Procédures modérées

Les images produites doivent illustrer un brevet en cours de rédaction et servir de base à la création d'une startup. 66 souris jeunes adultes vont être utilisées pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe trois séances d'IRM sous anesthésie, dont une de trois heures avec injection d'un agent de contraste au fer, puis deux séances d'une heure à trois et sept jours pour vérifier son élimination. Le porteur retient trois animaux par agent testé, "le nombre minimal permettant de conclure qualitativement", et prévoit de les maintenir en vie pour les réutiliser dans un autre projet.

Objectifs

Les agents de contraste IRM sont des molécules destinées à améliorer la qualité des images en réhaussant le signal là où elles sont présentes (hypersignal). Cela permet, lors d’un examen par IRM, de mettre en évidence certaines régions difficiles à visualiser. Les agents de contraste utilisés en IRM sont majoritairement à base de gadolinium. Certains, dits « linéaires », sont instables et peuvent relarguer du gadolinium dans l’organisme, avec accumulation dans divers organes (reins, os, cerveau). Ce phénomène est lié à des complications telles que la fibrose systémique néphrogénique, notamment chez les patients en insuffisance rénale sévère. En 2017, l’Agence européenne des médicaments a recommandé de restreindre l’usage de certains agents linéaires et de suspendre de nouvelles autorisations. Depuis, plusieurs produits ont été retirés du marché, et les radiologues appliquent une vigilance renforcée. Les agents restants, bien que plus stables, restent contre-indiqués chez des populations à risque : femmes enceintes, enfants en bas âge, personnes âgées, patients transplantés ou insuffisants rénaux, et ceux nécessitant des examens fréquents. Face à ces limites, l’équipe porteuse du projet développe depuis plus de 15 ans des agents de contraste à base de fer, un élément naturellement présent dans l’organisme, doté de écanismes de régulation et d’élimination. Ces nouveaux agents sont prometteurs pour réduire le risque chez les patients sensibles, tout en offrant une efficacité diagnostique équivalente, voire supérieure. Les études in vitro ayant montré une bonne biocompatibilité, le projet entre en phase préclinique. Cette étape vise à évaluer leur comportement en IRM, leur pharmacocinétique et leur tolérance, en vue d’un futur transfert clinique.

Bénéfices attendus

Les acquisitions d’images réalisées illustreront et exemplifieront le brevet en cours de rédaction, qui constitue la base de la propriété intellectuelle nécessaire pour développer le projet et créer une startup. Ces études précliniques représentent une étape cruciale, en démontrant l’intérêt médical et la faisabilité pratique de la technologie. La preuve de concept ainsi apportée est essentielle pour obtenir les financements nécessaires au développement d’un agent de contraste destiné à l’humain, qui représente un investissement important. Par ailleurs, les images recueillies valideront pré-cliniquement la structure des molécules testées, permettant ainsi de sélectionner la molécule candidate pour la suite des démarches réglementaires et des essais en conditions de bonnes pratiques de laboratoire (Good Laboratory Practice GLP) En définitive, ces résultats favoriseront l’avancement du projet vers la phase clinique et, ultérieurement, sa commercialisation en tant que nouvel agent de contraste pour l’IRM.

Procédures

Les animaux subiront trois séances d'imagerie IRM sous anesthésie générale à l’isoflurane et une injection unique de produit de contraste lors de la première séance (3 heures); deux séances supplémentaires (1 heure) sont prévues trois et sept jours plus tard afin de vérifier l'élimination complète du produit. Cette injection sera réalisée de manière systémique 15 minutes après la procédure d’anesthésie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus, bien que rares, sont de même nature que pour une injection de produit de contraste commercial : hypersensibilité, réaction anaphylactique, allergie cutanée, vasodilatation, malaise, fièvre, nécrose tissulaire, phlébite au point d’injection. La concentration sera identique à celle que l'on injecte classiquement chez l'humain et sera strictement inférieure à la dose létale médiane mesurée sur cellules vivantes. La déshydratation de l’animal suite à la première session d’imagerie qui durera trois heures, ainsi qu’une dessication des yeux sont prévus et pris en charge par la procédure expérimentale.

Devenir

Les interventions effectuées sur les animaux sont compatibles avec un maintien en vie des animaux et ceux-ci pourront être réutilisés dans un autre projet.

Remplacement

Ce projet, à la frontière entre la recherche fondamentale (de par la totale nouveauté des concepts moléculaires développés) et la recherche appliquée (valorisée par un futur brevet), a permis la réalisation d’une preuve de concept in vitro. Dans une optique de développement du concept moléculaire vers un agent d’imagerie à destination de l’humain, effectuer des tests de biocompatibilité, de performance et de pharmacocinétique in vivo de molécules sur petit animal est une étape indispensable avant le passage chez l’Homme (essais cliniques réglementaires). Dans ce but, aucune autre procédure ne peut remplacer cette étude.

Réduction

Le nombre total estimé d'animaux nécessaire est basé sur le nombre maximum d'agents de contraste à tester avec aux plus trois animaux par agent, trois étant le nombre minimal permettant de conclure qualitativement sur l'intérêt pour l'imagerie IRM d'un agent de contraste donné. C’est la raison pour laquelle le projet n’utilisera pas d’animaux de réforme, afin de garantir une comparaison fiable des données avec le nombre limité d’animaux utilisés. Les animaux seront imagés deux fois supplémentaire pour vérifier la présence ou non d’hypersignal dans certains tissus. L’IRM étant une technique d’imagerie non-invasive, elle permet de réduire par trois le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée selon la dernière directive en vigueur. Nous placerons des boîtes percées dans les cages en guise de raffinement de l’habitat. Le transport des animaux sera effectué sur une distance d’une cinquantaine de mètres via un chariot sur roues pneumatiques atténuant toutes vibrations pour être imagés. Les animaux subiront une procédure avec un temps d’anesthésie inférieur à trois heures. Les rongeurs seront conditionnés dans un lit dédié à l’exploration anatomique, chauffé par thermorégulation par système de circulation d’eau chaude avec monitoring de la respiration et suivi de température. On injectera aux animaux une solution de sérum glucosé chauffée à température corporel : 0.5mL seront injectés après le début de l’anesthésie, puis 1mL juste avant leur réveil afin de les réhydrater. On instillera une goutte d’Ocrygel dans chaque oeil de l’animal pour prévenir de la dessication oculaire. Notre attention sera portée sur les procédures expérimentales pouvant causer un stress ou une douleur telle que l’injection intraveineuse d’agents de contraste. Les animaux replacés à l’animalerie seront suivis quotidiennement. .

