif.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera au développement et éventuellement à la mise sur le marché de nouveaux traitements anti-grippaux offrant des thérapies plus efficaces contre les infections grippales.

Procédures

Les animaux recevront une administration intranasale de virus et recevront une/des injection(s) du traitement antiviral en dose unique ou répétées (maximum 3 administrations) en amont et/ou en avant l’infection. La procédure d’infection durera en moyenne 30 minutes, anesthésie comprise, comme l’administration des traitements. Des lavages nasaux, des lavages bronchoalvéolaires, des écouvillonnages oropharyngés et des prélèvements sanguins seront réalisés, 1 fois avant infection (baseline) puis au maximum, tous les 2 jours à partir du lendemain de l’infection et ce jusqu’à euthanasie des animaux (soit 6 fois au maximum durant l’ensemble de l’étude) pour les prélèvements de sang et les lavages bronchoalvéolaires ou tous les jours pour les lavages nasaux et les écouvillonnages oropharyngés. L’ensemble des prélèvements sera réalisés lors d’une même anesthésie et celle-ci durera en moyenne 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être infectés avec le virus de la Grippe entrainant l’apparition de signes cliniques reflétant la réalité clinique (principalement fièvre, éternuement, écoulement nasal et apathie). La sévérité et la durée de ces signes pourront varier entre les animaux traités et non traités. Les animaux seront également manipulés régulièrement pour différents actes (administration des traitements, pesées, observations cliniques, prélèvements, etc.) susceptible d’induire un stress.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la phase expérimentale afin de prélever les organes pertinents à la mesure d’efficacité des produits antiviraux en vues d’analyses des charges virales.

Remplacement

Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable l’efficacité de traitements antiviraux dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique). En effet, cette réponse dépend d’un très grand nombre de facteurs impliquant notamment l’ensemble du système immunitaire. Une sélection in vitro des candidats les plus prometteurs pourra être réalisée en amont des études précliniques par le donneur d'ordre.

Réduction

Cette étude a fait l’objet d’une réflexion étayée par des connaissances statistiques et des données de la littérature scientifique afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Toutefois, pour obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur une réelle efficacité du traitement testé, des groupes de minimum 6 animaux seront utilisés. Un groupe contrôlé infecté non traité ou traité avec le véhicule sera systématiquement inclus.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines minimum sera respectée durant laquelle une période d’habituation sera mise en place : les animaux bénéficieront quotidiennement de contacts avec le personnel pour limiter le stress. Cette phase consiste à caresser, porter et faire rentrer les animaux dans la boîte d’induction d’anesthésie qui sera ensuite utilisée lors des anesthésies pour les actes techniques). Les 3 premiers jours, les animaux ne seront pas trop stimulés pour s’habituer aux locaux et au personnel. Avant le démarrage de l’étude, le vétérinaire assurera une visite de contrôle clinique. Les animaux seront hébergés en groupes tout au long du projet avec des enrichissements appropriés à leurs besoins (distinction stricte entre les aires de repos avec des panières et linges permettant la nidation et des zones où ils pourront faire leurs besoins). Des hamacs comme aires de repos en hauteur et des jeux comme des balles avec des clochettes à l’intérieur, des sortes d’hochets avec des objets à l’intérieur émettant du bruit à la manipulation, des tubes PVC organisés en un réseau à sorties multiples et servant également de cachettes pour les furets seront ajoutés au parc ou cages d’hébergement. Une alternance des jouets pour stimuler l’intérêt des animaux sera respectée. Un temps de jeux quotidiens (hors weekend et jours fériés) de 15 à 30 minutes avec les animaliers, en particulier ceux réalisant les soins quotidiens des animaux, sera également respecté pour habituer les animaux au contact humain. Durant l’étude, le poids des animaux et la température seront mesurés quotidiennement. Ils seront complétés par un suivi clinique quotidien avec observations de signes cliniques spécifiques à la grippe (comportement général de l’animal pour déceler une éventuelle apathie, réponse à la stimulation, état de son pelage (soyeux ou en pilo-érection), présence d’éternuements (sporadiques ou fréquents), présence et fréquence d’écoulements nasaux et oculaires, identification d’éventuelles difficultés respiratoires et état des muqueuses avec d’éventuelles congestions). Ces observations serviront à établir un score total permettant d’évaluer avec le vétérinaire l’état clinique général des animaux. La décision d’euthanasie ou non sera évaluée au cas par cas par concertation entre vétérinaire et directeur d’étude.

Choix des espèces

Le furet a été choisi car il s’agit, à ce jour, du seul modèle naturellement susceptible à l’infection aux virus de la grippe adaptés à l'humain ainsi que du seul modèle animal présentant des signes cliniques typique de l’infection au virus de la grippe tel que de la fièvre, de la toux ou des éternuements. Les animaux sélectionnés pour ce projet seront âgés de 2 à 4 mois correspondant à un stade de jeune adulte doté d’un système immunitaire mature au moment de la vaccination.

Sept prélèvements sanguins sur animal vigile, des injections dans l'orbite de l'œil et 72 heures d'isolement dans une cage métabolique de 500 cm2 : 2 184 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont soumises à des régimes hypercaloriques ou déficients en méthionine et en choline pour provoquer une maladie du foie, avec des jeûnes de 8 à 16 heures et des tests de tolérance au glucose. L'objectif déclaré est de comprendre comment les plaquettes sanguines régulent l'installation des maladies hépatiques métaboliques, les retombées thérapeutiques restant énoncées au futur. Le résumé annonce "plusieurs injections successives par souris" sans nommer les substances injectées ni en donner le nombre, et qualifie les perturbations du métabolisme hépatique de "non dommageable pour la souris".