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus adaptée pour évaluer pré-cliniquement les agents de contraste sur l’instrument d’IRM préclinique à disposition. Le faible volume corporel de la souris permet une imagerie précise et résolue du corps entier. En effet, l’instrument est adapté à l’imagerie de petits rongeurs en disposant d’une cavité adaptée et d’un lit adapté. De plus, le faible volume sanguin de la souris implique un faible volume d’injection et donc la production d’une quantité d’agent de contraste acceptable pour le laboratoire de chimie qui produit les AC. Les souris utilisées seront au stade de développement « jeune-adulte ». Elles seront commandées à l’âge de 5 semaines

Isolées en cage individuelle pendant deux semaines au sortir du sevrage, 512 souris subissent ensuite jusqu'à huit injections dans l'abdomen, quatre incisions de la queue pour prélever du sang et, pour certaines, deux chirurgies crâniennes de trente-cinq et quarante minutes destinées à implanter des dispositifs d'enregistrement neuronal. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélever leur cerveau. Le projet cherche à savoir si l'isolement social à l'adolescence favorise l'anxiété à l'âge adulte, en reproduisant chez la souris l'isolement dont il veut mesurer les dégâts. Trois tests comportementaux de cinq à dix minutes sont annoncés, présentés comme fondés sur des comportements innés et donc sans effet indésirable attendu, sans qu'aucun soit nommé.

Objectifs

Il a été suggéré que l'isolement social durant la période adolescente constitue un facteur de risque au développement de troubles anxieux à l'âge adulte. Néanmoins la compréhension des mécanismes impliqués reste très parcellaire en raison de la nature observatoire et corrélationelle des études épidémiologiques disponibles à ce jour. Sur la base de ces observations, notre projet a pour objectif de mettre en place un modèle murin d'isolement social durant l'adolescence, d'en analyser les conséquences comportementales à long-terme en se concentrant sur le profil émotionnel, et de relier les potentiels dysfonctionnements comportementaux à une altération du développement de l'hippocampe, une structure clé pour le contrôle des états émotionnels. La réalisation de ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de comprendre les déficits comportementaux associés à la privation sociale durant l'adolescence, et d'en aborder certains mécanismes. La compréhension de ces mécanismes devrait nous permettre à moyen terme de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement ces mécanismes, mais aussi de développer des interventions préventives visant à réduire les effects néfastes de l'isolement sur la santé mentale.

Procédures

1) Hébergement individuel: il sera d'une durée de 2 semaines et sera réalisé dans l'Etablissement utilisateur 1 (EU1). 2) Injections intrapéritonéales: elles sont au nombre de 3 à l'âge de 4 semaines et 5 à l'âge de 10 semaines. La durée moyenne d'une injection, préhension de la souris inclue est de 30-40 secondes. Les injections seront réalisées dans l'EU1. 3) Stress aigu d'une durée de 6 min ou hébergement individuel d'une durée de 24 h. Ces interventions sont réalisées dans l'EU1 et concernent des animaux différents. 4) Tests comportementaux: ils sont au nombre de 3, et durent de 5 à 10 min chacun. Ils sont réalisés dans l'EU1 ou l'EU2. 5) Prélèvements sanguins: ils sont au nombre de 4 , et durent moins de 3 min, préhension de l'animal inclue. Ils sont réalisés dans l'EU1 sur des animaux n'ayant subi aucun test au préalable. 6) Chirurgie: sur animal adulte une chirurgie de 60 min environ est pratiquée; sur animal adolescent 2 chirurgies sont pratiquées, une à 4 semaines d'une durée moyenne de 35 min et une au moins 5 semaines plus tard d'une durée de 40 min environ. Les chirurgies sont réalisées dans l'EU1.

Impact sur les animaux

1) L'isolement social peut induire un état de stress de degré modéré puisque de courte durée. 2) Les injections intrapéritonéales peuvent engendrer un léger inconfort. 3) Le stress aigu sera à l'origine d'un incomfort passager, sans conséquences à long terme. 4) Les tests comportementaux sont basés sur les comportements innés des animaux et sont donc sans effet indésirable attendu. 5) Les prélèvements sanguins nécessitent une légère incision de la queue, ce qui peut entrainer une gêne et une légère douleur très locale et de très courte durée, avec un risque très faible d'une hypovolémie / anémie en cas de saignement non maitrisé, ce que nous n'avons jamais observé par le passé. 6) Les procédures chirurgicales, comme l'implantation de dispositifs pour l'enregistrement neuronal, comportent un risque de complications telles que des infections ou des réactions inflammatoires. Elles peuvent également générer de la détresse et du stress ainsi que de la douleur postopératoire d’un degré de gravité modéré, qui sera minoré par les antalgiques administrés.

Devenir

Les souris sont toutes euthanasiées en vue de prélever le cerveau pour analyse.

Remplacement

L’étude de comportements, notamment sociaux et relatifs aux emotions, ne peut être réalisée que sur animaux vivants ce qui rend impossible leur remplacement par des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes. Pour les études comportementales, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous effectuerons lorsque cela est possible sans biaiser les résultats de l'experience plusieurs test sur les mêmes animaux.

Raffinement

Pour réduire la souffrance imposée par le protocole, les règles suivantes seront appliquées pour le bien-être des animaux: 1- En amont des tests comportementaux, toutes les souris seront habituées à l'expérimentateur par des pesées hebdomadaires. Elles seront acclimatées aux pièces de test pendant une durée d'au moins 45 min avant le démarrage des tests, et surveillées pendant au moins 30 min à l'issue des tests afin de détecter l'apparition d'une anomalie comportementale (stéréotypie, prostration, grooming excessif…). 2- Avant les chirurgies, un analgésique sera administré en sous-cutané, à titre préventif afin d’éviter la souffrance post-opératoire. 3- Les chirurgies se feront sous anesthésie générale. Durant la chirurgie, la température de l’animal sera contrôlée par une sonde durant la chirurgie, et maintenue grâce à un tapis chauffant. Un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux pour prévenir la déshydratation oculaire. Un analgésique sera injecté avant la chirurgie ainsi que 24h après. 4- Après la chirurgie, de la nourriture humidifiée sera mise à disposition au sol de la cage. L’état de l’animal et la bonne cicatrisation de l’incision dans la peau de la tête seront contrôlés quotidiennement pendant la semaine suivant la chirurgie. Des points limites ont été établis pour chaque critère avec un arbre de décision. Si l’animal perd du poids, de la nourriture enrichie humide sera fournie. Si la plaie ne cicatrise pas correctement, elle sera désinfectée et surveillée. Si la souris est en souffrance, un analgésique sera injecté. Si les anomalies persistent, le vétérinaire sera contacté afin de prendre les mesures les plus adaptées pour le bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La neurogenèse dans le cerveau adulte, qui est notre candidat mécanistique pour expliquer les effets de l'isolement social, a été largement étudiée chez les rongeurs, lesquels représentent un modèle pertinent en raison de la similitude de leurs réponses physiologiques au stress avec celles des humains. Ils permettent ainsi une exploration intégrée des effets comportementaux, neurobiologiques et génétiques du stress. Par conséquent, la souris a été choisie comme modèle principal dans ce projet car 1) il est en continuité avec les études publiées sur des modèles équivalents , et 2) il permet l'utilisation d'outils transgeniques pour valider les hypothèses que nous pourrons formuler à l'issue des études. Les animaux seront utilisés à partir du sevrage puisque notre modèle a pour objectif d'étudier l'impact de l'isolement social à l'adolescence (P21-P35) sur la vulnérabilité / résilience à développer des troubles anxieux à l'âge adulte.

540 souris vont être utilisées, chacune subissant jusqu'à vingt-quatre prélèvements sanguins sur douze semaines de régime gras et sucré, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chez les autres, une injection unique détruit une partie des cellules du pancréas pour provoquer un diabète. Toutes reçoivent ensuite une mini-pompe implantée sous la peau lors d'une chirurgie de quinze minutes, puis passent un test de tolérance au glucose ou à l'insuline précédé de cinq heures de jeûne. Le porteur écrit que l'induction du diabète est "malheureusement strictement nécessaire", et que la mise à mort l'est tout autant, les organes devant être prélevés.

Objectifs

Les diabètes de type 1 et 2 sont caractérisés par une augmentation de la concentration du sucre dans le sang entrainant notamment des maladies du cœur et des reins mettant ainsi en jeu la vie des patients diabétiques. L’excès de sucre dans le sang se met en place lorsque le pancréas produit de façon insuffisante l’insuline qui est l’hormone capable de baisser la concentration de sucre dans le sang. La piste thérapeutique explorée vise à augmenter la production d’insuline par le pancréas pour traiter ces maladies à l’aide d’un traitement chronique. Les muscles squelettiques de souris peuvent produire différents facteurs capables d’augmenter le nombre de cellules productrices d’insuline sur des pancréas de souris mis en culture, en stimulant la formation de nouvelles cellules productrices d’insuline à partir de cellules souches du pancréas. L’objectif sera donc de tester si ces facteurs peuvent également agir chez la souris de laboratoire diabétique (dans un modèle de diabète de type 1 et un modèle de diabète de type 2), en augmentant le nombre de cellules productrices d’insuline et par conséquence la quantité d’insuline produite.

Bénéfices attendus

Le diabète de type 1 est caractérisé par un déficit total en cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline, la seule hormone hypoglycémiante de l’organisme. Le diabète de type 2 est caractérisé par une résistance à l’insuline associée à une carence relative en insuline. En France, on dénombre 4,3 millions de personnes diabétiques. La prévalence augmente depuis des années et est passée de 5,6 pour cent en 2015 à 6,07 pour cent en 2021 (source Santé Publique France et Fédération Française des diabétiques). Si les tendances restent identiques, 520 000 personnes deviendront diabétiques d’ici 2027 en France. 90 pour cent des diabétiques sont atteints du diabète de type 2, maladie touchant préférentiellement les adultes et associée à l’obésité. 10 pour cent des patients sont atteints du diabète de type 1 dont le déclenchement est observé majoritairement chez l’enfant et est lié à une dérégulation du système immunitaire. Des traitements contre cette maladie existent avec notamment des anti-diabétiques oraux pour le diabète de type 2 et des injections quotidiennes d’insuline pour le diabète de type 1. Néanmoins, des nouvelles pistes de traitement doivent être explorées pour tenter de restaurer une production endogène d’insuline, permettant une régulation physiologique de la glycémie, notamment en stimulant la formation de nouvelles cellules productrices d’insuline dans le pancréas. Le projet actuel a donc pour objectif de définir le potentiel thérapeutique de différents facteurs administrés de manière continue pour restaurer chez la souris diabétique un nombre suffisant de cellules productrices d’insuline et ainsi permettre de normaliser la concentration de sucre dans le sang.

Procédures

Une partie des animaux connaitra une induction d’un diabète qui se fera par injection unique sur animal vigile d’une molécule nocive pour une population de cellules du pancréas (quelques secondes par animal) effectuée après une mise à jeun courte (4h). Des prélèvements sanguins de faible volume (quelques microlitres) effectués quotidiennement pendant 5 jours après l’injection permettront de confirmer l’induction du diabète. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal à raison de 5 prélèvements par animal sur la durée de maintien. Une autre partie des animaux sera nourri par un régime riche en graisse associé à l’administration de sucre dans l’eau de boisson pendant 12 semaines. Des prélèvements sanguins de faible volume (quelques microlitres) effectués 2 fois par semaines permettront de confirmer l’induction du diabète. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal à raison de 24 prélèvements par animal sur la durée de maintien. Les souris seront ensuite implantées par des mini-pompes en sous cutané lors d’une unique chirurgie effectuée sous anesthésie générale et analgésie afin de délivrer notre traitement en continue durant 28 jours. Cette chirurgie sera de 15 minutes par animal. A la fin des traitements, les souris seront soumises à l’un des deux tests pour évaluer soit la tolérance au glucose ou celle à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun courte (5h), les souris seront injectées au niveau de l’abdomen avec une solution et 5 à 7 prélèvements sanguins de faible volume (quelques microlitres) sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 test par souris). Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les souris concernent l’induction d’un diabète chez les souris. Le diabète est associé à une augmentation de la concentration de sucre dans le sang pouvant impacter le bien-être des animaux avec notamment une augmentation de l’émission d’urine, de la prise de boisson et éventuellement une perte de poids. L’induction de cette pathologie est malheureusement strictement nécessaire pour mener à bien ce projet puisque notre objectif vise à identifier des thérapies innovantes pour traiter le diabète. L’induction du diabète de type 1 sera effectuée par administration unique d’un agent par injection au niveau de l’abdomen pouvant être source de stress et d’une douleur de courte durée au point d’injection. L’induction du diabète de type 2 sera effectuée en alimentant les animaux avec un régime hyperlipidique et du sucre dans l’eau de boisson. Le changement de régime pourra induire un léger stress. De même, le suivi glycémique longitudinal des animaux pourra induire un stress et une douleur de courte durée. Les traitements reposent sur la pose de mini-pompes en sous-cutané qui implique une courte chirurgie effectuée sous anesthésie et analgésie. Cet acte pourrait causer différentes contraintes liées à l’acte chirurgicale lui-même et notamment des douleurs post-opératoires et les risques inhérents à une chirurgie (stress thermique ou arrêt cardio-respiratoire lors de l’anesthésie, inflammation locale au niveau des cicatrises ou encore dans de très rare cas une infection). Le traitement pourrait induire une production accrue d’insuline chez les souris non diabétiques. De ce fait, des épisodes d’hypoglycémies modérées pourraient prendre place chez les souris non diabétiques. D’autres effets secondaires pourraient être observés mais sont difficiles à prévoir et une surveillance accrue des souris sera réalisée quotidiennement. Les tests métaboliques, qui comprennent une injection intrapéritonéale puis plusieurs prélèvements sanguins de faible volume afin de suivre la glycémie, peuvent être source de stress et d’inconfort pour l’animal. Ils peuvent également induire un stress et une légère sensation de faim pour les animaux en raison de période courte de mise à jeun.