Objectifs

Les maladies hépatiques métaboliques sont des conséquences hépatiques du syndrome métabolique. Elles peuvent rester asymptomatiques mais aussi évoluer vers une cirrhose et un cancer du foie avec un taux de survie de 10% sur 5 ans.Les maladies hépatiques métaboliques représentent un problème majeur de santé publique à l’échelon mondial. L'organisation mondiale de la santé les catégorise actuellement comme la cause numéro une des maladies hépatiques dans les pays occidentaux. Même si les maladies métaboliques hépatiques sont étroitement liées à l’obésité et au syndrome métabolique, les causes des maladies métaboliques hépatiques ne sont pas les mêmes chez tous les patients et demeurent actuellement en grande partie non élucidée, ce qui complique la prévention et la prise en charge de ces maladies. Comment les plaquettes sanguines et leur vésicules extra-cellulaires, acteurs clés du maintien de l’intégrité vasculaire, peuvent réguler l’installation des maladies métaboliques hépatiques est une question très intéressante et novatrice et aborde un problème médical important sous un angle à la fois moléculaire et de physiopathologie intégrée. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des plaquettes dans les maladies métaboliques hépatiques et ses conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie hépatique et aideront à évaluer l’intérêt thérapeutique de cibler les plaquettes pour prévenir les maladies métaboliques du foie.

Procédures

La souris sera soumise à différents régimes alimentaires (hypercalorique et/ou déficients en méthionine ou/et choline) (réalisé dans l'Etablissement Utilisateur (EU) 1/2). La souris sera mise à jeun (8h ou 16h) pour les tests de tolérance (réalisé dans EU 1/2). La souris sera soumise à des procédures avec des injections sur souris vigiles ou anesthésiées (plusieurs injections successives par souris de quelques secondes) (réalisé dans EU 1/2). Sept prélèvements sanguins de 30 secondes sur souris vigile (réalisé dans EU1/2) et une prise de sang terminale sur la souris anesthésiée (d’une durée environ de 2 min) seront réalisées (réalisé dans EU1/2 ou 2/2 en fonction de l’expérimentation réalisée avec le sang et les organes prélevés). Pour l'évaluation du métabolisme in vivo, la souris sera isolée individuellement en cage métabolique d’une surface de 500cm2 sur une durée de 72h (réalisé dans EU 1/2). Pour l'évaluation de la structure et perméabilité des vaisseaux sanguin : une seule injection (injection d'une durée de quelques secondes) sera réalisée sur la souris anesthésiée suivie de la mise à mort de la souris 30 minutes après suite à une anesthésie générale et antalgie locale et une perfusion intra-cardiaque (EU 2/2).

Impact sur les animaux

La mise en régime hyperlipidique de la souris induit : une prise de poids pour la souris et des perturbations du métabolisme hépatique non dommageable pour la souris. Les actions suivantes vont induire un stress modéré et un inconfort des animaux : injections intra-orbitaire et intra-péritonéale (durée : 30 sec), mise en isolation de 72h pour les mesures de calorimétrie indirecte, test de tolérance (induction d’hyerglécemie et d’hypoglycémie et prise de sang) (durée 2h).

Devenir

La souris sera euthanasiée suite à un prélèvement sanguin terminal à la veine cave ou suite à l’isolement dans les cages métaboliques de 72h qui ne permettra pas de réaliser en suivant d’autres mesures métaboliques.

Remplacement

Les effets pléiotropes dans un contexte d’hémostase et thrombose et de maladies métaboliques hépatiques font intervenir des fonctions et types cellulaires multiples dans l’organisme non modélisables à ce jour par des approches in vitro. Le recours à l’expérimentation animale est donc l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans un contexte intégré.

Réduction

Plusieurs résultats seront obtenus avec un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Nous utiliserons 6 à 8 animaux par groupe en fonction de la procédure (nombre minimum nécessaire déjà défini par des expériences déjà réalisées au laboratoire). Ce nombre a été estimé en fonction des tests statistiques qui seront utilisés. Les paramètres évalués seront analysés par une analyse de variance.

Raffinement

Le suivi des souris sera réalisé 2 fois par jour par les zootechniciens et l’expérimentateur et un calcul de score général sera réalisé. En fonction du score général, une surveillance accrue est nécessaire. De l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Des soins/désinfections seront prodigués à la souris. La souris peut être aussi momentanément séparée de ces congénères. Si l'animal atteint le point limite : mise à mort par l’expérimentateur ou par le service de zootechnie. Toutes les procédures invasives utilisent des analgésiques généraux ou locaux. Certains animaux seront transportés à pied selon un tracé bien défini de 5 minutes dans leur cage d’origine placée dans des sacs isotherme de transports à raison de 2 cages par sac de transport. Ceci permet de réduire le stress des animaux car dans l’obscurité et à une température contrôlée. Tout animal faible ou malade ne sera pas transporté et mis à mort avant transport par dislocation cervicale. Les animaux sont ensuite placés dans la salle d’expérimentaion pour une acclimation de 2 h avant l’expérimentation.

Choix des espèces

Nous utilisons des modèles murins car nous disposons de modèles de souris génétiquement modifiées ainsi que d'outils pharmacologiques commercialement disponibles et couramment utilisés pour modifier le compte plaquettaire chez la souris. Les modèles de drosophiles ou de poissons zèbres ne sont pas utilisables dans le contexte de ce projet de recherche car les plaquettes sanguines sont phénotypiquement et mecanistiquement très différentes de celles de l'Homme, ce qui n'est pas le cas chez les rongeurs. Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte, système cardiovasculaire et métabolique mature).