Devenir

Notre étude nécessite le prélèvement d’organes afin de caractériser l’effet des traitements mis en œuvre sur la pathologie étudié (le diabète). Ainsi, l’euthanasie des animaux est strictement nécessaire afin de répondre aux enjeux scientifiques du projet.

Remplacement

Les cellules bêta pancréatiques produisent l’insuline qui va agir sur ses tissus cibles pour stimuler le stockage du glucose, inhiber la production de glucose et la lipolyse. Lorsque l’insuline est produite en quantité insuffisante, la concentration de glucose dans le sang n’est plus régulée et augmente de façon chronique. C’est l’hyperglycémie qui est le symptôme premier du diabète, maladie multi-organes. Nous développons des stratégies afin de former de nouvelles cellules bêta dans le pancréas. Dans un premier temps, par des études in vitro sur un modèle d’explant de pancréas avec des résultats très prometteurs, puis in vivo sur un modèle de souris diabétiques pour augmenter la production d’insuline et résoudre l’hyperglycémie. Un organisme vivant est nécessaire pour établir la preuve d’efficacité des traitements par nos différents facteurs dans des modèles animaux de ces maladies humaines. Il n’est pas possible de recréer en culture de cellules la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaires rentrant en jeu et de tester le potentiel thérapeutique de nos facteurs sur la résolution du diabète.

Réduction

Un total de 540 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous analyserons sur chaque souris les cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline mais également les tissus cibles de l’insuline tels que le foie, les muscles squelettiques et les tissus adipeux gonadiques et sous cutanés. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe tout en nous assurant que nous obtiendrons des résultats statistiquement fiables. En effet, en raison des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (formation, soins, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés. La première contrainte concerne le développement du diabète nécessaire pour mener à bien ce projet. Nous assurerons un change supplémentaire des animaux dans le cas où une polyurie (production excessive d’urine) est constatée afin d’assurer un confort optimal d’hébergement. La deuxième contrainte concerne la procédure chirurgicale d’implantation de mini-pompes en sous cutané au niveau dorsale pour ne pas gêner les déplacements qui sera réalisée dans des conditions aseptiques, sous anesthésie générale et avec une prise en charge de la douleur à l’aide d’analgésique. Un soutien thermique (plateau chauffant) sera également apporté tout au long de la chirurgie pour limiter le stress thermique au cours de l’anesthésie générale. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés à la pathologie avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids et de la glycémie sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésie, soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nos résultats ont montré chez la souris adulte que le muscle squelettique rendu insulino-résistant produisait des protéines appelées myokines pour lesquelles nous avons montré qu’elles possédaient in vitro la capacité de stimuler la formation de nouvelles cellules bêta sur un modèle d’explants pancréatiques. Notre projet vise à tester cette même capacité chez la souris adulte normale et diabétique de type 1 et de type 2 justifiant le choix de cette espèce. Justification du stade de développement : Notre projet vise à définir le potentiel thérapeutique de nos traitements administrés en continue pour former de nouvelles cellules bêta et à permettre une nouvelle production d’insuline par le pancréas adulte dans des modèles de souris diabétiques de type 1 et de type 2. Il convient donc d’utiliser des souris adultes pour ce projet.

Injectées de cellules de lymphome T dans la veine ou directement dans la rate au cours d'une chirurgie, 743 souris immunodéprimées enchaînent ensuite jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie générale et cinq prélèvements sanguins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le développement de la tumeur peut provoquer un gonflement de l'abdomen et un déficit moteur des membres postérieurs. L'objectif est de mesurer l'efficacité de cellules CAR-T modifiées pour persister plus longtemps dans l'organisme, avec une production en laboratoire espérée d'ici cinq à dix ans. Toutes sont tuées à l'issue, leur sang et leurs organes prélevés pour compléter l'analyse d'efficacité et d'innocuité.

Objectifs

Les cellules CAR-T correspondent à un nouveau type de traitement qui utilise les cellules immunitaires du patient pour attaquer la tumeur, après modifications génétiques au laboratoire. Ces traitements ont révolutionné la prise en charge de certains cancers du sang et l’enjeu principal actuel est d’étendre l’utilisation de ces thérapies à d’autres types de cancer. Dans ce projet, nous nous intéressons à un cancer du sang rare, les lymphomes T, et nous avons développé un nouveau type de cellules CAR-T pour tenter de guérir cette maladie extrêmement agressive sans véritable traitement efficace à ce jour. Ces cellules CAR-T s’attaqueront spécifiquement à la tumeur grâce à des modifications génétiques additionnelles, qui leur permettront de persister plus longtemps dans l’organisme pour une meilleure efficacité. Les objectifs principaux de cette étude sont : - Évaluer l’efficacité antitumorale de ces nouvelles cellules CAR-T dans différents modèles murins et définir la dose minimale efficace, - Valider notre stratégie de modification génétique pour améliorer l’efficacité de ce traitement, - Évaluer la sécurité d’emploi de ce nouveau traitement. Ces résultats permettrons ensuite de valider l’évaluation de ce traitement chez l’homme dans le cadre d’un essai clinique.

Bénéfices attendus

Les résultats in vivo générés dans le cadre de ce projet sont extrêmement importants pour valider le transfert de cette thérapie vers la clinique. L’objectif à moyen terme est de produire ces cellules CAR-T dans des laboratoires de recherche d’ici 5 à 10 ans, afin de proposer aux patients atteints de ces cancers du sang rares un traitement innovant potentiellement curatif.

Procédures

Les animaux subiront les interventions suivantes : - Injection des cellules tumorales par voie intra veineuse, sous anesthésie générale (1x/souris, 5 minutes) - Injection des cellules tumorales dans la rate par voie chirurgicale, sous anesthésie générale (1x/souris, 15 minutes) - Imagerie sous anesthésie générale (maximum 12x/souris, 10 minutes), précédée de l’injection d’un produit de révélation de la tumeur sur souris vigile (maximum 12x/souris, 1 minute) - Prélèvements sanguins sous anesthésie locale (4x/souris, 5 minutes) ou anesthésie général (1x/souris, 5 minutes).

Impact sur les animaux

- Stress : l’ensemble des procédures, contentions et transports peuvent générer un stress chez la souris. - Douleurs légères : après injection intra veineuse ou abdominale, chirurgie, et prélèvement de sang. - Altération de l’état général : en lien avec le développement de la tumeur ou d’un éventuel effet secondaire du traitement. - Gonflement abdominal : en lien avec le développement de la tumeur. - Déficit moteur des membres inférieurs : en lien avec le développement de la tumeur. - Infection post-opératoire : en lien avec la chirurgie, risque nul en condition d’asepsie stricte. - Mauvaise cicatrisation : en lien avec la chirurgie, risque faible.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure expérimentale. En effet, les animaux ne peuvent pas être réutilisés pour d'autres procédures après l'injection de cellules tumorales. Le sang et les organes seront collectés lors de la mise à mort finale afin de compléter l’analyse de l’efficacité et de l'innocuité du traitement.

Remplacement

Ces nouveaux traitements basés sur l’utilisation des cellules immunitaires pour attaquer la tumeur sont préalablement testés in vitro à l’aide de lignées cellulaires pour remplacer les animaux. Ces résultats préliminaires nous permettent de déterminer les doses et les conditions d’intérêt à étudier plus en détail in vivo afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser par la suite. Néanmoins, les tests in vitro ne sont pas suffisants pour récapituler l’ensemble des mécanismes dynamiques immunitaires en jeu avec ces immunothérapies, ainsi que leurs effets multi-organes. Les expérimentations sur les animaux sont donc indispensables avant de passer aux études chez l’homme afin d’évaluer au mieux leur efficacité mais également leur profil de tolérance.

Réduction

Méthodologie de réduction du nombre des animaux nécessaires à l’expérimentation : - Évaluation in vitro approfondie sur les lignées cellulaires pour sélectionner un nombre restreint de conditions d’intérêt et de doses à tester pour l’étude in vivo. - Évaluation du nombre souris nécessaires et suffisantes pour garantir l’obtention de résultats statistiquement recevables, à l’aide d’outils statistiques. - Utilisation d’un même groupe de souris contrôles non traitées pour évaluer l’efficacité de différents traitements CAR-T - Recueil du maximum d’information à partir de chaque animal, avec analyse chez un même animal de plusieurs paramètres : tests sanguins, imagerie longitudinale. - Les ressources cellulaires post-mortem seront mutualisées au sein de l’équipe de recherche afin qu’un même échantillon puisse être exploité pour différents projets et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris.

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux grâce à un suivi fréquent et adapté des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel animalier lors du change et les personnes en charge de l’expérimentation afin d’observer leur comportement, leur apparence et tous signes qui permettraient d’identifier des indications révélatrices de souffrance animale. Toutes les injections de cellules tumorales seront réalisées sous anesthésie générale. Tous les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale et après application d’anesthésiques locaux. L’imagerie se fera sous anesthésie et les souris seront placées sur plateau chauffant pendant le suivi et pour le réveil afin de limiter l’hypothermie. Les chirurgies seront faites sous anesthésie et les souris recevront un analgésique, avant et jusqu’à 48h après la chirurgie. La chirurgie et le réveil se referont sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Une goutte de gel hydratant sera également appliquée sur chaque œil avant et après l'étape de chirurgie afin d'éviter un dessèchement. Les sutures seront surveillées régulièrement en post-opératoire afin de prévenir tout risque d’infection jusqu’à cicatrisation. Aucune chirurgie ne sera réalisée le vendredi pour permettre le suivi de 48h en semaine. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et extrapolables à l’homme. C’est également l’espèce où le plus d’outils sont actuellement disponibles pour permettre une étude approfondie et de répondre à notre question de recherche. Les souris immunodéprimées ont été décrites dans la littérature scientifique depuis plusieurs années comme le meilleur modèle pour greffer et étudier le développement des cancers du sang et servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouvelles thérapies cellulaires. Nous utiliserons des souris adultes entre 6 et 12 semaines en début de procédure, âge durant lequel la probabilité de prise de greffe est maximale selon les données de la littérature et l’expérience du laboratoire, et la tolérance au traitement est la meilleure. Cela permet aussi de comparer nos données aux autres données de la littérature qui utilisent de façon uniforme ces souris aux mêmes âges.

Immunodéprimées pour accepter sans rejet des cellules de mélanome humain, 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leurs tumeurs et leurs organes. Elles reçoivent des injections dans l'abdomen chaque jour ou tous les trois jours pendant quatre semaines, une perfusion dans la veine de la queue et une séance d'imagerie de 30 minutes sous anesthésie. Le porteur teste un anticorps issu de son laboratoire face au traitement de référence, après des résultats sur cellules en culture qu'il juge prometteurs. La tumeur peut se nécroser et ulcérer la peau, ce qui déclenche alors une mise à mort anticipée.

Objectifs

Le mélanome est le cancer de la peau le plus agressif, et son nombre de cas augmente fortement. En France, il provoque plus de 2 000 décès par an (Inca, 2020). Lorsqu’il est détecté à un stade précoce, la chirurgie suffit généralement pour l’enlever. En revanche, s’il s’est déjà propagé dans l’organisme (métastases), le pronostic est très mauvais, avec une espérance de vie médiane d’environ 6 mois. Ces dernières années, de nouveaux traitements ont été développés, notamment des anticorps spécifiques et des médicaments ciblant certaines protéines impliquées dans la croissance des mélanomes. Cependant, ces traitements perdent souvent leur efficacité rapidement à cause du phénomène de résistance, empêchant une guérison durable. C’est pourquoi la recherche continue à explorer de nouvelles approches. Nous avons mis au point une molécule thérapeutique appelée "anticorps" capable de reconnaître une marque spécifique présente à la surface des cellules de mélanome. Nos premiers tests en laboratoire montrent que cet anticorps ralentit significativement la multiplication des cellules cancéreuses, comparé à un anticorps témoin. Ces résultats ouvrent la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le mélanome.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’efficacité de notre anticorps comme traitement contre le mélanome en testant son effet sur des modèles de souris porteuses de tumeurs humaines. Pour cela, nous injecterons des cellules de mélanome humain à des souris et comparerons l'effet de notre anticorps avec un anticorps témoin. Nous comparerons également son efficacité à celle du traitement de référence. L’intérêt principal de cette approche est de cibler uniquement les cellules cancéreuses sans affecter les cellules saines, ce qui limiterait les effets secondaires. Nos premiers tests en laboratoire ont montré des résultats prometteurs, mais il est essentiel de confirmer cette efficacité dans un modèle vivant avant d’envisager une application chez l’humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à un examen d’imagerie, sous anesthésie générale, une seule fois, ainsi qu’à des injections quotidiennes ou tous les 3 jours dans l’abdomen sur animal vigile, pendant 4 semaines maximum. Concernant le produit de contraste pour l’imagerie, une perfusion sera installée au préalable dans la veine de la queue de la souris (sous anesthésie) afin de pouvoir injecter le produit de contraste lorsque la souris sera dans l’imageur. L'examen aura une durée maximale de 30 min.

Impact sur les animaux

Dans cette étude sur le mélanome, les souris peuvent subir plusieurs effets indésirables liés à la croissance tumorale, aux traitements administrés et aux procédures expérimentales. La formation de la tumeur peut entraîner une gêne locale, voire une douleur si elle atteint une taille importante, pouvant aussi causer une perte de poids ou une altération de l’état général. Dans certains cas, la tumeur peut évoluer vers une nécrose, conduisant à une inflammation locale ou à une ulcération cutanée nécessitant une euthanasie anticipée. Les injections répétées des molécules thérapeutiques dans l’abdomen peuvent provoquer un léger inconfort abdominal et certains traitements anticancéreux peuvent affecter la fonction hépatique ou rénale, se traduisant par une fatigue accrue. De plus, la contention régulière pour la mesure de la tumeur au pied à coulisse ainsi que les injections fréquentes peuvent générer du stress, bien que ces manipulations soient effectuées rapidement pour minimiser l’inconfort. Enfin, l’imagerie, bien que non invasive, nécessite une anesthésie par isoflurane, qui peut induire une légère hypothermie ou une récupération plus lente chez certains animaux. Afin de limiter ces effets indésirables, une surveillance rigoureuse est mise en place et des critères éthiques stricts sont appliqués pour éviter toute souffrance excessive des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés après les examens pour permettre l’analyse des tumeurs et de certains organes. Ces analyses sont essentielles pour valider les données obtenues lors des examens d’imagerie ainsi que l’efficacité de l’anticorps évalué.

Remplacement

Les expériences sur les cellules en laboratoire ne permettent pas de reproduire précisément les interactions complexes entre les cellules tumorales, les vaisseaux sanguins et les tissus environnants. L’utilisation d’un modèle vivant est donc nécessaire pour répondre aux questions posées par le projet.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé grâce à des tests de puissance statistique. La mesure des tumeurs par pied à coulisse permet de suivre les animaux tout au long de l'étude sans avoir à les euthanasier à chaque étape, ce qui réduit considérablement le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

À leur arrivée, les souris seront installées dans des cages adaptées, avec de la litière changée régulièrement, des enrichissements (comme des tunnels, des dômes et du coton), ainsi que de la nourriture et de l’eau à volonté. Elles auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement. Ensuite, une injection sera faite pour que les souris développent une tumeur. Leur état sera suivi de près (taille de la tumeur, poids). À partir d’une certaine taille tumorale, les souris recevront une injection de substances thérapeutiques dans l’abdomen, tous les jours ou tous les 3 jours, associée à une récompense à base de céréales sucrées pour diminuer leur stress. Pour l’examen d’imagerie, les souris seront anesthésiées avec un gaz pour qu’elles restent immobiles. Elles seront placées sur un lit chauffant, et leur respiration et leur cœur seront surveillés en continu. Si des signes de douleurs sont observés dans le cadre de mise en ouvre de cette procédure alors des molécules analgésiques seront administrées aux animaux. Par ailleurs des points limites ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Des souris mâles et femelles immunodéprimées seront utilisées pour permettre l’implantation de cellules tumorales humaines sans rejet. Le cancer étudié étant le mélanome, il est plus représentatif de la réalité clinique d’utiliser les deux genres. De plus, des souris âgées de 6 semaines ont un poids suffisamment stabilisé pour évaluer l’efficacité de cette immunothérapie.

Greffées de cellules tumorales sous la peau, puis piquées de deux à sept fois pour recevoir des traitements, 800 souris voient leur tumeur mesurée au pied à coulisse ou par imagerie tous les trois jours. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, avec des douleurs locales liées à la croissance de la tumeur, et toutes les souris sont tuées pour prélever des organes. Le projet cherche à situer l'origine cellulaire ou tissulaire des signaux qui rendent la mort des cellules cancéreuses visible par le système immunitaire. Les retombées annoncées, des conditions thérapeutiques "transposables en applications cliniques", sont renvoyées au long terme.

Objectifs

La mort cellulaire immunogène est un type de mort cellulaire déclenché dans le cadre de thérapies antitumorales comme les chimiothérapies. Il a été démontré qu'elle est déterminante pour l’effet à long terme de la thérapie anticancéreuse dans les contextes précliniques et cliniques. Elle implique un ensemble de motifs moléculaires associés aux dommages cellulaires. L'exposition et la libération spatiales et temporelles définies de ces motifs moléculaires dictent l'immunogénicité de la thérapie anticancéreuse. Il n’est pas encore démontré si une augmentation de l’effet de la tumeur ou des cellules malignes individuelles entraîne une immunogénicité. Cette incertitude a freiné l'exploration et l'application des traitements en lien avec la mort cellulaire immunogène. Les recherches visant à développer des mesures induisant ce mécanisme pour différents types d'entités tumorales bénéficieraient largement de la délimitation spatiale de l'émission de ces motifs et de leurs effets conséquents sur l'immunité antitumorale. Par conséquent, ce projet se concentrera sur l'élucidation du rôle et de l'origine (cellulaire ou tissulaire) des principaux motifs. Comprendre l’importance de ces motifs pour cette modalité de mort cellulaire immonogène et leurs modes d’interaction coopérative aidera les chercheurs à mieux mettre en œuvre lacette mort cellulaire dans différents types de tumeurs solides dans les thérapies cliniquement applicables.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider, dans des modèles précliniques, une nouvelle stratégie pharmacologique antitumorale efficace contre plusieurs types de cancer, en association avec d'autres thérapies et immunothérapies. À court terme, nous espérons aborder la question de l'origine des motifs liés à la mort cellulaire immunogène, ce qui permettra d'affiner les stratégies de traitement anticancéreux. À plus long terme, nous prévoyons de définir des conditions thérapeutiques optimales transposables en applications cliniques.

Procédures

Les souris recevront une injection sous anesthésie générale (2 min). De plus, elles recevront entre deux et sept injections suivant la procédure (animal vigile, anesthésie locale, durée maximale 1min).

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes de cellules tumorales sous anesthésie générale, des injections de traitements, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse ou d’imagerie tous les trois jours. Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress chez l’animal et les croissances tumorales en sous cutanées peuvent entraîner des douleurs locales et modérées.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de collecter divers organes pour des analyses immunologiques.

Remplacement

L'utilisation d'animaux vivants est essentielle car ce projet vise à tester l'efficacité des traitements anticancéreux et à confirmer l'activation du système immunitaire, et actuellement, il est impossible de reconstruire un système immunitaire fonctionnel in vitro/ex vivo à cause des limites des technologies actuelles.

Réduction

Ce projet prévoit d'utiliser un maximum de 800 souris, avec 10 souris par groupe dans les procédures. Les expériences seront regroupées autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux témoins. L'étude sera interrompue si la procédure initiale invalide l'hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) afin d'extraire un maximum de données pour chaque expérience. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Une analyse statistique a été réalisée pour calculer le nombre d'animaux requis.

Raffinement

Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress : plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale ou non selon le geste à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Plusieurs justifications d’ordre scientifique, et pratique sont à la base du choix de la souris comme modèle préclinique, notamment le fait que la souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale. Cela permet de travailler sur un modèle de mammifère suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, suffisamment grand pour une mise en place des méthodologies envisagées relativement aisée et dont la génétique est la mieux connue. La souris est le modèle le plus utilisé dans notre centre de recherche, ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. De plus, la pratique expérimentale que nous avons acquise sur cette espèce est désormais confirmée. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

Capturés à la ligne ou à la palangre, gardés en bassin de une à cinq heures, anesthésiés puis ouverts au niveau de l'abdomen pour y recevoir des marques, 600 bars européens et lieus jaunes adultes subissent aussi le prélèvement de quatre écailles et d'un fragment de nageoire caudale. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et tous les poissons sont relâchés en mer, le porteur reconnaissant qu'elles peuvent occasionner des mortalités directes ou indirectes. L'objet déclaré est de cartographier leurs habitats et leurs migrations pour la gestion des pêches de deux espèces commercialement importantes. L'effectif de 600 individus résulte d'un compromis entre le coût de l'opération et les 90 recaptures espérées, soit 15 % des poissons marqués.

Objectifs

Un manque de connaissance existe sur les habitats dont les poissons ont besoin pour se reproduire, se nourrir ou grandir, et sur leurs interactions. Cette étude vise à caractériser les habitats marins utilisés par le bar européen et le lieu jaune dans leur milieu naturel, et à analyser les comportements migratoires entre les habitats essentiels de ces populations naturelles. Ces processus sont le résultat d’interactions complexes entre des individus et leur environnement physique et biologique. Ce projet cherchera également à combler ces lacunes par le déploiement d’un réseau de télémétrie acoustique et le suivi par marquage des déplacements des deux espèces de poissons. Nous analyserons les mouvements et migrations de ces deux espèces cibles, composantes importantes des écosystèmes littoraux étudiés et des espèces commercialement importantes pour la région.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’écologie des espèces suivies et ainsi de répondre aux questions suivantes : Quels sont les habitats fréquentés par ces 2 espèces ? Quelles fonctions (alimentation, reproduction, croissance, etc.) permettent-ils de réaliser ? Existe-t-il des migrations saisonnières entre ces habitats ? La population est-elle composée de sous-populations ? Ce projet répondra à ces questions en suivant les mouvements et les comportements de ces espèces par télémétrie acoustique et par géolocalisation. Ces nouvelles connaissances seront utiles pour améliorer la gestion et l'exploitation durable de ces espèces.

Procédures

Les bars et lieus jaunes anesthésiés et analgésiés seront soumis à une seule intervention chirurgicale, d'une durée de 5 minutes, nécessaire à l'implantation de marques archive et acoustique dans la cavité abdominale. Un prélèvement de 4 écailles et d'un fragment de nageoire caudale, d'une durée de 2-3 minutes, sera réalisé afin de déterminer l'âge des individus et faire des analyses génétiques respectivement.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables incluent : - Le stress à la capture (intensité légère pendant environ 15 min) - la période de captivité avant intervention (intensité légère pendant 1 à 5 heures) – L’implantation des marques internes (intensité modérée pendant 5 min) - L’implantation de la marque externe (intensité légère pendant 30 s) – Le prélèvement de 4 écailles et d'un fragment de nageoire caudale et le marquage externe au bleu Alcian (intensité légère pendant 2-3 minutes) – Le stress lors la phase de réveil en milieu captif (intensité légère pendant 5-10 min). Ces procédures peuvent occasionner des mortalités directes ou indirectes.

Devenir

L'objectif de l'étude est d’analyser les mouvements et les migrations du bar européen et du lieu jaune au stade adulte en Manche afin de mieux comprendre la structure spatio-temporelle de ces populations et la manière dont elles exploitent les habitats marins, éléments indispensables pour la mise en place de la gestion écosystémique des pêches. L’ensemble des poissons capturés sera relâché dans le milieu naturel après leur marquage.

Remplacement

Cette étude vise à caractériser les habitats marins utilisés par le bar européen et le lieu jaune dans leur milieu naturel, et à analyser les comportements migratoires entre les habitats essentiels de ces populations naturelles. Ces processus sont le résultat d’interactions complexes entre des individus et leur environnement physique et biologique, il n’est donc pas possible de faire appel à des méthodes de remplacement.

Réduction

Le nombre de poissons par espèce a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique. Il est prévu de marquer, dans le milieu naturel, 600 poissons adultes (50%-70% bar européen et 30%-50% lieu jaune) sur 4 sites répartis en Manche. Ce nombre est un compromis entre le coût de l'opération et le nombre de recaptures escomptées de 15% en moyenne soit 22.5 poissons par site et 90 poissons au total, les recaptures par espèce devant être considérées comme représentatives des populations étudiées.

Raffinement

Les techniques de pêche n’altèrent que peu l’état de santé des poissons capturés (ligne ou palangre). Les individus seront maintenus en groupe dans de grands bassins afin qu’ils aient un comportement normal et calme. Si les poissons ont un comportement agité, une sédation légère sera réalisée. Lors du marquage, les poissons seront anesthésiés dans des seaux opaques avec couvercles. Nous utiliserons une épuisette et un linge humide pour manipuler le poisson, en couvrant leurs yeux et en protégeant leurs écailles. Nous utiliserons un antalgique et les surveillerons au moins deux heures avant de les relâcher dans le milieu naturel. Ce projet comporte des points limites stricts et spécifiques du projet.

Choix des espèces

Le projet se focalise sur le bar européen, poisson d'intérêt écologique, économique et sociale. Il existe un besoin de quantifier les mouvements de l'espèce pour la gestion des stocks Mer Celtique, Manche, Mer du Nord et Golfe de Gascogne. Le projet s’intéresse aussi au lieu jaune, poisson d'intérêt écologique, économique et sociale. La gestion de l'espèce repose actuellement sur trop peu de données et il existe un manque patent de connaissances sur l'écologie de cette espèce. La proportion attendue des espèces marquées sera égale ou pourra être légèrement plus forte pour le bar. Nous nous focaliserons sur le stade adulte, car il permettra d'améliorer nos connaissances sur les migrations de reproduction et les zones de reproduction, habitats essentiels à protéger pour exploiter durablement ces espèces.

4 840 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyse de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, jusqu'à trois gavages de matières fécales, un traitement antibiotique, jusqu'à quatre injections d'immunothérapie et sept injections bloquant des voies immunitaires, certaines subissant en plus une chirurgie. Les tumeurs peuvent limiter leur mobilité, les antibiotiques provoquer des diarrhées et le tout des pertes de poids. Le porteur affirme que seul un animal "vivant, entier" permet d'étudier ces interactions, les organoïdes ne reproduisant pas selon lui le dialogue entre immunité intestinale et tumeur.

Objectifs

De plus en plus de preuves indiquent que le microbiote intestinal influence fortement l'immunité antitumorale et les réponses cliniques aux immunothérapies dans le traitement du cancer. Notre laboratoire a montré que la dysbiose, une composition altérée du microbiote intestinal, peut réduire l'efficacité des immunothérapies et contribuer à la résistance au traitement contre le cancer. Alors que les interventions microbiennes telles que la transplantation de microbiote fécal (TMF) peuvent restaurer les communautés bactériennes intestinales bénéfiques et améliorer les réponses aux traitements, les mécanismes expliquant l'efficacité des TMF sont encore à étudier. Parmis ceux potentiels, la modulation du métabolisme et de l'immunité post-TMF seront étudiés dans ce projet. Dans ce projet, nous testerons un métabolite mis en évidence dans d'anciens projets, associé à une meilleure efficacité des traitements par immunothérapies post-TMF. Nous étudierons plus en détails les effets immunomodulateurs de ce métabolites, sur sa voie d'action (locale ou systémique) et ses effets sur le thymus.

Bénéfices attendus

En effet, nous avons mis en évidence un métabolite associé à la réponse aux immunothérapies chez les patients, et nous étudierons son effet dans ce projet, en association aux TMF et au traitement par immunothérapie. De plus les modulations immunitaires seront étudiées, et notamment le rôle du thymus. En évaluant la modulation de la réponse immunitaire et du métabolisme de manière microbiote-dépendante, ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de résistance ou la réponse aux immunothérapies chez les patients atteints de cancer. Cette compréhension permettrait aussi de montrer que le métabolite étudié pourrait constituer un biomarqueur de la réponse aux TMF + immunothérapies. De plus, cela pourrait aider à comprendre la réussite ou l’échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux ICI, et de pouvoir sélectionner des donneurs. Enfin, cela permettrait d’optimiser l’utilisation des immunothérapies, et d’éclairer les interactions entre l’immunité et le microbiote intestinal, pouvant au final influencer les décisions cliniques.

Procédures

Les interventions prévues seront l'implantation d'une tumeur par injection sous cutanée (une fois, d'une durée de moins d'1 minute), l'administration orale de matières fécales avec une sonde de gavage oral (1 à 3 fois, durée 1 minute), l'administration de traitements d'immunothérapie par injection intrapéritonéale (4 fois maximum, durée 1 minute), l'administration de traitements bloquant certaines voies immunitaires par injection intrapéritonéale (7 fois maximum, durée 1 minute). Dans les procédures 4 et 5, une chirurgie seral réalisée, sous anesthésie générale et les souris seront traités par un anti-douleur (une fois, durée 15-20 minutes). Enfin, des prélèvements de sang seront réalisés, une fois par semaine si 100uL sont prélevés (durée 2-3 minutes). Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale, par lidocaïne.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress léger et transitoire lié aux manipulations. Les gavages oraux pourront provoquer un inconfort léger et transitoire pour la souris. Il y a un risque de diarrhée car les souris recevront un traitement antibiotique de courte durée, induisant une déshydratation légère et de courte durée. Il y a aussi un risque de perte de poids modéré post-transplantation de microbiote, post traitement par antibiotique ou post injection de tumeur sous-cutanée. Les injectionspeuvent provoquer des douleurs légères et transitoires et seront faites sous anesthésie locale. Les tumeurs peuvent provoquer une limitation modérée de l'activité et de la mobilité des souris. Les chirurgies comportent un risque de douleur post-opératoire modérée.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées afin d’analyser les organes post-mortem.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale, intestinale et périphérique et l’effet de la transplantation de microbiote fécal sur l'immunité et la réponse antitumorale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo. En effet, l'utilisation d'organoïdes n'est pas possible car les organoïdes reproduisent un tissu ou organe mais ne peuvent reproduire l’interaction du système immunitaire intestinal avec l’environnement tumoral après stimulation par le microbiote. Dans ce projet, nous voulons observer l'effet d'une transplantation de microbiote fécal sur différentes composantes de l'immunité. Seul un organisme entier permet d’étudier cela, avec un système immunitaire et une génétique proche de l'Homme comme la souris.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé pour optimiser les ressources tout en garantissant des résultats fiables. D'après nos études antérieures et des analyses statistiques, nous avons besoin de 8 animaux par groupe pour obtenir des différences significatives.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être avec un régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi du comportement de la souris et l’éventuelle mise en place de mesure d'analgésie si les animaux présentent une souffrance, voire d'euthanasie si les animaux atteignent les points limites. Toutes les injections sous-cutanées, intraveineuses et intrapéritonéales (i.p.) seront faites sous anesthésie locale. Toutes les souris auront un examen clinique quotidien et des pesées régulières (au moins une fois/semaine). Les points limites seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique est proche de celle de l’Homme et bien connue. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de 6-7 semaines de développement, les cancers cibles touchant l’adulte. De plus, à cet âge-là, les animaux sont matures du point de vue immunologique.